CN101389962A - 用于诊断胃癌的作为标记的mac-2bp - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于胃癌的诊断试剂盒。它包括可以检测并定量测定该胃癌标记Mac－2BP的试剂。本发明还涉及一种使用所公开的该试剂盒用于检测该胃癌标记的方法。

Description

用于诊断胃癌的作为标记的MAC-2BP

技术领域

本发明涉及一种用于胃癌的诊断标记。更具体地，本发明涉及一种用于胃癌的诊断试剂盒，其包括可以检测被确认为胃癌标记的Mac-2BP(Mac-2结合蛋白)的试剂。本发明还涉及一种使用该试剂盒用于检测该胃癌标记的方法。

背景技术

人体肿瘤表达并分泌各种被称为癌症标记抗原的特异性分子。目前，已经提供大量用于癌症抗原的诊断和治疗的抗原。迄今，已经发现了60多种肿瘤标记。在它们之中，商业上应用的一些癌症标记包括AFP(肝癌)，CEA(结肠直肠癌，胃癌，胰脏癌，乳腺癌)，HCG(绒毛膜癌)，PAP(前列腺癌)，NSE(肺癌)，C15-3(乳腺癌)，和CA19-9(结肠直肠癌，胰腺癌)。胃癌是世界上表现最高发病率和死亡率的癌症之一，并且在包括韩国，日本，中国，俄罗斯，香港，和中欧，中美和南美的国家和斯堪的纳维亚半岛的不同国家中，胃癌是死亡的主要原因。在胃癌的诊断和治疗中，标记或治疗剂是非常有用的，然而，标记或治疗剂还没有被开发出来。

起初，Mac-2BP(Mac-2结合蛋白)被称为90kd。Mac-2BP是一种分泌性糖蛋白，并在血浆、尿液、母乳和其它人体体液中被发现，并作为结合到半乳凝素-1，-3和-7上的配体。迄今为止，已经报导在包括乳腺癌，肺癌，结肠直肠癌和卵巢癌的不同癌症病人的血浆中Mac-2BP以高水平分泌总计若干μg/ml。对于乳腺癌和肺癌，已经报导Mac-2BP的表达和分泌的水平可以作为指示病人的转移阶段和存活率的标记。然而，在前述报导中完全提到Mac-2BP用于诊断乳腺癌的应用。

对于本发明，本发明人在与癌细胞的发生和产生有关的基因上进行了大量并彻底的研究，结果发现Mac-2BP基因在胃癌细胞中特异性的表达并且在Mac-2BP的表达和分泌与胃癌的发生之间存在紧密的关系。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于胃癌的诊断试剂盒，其包括可以检测该胃癌标记Mac-2BP的试剂。

本发明的另一个目的是提供一种使用该试剂用于检测该胃癌标记的方法。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明的上述和其它目的，特征和其它优点将被更加清楚的理解，其中：

图1A显示通过Northern印迹测定，与作为对照组的使用实体瘤标记豆类天冬氨酸蛋白内切酶(Legumain)的原发性癌组织比较，Mac-2BP转录物在转移性的继发性癌组织中以较高的水平表达；

图1B显示通过流式细胞计量术测定的在胃癌细胞株中Mac-2BP蛋白的特异性表达，其中每种细胞株用甲醛固定并用针对Mac-2BP的单克隆抗体染色；

图2A显示使用细胞株的细胞溶胞产物，通过Mac-2BP ELISA测定的在胃细胞株中Mac-2BP蛋白的表达水平；

图2B显示使用细胞培养液的浓缩物，通过ELISA测定从胃细胞株SNU-484、-620、和-638中分泌的Mac-2BP水平，其不同于细胞内的表达水平；

图3显示与正常组织(3A和3C)比较，Mac-2BP在胃癌组织(3B和3D)中以较高水平的过度表达，其使用Mac-2BP的单克隆抗体，通过免疫组织化学测定；和

图4显示使用取自胃癌病人和正常人体的血清，通过ELISA测定的分泌到细胞外环境的Mac-2BP水平。

具体实施例

在一个方面，本发明涉及一种用于胃癌的诊断试剂盒，其包括一种可以确定Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平的试剂。

另一方面，本发明涉及一种用于检测胃癌标记的方法，其包括将生物样品与确定Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平的试剂进行接触。

在此使用的术语“标记”意思是一种可以在正常细胞之中鉴别癌细胞的材料，并且它可以是Mac-2BP基因的核苷酸标记或是Mac-2BP蛋白的多肽标记。与正常细胞比较，在胃癌细胞中，这些标记的表达是增加的。

在此使用的术语“诊断”意思是鉴别胃癌的存在或特征，并且特别地，其与胃癌的转移有关，胃癌的转移包括转移是否已经发生和是否有转移的可能性。

已知Mac-2BP(NCBI编号；L13210)在肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和卵巢癌中被过度表达。例如，在血浆或其它人体体液中的Mac-2BP的水平被公认是指示肺癌或乳腺癌的病人的癌细胞的转移和存活率的临界参考(Iacobelli S等人，Br.J.Cancer，1994，69，171-76；Antonio M等人，Cancer Res，2002，62，2535-39)。然而，在本发明之前，没有出版物公开Mac-2BP基因与胃癌发生之间的关系。

在本发明中，Mac-2BP作为胃癌标记的效用被证实如下：发现Mac-2BP转录物在来源于韩国病人的胃癌细胞的SNU株中被特异性表达。特别地，原发性癌组织细胞SNU-1和-484具有十分低的Mac-2BP转录物的表达水平，而在继发性癌组织株SNU-16、-216、-620和-638中具有明显增加的Mac-2BP转录物的表达水平(图1A)。在这张图中，AZ521是取自日本病人的胃癌细胞株，并且其作为对照组。HS677st是取自韩国病人的胃癌细胞株，其作为阴性对照组。HLF(人体肺成纤维细胞)取自正常人体肺组织。参考对照组细胞中的结果，Mac-2BP可以在例如HLF的正常细胞中被适当的表达，并且在例如AZ521的胃癌细胞中不能被表达。然而，与阴性对照组比较，发现Mac-2BP对于韩国人的胃癌细胞株SNU具有高度特异性的表达。已知豆类天冬氨酸蛋白内切酶基因在实体癌细胞中被过度表达并与癌症的转移有关，其被作为标准标记(Cheng L等人，Cancer Res.2003，63，2957-2964)。Mac-2BP蛋白在该胃癌细胞株中同样用于检测特异性表达。为了这个目的，细胞内的Mac-2BP蛋白使用单克隆抗体染色。使用单克隆抗体的免疫组织化学染色测定的结果与使用Northern印迹分析的结果相似，这就证明了Mac-2BP在SNU-620和SNU-638中被特异性地表达，SNU-620和SNU-638都是可以转移性的(图1B)。随后，为了定量测定Mac-2BP的表达水平，对胃癌细胞株的溶胞产物进行ELISA测定。在SNU-620和-638中发现产生高达0.4μg/mg水平的Mac-2BP蛋白，但是在SNU-484中没有产生Mac-2BP蛋白，在其中基本没有Mac-2BP转录物。这些结果证实，Mac-2BP转录物的水平与Mac-2BP蛋白的水平是一致的(图2A)。另外，为了检测Mac-2BP是否向细胞外分泌，收集细胞培养液，用超过滤器浓缩该培养液并对其蛋白水平进行测定。在胃癌细胞株中，Mac-2BP的细胞外的水平大约是其细胞内的水平的10倍。特别地，发现SNU-620和-638分泌了大约3μg/mg的Mac-2BP到其培养基中。不大相同的是，在SNU-484的培养基中几乎没有检测出Mac-2BP。由于Mac-2BP基因在使用端粒酶阴性细胞株SW13的hTERT-过度表达克隆的微数列中鉴别，在这个试验中，SW13/pcDNA和SW13/hTERT作为对照组(图2B)。Mac-2BP基因的转录物和蛋白在胃癌细胞中的特异性表达的事实的证明引起了在胃癌治疗中有用的包含目的基因抑制剂的药学组合物的开发。在这点上，胃癌病人的胃组织使用抗-Mac-2BP的单克隆抗体染色。胃组织从包括正常人体和胃癌病人的22个人体中获得。发现大约70～75％的胃癌组织中含有丰富的Mac-2BP。如图3所示，Mac-2BP在正常胃组织中轻度地表达(A和C)，但在胃癌组织(B和D)中被高度地特异性表达。对于该基因表达的定量，使用s90k/Mac-2BP ELISA试剂盒(Bender Med System GmbH，Austria)。

由于目的基因在胃癌细胞中特异性地表达，胃癌病人的血浆通过ELISA用于Mac-2BP的定量测定。血浆从9个正常人体和36个胃癌病人中获得。病人血浆中的Mac-2BP水平范围从2.4至22μg/ml，平均值是11μg/ml。这明显地高于正常人体4.6μg/ml的平均值，并在学生t-试验中显示出p值＝0.0012的显著性(图4)。血浆Mac-2BP的分布和胃癌临床病理因素之间的关系用统计学进行分析。年龄或性别对病人血浆中的Mac-2BP水平没有影响。然而，Mac-2BP的表达水平在继发性转移性的病人组中比无转移性的病人组中要高(p值＝0.05)。同样，如下表1所示，发现在TNM临床阶段III和IV的病人组中的Mac-2BP比在TNM临床阶段I和II的病人组中的Mac-2BP的分布稍高(p值＝0.04)。

在生物样品中的胃癌标记基因Mac-2BP的表达水平可以通过Mac-2BP的mRNA或蛋白的定量测定确定。可以使用各种已知的技术从生物样品中分离mRNA或蛋白并确定其含量。

在此使用的术语“生物样品”意思是可以分析胃癌标记基因Mac-2BP的mRNA或蛋白水平的材料，其例子包括组织，细胞，尿液，血液，血浆，血清等，但不限于此。

在此使用的术语“mRNA水平的分析”意思是测定生物样品中的mRNA的含量，以检测胃癌标记基因Mac-2BP的mRNA的存在和表达程度，从而检测该胃癌标记基因。举例说明，mRNA水平的分析方法可以是RT-PCR，竞争RT-PCR，实时RT-PCR，RPA(RNA酶保护测定)，Northern印迹，和DNA芯片，但不限于此。

使用这些方法，mRNA的表达水平可以在正常对照组和样品组之间进行比较。为了检测从标记基因Mac-2BP到mRNA的转录物水平是否增加，这些方法也是有用的，其是进行诊断胃癌的依据。

一种通过RT-PCR分析mRNA水平的试剂盒，包括对胃标记Mac-2BP基因有特异性的一对引物。具有一个特异于一段标记基因的核苷酸序列的每个引物的长度范围大约从7至50bp，并优选大约从10到30bp。该试剂盒可以包括特异于一段控制基因的核苷酸序列的引物。另外，该RR-PCR试剂盒可以包括试管或适合的容器，反应缓冲液(pH和镁的浓度变化)，dNTPs，Taq-聚合酶和逆转录酶，脱氧核糖核酸酶，无核糖核酸酶的DEPC水和无菌水。术语“引物”意思是可以与互补的模板形成碱基对的短链核苷酸序列，并且其具有游离的3’羟基，该3’羟基作为该模板的DNA复制的起始点。引物是需要的，这是因为催化该DNA复制的大多数酶(例如DNA聚合酶或逆转录酶)仅可以在适当的缓冲液，温度，不同试剂，和四种不同的三磷酸核苷的条件下添加到即成的核苷酸链中。引物可以以附加的特征加入，但不能改变它们作为DNA合成起始点的基本功能。引物可以使用亚磷酰胺固体载体方法或一些其它已知的方法化学合成。这些核苷酸序列还可以通过已知方法进行修饰。

在此使用的术语“蛋白水平的分析”意思是确定由胃癌标记基因Mac-2BP编码蛋白的含量，优选使用对其有特异性的抗体，以检测该蛋白的存在和表达程度。

在此使用的术语“抗体”意思是作为免疫应答的一部分对抗原作出应答而产生的蛋白分子。对于本发明的目的，该抗体指特异性结合到该胃癌标记蛋白Mac-2BP上的蛋白分子，包括多克隆抗体，单克隆抗体，和重组抗体。可以使用各种方法使用抗体来分析蛋白水平，举例说明，其包括但不限于，Western印迹，ELISA(酶联免疫吸附测定)，RIA(放射免疫测定)，放射免疫扩散法，双向免疫扩散法，火箭免疫电泳法，免疫组织化学染色法，免疫沉淀作用法，补体结合作用法，FACS，和蛋白芯片法。

使用这些方法，可以在正常对照组和样品组之间比较抗原-抗体复合物的含量。检测从标记基因Mac-2BP到蛋白的表达水平是否显著的增加，这些方法也是有用的，其是进行诊断胃癌的依据。

在此使用的术语“抗原-抗体复合物”意思是通过Mac-2BP蛋白和对其有特异性的抗体的结合形成的复合物。该抗原-抗体复合物可以使用检测指示物的信号强度定量地确定。

在抗原-抗体复合物的定量测定中有用的是选自酶，荧光剂，配体，发光剂，微粒，氧化还原分子，和放射性同位素之中的检测指示物。然而，在抗原-抗体复合物的定量测定中可以使用其它的检测指示物。可以作为检测指示物用于分析的酶的例子包括β-葡萄糖苷酸酶，β-D-葡糖糖苷酶，β-D-半乳糖苷酶，尿素酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶，己糖激酶和GDP酶，核糖核酸酶，葡萄糖氧化酶和荧光素酶，磷酸果糖激酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，谷草转氨酶，磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶，和β-内酰胺酶，但不限于此。对于荧光剂，举例说明，它们可以是，但不限于，二羟基荧烷，异硫氰酸盐，玫瑰红，藻红蛋白，藻蓝蛋白，异藻蓝蛋白，邻苯二甲醛，和荧光胺。生物素衍生物可以作为配体，但不限于此。作为检测指示物有用的发光剂包括吖啶酯，荧光素，和荧虫素酶，但不限于此。举例说明，微粒的非限制性例子包括胶体金和染色的乳胶。氧化还原分子形式的检测指示物可以是二茂络铁，钌络合物，紫精，醌，Ti离子，Cs离子，二酰亚胺，1，4-苯醌，对苯二酚，K₄W(CN)₈，[Os(bpy)₃]²⁺，[RU(bpy)₃]²⁺或[MO(CN)₈]^4-，但不限于此。有用的放射性同位素是³H，¹⁴C，³²P，³⁵S，³⁶Cl，⁵¹Cr，⁵⁷Co，⁵⁸Co，⁵⁹Fe，⁹⁰Y，¹²⁵I，¹³¹I和¹⁸⁶Re，但这些不是为了限制本发明。

蛋白水平的分析优选使用ELISA进行(酶联免疫吸附测定)。ELISA可以被细分为直接夹心ELISA和间接夹心ELISA：前者中，附着在固体载体上的抗原-抗体复合物与可以识别该抗原的标记的抗体结合，而后者利用识别一抗的标记的二抗，一抗与附着在固体载体上的抗原-抗体复合物中的该抗原结合。优选地，使用夹心ELISA测定该蛋白水平，其中附着在固体载体上的抗体与样品反应，形成抗原-抗体复合物，并且随后该复合物与可以识别该抗原的标记的抗体结合，随后发生酶介导显色，或者其中标记的二抗与可以识别抗原-抗体复合物的该抗原的抗体结合，并且随后发生酶介导显色。可以使用胃癌细胞标记蛋白Mac-2BP与抗体结合的复合物水平来诊断胃癌。

同样优选的是使用蛋白芯片来分析蛋白水平，其中针对该胃癌标记蛋白Mac-2BP的一个或多个抗体以高密度预定位置被排列并固定在基质上。在这点上，蛋白从样品分离并与蛋白芯片杂交，形成抗原-抗体复合物，随后读取该复合物来检测样品中蛋白的存在或表达水平，从而诊断胃癌的发生。

另一种优选的分析方法是Western印迹技术，其利用针对该胃癌标记Mac-2BP的一种或多种抗体。对于Western印迹，蛋白与样品分离，根据大小由电泳分离，转移到硝酸纤维素膜，并与针对该胃癌标记Mac-2BP的抗体反应。使用标记的抗体定量分析该抗原-抗体复合物，来诊断胃癌。

根据本发明的检测方法包括在未被感染胃癌的对照组和样品细胞之间比较该标记基因的表达水平。mRNA或蛋白的表达水平可以用该标记蛋白的绝对含量(例如，μg/ml)或相对单位(例如，信号的相对强度)表示。

在一个优选实施例中，本发明提供一种用于胃癌的诊断试剂盒，其包括特异性结合到Mac-2BP蛋白上的抗体。

在另一个优选实施例中，本发明提供一种用于检测胃癌标记的方法，该方法包括将针对Mac-2BP蛋白的抗体与生物样品接触。

如上面所述，由于Mac-2BP已经被确认为胃癌标记，作用于它的抗体可以使用已知的技术容易地产生。

可以使用本领域技术人员已知的方法来制备多克隆抗体，例如，通过将该胃癌标记蛋白Mac-2BP注入到动物中并从该动物中取得血清。产生多克隆抗体的宿主可以使用任何哺乳动物，例如山羊，兔子，绵阳，猴子，马，猪，奶牛，狗等。

可以使用已知的方法进行单克隆抗体的产生，例如杂交瘤方法(Khler和Milstein(1976)European Journal of Immunology 6：511-519)，或噬菌体抗体库技术(Clackson等人，Nature，352：624-628，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：58，1-597，1991)。

通常，杂交瘤方法利用来源于适合免疫的宿主动物的细胞，例如注入抗原，胃标记蛋白Mac-2BP，和癌瘤或骨髓瘤细胞株的小鼠。这些两种类型的细胞用已知方法使用例如聚乙二醇融合，并且从而形成该产生抗体的细胞根据标准组织培养基方法培养。使用有限稀释技术对阳性克隆进一步亚克隆，确保单克隆性。可以产生对该胃癌标记蛋白Mac-2BP有特异性的抗体的该杂交瘤细胞使用常规技术在体外或体内大规模的培养。

虽然它们使用时无需纯化，由该杂交瘤细胞产生的该单克隆抗体优选使用现有技术中已知的方法被纯化到高浓度。

在噬菌体抗体库方法中，在体外通过克隆编码该抗体的基因并在噬菌体表面以融合蛋白的形式表达它们来构建针对该胃癌标记蛋白Mac-2BP的巨大噬菌体表达的人单链可变区(scFv)抗体库，随后将结合到该Mac-2BP蛋白的单克隆抗体从该抗体库中分离。

对于使用上述方法制备的抗体的纯化可以使用各种方法，包括凝胶电泳法，透析，盐析，离子交换色谱法，和亲合色谱法。

本发明的试剂盒中包括的抗体可以是包括两个全长轻链和两个全长重链或功能性抗原片段的完整形式。术语“功能性抗原片段”意思是具有抗原结合功能的片段，举例说明是Fab，F(ab’)，F(ab’)2和Fv。

根据本发明的包括特异性结合到Mac-2BP蛋白上的抗体的试剂盒优选是诊断型ELISA试剂盒。它可以包括对调控蛋白有特异性的抗体，用于检测抗原-抗体复合物的试剂，例如标记的二抗，生色团，酶(例如结合抗体(antibody-conjugated))和其酶作用物，或其它结合到该抗体上材料。

本发明的更好的理解可以通过下面的出于举例说明的实施例获得，但是该实施例不是为了限制本发明。

实施例1：细胞株的培养

韩国人的胃癌细胞株SNU-1，-16，-216，-484，-620和-638从位于首尔国立大学医学院的韩国人的细胞株库中购买，并在RPMI 1640下培养(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)。SW13/pcDNA和SW13/hTERT在DMEM(InvitrogenCorporation)中培养。在37°C下的5％的CO₂环境下培养之前，使用的所有培养基补充10％的牛血清(HyClone)和抗生素(Life Technologies)。

实施例2：SW13/hTERT表达细胞株的构建

由Sungkyunkwan大学的Han-Woong Lee，Ph.D教授的实验室获得pcDNA3/hTERT全长质粒作为hTERT cDNA的表达载体。次日，在以5×10⁶细胞/100mm培养皿的密度接种后，SW13细胞用该表达载体转化。5mg的该表达载体在无血清培养基中被稀释，形成500ml的最终体积。另外，30ml的脂质体转染试剂(Lipofectamine)(GIBCO，GrandIsland，NY)被添加到475ml的无血清培养基中并在室温下培养15分钟。随后，添加DNA的培养基和添加脂质体转染试剂的培养基混合，随后在室温下培养30分钟。该细胞用无血清培养基洗涤两次。DNA-脂质体转染试剂(DNA-Lipofectamine)复合物被添加到5ml的培养基中，在稀释的复合物覆盖在洗涤过的细胞上后形成6ml的总体积。在该培养基被正常生长培养基取代之前，该细胞在37℃下的5％的CO₂培养箱中培养6小时。在开始转染的24小时后，该变异细胞针对G418在包含0.8mg/ml的G418(Sigma，St Louis，MO)的培养基中进行两周的筛选。该G418-抗性细胞以每孔0.5～1细胞密度在96孔板上接种，以选择单克隆。最后选择的是SW13/hTERT#31克隆，其显示hTERT的最高表达率。

实施例3：RNA分离和Northern印迹

为了检测该Mac-2BP基因是否在胃癌细胞株中表达并且是否与胃癌的进展有关，进行Northern印迹分析。使用酸-硫氰酸胍-苯酚-氯仿(acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform)提取方法分离总RNA。首先，该细胞株(2～10 x 10⁶细胞)用PBS洗涤并用100mM的2-巯基乙醇和2M的醋酸钠在4M的异硫氢酸胍中溶解。在30分钟的离心之前，在苯酚和氯仿-异胺醇(isoamine alcohol)中在4℃下培养1小时。将等体积的异丙醇添加到600μl的上清液中，在-20℃下培养1小时或更长时间。在离心后，形成的该RNA片状物被干燥并溶解在用DEPC处理过的水中。该RNA使用UV分光光度计进行浓度和纯度的分析。

该RNA通过电泳在2％的琼脂糖凝胶上分离，以鉴别18S和28S条带，并转移到尼龙膜上。用放射标记的Mac-2BP探针(NCBI number；L13210，683bp-1275bp)和豆类天冬氨酸蛋白内切酶探针(NCBI number；NM_005606，525bp-1325bp)进行杂交。曝光X光片2天使得每个细胞中的Mac-2BP和豆类天冬氨酸蛋白内切酶基因的表达可视化。该结果在图1A中显示。

实施例4：通过流式细胞计量术分析Mac-2BP的表达

进行流式细胞计量术检测Mac-2BP的细胞内的表达水平。培养并收集该胃癌细胞株。这些细胞用FACS染色缓冲液(0.05％BSA，0.02％叠氮化钠，PBS中)洗涤一次，溶解在2％的多聚甲醛溶液中，在冰上固化15分钟，并再次用FACS染色缓冲液洗涤一次。该洗涤过的细胞片状物溶解在透化缓冲液(permeabilization buffer)(0.1％皂角苷和0.05％叠氮化钠，在PBS中)中并在冰上培养15分钟。随后用FACS染色缓冲液洗涤，该细胞用Mac-2BP单克隆抗体(Alexis)培养30分钟。在用FITC-结合IgG抗体(分子探针)在冰上培养30分钟之前，用FACS染色缓冲液再次洗涤。在该细胞用FACS染色缓冲液洗涤三次或四次之后，用流式细胞测定器对该细胞进行分析。结果如图1B中所示。

实施例5：通过ELISA对Mac-2BP的定量测定

收集每个细胞株并在裂解缓冲液(0.01％诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40，10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 7.6，50mM KCl，5mM MgCl₂，2mM二硫苏糖醇，20％甘油+蛋白酶抑制剂混合物)(Sigma)中完全溶解40分钟。在定量分析蛋白之前，在12,000rpm下离心20分钟将水不溶性蛋白去除。在Mac-2BP ELISA中使用相同含量的蛋白。使用s90k/Mac-2BP ELISA试剂盒(Bender Med System)。该蛋白混合物用Mac-2BP单克隆抗体包被的创口贴(strip)在4℃下隔夜培养，以在其上附着该Mac-2BP，随后用洗涤缓冲液洗涤四次。随后，该创口贴用HRP-结合的二抗在37℃下培养1小时，用洗涤缓冲液洗涤四次，并在用终止缓冲液使反应终止前在100ml的底物溶液中培养5分钟来显色。在多孔板中引入酶标仪，并在540nm下读取吸光度并使用SoftMax软件分析。

当使用细胞培养时，在对Mac-2BP进行ELISA分析之前，浓缩并透析该蛋白。对于来自胃癌病人的血清，在对Mac-2BP进行ELISA分析之前，它们以1：200的比例被稀释。该结果在图2A，2B和4中显示。

实施例6：胃癌细胞株和SW13细胞株的培养基的收集

为了定量地分析向细胞外分泌的Mac-2BP，收集胃癌细胞株和SW13细胞株的培养液。在15cm-培养皿中培养后，用无血清培养液洗涤每个细胞株并随后在无血清培养液中培养每个细胞株。在培养24小时后，该细胞培养在2,000rpm下离心两次，每次10分钟，收集无细胞的培养液。该培养液使用导电银胶(Amicon)(cutoff MW50,000Da，Millipore)浓缩。该浓缩物放置于活性透析带中并在1×PBS中4℃下每隔4小时透析3次或更多次。在用于ELISA之前，使用BioRad蛋白测定试剂盒测定蛋白的浓度。

实施例7：由免疫组织化学染色法对Mac-2BP蛋白的检测

为了检测在胃癌组织中Mac-2BP的表达水平，进行免疫组织化学染色法。植入了取自胃癌病人的胃癌组织的石蜡切片用二甲苯去石蜡化并使用分级乙醇洗涤剂与水化合。在该水合的切片被微波照射3次，5分钟后，该水合的切片被放置在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中。通过用3％的过氧化氢在甲醇中处理6分钟，阻断内源性过氧化物酶。随后，该切片用载体试剂盒(Cat No.PK6102)的工作溶液处理30分钟，以防止非特异性的蛋白结合。在1×PBS稀释的Mac-2BP IgG抗体中，在室温下进行培养2小时，并且随后用生物素酰化的抗小鼠Ig Ab(载体试剂盒)，在室温下培养30分钟。随后，该切片用ABC Elite试剂盒(载体试剂盒)在室温下处理30分钟，并且随后与二氨基联苯胺盐酸盐底物(diaminobenzidine tetrahydrochloridesubstrate)(载体试剂盒)反应2分钟，来分析在胃癌组织中的Mac-2BP的表达水平(图3)。如图3所示，在癌瘤感染的胃肠组织中，Mac-2BP以明显的高水平表达(图3B和3D)，但在正常胃肠组织中其以低水平表达(图3A和3C)。

实施例8：血浆Mac-2BP的分布和临床病理因素之间的关系

血浆Mac-2BP的分布和胃癌的临床病理因素之间的关系在图4中显示，对该关系进行统计分析并在以下的表1总结出。

表1

a：Mac-2BP水平高于截断值11.2g/ml的胃癌病人的数(百分比)。

b：p值通过曼-惠特尼U检验确定。

从表1的数据中明显的看出，在病人血浆中的Mac-2BP水平不受年龄或性别的影响。然而，在具有继发性转移性的病人组中，Mac-2BP的表达水平比没有转移性的病人组中要高(p值＝0.05)。同时，发现与在TMN临床阶段I和II中的病人组比较，在TMN临床阶段III和IV中的病人组中，Mac-2BP的表达有较高分布(p值＝0.04)。

工业实用性

如目前所描述的，该Mac-2BP基因在胃癌细胞中特异性地过度表达并且分泌到细胞的细胞外的环境中。另外，样品基因在具有转移能力的癌细胞组织的胃肠组织中明显高水平地被表达。因此，通过检测Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平，可以诊断胃癌，特别是诊断可以转移性的或转移性的胃癌。发现在36个胃癌病人中的血浆具有平均11μg/ml的Mac-2BP水平，其明显高于9个正常人体的4.6μg/ml的平均值。特异性地结合到Mac-2BP的抗体在诊断胃癌中是有用的。

虽然出于举例说明的目的已经公开了本发明的优选实施例，在不背离在所附的权利要求所公开的本发明的范围和精神下，本领域的技术人员将做出各种改进，增加和替换是可能的。

Claims (10)

1.一种用于胃癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合到Mac-2BP的抗体。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其中所述胃癌是转移性的或可以转移性的。

3.根据权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒允许在对照组和样品组之间比较蛋白水平。

4.根据权利要求1至3中任何一项所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒利用酶联免疫吸附测定方法。

5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒利用夹心酶联免疫吸附测定方法。

6.一种用于检测胃癌标记的方法，所述方法包括将特异性结合到Mac-2BP结合蛋白的抗体与选自尿液，血液，血清，和血浆的生物样品进行接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述胃癌是转移性的或可以转移性的。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法允许在对照组和样品组之间比较蛋白水平。

9.根据权利要求6至8中任何一项所述的方法，其中所述方法利用酶联免疫吸附测定方法。

10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括：

(a)提供生物样品；

(b)将所述样品与特异性结合到Mac-2BP结合蛋白的抗体进行接触；

(c)定量分析抗原-抗体复合物；和

(d)将所述步骤(c)的定量分析结果与正常对照组的定量分析结果进行比较。

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