TWI682176B - 用於甲狀腺癌預後之生物標記 - Google Patents

用於甲狀腺癌預後之生物標記 Download PDF

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Abstract

本揭示內容提供甲狀腺癌預後的方法，包括從已接受過如甲狀腺切除術的甲狀腺癌治療的對象獲得外泌體，和檢測該外泌體中是否存在有甲狀腺球蛋白。此外，本揭示內容提供以尿外泌體甲狀腺球蛋白作為甲狀腺癌患者的非侵入性、可再現的、方便的、連續的、和精確的追蹤標記的用途。

Description

用於甲狀腺癌預後之生物標記 [相關申請的交叉引用]
本申請案主張2017年9月18日所提交美國臨時申請案序號62/560,171的優先權，其全部內容係藉由引用方式而併入本文。
本揭示內容涉及一種實用且可靠的生物標記，用於對象中甲狀腺癌的預後，特別是經燒灼治療甲狀腺癌的對象。
甲狀腺癌是最常見的內分泌系統癌症。雖然大多數甲狀腺癌可被治療，並認為是低度的(low-grade)內分泌惡性腫瘤，但過去幾年的發病率卻有所增加。事實上，在過去三十年中，它是美國癌症增長最快的癌症。此外，甲狀腺癌發生在所有的年齡層，且與大多數其他成人的癌症不同，它通常在年齡較輕者中被診斷出，最常見於45至54歲的人。
大多數甲狀腺癌的患者接受燒灼放射性碘治療(ablative radioactive iodine therapy)的甲狀腺切除術。雖然通常大多數甲狀腺癌患者的預後良好，但復發率可高達30%，並且在初次診斷後的數十年內甚至也都可能發生復 發。因此，甲狀腺癌患者通常會定期接受追蹤檢查，以檢測癌症是否已重新出現，並且這種監測會在患者的一生中持續進行。因此，隨著甲狀腺癌的發生年紀相對較輕下，甲狀腺癌患者的追蹤和復發監測的時期可持續長達數十年。
甲狀腺癌患者在接受以燒灼放射性碘之甲狀腺切除術後，會進行甲狀腺超音波檢查和連續血清甲狀腺球蛋白的評估。在目前的臨床上，血清甲狀腺球蛋白被認為是作為用於檢測可能的殘留腫瘤或甲狀腺癌復發的關鍵性生物標記。一般來說，術後血清甲狀腺球蛋白表示遠處轉移。低風險患者通常定義為具有小於0.4ng/mL的未受刺激之術後血清甲狀腺球蛋白，或小於1.0ng/mL的甲狀腺激素停用(withdrawal)下的甲狀腺球蛋白。然而，通常需要昂貴的重組人促甲狀腺素(rhTSH)來刺激血清甲狀腺球蛋白，以用於檢測局部復發或遠處轉移，即使刺激可能總是無法導致可檢測的血清甲狀腺球蛋白。因此，需要一種更可靠的生物標記和更靈敏的方法來確定甲狀腺癌的預後。
於本文中，本揭示內容的目的因此係提供生物標記和方法，以預測對象中甲狀腺癌的發展或復發。
於本揭示內容的態樣中，係提供給有需要的對象一種用於甲狀腺癌預後的方法。該方法包含從該對象獲得外泌體，和檢測於該外泌體中是否存在有甲狀腺球蛋白。
於本揭示內容的一個具體實施例中，該對象已經確認為甲狀腺癌患者。於本揭示內容的另一個具體實施例中， 該對象已經被辨別為已接受甲狀腺癌治療之甲狀腺癌患者。又於本揭示內容之另一個具體實施例中，該甲狀腺癌治療可選自下列各者所組成之群組：全甲狀腺切除術、部分甲狀腺切除術、以放射性碘進行之甲狀腺殘留燒灼(thyroid remnant ablation)、標靶治療及其組合。又於本揭示內容之另一個具體實施例中，該方法係在該對象之甲狀腺癌治療後進行。於本揭示內容的進一步具體實施例中，該方法是在甲狀腺癌患者定期追蹤中進行一段時間。
於本揭示內容的一個具體實施例中，甲狀腺癌可選自由下列各者所組成之群組：濾泡性甲狀腺癌、濾泡變異乳頭狀甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、何氏(Hurthle)細胞癌、甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer)、以及其組合。於本揭示內容的另一個具體實施例中，該甲狀腺癌係濾泡性甲狀腺癌或乳頭狀甲狀腺癌。
於本揭示內容的一個具體實施例中，於外泌體中甲狀腺球蛋白之存在係藉由質譜法進行胜肽定序(peptide sequencing)。
於本揭示內容的一個具體實施例中，外泌體係從對象的體液樣本單離。於本揭示內容的另一個具體實施例中，該樣本可以選自尿液、血漿和血清。又於本揭示內容的另一個具體實施例中，該樣本係尿液。
於本揭示內容的一個具體實施例中，該方法進一步包含從該樣本單離外泌體，其係藉由下列各者所組成群組的步驟進行：粒徑篩析層析術、密度梯度離心、差速離心、 奈米膜超過濾、免疫吸附捕獲、親和純化、微流體分離、以及其組合。於本揭示內容的另一個具體實施例中，外泌體係藉由密度梯度離心從該樣本單離。
於本揭示內容的一個具體實施例中，該方法進一步包含當檢測到外泌體中存在有甲狀腺球蛋白時，診斷患有復發性甲狀腺癌的對象。於本揭示內容的另一個具體實施例中，該方法進一步包含給予經診斷的對象甲狀腺癌治療。又於本揭示內容之另一個具體實施例中，該甲狀腺癌治療係選自放射性碘、標靶治療以及其組合。
於本揭示內容的另一種態樣中，提供了評估甲狀腺癌治療的方法。該方法包含從已接受該甲狀腺癌治療的對象獲得外泌體，和檢測甲狀腺球蛋白是否存在於該外泌體中，其中，甲狀腺球蛋白於外泌體中的水平(level)係表示甲狀腺癌治療的功效。
於本揭示內容的一個具體實施例中，甲狀腺球蛋白於外泌體中的存在係表示甲狀腺癌的復發。
於本揭示內容的一個具體實施例中，外泌體從對象的體液樣本獲得。又於本揭示內容之另一個具體實施例中，外泌體從尿液樣本獲得。
於本揭示內容的一個具體實施例中，該方法進一步包含當檢測到甲狀腺球蛋白於外泌體中的存在時，給予對象甲狀腺癌治療。於本揭示內容的另一個具體實施例中，該甲狀腺癌治療係選自放射性碘、標靶治療以及其組合。
本揭示內容的生物標記和方法提供藉由檢測從對象 體液單離的外泌體中的甲狀腺球蛋白水平的增加趨勢，而早期檢測甲狀腺癌的復發。此外，本揭示內容的生物標記和方法對於血清甲狀腺球蛋白檢測不到的甲狀腺癌復發患者，可實現既實用又可靠的甲狀腺癌預後。
第1A至1M圖顯示對象患者手術前後尿外泌體蛋白水平的變化趨勢。
第2圖顯示接受全甲狀腺切除術和放射性碘燒灼的患者手術前後尿外泌體蛋白水平的變化趨勢。
本揭示內容提供了一種藉由分析外泌體來特徵化對象中甲狀腺癌之方法和生物標記，更具體地，藉由分析作為生物標記之尿外泌體蛋白而確定甲狀腺癌患者預後的敏感和非侵入性方法。藉由本揭示內容的方法，確定甲狀腺癌預後的對象，不需停用甲狀腺激素或接受rhTSH刺激。
目前，接受採用燒灼放射性I-131治療的甲狀腺癌切除術的甲狀腺癌患者，血清甲狀腺球蛋白在追蹤期間被用作癌症生物標記。如果在血清中檢測不到甲狀腺球蛋白，則認為患者已經完成治療，與抗甲狀腺球蛋白抗體的干擾無關。通常，在生化完全治療的患者中，甚至在昂貴的rhTSH刺激下，也不能檢測到血清甲狀腺球蛋白，使得血清甲狀腺球蛋白不足以用於甲狀腺癌復發的生物標記。本揭示內容發現尿外泌體甲狀腺球蛋白可作為用於甲狀腺癌患者的非侵入性、可再現的、方便的、連續的、和精確的 追蹤標記的用途。更具體地，分析胜肽序列以定量尿外泌體中的甲狀腺球蛋白水平。在不需要rhTSH的情況下，成本降低了，患者可以在癌症追蹤期間繼續使用甲狀腺激素。
在本揭示內容中，分析了來自於對象中生物樣本的外泌體以特徵化甲狀腺癌。外泌體是從各種不同細胞分泌到細胞外環境中的奈米囊泡。例如但不限於源自外胚層、內胚層或中胚層或衍生自外胚層、內胚層或中胚層的細胞，包括已經歷遺傳、環境和/或任何其他變化或改變的任何此等細胞(例如，腫瘤細胞或具有基因突變的細胞)。外泌體的直徑通常為40nm至100nm，並且對應於內體多泡體(endosomal multivesicular bodies)的管腔內囊泡(intraluminal)。外泌體可具有但不限於大於約10、20或30nm的直徑。它們可具有約30nm至1000nm、約30nm至800nm、約30nm至200nm或約30nm至100nm的直徑。在一些具體實施例中，外泌體可具有，但不限於，小於約10,000nm、1,000nm、800nm、500nm、200nm、100nm或50nm的直徑。如全文所用，當提及一個值或一個量時，術語「約」意味著包括於某些具體實施例中特定量±10%的變化，當此等變化是合適的。
細胞分泌的外泌體由細胞間的分子訊息傳遞，且被用作癌症的生物標記，以用於惡性腫瘤的診斷和預後。外泌體蛋白可影響細胞訊息傳遞、發炎、免疫。此外，發炎外泌體蛋白有助於細胞行為中的各種病理生理過程。外泌體 可從對象的生物樣本中收集，例如血清、組織液和尿液，以用於特徵化疾病。
從對象獲得的生物樣本可以是任何體液。例如，生物樣本可以是末梢血液、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊髓液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支氣管肺泡灌洗液體、精液(包括前列腺液)、考氏(Cowper's)液體或射精液、女性潮射(female eiaculate)、汗液、糞便、頭髮、眼淚、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間質流體、月經、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺吸出液或其他灌洗液。生物樣本還可包括胚泡腔、臍帶血或母體循環，其可以是胎兒或母體來源。生物樣本也可以是組織樣本或活組織檢查，可以從中獲得外泌體。
可以從生物樣本中直接測定外泌體，從而確定外泌體的水平，或在未經事先單離、純化或濃縮的情況下測定外泌體中的生物標記。或者，可以在分析之前從其樣本中單離、純化或濃縮外泌體。
可從生物樣本中獲得富集的外泌體群。例如，外泌體可使用粒徑篩析層析術、密度梯度離心、差速離心、奈米膜超過濾、免疫吸附捕獲、親和性純化、微流體分離、或其組合，從其生物樣本中濃縮或單離。
可採用如凝膠滲透管柱、離心或密度梯度離心的粒徑篩析層析術以及過濾方法。例如，可藉由差速離心、陰離 子交換和/或凝膠滲透層析術、蔗糖密度梯度、胞器電泳、磁性活化之細胞分選(MACS)或奈米膜超過濾濃縮器，而單離外泌體。可使用單離或濃縮方法的各種組合。
單離的外泌體用於本揭示內容中生物標記的分析，以進行甲狀腺癌的預後或甲狀腺癌治療的評估。因此，本揭示內容的示例性具體實施例提供了方法，用於檢測來自生物樣本的單離的外泌體中甲狀腺球蛋白的存在或豐度水平(abundance levels)。可藉由ELISA、質譜或流式細胞術分析甲狀腺球蛋白。外泌體的蛋白質體學分析也可按照所屬技術領域中熟知的方法，藉由免疫細胞化學染色、西方印漬術、電泳、層析術或X射線晶體學而在外泌體上進行。
在其他具體實施例中，可使用2D差示凝膠電泳或液相層析質譜法分析外泌體的蛋白質生物特徵。外泌體可進行基於活性的蛋白質剖面測勘(activity-based protein profiling)。在其他具體實施例中，可使用奈米噴霧液相層析串聯質譜法對外泌體進行剖面測勘。在另一具體實施例中，外泌體可使用串聯質譜(MS)進行剖面測勘，如使用液相層析術/MS/MS(LC-MS/MS)，例如使用LTQ和LTQ-FT離子阱質譜儀。可藉由比較光譜計數而確定蛋白質鑑定，並且評估相對定量。
包括在本文中使用的描述性或技術性術語的所有術語應被解釋為具有對於所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的含義。然而，根據所屬技術領域中具有通常知識者的意圖、先例或新技術的出現，術語可以具有不同的含 義。此外，一些術語可以由申請人任意選擇，並且在此情況下，將在本揭示內容中詳細描述所選術語的含義。因此，本文使用的術語必須基於術語的含義以及整個說明書中的描述來定義。
此外，當部分「包括(include)」或「包括(comprise)」組分或步驟時，除非存在與其相反的特定描述，否則該部分可進一步包括步驟的其他組分或其他步驟，而不排除其他者。
進一步注意到，如本說明書中所使用的，單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」，除非清楚且明確地限於一個指示物，否則包括複數指示物。除非上下文另有明確說明，否則術語「或」可與術語「和/或」互換使用。
對象或個體中的「特徵化(characterize)」一詞可包括但不限於，疾病或病症的診斷、疾病或病症的預後、疾病階段或病症階段的確定、監測癌症復發、藥物功效、生理狀況、器官窘迫或器官排斥、疾病或病症進展、與疾病或病症的治療相關的關聯、或特定的生理或生物狀態。
本文使用的術語「胜肽」是指含有超過一個胺基酸單體的短鏈，其中超過一個胺基酸單體係藉由醯胺鍵彼此連接。必須注意的是，本揭示內容的胜肽中使用的胺基酸單體不限於天然胺基酸，並且胜肽的胺基酸序列還可包括非天然胺基酸、具有相似結構的化合物、或者缺乏胺基酸。
以下實施例用於舉例說明本揭示內容。基於本揭示內容的說明書，所屬技術領域中具有通常知識者可了解本揭 示內容的其他優點。本揭示內容也可如所述那樣實現或應用於不同實施例。可修改和/或改變用於實施本揭示內容的上述實施例，但不違背其精神和範疇。
實施例
本揭示內容的例示性具體實施例係進一步在以下實施例中描述，其並非限制本揭示內容的範圍。
以下實施例描述了分析從尿液樣本中單離的外泌體中的尿外泌體蛋白作為早期預後生物學標記的步驟。
13例新診斷的乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌患者經追蹤6個月。所有13名患者在手術評估後接受甲狀腺全切除術，9名患者在術後約4週接受放射性I-131燒灼術。
實施例1：患者評估
所有患者均接受了甲狀腺功能的全面術前和術後評估，除了基本的人口統計資訊(demographic information)，還包括血清甲狀腺球蛋白和抗甲狀腺球蛋白抗體水平、根據惡性腫瘤的TNM分類確定癌症分期的外科病理結果。使用IMMULITE 2000甲狀腺球蛋白(一種固相化學發光免疫測定法)測定甲狀腺球蛋白水平。其分析靈敏度為0.2ng/mL(Siemens，Erlangen，Germany)。使用ARCHITECT Anti-Tg測定法測定抗甲狀腺球蛋白抗體的水平，該測定是用於定量測定人類血清中甲狀腺球蛋白自身抗體的兩步(two-step)免疫測定。其靈敏度
Figure 107116453-A0202-12-0010-21
1.0IU/mL(Abbott Laboratories，Chicago，IL，USA)。評估結果如下表1所示。
Figure 107116453-A0202-12-0011-1
表1列出了患者評估的結果，包括基本人口統計學信息、甲狀腺功能的術前和術後評估、包括血清甲狀腺球蛋白和抗甲狀腺球蛋白抗體水平、根據惡性腫瘤的TNM分類確定的癌症分期的外科病理學發現。
實施例2：尿液樣本收集
在手術前、剛手術後、術後3個月和6個月，從患者收集尿液樣本，每個患者共收集4個樣本。收集來自患者的尿液樣本以用於沉澱尿外泌體。具體地，針對每位患者收集200mL新鮮的人類尿液樣本。將這些樣本在4℃以3000×g離心15分鐘以去除細胞和細胞碎片，然後在4℃以10,000×g離心30分鐘以去除微泡。
使用Amicon® Ultra15離心過濾器，100K(Millipore，Billerica，MA，USA)將200mL尿液樣本濃縮至5mL至10mL。使用ExoQuick-TC(SystemBiosciences，PaloAlto，CA，USA)分離尿外泌體。將上清液轉移到新管中，加入cOmpleteTM、不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Basel，Switzerland)，並將樣本儲存在-80℃。將外泌體顆粒(pellet)重新懸浮於裂解緩衝液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS)中。將經此製備的外泌體蛋白樣本在-80℃冷凍，直至多反應監測(multiple reaction monitor，MRM)分析。
實施例3：外泌體蛋白的胰蛋白酶消化(tryptic digestion)
尿外泌體樣本在-20℃以三體積的冷甲醇沉澱，然後以 10,000×g離心10分鐘。然後將沉澱的顆粒懸浮在裂解緩衝液(4M尿素、25mM碳酸氫銨，pH 8.5)中。將變性的樣本在室溫以200mM二硫蘇糖醇還原1小時，然後在室溫以200mM碘乙醯胺在黑暗中烷基化1小時。藉由加入200mM DTT而淬滅剩餘的碘乙醯胺，並在室溫培育20分鐘。將修飾的測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)添加至樣本中。在37℃進行16小時消化。
實施例4：使用直接輸注之MRM Q1/Q3離子對選擇
半乳糖凝集素3用於比較以確認甲狀腺球蛋白水平的趨勢。半乳糖凝集素3係藉由半乳糖苷酶結合蛋白調節細胞生長，其與乳頭狀甲狀腺癌的發生和轉移相關。
甲狀腺球蛋白和半乳糖凝集素3的胜肽序列可從Peptide Atlas和UniProt獲得，且表示在下表2中。
Figure 107116453-A0202-12-0013-2
標準胜肽係由明欣生物科技有限公司(Mission Biotech， Ltd.)(台北，台灣)合成。將合成的胜肽乾燥並用乙醚沉澱。藉由反相高效液相層析法純化胜肽，同時監測230nm處的胜肽沖提。將合成的標準胜肽在0.1%甲酸中稀釋至2μg/mL，使用注射泵以每分鐘10μL的流速輸注。藉由使用配備有TurboV源並由Analyst軟體控制的AB SCIEX QTRAP 5500質譜儀(Framingham，MA，USA)之電噴霧電離分析輸注的胜肽溶液。質譜分析採用正離子模式，離子噴霧電壓設定為5500V。源溫度設定為550℃。另外的參數有霧化器和乾燥氣體流量分別是60和45psi。Analyst軟體用於產生所有可能的b-和y-系列碎片離子的列表，均用於2+和3+前體離子電荷狀態，跨越m/z範圍為從100到1，000。最佳化MRM Q1/Q3離子對之MRM掃描在Q1和Q3均設定為單位分辨率(半峰全寬0.7Da)的情況下進行，同時碰撞能量(collision energy，CE)以1V從5V增量至55V，每次的過渡停留時間為150ms。根據該數據，在每個胜肽的基礎上選擇產生最強信號的四個轉變(transitions)。接下來，從這四個轉變中選擇產生無信號干擾的最豐富信號的三個轉變。
實施例5：尿外泌體消化的LC-MRM/MS分析
使用Agilent 1260 Infinity HPLC系統(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)將10μL尿液消化樣本直接注入保持在室溫之反相分析柱(100×2.1mm內徑，2.7μm，Agilent Poroshell 120 EC-C18)。使用每分鐘 300μL的流速和3%至90%流動相B的梯度在30分鐘的總運行時間內分離樣本。流動相A係由0.1% v/v甲酸組成，而流動相B係由ACN/0.1%甲酸組成。梯度法由多個線性梯度組成如下(時間：%B)：0.1分鐘，10% B；3.5分鐘，11% B；6.5分鐘，20% B；7分鐘，21% B；7.5分鐘，22% B；12.5分鐘，22.5% B；17分鐘，25% B；20分鐘，30% B；22.5分鐘，42% B；23.5分鐘，90% B；27分鐘，3% B；30分鐘，3% B。將由Analyst軟體控制的具有TurboV電離源的AB SCIEX QTRAP 5500用於所有LC-MRM/MS樣本分析。所有採集方法均採用以下參數：5500V離子噴霧電壓；霧化器和乾燥氣體流量分別為60和45psi；源溫度為550℃；Q1和Q3設置為單位分辨率(0.7半峰全寬)。
在確定高信號產生無干擾轉換和LC方法發展期間，MRM採集方法最初由每個胜肽的四個離子對組成。最終分析方法由每個胜肽的一個經過驗證的定量離子對組成，並且是一種高通量，已經評估了常見的尿液干擾的快速30分鐘方法。然而，用每個靶胜肽包含三個經驗證的離子對轉換的獲取方法所進行的樣本尿液分析，以確保檢測任何次要的樣本特異性信號。使用碎片離子特定的調諧CE電壓和保留時間約束以構建MRM採集方法。
實施例6：尿外泌體消化物中胜肽靶標的MRM數據分析
使用AB SCIEX Analyst軟體(版本1.5)處理所有MRM數據，並使用Integrator演算法將峰積分設置為預設值。 人工檢查所有積分峰，以確保正確的峰檢測和精確的積分。使用標準1/x2(x=濃度)加權選項進行所有校準曲線的線性回歸，以幫助覆蓋寬動態範圍。基於觀察到的反應和來自標準曲線所實驗確定的線性回歸方程式，計算每個胜肽靶的濃度。計算的濃度以μM計，並藉由使用考慮整個加工蛋白質的重量之公式(ng/mL)=(μM)x(以道爾頓計的分子量)而轉換為ng/mL。
十三名患者的尿胜肽生物標記濃度列於下表3中，並且第1A至1M圖中描繪了每個患者的趨勢。
Figure 107116453-A0202-12-0017-3
這些數據顯示，雖然化學發光免疫測定法在高靈敏度(0.2ng/mL)下未檢測到血清甲狀腺球蛋白，但可藉由胜 肽定序檢測尿液外泌體甲狀腺球蛋白。特別是在放射性I-131燒灼後的患者1、3、4和7未檢測到血清甲狀腺球蛋白；然而，尿外泌體甲狀腺球蛋白呈增加趨勢，表示甲狀腺癌可能復發。在可以檢測到血清甲狀腺球蛋白的患者10、11和12中，尿外泌體甲狀腺球蛋白水平也與增長趨勢相關聯。
此外，在接受全甲狀腺切除術和放射性碘燒灼的患者中，術前和術後連續變化的尿外泌體甲狀腺球蛋白在第2圖中顯示。
如第2圖所示，尿外泌體甲狀腺球蛋白於乳頭狀甲狀腺癌，伴有軟組織侵犯、或具有IV級淋巴結轉移、或具有淋巴血管侵襲的濾泡性甲狀腺癌之患者1、3、4和8中，顯示升高趨勢。然而，在術後6個月的燒灼治療後，這些患者的血清甲狀腺球蛋白無法被檢測到。
與血清甲狀腺球蛋白相比，在本揭示內容的方法中所使用的尿外泌體甲狀腺球蛋白是甲狀腺癌復發的促發炎性預測因子和更敏感的生物標記，用於甲狀腺切除術的患者。尿外泌體甲狀腺球蛋白於此等患者中的增加趨勢表示其可作為預測復發的不可檢測的血清甲狀腺球蛋白的更好替代物，並且可作為監測甲狀腺癌患者的敏感性和早期的生物標記。
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(7)
<400> 2
Figure 107116453-A0202-12-0020-5

Claims (16)

  1. 一種在有需要的對象中的甲狀腺癌預後的方法，包含：從該對象獲得外泌體；以及檢測於該外泌體中是否存在甲狀腺球蛋白，其中，該對象已經確認為甲狀腺癌患者。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該對象已接受甲狀腺癌治療。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該甲狀腺癌治療係選自由下列各者所組成之群組：全甲狀腺切除術、部分甲狀腺切除術、以放射性碘進行的甲狀腺殘留燒灼、標靶治療以及其組合。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該外泌體係從該對象的體液樣本中單離出。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中，該樣本係尿液、血漿或血清。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該樣本係尿液。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，進一步包含藉由粒徑篩析層析術、密度梯度離心、差速離心、奈米膜超過濾、免疫吸附捕獲、親和純化或微流體分離，而從該樣本中單離該外泌體。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，進一步包含當檢測到該外泌體中存在有甲狀腺球蛋白時，診斷該對象患有復發性甲狀腺癌。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該甲狀腺癌係選自由下列各者所組成之群組：濾泡性甲狀腺癌、濾泡變異乳頭狀甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、何氏細胞癌、甲狀腺未分化癌、以及其組合。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，該甲狀腺癌係濾泡性甲狀腺癌或乳頭狀甲狀腺癌。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，於該外泌體中之甲狀腺球蛋白的存在係藉由質譜法進行胜肽定序而檢測。
  12. 一種評估甲狀腺癌治療的方法，包含：從已接受該甲狀腺癌治療的對象獲得外泌體；以及檢測於該外泌體中是否存在有甲狀腺球蛋白，其中，於該外泌體中之甲狀腺球蛋白的水平係表示該甲狀腺癌治療的功效。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，於該外泌體中之甲狀腺球蛋白的存在係表示甲狀腺癌的復發。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該甲狀腺癌治療係選自由下列各者所組成之群組：全甲狀腺切除術、部分甲狀腺切除術、以放射性碘進行之甲狀腺殘留燒灼、標靶治療及其組合。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之方法，進一步包含從該對象的體液樣本中單離該外泌體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該樣本係尿液。
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