CN102301236B - 方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法,其包括下列步骤:(i)鉴定和/或分离来自所述受试者的样品中的外来体;并(ii)检测外来体相关5T4。
Description
发明领域
本发明涉及用于在受试者中检测癌症,特别是5T4阳性癌症的方法。本发明还涉及此类方法用于诊断癌症和监测癌症的进展和/或治疗的用途。
发明背景
前列腺癌(PCa)仍然是西半球最流行的男性癌症,2008年预期在美国预计有186,000例新病例,和28,000例死亡(American Cancer Society,Atlanta,Georgia 2008)。虽然在了解此疾病下的生物学方面及在其治疗的许多方面正在取得进展,但是仍需要用于PCa诊断和监测的更好的工具。
本发明涉及一种用于检测癌症,诸如前列腺或膀胱癌的新的基于生物标志物的方法,其提供了一种用于早期疾病检测、用于鉴定适合于特定疗法的患者、和用于监测治疗/疾病进展的非侵入性技术。
发明概述
本发明人令人惊讶地发现了癌症相关生物标志物5T4在来自癌症患者的外来体,诸如尿外来体中表达,而且是可检测的。
5T4的表达表现为在外来体中/上高于在正常细胞中/上。
如此,在第一方面,本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法,其包括下列步骤:
(i)鉴定来自所述受试者的样品中的外来体和/或自来自所述受试者的样品纯化外来体;并
(ii)检测外来体相关5T4。
所述方法可以牵涉检测例如5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。
5T4阳性癌症可以是生殖泌尿道癌症,诸如前列腺或膀胱癌。
样品可以是例如尿液样品、血液样品、或自其可衍生的样品,诸如血清样品。尿外来体中5T4的检测具有尿液样品非侵入性可获得的优点。或者,样品可以来自肺的胸腔积液,或组织样品。
为了证实和/或量化结果,所述方法还可以牵涉检测下列一项或多项:
(i)在5T4外的癌症生物标志物;
(ii)外来体标志物;和/或
(iii)特定组织或细胞类型的标志物。
对于例如前列腺癌检测,所述方法可以牵涉检测一种或多种前列腺标志物,诸如PSA、PSCA和/或PSMA。
在第二方面,本发明提供了一种通过使用依照本发明的第一方面的检测方法来测定受试者中的给定癌症是否是5T4阳性癌症的方法,其中5T4的检出确认所述癌症是5T4阳性的。
在第三方面,本发明提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法,其包括下列步骤:
(i)通过依照本发明的第二方面的方法来测定所述癌症是否是5T4阳性的;并
(ii)对通过步骤(i)测试呈阳性的受试者施用基于5T4的治疗剂
在第四方面,本发明提供了一种用于测定给定受试者是否会适合于用基于5T4的治疗剂治疗的方法,其包括通过依照本发明的第一方面的方法来检测所述受试者中的5T4阳性癌症的步骤。
在第五方面,本发明提供了一种使用依照本发明的第一方面的检测方法来监测5T4阳性癌症进展的方法,其包括比较在多个时间点时自受试者采集的样品中的外来体相关5T4的水平的步骤,其中升高指明所述5T4阳性癌症的恶化,而降低指明改善。
本发明的第五方面的方法可以用于在治疗期间监测5T4阳性癌症的进展,其中在治疗期间的多个时间点时自受试者采集样品。
癌症治疗可以牵涉施用基于5T4识别或表达的治疗剂。
在第六方面,本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的试剂盒,其包括:
(i)外来体检测、收集和/或纯化系统;和
(ii)针对5T4的检测系统。
检测系统可以例如检测5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。检测系统还可以量化5T4的水平。
结合本发明,可以使用下列一种或多种方法来检测5T4:
(i)结合抗5T4抗体;
(ii)结合对由MHC分子呈递的5T4肽特异性的T细胞受体;
(iii)结合与编码5T4的核酸序列整个或部分的互补物显示高程度同一性的核酸序列;和
(iv)使用5T4特异性引物来扩增5T4核酸。
附图简述
图1:尿液衍生外来体的纯化
将健康供体尿液进行外来体纯化,并在每个步骤,保留10μl样品以进行电泳分析(4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶,银染色)(A),表明有效除去主要的非外来体蛋白质条带诸如为约80Kd的,并在最终的外来体产物中显著富集多种多样的蛋白质种类(A)。运行平行凝胶以进行免疫印迹分析,其使用如标示的针对典型外来体蛋白质的抗体进行(B)。比较蔗糖垫法与Pisitkun等的更简单的方法,其中将细胞培养基(C)或新鲜尿液(D)以17,000g进行离心,接着以200,000g沉淀。对于蛋白质差异,使外来体(来自蔗糖法)和200,000g沉淀物标准化,并通过Western印迹对2.5μg/孔分析如标示的标志物。
图2:量化健康供体和前列腺癌患者中的尿液衍生外来体
使用BCA蛋白质测定法来测量每份制备物中存在的外来体数量。在尿液样本体积方面校正数值,并以ng外来体/ml尿液表示。比较来自10名健康供体和在ADT4(4周ADT后)、ADT12(3个月的ADT后)、和RT20(和20份放射疗法后)时的10名经历标准疗法的PCa患者的制备物。工形线表示均值+SE。显示了使用Wilcoxon配对检验得到的*p<0.5。
图3:表征由LNCaP前列腺癌细胞系生成的外来体。
将如标示的前列腺癌细胞系(LNCaP和DU145)在培养物中作为阳性对照前列腺癌外来体的来源维持(用于随后的分析)。用如标示的一组抗体通过SDS-PAGE(5μg/孔)来分析全细胞溶胞物(CL)或外来体(Exo)。
图4:表征来自健康供体尿液的外来体
6名健康供体(表3中详述)提供了尿液样本,并将外来体纯化。用5μg尿液衍生外来体/孔,或用5μg LNCaP衍生外来体(Exo)或5μg LNCaP全细胞溶胞物(CL)进行Western印迹。用如标示的针对PSA、TSG101、5T4、CD9和GAPDH的抗体来探查印迹。
图5:表征来自PCa患者的外来体
用如标示的一组抗体将自8名PCa患者(在ADT4、ADT12或RT20时)分离的尿外来体(5μg/孔)进行Western印迹分析。在每块凝胶上包括LNCaP的全细胞溶胞物(CL)或外来体(Exo)(5μg/孔)作为阳性对照。
图6:患者的Western印迹数据的汇总
图7:使用Western印迹、流式细胞术和电子显微术来表征HT1376衍生外来体
使用如标示的一系列抗体通过Western印迹来比较细胞(CL)或外来体(Exo)溶胞物(5μg/孔)。这表明外来体中数种蛋白质的相对富集。一些标志物诸如gp96是外来体所没有的,这指明细胞碎片对制备物的污染可忽略(这代表3次实验)(A)。通过流式细胞术来分析与胶乳珠偶联的外来体,并且这揭示了四跨膜蛋白(tetraspanin)分子在外来体表面上的阳性表达。显示了中值荧光强度值(MFI)(代表大于5次实验)(B)。在与胶乳珠偶联前用增加量的FBS有意污染纯化的外来体揭示了CD9的信号强度降低(均值±SEM,n=6,**p<0.001,单因素ANOVA及Tukey氏后检验)(B线图)。将以70,000g自细胞条件化培养基沉淀的材料铺于线性蔗糖梯度(0.2至2.02M)上,并以210,000g超速离心18小时。通过折光测定法来分析所收集的级分以确定级分密度,此后使用针对作为外来体标志物的TSG101的抗体通过Western印迹来分析。TSG101以1.1和1.2g/ml之间的典型外来体密度漂浮(代表4次实验)(C)。典型外来体制备物的透射电子显微照片,其揭示了直径为30和100nm之间的异质小囊泡(D)。
图8:纳级LC/MS衍生的蛋白质鉴定针对来自ExoCarta和GeneGO的基因集的过度表示分析的汇总。
为了便于与Exocarta基因集比较,首先将我们的蛋白质列表转换成EntrezGene鉴定的基因列表,之后使用超几何分布来进行ORA。过滤结果以仅包括与基于MS的研究的比较,及与报告10种或更多种匹配基因的那些比较。这表明我们的MS数据多么好地与来自规定细胞类型的外来体蛋白质谱比较,其以在假检出率方面校正的对数(p值)显示(A)。对于鉴定的蛋白质列表,使用MetaCore进行的ORA分析利用SwissProt ID。为了清楚,我们报告了组标题疾病生物标志(B)、疾病(C)、生物学过程(D)和细胞区室(E)之每项内含有的前10种过度表示的基因。虚线标示p=0.05,因此这左侧的柱不是统计学显著的。
图9:通过Western印迹和流式细胞术分析验证一些经MS鉴定的蛋白质
通过Western印迹对通过标准蔗糖垫法纯化的HT1376外来体(5-20μg/孔)分析如标示的一系列经MS鉴定的蛋白质的表达(A)。通过在线性蔗糖梯度(0.2M至2.5M)上离心来将自HT1376细胞条件化培养基获得的70,000g沉淀物进行分级。收集15个总级分,并通过折光测定法来测量密度。此后,将每个级分的1/3与胶乳珠偶联,接着是对如标示的外来体表面表达的流式细胞术分析(B)。平行地,对于如标示的蛋白质,将每个级分剩余的2/3进行Western印迹(C)。数据揭示于公认的外来体密度范围(1.12-1.2g/ml)漂浮的蛋白质。(数据代表2次实验)。
图10:使用2DE和MS来分析HT1376衍生外来体
通过在pH 3-10非线性梯度上的2DE解析来自HT1376外来体的蛋白质提取物。通过银染色来显现蛋白质(A)。随机选择32个点,切出凝胶栓,并在胰蛋白酶消化后回收肽。这些中,对17个点获得成功的鉴定(在A中注释),并列出MS鉴定的详情(B)。来自数据集的代表性MS/MS分析显示于(C),肽来自整联蛋白α-6,点10。肽具有1191.9的前体质量,并加以注释以显示衍生的肽序列。
图11A和B:外来体表达表面5T4,其通过微量板测定法检测。
发明详述
5T4
本发明涉及一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法。
5T4是一种在癌瘤中广泛表达,但是在正常成体组织中具有高度限制性表达样式的72kDa跨膜糖蛋白(参见表1)。它表现为与结肠直肠和胃癌的转移强烈相关。人5T4的完整核酸序列是已知的(Myers等,1994J Biol Chem 169:9319-24)。
表1
5T4表达与许多癌症有关,所述癌症包括但不限于:间皮瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺、卵巢、肺、宫颈、结肠直肠、肝、胃、胰腺、膀胱、子宫内膜、脑和食管癌。
结合本发明,“5T4阳性”癌症指与5T4表达有关的癌症:5T4作为肿瘤相关抗原的癌症。
特别地,5T4的过表达与高转移潜力和预后较差的癌症有关,因此本发明的检测方法也可以作为预后指标使用。
外来体
外来体是在一些体液,诸如血清和尿液中找到的纳米大小(40-100mn)的小囊泡。外来体以细胞中的多泡体(MVB)的内部小囊泡起源。它们首先被描述为循环血细胞,诸如红血球和淋巴细胞的产物。在肾中,外来体通过MVB的外膜与顶端质膜的融合而释放入尿液中。
使用串联质谱术对尿外来体的蛋白质组学分析揭示了来自每种面向尿空间的细胞类型的膜蛋白。另外,外来体的腔含有来自其起源细胞的胞质蛋白质和mRNA,它们在外来体在MVB中形成时被带走。
外来体可以基于其外来体标志物诸如肿瘤易感性基因(TSG101)、水膜孔蛋白2(AQP2)、神经元特异性烯醇化酶(NES)、膜联蛋白V、足萼蛋白(PODXL)和CD9的表达来检测和/或纯化。
外来体分离
可以通过本领域中已知的方法诸如超速离心(Pisitkun等(2004)PNAS101:13368-13373)或超滤(Cheruvanky等(2007)Am.J.Physiol.Renal Physiol.292:F1657-F1661)来分离或纯化外来体。还已知可能优于(precede)离心的牵涉连续流电泳和层析规程的方法(Taylor和Gercel-Taylor(2005)Br J Cancer92:305-311)。错流超滤也可以作为外来体纯化方法的一部分使用(Lamparski等(2002)J Immunol.Methods 270:211-226)。
也有可能通过在不分离或纯化外来体的情况中鉴定外来体(并且如此检测外来体相关5T4)来实施本发明方法。例如,可以例如通过免疫亲和捕捉来将外来体捕获至微量板上,接着进行5T4检测。
也有可能例如通过使用能够检测外来体和5T4两者的双功能分子或使用针对外来体和/或5T4的抗体的二色免疫荧光来检测液相中的外来体相关5T4。
5T4检测方法
本发明的检测方法可以牵涉检测5T4肽、多肽、或编码此类多肽的核酸。
如本文中所使用的,术语“多肽”指其中单体为氨基酸而且经由肽键或二硫键连接在一起的聚合物。“多肽”指全长天然存在的氨基酸链或其片段,诸如多肽中在结合相互作用方面感兴趣的选定区。包含5T4片段的多肽可以长至少100、200、300或400个氨基酸。全长人5T4的长度是420个氨基酸。
如此,“肽”指作为全长5T4的一部分或片段的氨基酸序列,其可以长约8-约100个氨基酸。
肽可以是或者包含5T4的T细胞表位。
T细胞表位是一种自蛋白质抗原可衍生的短肽。抗原呈递细胞能使抗原内在化,并将其加工成能够结合MHC分子的短片段。肽结合MHC的特异性取决于肽与特定MHC分子的肽结合沟之间的特异性相互作用。
结合MHC I类分子(并由CD8+T细胞识别)的肽通常长6-15,例如8-12个氨基酸。肽的氨基端胺基团与肽沟一端的不变位点接触,而羧基端的羧酸根基团结合沟的另一端的不变位点。肽处于沿着沟延伸的构象,在主链原子与沿沟排列的保守氨基酸侧链之间有进一步接触。通过肽主链中,经常在脯氨酸或甘氨酸残基处的扭结来调节肽长度变化。
WO 03/068816描述了5T4的多种MHC I类表位,包括PLADLSPFA、LHLEDNALKV、LEDNALKVLH、HLEDNALKV、LEDNELKVL和LADNALKV。
结合MHC II类分子的肽通常长至少10个氨基酸,例如10-50、10-30或15-25个氨基酸。这些肽处于沿着MHC II肽结合沟延伸的构象,所述MHC II肽结合沟在两个末端均开放。肽主要通过主链原子与沿肽结合沟排列的保守残基的接触来保持到位。
WO 03/068815描述了5T4的多种MHC II类表位,包括YRYEINADPRLTNLSSNSSDV和QTSYVFLGIVLALIGAIFLL。WO2006/120473和WO2008/059252描述了5T4的其它肽表位。
人5T4如由Myers等(如上文)所表征,其序列在GenBank中以编号Z29083出现。对于兽医应用,还考虑相关同系物。犬和猫5T4的序列记载于WO01/36486和WO 02/38612。
使用本发明的方法可检测的5T4肽可以包含抗体结合位点。Myers等(如上文)描述了一种结合5T4核心蛋白的小鼠多克隆抗5T4抗血清。
可以使用本领域中已知的任何方法来检测5T4多肽或肽,所述方法包括ELISA、Western印迹、FACS分析、免疫沉淀、原位杂交和质谱术。
抗5T4抗体是本领域中已知的。Myers等((1994)J.Biol.Chem.269:9319-9324)描述了一种小鼠多克隆抗5T4抗血清。新近,描述了抗5T4抗体H8(Boghaert等(2008)Int.J.Oncol.32:221-234)。
结合5T4检测的术语“抗体”包括功能性抗体片段,诸如Fab、F(ab)2、Fv、scFv和域抗体(dAb)及其融合物和模拟物,诸如Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、和Versabody。
WO 03/020763和WO 99/18129概述了会适合于5T4检测的可溶性T细胞受体形式的设计和生成。
如本文中所使用的,术语“核酸”指能够编码5T4肽或多肽,或者与能够编码5T4肽或多肽的序列互补的核苷酸序列,其可以是DNA或RNA、单链或双链。
先前描述的Northem分析已经表明了一种2.5kb mRNA与5T4表达有关(Myers等(如上文))。
编码5T4多肽的核酸序列可以是或包含能够编码全长蛋白质的1260个碱基部分。编码5T4片段的核酸序列可以长300-1200个碱基,例如500-1000个碱基。编码5T4肽的核酸序列可以长24-500个碱基,例如50-300个碱基。
先前描述了用于扩增5T4核苷酸序列的引物(Myers等(1994)如上文)。
可以使用与5T4核苷酸序列的互补物显示高程度同源性的探针来检测该序列。合适的探针可以是具有包含10-50,例如15-30和或至少约20个连续碱基的核苷酸序列的单链DNA或RNA,所述连续碱基与5T4编码序列的相等或更大数目的连续碱基相同(或互补)。作为探针选择的核酸序列应当具有足够的长度且足够明确,使得假阳性结果最小化。为了使假阳性最小化,探针可以基于很大程度上对于5T4而言独特的序列部分,即其与任何其它序列不显示高程度同一性。
可以标记核酸探针以杂交后即行进行检测。例如,可以将探针放射性标记。标记DNA片段的优选方法是通过在随机引发反应中用DNA聚合酶的Klenow片段掺入α32P dATP,其是本领域中公知的。通常用经γ32P标记的ATP和多核苷酸激酶对寡核苷酸进行末端标记。然而,也可以使用其它方法(例如非放射性)来标记片段或寡核苷酸,包括例如酶标记、用合适荧光团的荧光标记和生物素化。
可以使用本领域中已知的任何方法来检测5T4核酸,包括Northern印迹、聚合酶链式反应(PCR)和定量PCR。WO 02/18645描述了用于检测5T4RNA的多种方法,包括通过逆转录酶PCR进行的体外扩增、连接酶链式反应、DNA信号扩增、可扩增RNA报告物、Q-bate复制、基于转录的扩增、基于核酸序列的等温扩增、自维持序列复制测定法、飞反(boomerand)DNA扩增、链置换活化、循环探针技术;接着通过诸如凝胶电泳、毛细管电泳、常规的酶联免疫吸附测定法(ELISA)、使用特异性标记探针的核酸杂交、Southern印迹分析、Northern印迹分析、电化学发光、激光诱导的荧光、反向点印迹检测和高效液相层析等方法来检测。
使用Western印迹,尚未在健康个体中检测出外来体5T4表达。其它检测方法可以能够检测出痕量的5T4。外来体5T4的表达在患有5T4相关癌症的个体中比在健康个体中可以大10、50、100、500或1000倍。
本发明的方法可以牵涉与自健康个体采集的等同样品比较受试者中的外来体5T4的步骤。这可以牵涉相对于所述样品中的外来体数目标准化获得的数值。
在5T4外,检测方法可以牵涉检测一种或多种其它生物标志物。
这些别的生物标志物可以是例如癌症(或其特定类型)、外来体、或特定组织或细胞类型特征性的。
基于5T4表达或识别的治疗剂
已经描述了多种基于5T4识别的治疗剂,诸如刺孢霉素(calicheamycin)与抗5T4抗体的偶联物(Boghaert等(2008)如上文)和识别5T4的Fab与超抗原葡萄球菌肠毒素A的融合物(Shaw等(2007)Br.J.Cancer 26:567-574)的使用。
也有可能通过在受试者中诱导和/或提高5T4表达来刺激在癌症疗法中有用的免疫应答。
受试者
在本发明的第一方面的方法中接受样品采集的受试者可以是哺乳动物受试者,诸如人。
受试者可以是非妊娠哺乳动物。在妊娠期间,可以在母系循环中找到胎盘外来体,其可以表达5T4(Taylor等(2006)J.Immunol.176:1534-1542)。为了避免肿瘤检测方法的复杂化,因此对于妊娠哺乳动物,可以有必要自检测系统除去胎盘外来体。此类除去可以是物理的,或概念的,由此自检测方法扣除胚胎外来体,例如通过使用胎盘标志物的负选择或使用与另一种组织(诸如具有与基于5T4的癌症有关的潜力的组织)有关的标志物的正选择来实现。
试剂盒
本发明的第六方面提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的试剂盒,其包括:
(i)外来体检测、收集和/或纯化系统;和
(ii)针对5T4的检测系统。
外来体检测、收集和/或纯化系统可以适合于与上文所提及的已知的超速离心或超滤系统一起使用。或者,外来体检测系统可以是适合于外来体捕捉的基片,诸如用针对外来体标志物的抗体包被的微量滴定板。
检测系统可以适合于通过上文所提及的任一种方法来检测5T4肽、多肽或核酸。检测系统可以包含抗5T4抗体。
试剂盒还可以包含关于使用外来体检测、收集或纯化系统和/或5T4检测系统的指令。
本发明现在会以实施例的形式进一步描述,所述实施例意图用来帮助本领域普通技术人员实施本发明,而并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:尿外来体的纯化
使用设计用于自细胞培养上清液进行外来体纯化的标准化方法,并应用于作为外来体来源的新鲜尿液。凭借此方法,将外来体基于其浮力特征来分离(Raposo等(1996)J.Exp.Med.183:1161-1172)。在整个纯化过程中在多个步骤对尿液蛋白质含量的分析揭示所述方法在消除主要的非外来体污染物(图1a)(诸如80Kd的条带)同时显著浓缩携带整个分子量谱上的独特蛋白质全集的小囊泡(图1a)方面是有效的。在平行凝胶上实施免疫印迹分析揭示仅在最终的外来体产物中检测出典型的外来体蛋白质(图1b)。
还直接比较此方法与Pisitkun等((2004)PNAS 101:13369-13373)的方法,其使用细胞培养上清液(图1c)或健康供体尿液(图1d)作为来源材料进行。此后一种方法牵涉以17,000g使碎片沉淀,接着是上清液的200,000g旋转以沉淀外来体。我们的蔗糖法产生更富集外来体的沉淀物,其根据外来体标志物诸如CD9、TSG101和LAMP-1的强条带强度是明显的。重要的是,蔗糖法导致肿瘤相关抗原,在此情况中为5T4(图1c)的良好富集,指明与沉淀的沉降物相比在对外来体的分析方面有重要的优点。虽然在比较制备物中检测出许多标志物,但是这些处于较低水平。更强烈的钙联接蛋白(一种非外来体表达标志物)条带是一种在使用比较方法时较多非外来体污染物的直接指示物(图1c)。使用蔗糖垫法的相似优点是显而易见的,其使用新鲜尿液作为来源材料进行(图1d),显示了较高水平的外来体表达蛋白质,和降低的TammHorfsall蛋白(THP)污染。数据支持用于自新鲜尿液样本富集外来体的此方法;而且赋予与先前发表的尿液-外来体方案相比的一些优点。
实施例2:PCa治疗期间尿液-外来体数量变化
测量每份制备物中存在的外来体数量,对其校正起始尿液体积,并在图2中显示了健康供体与患者组间比较的数值。与健康男性相比,前列腺癌患者平均具有高1.2倍的尿外来体水平(在ADT4时)(图2A)。健康供体(366.8±92.56,n=10,均值±SE)和患者(443.2±109.7,n=10,ADT4)两者在外来体含量方面均有广泛的变化,因此此差异没有达到显著性。还在3个月的雄激素剥夺疗法(ADT12)(224.9±82.7,n=10)后,及在20份放射疗法(RT20)(499.6±225.6,n=9)后测量外来体水平。12周激素治疗后平均外来体水平降低2倍,其中10名患者中的8名显示尿外来体数量的降低。就放射治疗而言,与ADT4或ADT12相比,没有显著性差异,因为9名患者中的3名表明外来体水平的进一步降低,同时9名中的6名具有正在升高的尿外来体水平。使用血清PSA水平作为前列腺癌后果的替代标志物,指明在9/10名患者中,ADT和RT的标准疗法在肿瘤体积缩小方面是成功的。
总之,不可能表明局部晚期PCa与尿液中存在的外来体数量的关联,而且血清PSA与尿外来体水平之间没有关联。然而,从目前的数据集看,有一些提示,即在ADT12时,存在的外来体量有降低。
实施例3:前列腺癌细胞系生成在前列腺和癌症相关抗原方面呈阳性的典型外来体
将2种充分表征的前列腺癌细胞系在培养物中作为PCa外来体的来源维持,并检查典型的外来体标志物(例如四跨膜蛋白CD9)和一些已知的前列腺标志物(PSA和PSMA)的表达。通过免疫印迹将LNCaP细胞(全细胞溶胞物)与LNCaP外来体直接比较,揭示PSA和PSMA的阳性外来体表达。LNCaP外来体还有清楚的5T4阳性外来体表达。与亲本细胞相比,外来体中特别富集PSA和5T4两者(图3A)。DU145细胞系(其不表达PSA或PSMA)充当对照,表明特异性染色。GAPDH的染色显示各孔的相等加载。得出结论,自PCa细胞分离的外来体表达来自其它细胞来源的外来体的典型分子及前列腺标志物和肿瘤相关抗原。因此,认为此简单的免疫印迹组适合于在随后的研究中分析尿外来体。
实施例4:健康供体尿外来体的表型
自健康供体(HD)实施相似的尿外来体分析,并与LNCaP衍生外来体比较这些分子的表达水平。虽然与LNCaP标准品相比处于低水平,但是通过Western印迹在大多数HD样本中检测出诸如TSG101和CD9等标志物。不管供体的年龄如何,前列腺标志物(PSA和PSMA)不在任何健康供体样本中表达,这指明健康供体尿液中即使有也很少的外来体源自前列腺。在任何HD样本中都没有找到肿瘤抗原5T4(图4)。
总之,通过此方法检查自不同供体获得的尿外来体揭示样品间的外来体质量变化。在外来体质量为中等/良好(即与LNCaP外来体相当)的情况中,可以确认健康供体尿外来体在PSA、PSMA和5T4方面呈阴性。
实施例5:PCa患者的尿外来体的表型,并评估随治疗的变化
以相似的方式通过Western印迹检查PCa患者衍生的外来体。显示了来自8名个体患者的数据(图5)。总体上,样品系列间有条带强度(具有多种标志物)的变化性,其中与LNCaP外来体相比在大多数情况中为弱染色。虽然弱,但是24份样品中的20份中有外来体标志物(诸如CD9)呈阳性的证据。有患者分组间的变化,和来自个体的样品系列(ADT4、ADT12和RT20)内的变化。因为非常注意加载每孔5μg样品,所以我们认为结果很有可能反映样品的可变外来体含量,而非样品加载的技术问题。
先前不知道前列腺能将任何外来体贡献给总尿液外来体集合。在健康供体中,在前列腺标志物PSA或PSMA方面没有阳性染色,而且肿瘤标志物5T4也呈阴性。在患者分组中,PSA在8/20份样本中是明显的,而PSMA存在于9/20份样本中(其中20/24份样本在一种或多种外来体标志物方面呈阳性;即可评估为外来体阳性)。5T4染色在14/20份样品中显示阳性。共同地,这第一次表明,尿外来体表达前列腺和癌症相关标志物。
一名特殊的患者(p8)在三个时间点之每个表明相当的外来体存在,和响应疗法的外来体PSA的清楚的丧失,在ADT4时显示强的PSA条带,其随治疗而减弱,在RT20时变得检测不到。然而,出乎意料地,即使在20份放射疗法后,5T4仍然强烈表达,提示了这可以是一种用于评估对雄激素剥夺或放射疗法的效果不应的残留恶性细胞的存在的候选标志物。图6中汇总了数据。
用于实施例1至5的材料和方法
前列腺癌患者和健康供体
募集10名PCa患者(其参与局部II期临床试验)及10名健康男性志愿者。通过活组织检查确认患者在PCa方面呈阳性,并在表2中汇总了肿瘤阶段、Gleason得分、血清PSA和年龄。患者接受3-6个月新辅助雄激素剥夺疗法(ADT),之后进行根治性放射疗法(RT),其由以20份向前列腺投递55Gy和以20份向骨盆结投递44Gy的单一阶段组成。依照临床需要,患者继续进行辅助ADT。试验得到西南威尔士伦理委员会(South East Wales Ethics Committee)批准,而且自参与研究的患者和志愿者获得知情同意。
表3中给出了自健康供体收集的尿液样本的详情。
表2:参与此研究的患者的详情
n/d未测定。
表3:自健康供体收集的尿液样本的详情
尿液样品收集
将多至200ml体积的尿液样本收集入无菌塑料容器(Millipore)中,并在30分钟内带到实验室进行处理。在上午的中期至后期收集样品,并且这些不是第一次晨尿。对尿液测试血液、蛋白质、葡萄糖和酮,并测量pH(通过Combur5 浸渍片(Roche)进行),表4中呈现了结果。在三个时间点时收集PCa患者尿液:“ADT4”(启动ADT后0-4周)、“ADT12”(3个月的ADT后)和“RT20”(20份放射疗法后)。在治疗期间的时间间隔(ADT4、ADT12和放射疗法后4周时),测量血清PSA水平。
表4:自PCa患者收集的尿液样本的详情
-未记录,或样品不可得
外来体纯化
将新鲜尿液进行连续离心,除去细胞(300g,10分钟),除去非细胞碎片(例如脱落物、晶体、膜碎片等)(2000g,15分钟,重复直至没有可见的沉淀物)。然后,将上清液铺在30%蔗糖/D2O垫上面,并以100,000g进行超速离心达2小时(SW32转子,Optima LE80K超速离心机,Beckman Coulter)。将垫收集,在至少7x体积PBS中稀释,并使用70Ti转子(Beckman Coulter)通过以100,000g持续2小时的再次超速离心步骤来使外来体沉淀。将外来体沉淀物在100-150ul PBS中重悬浮,并于-80℃冷冻。通过微量BCA蛋白质测定法(Pierce/Thermo Scientific)来测定每份沉淀物中存在的外来体量。
细胞培养
将LNCaP和DU145前列腺癌细胞系(来自ATCC)接种入生物反应器烧瓶(来自Integra)中,并以高密度培养物维持,用于外来体生产。生物反应器烧瓶每7天补料,其中保留条件化培养基以进行外来体纯化,如上文的。
电泳和免疫印迹
通过免疫印迹来比较细胞溶胞物与外来体。简言之,通过添加30%体积的6M尿素、50mM Tris-HCl、2%SDS和0.002%w/v溴酚蓝来溶解相等数量的蛋白质(每孔5μg)。将样品电泳通过10%聚丙烯酰胺凝胶,并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,其在PBS中的3%w/v脱脂奶、0.05%v/v Tween-20(PBS-T)中封闭过夜。将一抗温育1小时,在PBS-T中5次清洗后,添加来自Santa Cruz的山羊抗小鼠Ig-HRP偶联物(为1∶35,000稀释)达30分钟。在PBS-T中5次清洗后,使用ECL+系统(Amersham/GE healthcare)来检测条带。单克隆一抗包括小鼠抗人PSA(即一份来自Atilla Turkes博士,Cardiff and Vale NHSTrust,Cardiff的赠品)、抗TSG101、抗LAMP-1、抗HSP90、抗钙联接蛋白、抗CD81和抗PSMA(来自Santa Cruz Biotechnology)、抗GAPDH(来自BioChain Institute,Inc)、抗CD9(来自R&D Systems)。抗5T4是一份来自RHarrop博士(Oxford BioMedica UK Ltd)的赠品。山羊多克隆抗Tamm Horsfall蛋白(THP)来自Santa Cruz,并使用抗山羊HRP(Dako)来检测条带。使用Restore PlusTM Western印迹剥离缓冲液(Pierce/Thermo Scientific)来将膜剥离,封闭过夜,并再探查。
检查外来体膜完整性
为了调查尿液是否破坏外来体膜,将自B细胞系分离的外来体固定化至经抗MHC II类包被的Dynal珠(Dynal/Invitrogen)上。将外来体-珠复合物于37℃在25mM钙黄绿素-AM中温育过夜。将加载有钙黄绿素的外来体-珠复合物于室温暴露于多种盐溶液或新鲜尿液达1小时。运行Cell Quest软件(BD)通过流式细胞术(FACScan,BD)来分析荧光。将钙黄绿素荧光与平行管中的经抗I类(RPE)染色的外来体-珠的荧光比较;即测量外来体是否仍附着于珠表面。结果表示为钙黄绿素:I类荧光的比。
检查尿液对外来体的蛋白水解破坏
在存在或没有蛋白酶抑制剂(包括EDTA、胃酶抑素A、亮肽素和PMSF)的情况中用新鲜尿液处理自LNCaP细胞纯化的外来体。2小时或18小时后,通过Western印迹对样品检查CD9、PSA和TSG101表达。作为蛋白水解的阳性对照,用胰蛋白酶(Cambrex)处理外来体。
实施例6:对膀胱癌外来体的蛋白质组学分析
6.1HT1376外来体的表征
培养的HT1376细胞(一种典型的且充分表征的移行细胞癌(TCC)系)是供此研究用的外来体来源。本发明人使用基于先前所限定的外来体浮选特征(Raposo等(1996)如上文)来分开外来体与非外来体材料的先前开发的方法,其利用差速超速离心和30%蔗糖/D2O垫上的浮选来进行,以自细胞条件化培养基分离外来体(Lamparski等(2002)I Immunol Methods 270,211-226)及Andre(2002)Lancet 360,295-305)。将以此方式纯化的外来体进行数种形式的分析以评估样品质量/纯度,之后使用蛋白质组学工作流来分析。首先,实施Western印迹以比较全细胞溶胞物与外来体,以检查预期的外来体标志物(依照描述其它外来体类型的发表报告)(Théry等(2006)Curr Protoc CellBiol,UNIT 3.22)的表达,并与作为整体的亲本细胞相比,评估这些标志物的相对表达。如预期的,与细胞溶胞物相比,外来体制备物中强烈富集多泡体标志物TSG101(图7A)。
另外,类似地富集许多其它分子,包括MHC I类、四跨膜蛋白CD9、CD81、溶酶体蛋白LAMP-1、和在某种程度上为GAPDH。此类特征是由各种各样的细胞类型生成的外来体典型的(Théry等(2006)如上文)。热休克蛋白hsp90不是外来体富集的,并且这是不在细胞应激条件下的细胞典型的(Mitchell等(2008)J.Immunol Methods 335,98-105,Clayton等(2005)J Cell Sci 118.3631-3638及Dai等(2005)Clin Cancer Res 11,7554-7563)。细胞角蛋白18的染色揭示细胞溶胞物中的强条带,但是在外来体中很少的条带或检测不到的条带。类似地,内质网驻留的gp96容易在细胞溶胞物中而非在外来体中检出,这指明外来体制备物中存在即使有也很少的污染性细胞碎片。还在与胶乳珠偶联后通过流式细胞术来检查外来体表面的表型(图7B)。实施此流式细胞术以表明外来体表面上正确取向的蛋白质的表达。四跨膜蛋白是其选择标志物,因为其表达是来自多种细胞类型的外来体的一项得到良好证明的特征。分析显示对于此癌细胞系和其它癌细胞系(未公开的观察结果)而言典型的次序CD9>CD81>CD63的四跨膜蛋白的非常强的表达(图7B)。此外,此测定法还能突出显示制备物中的显著的污染性蛋白质的存在,其中污染物而非外来体会在偶联反应期间结合珠表面,随后产生外来体标志物(像CD9)的低荧光信号(图7B线图)。用FBS(我们的系统中的最有可能的污染物来源)有意地污染纯化的外来体揭示添加0.01%FBS足以将CD9特异性染色降低30%左右。认为染色低于5000个中值荧光单位的外来体制备物(对于CD9染色)是低质量,并且不被进一步利用。与典型的外来体分子谱的表达一样,还调查另一项重要的外来体特征;即其密度特征。将以70,000xg沉淀的HT1376外来体铺于线性蔗糖梯度上,并进行超速离心达18小时。收集15份级分,并且通过Western印迹进行的分析揭示漂浮于1.1-1.19g/ml左右的密度范围的TSG101的存在(图7C)。此类分析表明HT1376细胞生成具有与对来自其它细胞类型的外来体所描述的密度(Raposo等(1996)如上文)相似的典型密度的外来体。还使用与胶乳微珠测定法(上述)结合的此方法作为用于验证此手稿后面部分中的MS蛋白质鉴定的工具。还实施制备物的电子显微术(图7D),揭示在与其作为外来体的定义一致的大小范围(30-100nm)内的纳米小囊泡结构。总之,数据指明HT1376膀胱癌细胞生成与其它细胞类型的外来体具有相似分子和生物物理特征的外来体,而且我们的来自此来源的外来体制备物具有高质量,并且具有低污染性细胞碎片或没有污染性细胞碎片。
8.2通过纳级LC-MALDI TOF/TOF鉴定外来体蛋白质
为了获得外来体衍生的胰蛋白酶消化肽来进行纳级LC,本发明人修改了涵盖1%(w/v)SDS提取以溶解膜蛋白的标准方案型式(Tan等(2008)Proteomics 8,3924-3932)。此修改方案牵涉通过超速离心来沉淀先前制备的HT1376外来体,并将此沉淀物在含有1%(w/v)SDS和20mM DTT的TEAB缓冲液中煮沸。添加本文包含的DTT以提高增溶作用。这之后还包括再次超速离心步骤(以118,000g旋转45分钟)以除去任何剩余的不溶性材料和/或聚集物。将上清液进行基于溶剂的沉淀法以除去SDS、盐和脂质(2D清除,GEHealthcare)。通过蛋白质测定法来量化外来体蛋白质的所得沉淀物,之后进行胰蛋白酶消化和纳级LC。此方法导致353种蛋白质(2种肽或更多种)的鉴定。表6中列出了鉴定结果的全组,并且注意到仅仅报告了高置信度蛋白质鉴定结果(两种或更多种具有高质量MS/MS数据的肽)。由于这些选择标准,我们的FDR是0%。与许多其它蛋白质组学实验室一样,单个肽尚不报告鉴定结果,虽然不可避免地,这些中的一些分配会是有效的。探索纳级LC/MS鉴定结果揭示与外来体生物合成一致的数种蛋白质。例如,存在泛素依赖性复合物ESCRT(转运需要的内体分选复合物)的成员,包括空泡蛋白分选相关蛋白28同系物(vps-28)和空泡蛋白分选相关蛋白4B(vps-4B)、泛素样修饰基因激活酶和泛素。这些鉴定结果提示所分析样品的多泡体起源。牵涉膜运输和融合过程的蛋白质也是明显的(网格蛋白重链1、Rab-11B、Rab-5A、Rab-6a、Rab-7a、Rab GDP解离抑制物β、膜联蛋白A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、膜联蛋白A8样蛋白和膜联蛋白A11)。还存在内体/溶酶体的标志物(含EH域蛋白1和2、溶酶体膜蛋白2、溶酶体相关膜蛋白-2、三肽基肽酶1、组织蛋白酶-D、Sequestosome-1),而且鉴定出具有蛋白伴侣功能的数种蛋白质(hsp70、hsc70、hsp90、应激诱导的磷蛋白1、T复合物蛋白1、内质蛋白)。还预期在外来体腔内找到胞质溶胶的成分,即多泡体形成期间膜出芽过程的天然后果,而且本文还找到多种多样的胞质酶(甘油醛-3-磷酸脱氢酶、胞质溶胶氨肽酶、胞质乙酰辅酶A乙酰基转移酶、烟酸磷酸核糖基转移酶)和细胞骨架成分(肌动蛋白、α-辅肌动蛋白-4、细胞角蛋白、埃兹蛋白、微管蛋白、肌球蛋白)。多种多样的跨膜蛋白也是丰富的(包括多种整联蛋白(β1、β4、α3、α6、αv)、MHC分子、CD9、EGF受体、MUCIN-1、CD44、粘结蛋白聚糖-1)和多种膜转运蛋白(溶质载体家族2和3、4F2细胞表面抗原重链、胆碱转运蛋白样蛋白、钠/钾-14转运ATP酶亚基β-3)。因此,本文鉴定的蛋白质组与对外来体期望的蛋白质组广泛一致,这与由调查来自其它细胞或生理学来源的外来体的其它研究人员突出显示的蛋白质组学鉴定结果相当(图8A)(Simpson等(2009)Expert Rev Proteomics 6,267-283)。
8.3Exocarta和基因本体论分析
为了帮助解读整个蛋白质鉴定组,对我们的MS数据进行简要的生物信息学分析,首先比较鉴定结果与Exocarta数据库(外来体的先前蛋白质组学研究的全集),其次使用GeneGO Metacore(第5.4版)鉴定数据中的重要生物学主题。Exocarta数据库整理了自外来体研究出版物提取的EntrezGene ID列表。应用使用超几何分布的过度表示分析(ORA)以探索是否有比可偶然期望的更多的与Exocarta基因集交叠的基因。本发明人将比较限于利用基于MS的蛋白质组学方法的研究,及那些具有至少10个匹配(Wubbolts等(2003)JBiol Chem 278,10963-10972)鉴定结果的,而且FDR修正结果以作为多重检验的对照。包括发现的概要图(图8A)。结果指明此数据集为与外来体的其它研究一致。然而,重要的是,在比较我们的数据与自结肠直肠癌细胞分离的外来体时看到非常显著的数据匹配。因此,与癌瘤相关的蛋白质必定在目前的数据集中表现较多;其含有能够区别新生物与非新生物上皮的蛋白质鉴定结果。还使用基因本体论和GeneGO Metacore内的专有安排基因集两者来实施相似的无偏过度代表分析,其中分别在四种种类,即疾病生物标志物、全身疾病、生物学过程和细胞区室下进行查询。对于疾病生物标志物,我们的数据指明最显著的关联是与膀胱癌;因此支持如下的前提,即外来体分析有可能是一种对于疾病特异性生物标志物鉴定有用的工具。其它生物标志物关联包括结肠和乳腺癌(图8B)。相似地,检查全身疾病关联的查询揭示与胃肠道癌症、转移癌、呼吸道疾病(包括肺癌)和癌瘤有关的特征(图8C)。虽然在前40个显著关联中存在与生殖泌尿道(包括膀胱新生物)的显著关系,但是令人惊讶的是,没有看到在前10个(显示的)内表现的泌尿道相关疾病。因此,此ORA分析揭示HT1376外来体表达一般与新生物疾病,而且特别地与癌瘤强烈相关的蛋白质(图8B和图8C)。检查与此蛋白质组有关的生物学过程揭示与控制细胞骨架、细胞间粘附、基质粘附过程、和蛋白质折叠相关过程的显著关联(图8D)。就细胞区室而言,蛋白质组与胞质内的膜性小囊泡、胞质和细胞骨架强烈相关。然而,顶部关联规定黑素体和色素颗粒区室(图8E)。细胞核、内质网和线粒体不表现为显著相关的区室。总之,本文呈现的基于统计学的无偏分析表明与来自其它来源的外来体相似的膀胱癌外来体蛋白质组的方面,但是此外,强调特别牵涉癌瘤的蛋白质组。
8.4使用2DE来验证纳级LC方法
本发明人为了选择用于MS鉴定的随机点而实施2DE,而且以便确认这些蛋白质在主鉴定表(表6)中的缺失/存在。虽然使用100μg左右的纯化的外来体来尝试此类凝胶,但是点挑选物含有太少的材料以致不能产生确信的蛋白质鉴定,其中小于10%的尝试产生成功的鉴定。然而,使用每块凝胶500μg左右的外来体来放大此方法产生大于53%的鉴定命中率。通过MS分析成功鉴定出中间染色强度(银染色)的17个点。这些包括整联蛋白α3和α6、凝溶胶蛋白、胞质酶LDH和GAPDH、细胞骨架蛋白肌动蛋白和细胞角蛋白、埃兹蛋白等。还通过纳级LC法将来自此基于凝胶的方法的21种鉴定结果鉴定出19种,表明这些用于解析外来体蛋白质/肽的不同方法之间卓越的一致性(90%)(图10中汇总了数据)。
8.5所鉴定蛋白质的验证:反常的MHC I类鉴定结果
如同任何此类蛋白质组数据集一样,重要的是,对列表手工评估任何出乎意料的或不可解释的MS鉴定结果,并怀疑数据中发现的任何反常的有效性。在目前的分析中,纳级LC/MS数据含有16种HLA分子的多个鉴定结果,其通过了我们的质量标准(期望值小于0.05,和基于超过一个肽的ID)。然而,这些鉴定结果在生理学上是不可能的。这些包括5种HLA-B等位基因和5种HLA-C等位基因(表5)。这点的解释可以包括来源细胞系被来自不同供体的其它细胞污染、研究人员对样本的疏忽污染、或与MASCOT如何基于自MS产生的肽序列指派HLA单元型命名有关的问题。为了解决这些可能性,采用临床诊断服务(Welsh Blood Service,Llantrisant,Wales,UK)来为研究人员和HT1376细胞系测定单元型。研究人员没有与MS表中的HLA等位基因对应的HLA等位基因,同时HT1376测定的单元型为HLA-A*24;B*15(62);Cw*03(9),因此确认是均质细胞系。这引导我们更为详细地检查所获得的肽序列,并评估这些如何通过MASCOT归入给定的HLA命名(表5)。显而易见的是,已经将数种肽序列归入多种HLA类型。例如,将序列FDSDAASPR指派至HLA-B15、B52、B54、B59及HLA-C01、C12、C17和C03。然而,比较而言,有仅以单一指派出现的一些肽。将这些独特的序列归入HLA-A24(APWIEQEGPEYWDEETGK、AYLEGTCVDGLR和WEAAHVAEQQR)、HLA-C03(GEPHFIAVGYVDDTQFVR)和HLA-G(APWVEQEGPEYWEEETR、FIAMGYVDDTQFVR和THVTHHPVFDYEATLR)。虽然在鉴定的HLA-B亚型中,HLA-B15分配最大数目的肽,但是对于任何HLA-B等位基因而言没有独特的肽。总之,推荐对指派为MHC I类鉴定结果的肽进行手工分析以澄清源自此类MASCOT结果的潜在混淆。
8.6所鉴定蛋白质的外来体表达的验证
通过其它技术来鉴定样品中的蛋白质存在以确定一些经MS鉴定的蛋白质的有效性也是重要的。凭借多达353种蛋白质的列表,不可能大批进行这点,因此本发明人将此类验证限于一组可具有生物学兴趣的蛋白质。实施一系列的Western印迹板,分析每孔多达20μg HT1376外来体,以确定一些经MS鉴定的蛋白质在我们的外来体制备物中是否可检出。本发明人在作为我们选择的多泡体(因此为外来体)标志物的TSG101方面染色,所述TSG101是一种通过MS仅根据单一肽序列偶然检出,并且因此按此基础自我们的数据排除的蛋白质。通过MS在样品中检测出溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP2),即一种预期存在于外来体中的分子,并在本文通过Western印迹确认为强阳性(图8A)。在MS鉴定结果中的是许多细胞角蛋白鉴定结果(I型细胞骨架角蛋白1、7、13、14、16、17、18、19)。虽然在其它外来体蛋白质组学研究中找到,将此类细胞骨架成分加载入外来体中是一个尚未特别突出显示为外来体的生物学特征的方面。本发明人已经确认制备物中的细胞角蛋白17和细胞角蛋白18的表达,揭示外来体细胞角蛋白17的丰富表达。然而,细胞角蛋白18仅在每孔20μg外来体的情况中可检测,提示外来体真正确实表达多种细胞骨架成分,而且纳级LC/MS方法灵敏得足以检测出难以通过传统的Western印迹法揭示的分子诸如CK18。由于围绕MHC鉴定结果的反常问题,重要的是,测定HLA-G是否实际上由HT1376外来体表达,因为这不包括在HT1376细胞的PCR单元型分析中。本文通过Western印迹明确地确认HLA-G呈阳性。确认在癌症生物学的各个不同方面具有已证明的关联的其它膜相关(半乳凝素-3、Basigin和CD73)或可溶性(hnRNPK、β-联蛋白)分子由HT1376外来体阳性表达。虽然本文所使用的标准外来体纯化方法是有力的,但是仍有可能的是,一些非外来体污染性物质存在于制备物中,而且这些中的一些MS鉴定结果不是真正地外来体表达蛋白。为了尝试并解决此问题,自HT1376细胞条件化培养基实施线性蔗糖梯度制备,以测定所鉴定蛋白质在外来体密度处漂浮的性能。将15份所收集级分之每份分开,1/3用于通过(经外来体包被的珠的)流式细胞术进行分析,而2/3用于Western印迹。前一种方法会揭示外来体表面上的候选蛋白质的可能的表达,而溶解外来体以进行Western印迹会让表面和腔内的成分得到揭示。在流式细胞术测定法中,通过在四跨膜蛋白CD9和CD81方面及在MHC I类(已知其在HT1376外来体的表面上表达)方面的强染色来鉴定含有外来体的级分,揭示于1.12g/ml密度的清楚的(和主要的)峰(图9B),所述密度在期望的外来体密度内(图7C)。因此,含有大多数外来体的此级分还揭示在经MS鉴定的蛋白质β1和α6整联蛋白、CD36、CD44、CD73、CD10、MUC1、滋养层糖蛋白(5T4)和Basigin方面的阳性表面染色。还用钙联接蛋白特异性抗体对相同级分染色,揭示主要在比含有外来体的级分大的密度的低水平表达,突出显示在所测试的其它标志物方面的阳性染色的特异性,而且显示含有外来体的级分中的此蛋白质的缺乏,如预期的(图8B)。为了在Western印迹板中揭示相关级分,本发明人在TSG101方面染色,这突出显示1.12-1.2g/ml的密度为含有外来体的。在高密度级分(大于1.2g/ml)上有一些阳性染色,但是这相对较弱,而且可能是由于外来体或蛋白质聚集体。蛋白质5T4、CD44、Basigin、半乳凝素-3和β-联蛋白均共定位于相同密度范围,这与其外来体表达一致。数据显示此研究中实现的MS鉴定结果由HT1376外来体表达,而且已经将膜相关分子(其经常难以溶解并通过MS方法鉴定)成功鉴定并验证为位于外来体膜。
总之,本发明人已经使用高纯度外来体制备物、严格的样本质量控制、严格的MS标准和实质验证来实现膀胱癌细胞衍生的外来体的第一次高质量蛋白质组描述。最终可以使用此系统集合的信息来用基于尿外来体的完全非侵入性技术替换目前在诊断和监测此疾病中利用的高度侵入性规程。
用于实施例6的材料和方法
细胞培养:HT1376是一种源自膀胱原发性移行细胞癌(TCC)(T2期,G4级)的细胞系(Gardner等(1997)J Natl Cancer Inst 58,881-890)。这些细胞作为此项研究的外来体来源使用,因为它们先前已经得到广泛表征,而且良好地代表TCC的行为和表型(Gardner等(1997)如上文;及Masters等1986Cancer Res 46,3630-3636)。将细胞在补充有pen/strep和5%FBS(通过以100,000g的过夜超速离心,接着过滤流过0.2μm,然后是0.1μm真空滤器,Millipore来对其消减外来体)的DMEM中维持。将细胞接种入生物反应器烧瓶(来自Integra)中,并以高密度培养物维持以进行外来体生成,如描述的(Mitchell等Immuno Methods 335,98-105)。通过每月筛选(mycoalert,Lonza)来确认细胞在枝原体污染方面呈阴性。
外来体纯化:将细胞培养液进行连续离心,除去细胞(300g,10分钟),除去细胞碎片(2000g,15分钟)。然后,以10,000g将上清液离心30分钟,并保留上清液。将其铺在30%蔗糖/D2O垫上面,并以100,000g进行超速离心达2小时。收集垫,并将外来体在PBS中清洗,如描述的(Lamparski等(2002)Immunol Methods,270,211-226;Andre等(2002)Lancet 360,295-305;及Clayton等(2007)Cancer Res 67,7458-7466)。将外来体沉淀物在100-150ulPBS中重悬,并于-80℃冷冻。通过微量BCA蛋白质测定法(Pierce/ThermoScientific)来测定外来体数量。实施制备物的透射电子显微术,如描述的(Clayton等(2007)如上文)。
外来体密度的测定:为了量化由HT1376所生成的外来体的密度,使用与先前所描述的方案相似的方案,其基于线性蔗糖梯度上的超速离心进行(Raposo等(1996)J.Exp.Med.183,1161-1172及Théry等(2006)Curr ProtocCell Biol,UNIT 3.22)。简言之,将细胞培养上清液进行差速离心,并将70,000g的沉淀物铺于线性蔗糖梯度(0.2M直至2.5M蔗糖)上。使用Optima-Max超速离心机(Beckman Coulter)在MLS-50转子中将样本于4℃以210,000g离心过夜。使用自动折光计(J57WR-SV,Rudolph Scientific)来测量(于20℃)所收集级分的折射率,并从这点出发,计算密度,如所描述的(Raposo等(1996)如上文)。通过以150,000g超速离心(在TLA-110转子中,Optima-Max超速离心机)将级分在缓冲液(PBS或MES缓冲液;下文所讨论的)中清洗,并将沉淀物在MES缓冲液中重悬浮以与微珠偶联,或者在SDS样品缓冲液中重悬浮以通过Western印迹进行分析。
对经外来体包被的珠的流式细胞术分析:将1微克纯化的外来体与1μl胶乳珠(无表面活性剂,醛-硫酸酯3.9μm珠,Interfacial Dynamics,Oregon)一起温育,所述胶乳珠已经在MES缓冲液(0.025M MES、0.154M NaCl,pH6)中清洗两次。对于对蔗糖梯度级分的分析,将30%每份级分与0.5μl储用珠偶联。将外来体-珠在终体积100μl MES缓冲液中于RT在摇动平台上温育1小时,此后于4℃滚动过夜。通过与1%BSA/MES缓冲液一起于RT温育2小时来封闭珠。洗去封闭缓冲液,并将珠在0.1%BSA/MES缓冲液中重悬浮。将一抗于4℃添加(以2-10μg/m1)1小时。一次清洗后,添加0.1%BSA/MES缓冲液中的山羊抗小鼠偶联有Alexa-488的抗体(以1∶200,Invitrogen)达1小时。清洗后,使用配置有高通量取样模块的FACSCanto仪运行FACSDiva v6.1.2软件(Becton Dickinson)通过流式细胞术来分析珠。
1D电泳和免疫印迹:通过免疫印迹来比较细胞溶胞物与外来体溶胞物,如描述的(Clayton等(2003)Eur.J.Immunol 33,552-531),其中通过添加30%体积的6M尿素、50mM Tris-HCl、2%SDS、20mM DTT和0.002%w/v溴酚蓝来溶解蛋白质(每孔多至20μg)。将样品电泳通过4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen),并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,将其封闭,并使用系统(Invitrogen)用抗体探查。使用MiniBIS Pro成像系统(DNR Bio-ImagingSystems)来显现条带。对TSG101、LAMP-1、HSP90、钙联接蛋白、HLA-G、半乳凝素-3、Basigin、hnRNPK、细胞角蛋白18和17及CD44特异的单克隆一抗来自Santa Cruz Biotechnology。抗GAPDH(来自BioChain Institute,Inc)、抗CD9(来自R&D Systems)、和抗CD81(来自Serotec)。抗5T4是来自R Harrop博士(Oxford BioMedica UK Ltd)的赠品。
2D电泳和MS:使用标准的2DE方案,采用基于凝胶的方法来检查外来体蛋白质谱。简言之,将外来体(750μg)于室温在150μl裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、20mM DTT、4%(w/v)CHAPS、0.005%(w/v)溴酚蓝和0.5%(v/v)固定化的pH梯度(IPG)缓冲液pH 3-10NL(GE Healthcare))中溶解1小时。然后,使用2D清除试剂盒(GE Heathcare)将提取的蛋白质进行溶剂沉淀,之后将沉淀物在裂解缓冲液中重悬浮。使用18cm pH 3-10NL IPG再水合条、EttanIPGphorIII IEF系统(GE Healthcare)和推荐的电压来实施样品的等电聚焦。随后,将IPG条在含有1%(w/v)DTT的平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.8、6M尿素、2%(w/v)SDS、30%(v/v)甘油、0.002%(w/v)溴酚蓝)中平衡15分钟,接着在含有2.5%(w/v)碘乙酰胺的平衡缓冲液中平衡15分钟。使用EttanTM DALTsix系统(GE Healthcare)将经平衡的IPG条进行第二维分离。实施银染色,并切割随机选定的凝胶点,将其进行胰蛋白酶消化和MALDI-TOF/TOF质谱术分析,如先前所描述的(Brennan等(2009)Proteomics-Clin Apps 3,359-369)。所采用的数据库搜索设置与对LC-MALDI蛋白质鉴定所描述的相同,只是使用50ppm的前体质量容差。
为纳级LC制备外来体衍生的肽:将HT1376衍生的外来体制备物于4℃在TLA-110转子,Optima-Max超速离心机(Beckman Coulter)中以118,000g再沉淀45分钟。将沉淀物在100μl含有20mM DTT和1%(w/v)SDS的三乙基碳酸氢铵(TEAB)裂解缓冲液(20mM TEAB)中于RT溶解10分钟,接着于95℃达10分钟,并于RT再留10分钟。将样品再进行超速离心步骤(于室温,118,000g达45分钟),并将上清液(现在没有不溶性材料)进行溶剂沉淀以除去盐、脂质和去污剂(使用2D除去,GE Healthcare)。将沉淀物在20mM TEAB中重悬浮,并于4℃留下过夜。然后,使用BCA蛋白质测定试剂盒(Sigma)来测定蛋白质含量。然后,将样品还原,变性,并使用Applied Biosystems iTRAQ标记试剂盒和标准的方案来烷基化。用每份样品0.8μg胰蛋白酶将蛋白质进行消化,并于37℃温育12至16小时。然后,将样品干燥,并在具有0.1%(v/v)TFA的水中重悬浮。
LC-MALDI和蛋白质鉴定:使用二维盐栓法来将经消化的肽在纳级LC系统(UltiMate 3000,Dionex,Sunnyvale,USA)上分离,如先前所描述的(Brennan等(2009)Proteomics-Clin Apps 3,359-369)。使用Applied Biosystems 4800MALDI TOF/TOF质谱仪来实施质谱术,如记载于Brennan等(2009)的。使用嵌入GPS Explorer软件v3.6Build 327(Applied Biosystems)(缺省GPS参数,容许1处误切割、固定的对MMTS的修饰(C)、可变的对氧化的修饰(M)、pyro-glu(N端E)和pyro-glu(N端Q)、MS中的150ppm质量容差和对于MS/MS的0.3Da质量容差)的MASCOT数据库搜索引擎v2.1.04(Matrix Science Ltd,London,UK),使用MS/MS数据来搜索Swiss-Prot数据库(第57.1版;发布日期2009年4月14日;462764种序列;人分类学)。为了使蛋白质被鉴定,需要有最少两个具有小于0.05的MASCOT值的肽。有0%的假发现率(FDR),其是使用相同SwissProt数据库及整个随机化的序列测得的。用两个生物学重复来实施分析,每个包括技术重复。
MS数据分析:在针对限定列表的任何生物学富集方面使用MetacoreGeneGO(5.4版)分析所得的蛋白质列表,并且其来自选定的ExoCarta提交(含有10或更多种匹配基因标识符的基于MS的数据)。对于使用Exocarta基因集的分析,使用BioMart将我们的蛋白质列表从SwissProt登录转换成EntezGeneID,之后使用R中的超几何分布针对所有人基因的背景用EntrezGene ID进行过度代表分析(ORA)。对于MetaCore中的ORA,首先将数据转换成SwissProtID(使用BioMart进行),之后再次使用超几何检验来分析。
实施例7:通过ELISA来检测外来体的5T4表达
将捕捉抗体CD9((克隆209306-IgG2b)纯化的小鼠抗人(无载体蛋白)抗体(R&D Systems,US))在dPBS(Lonza,UK)中稀释至工作浓度10μg/ml,并将100μl添加至要使用的每孔(1μg/孔)。将捕捉抗体在ELISA板(96孔平底的、F剥离的、高结合ELISA板(Greiner bio9-oine Ltd,UK))上于4℃温育18小时。然后,用300μl/孔DELFIATM(Perkin Elmer)清洗溶液将平板孔清洗三次。
为了封闭非特异性结合,将试剂稀释剂(10x浓缩物2(10%BSA)(R&DSystems,US))在dPBS(10%)中稀释10倍以生成1%BSA。然后,将300μl添加至要封闭的每孔,并于室温温育2小时。然后,用300μl/孔DELFIA清洗溶液将平板孔清洗三次。
为了捕获外来体,将100-200μl含有外来体的样品(诸如生物学流体或细胞条件培养基)添加至每孔,并于室温温育2小时。用300μl/孔DELFIA清洗溶液将平板孔清洗三次。
可以如下用5T4抗体(5T4(克隆H8):偶联有生物素的抗体(OxfordBioMedica,Oxford UK))实施检测,即将5T4抗体在DELFIA测定缓冲液中稀释至工作浓度0.1μg/ml,将100μl添加至每孔以进行检测(0.01μg或10ng/孔),于室温温育2小时,然后用300μl/孔DELFIA清洗溶液清洗平板孔。
可以如下对5T4-生物素抗体进行铕-链霉亲合素标记,即将铕-链霉亲合素在DELFIA测定缓冲液中稀释1/1000,将100μl添加至每孔,于室温温育45分钟,并用300μl/孔DELFIA清洗溶液将平板孔清洗六次。
如下获得铕信号,即将100μl DELFIA增强溶液添加至每孔,于室温在混合的情况中温育5分钟,并在Wallac Victor 2多标记物计数器读板仪(PerkinElmer)上读板。图11中显示了结果。
通过提及而将上述说明书中所提及的所有出版物收入本文。本发明所描述的方法和系统的各种修饰和变型在不背离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明,但是应当理解,如要求保护的发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上,对于使用流式细胞术进行细胞研究或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰意图在所附权利要求书的范围内。
Claims (18)
1.针对5T4的检测系统在制造试剂盒中的用途,该试剂盒供一种用于在受试者中检测生殖泌尿道的5T4阳性癌症的方法使用,其中所述方法包括下列步骤:
(i)鉴定来自所述受试者的尿液样品中的外来体和/或自来自所述受试者的尿液样品纯化外来体;并
(ii)检测外来体相关5T4,其中升高的外来体相关5T4的检出指示存在生殖泌尿道的5T4阳性癌症。
2.依照权利要求1的用途,其中所述方法包括检测5T4肽、多肽或编码5T4肽或多肽的核酸。
3.依照权利要求1的用途,其中所述方法用于检测前列腺癌或膀胱癌。
4.依照前述权利要求中任一项的用途,其中所述方法还牵涉检测下列一项或多项:
(i)在5T4外的癌症生物标志物;
(ii)外来体标志物;和/或
(iii)特定组织或细胞类型的标志物。
5.依照权利要求4的用途,其中所述方法牵涉检测一种或多种前列腺标志物。
6.依照权利要求5的用途,其中所述方法牵涉检测PSA和/或PSMA。
7.依照权利要求1的用途,其中所述方法用来测定受试者中的给定癌症是否是5T4阳性癌症,其中5T4的检出确认所述癌症是5T4阳性的。
8.依照权利要求7的用途,其中所述方法用于在受试者中治疗癌症,其包括下列步骤:
(i)测定所述癌症是否是5T4阳性的;并
(ii)对通过步骤(i)测试呈阳性的受试者施用基于5T4的治疗剂。
9.依照权利要求1的用途,其中所述方法用于测定给定受试者是否会适合于用基于5T4的治疗剂治疗,其包括检测所述受试者中的5T4阳性癌症的步骤。
10.依照权利要求1的用途,其中所述方法用来监测5T4阳性癌症进展,其包括比较在多个时间点时自受试者采集的样品中的外来体相关5T4的水平的步骤,其中升高指明所述5T4阳性癌症的恶化,而降低指明改善。
11.依照权利要求10的用途,其中所述方法用于在治疗期间监测5T4阳性癌症的进展,其中在治疗期间的多个时间点时自受试者采集样品。
12.依照权利要求11的用途,其中所述治疗包括施用基于5T4的治疗剂。
13.一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的试剂盒,其包括:
(i)外来体检测、收集和/或纯化系统;和
(ii)针对5T4的检测系统,其中所述检测系统检测5T4肽、多肽或编码5T4肽或多肽的核酸。
14.依照权利要求13的试剂盒,其中所述检测系统还量化5T4的水平。
15.依照权利要求1的用途,或依照权利要求13的试剂盒,其中使用下列一种或多种方法来检测5T4:
(i)结合抗5T4抗体;
(ii)结合对5T4肽特异性的T细胞受体;
(iii)结合与编码5T4的核酸序列整个或部分的互补物显示高程度同一性的核酸序列。
16.依照权利要求15的用途或试剂盒,其中通过使用5T4特异性引物扩增5T4核酸来检测5T4。
17.依照权利要求1的用途,或依照权利要求13的试剂盒,其中针对5T4的检测系统包含下列一种或多种:
(i)抗5T4抗体;
(ii)对5T4肽特异性的T细胞受体;
(iii)与编码5T4的核酸序列整个或部分的互补物显示高程度同一性的核酸序列。
18.依照权利要求17的用途或试剂盒,其中所述针对5T4的检测系统包含5T4特异性引物。
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