CN102680688A - 诊断试剂盒及bfar在制备胃癌早期诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物科学领域，特别涉及一种诊断试剂盒及BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。本发明的诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质BFAR、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述人蛋白质BFAR包被于所述酶标板上。与现有技术相比，本发明有以下优点：1、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌；2、提供的血清生物标志物人蛋白质BFAR的特异性为84%，敏感性为85%，具有高特异性和高敏感性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物科学领域，特别涉及一种诊断试剂盒及BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
背景技术
胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织（WHO）2008年的统计（世界卫生组织年度统计，2008），在全世界范围，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的统计中显示有接近950,000个新发病例，同时有约700,000人死于这一种疾病。在我国，每年胃癌新发患者数超过30万，死于胃癌的人数约16万，病死率居恶性肿瘤之首，严重威胁人民生命健康(陈竺,全国第三次死因回顾抽样调查报告,2008)。为降低死亡率，提高胃癌的疗效，关键是胃癌的“三早”工作，即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而，由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性的临床症状，故早期胃癌诊断率很低，手术率不足10%（吴云林：外科理论与实践，2005，10:401）；术后病人的生存期也较短。目前，我国胃癌总体5年生存率为43．4％，术后病理分期(pathological TNM，pTNM)I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的术后5年生存率分别为75．65％、58．73％、28．Ol％和8．42％（刘炳亚:中华胃肠外科杂志,2010,13:163）。因此，提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。因此，从长远角度看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外，胃癌异质性大，预后及对治疗的反应性差别较大，对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价，均需良好的肿瘤标志物。
理想的肿瘤标志物应符合以下条件：（1）敏感性高；（2）特异性高；（3）肿瘤标志物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能协助肿瘤分期和判断预后；（4）半衰期短，有效治疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；（5）存在于体液，特别是血液中,易于检测(刘炳亚:中华胃肠外科杂志,2010,13:163)。
肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物：如癌胚抗原（CEA），存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较小，主要用于胃癌治疗前后的动态观察(Lipkin M:CancerResearch,1988,48:235；Lipkin:JBC Supplymental,1992,16:1)；CA125、CA19-9、CA50、CA724以及CA242等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性仅20～40％（Kodera Y:The American journal of gastroenterology,1996,91:49；Chou M:Disease Markers,2000,16:105；Lai IR etal:Hepato-gastroenterology,2002,49:115；Edip U et al:Advances inTheray,2008,25:1075）；还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原-72（TAG-72）对胃癌的敏感性为69%，特异性为84％（刘军等：实用医学杂志，1999，15:4）；糖蛋白抗原MG7-Ag在血清中有40％-60％的阳性检出率，在胃癌组织中有80％-94％的阳性检出率（Ren J:Cancer，2000，88：280）；核小体组蛋白类抗原(IPO—38)作为胃癌诊断的敏感性为57.4%，特异性超过90%（Hao Y etal:J ProteomeRes,2008，7:3668）以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因，如DDC、c-myc、c-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义，但广泛应用于临床仍受限制（刘倩等，人民卫生出版社，2004）。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。
我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了胃癌病人相关血清101份（胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份），在较短时间内比较了患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗胃癌。
蛋白BFAR（bifunctional apoptosis regulator）双功能凋亡调节子最早是由Zhang等人发现的一种多结构域的膜整合蛋白（Zhang H et al:PNAS，2000,97:2597）,它含有450个氨基酸。BFAR主要分布在内质网，少量分布在线粒体膜（Roth W et al：Cell Death Differ，2003,10:1178），包括4个可识别结构域:N末端锌指结合RING环结构域，可结合泛素连接酶E2s；SAM结构域，能促进Bcl-2和Bcl-X的相互作用，抑制Bax诱导的细胞凋亡；DED结构域，与procaspases-10的死亡效应结构域DED序列同源,有报道称其直接或间接与caspase8和caspase10前体相关，阻碍Fas介导的凋亡信号通路；以及C末端跨膜结构域TM,BFAR通过TM定位在内质网膜上（李红梅等：中国科学，2011，41:1140）。有研究发现，BFAR的组织表达谱有高度特异性，仅在脑组织中高表达（Roth W et al：Cell Death Differ，2003,10:1178）。
目前，未见有将BFAR蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诊断试剂盒，以解决现有技术中的胃癌诊断试剂盒不能实现对胃癌的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。
本发明的第二目的在于提供一种BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的应用，以解决现有技术中的胃癌诊断试剂不能实现对胃癌的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质BFAR、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述人蛋白质BFAR包被于所述酶标板上。
优选地，所述人蛋白质BFAR是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为10μg/mL。
优选地，所述标准血清包括0U/mL标准血清1和100U/mL标准血清2，所述0U/mL标准血清1为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述100U/mL标准血清2为BFAR抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
优选地，所述酶标试剂含HRP-二抗0.1-1μg/mL。
优选地，所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30%双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB 350mg、DMSO 20mL和柠檬酸·H2O5.1g。
优选地，所述封闭液为0.5%BSA的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）溶液，即1升溶液中含5g BSA（牛血清白蛋白）、8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2g KCl。
优选地，所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）；所述洗涤液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0.05%Tween-20，即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5mL Tween-20；所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
优选地，所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。
一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体；具体是：用人蛋白质BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待测血清，再与HRP标记的二抗结合，形成BFAR-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质BFAR的IgA抗体的水平呈正相关。
人蛋白质BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明有以下优点：
1、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌；
2、提供的血清生物标志物人蛋白质BFAR的特异性为84%，敏感性为85%，具有高特异性和高敏感性的特点。
附图说明
图1为银染鉴定BFAR的表达浓度、纯化状况的示意图，
图中：
1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL；
2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL；
3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL；
4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL；
5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL；
6表示经琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）（国家生化工程技术研究中心）分离纯化后的BFAR蛋白质样品（含GST标签）；
7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：170KD，130KD，95KD，72KD，55KD；
图2为Western-Blotting鉴定BFAR的表达、纯化状况的示意图，
图中：
1表示经琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）（国家生化工程技术研究中心）分离纯化后的BFAR蛋白质样品（含GST标签）；
2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130KD，95KD，72KD，55KD；
图3为健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体的浓度变化曲线图，注：图中的数值是健康人、高危、胃癌患者各300份血清样本中的抗蛋白质BFAR的IgA抗体浓度的相对水平。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
1、表达、纯化及鉴定BFAR：
蛋白质BFAR是由基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，之后，经琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）分离纯化而得到，对其进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。
2、血清样品的准备：
全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN3，因为NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
3、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配制方法：
（1）包被缓冲液：0.05M pH 9.6的Na2CO3-NaHCO3
（2）样品稀释液：pH 7.4PBS溶液
（3）洗涤液：pH 7.4的PBST溶液
(4)封闭液：0.5%BSA的pH 7.4PBS溶液
（5）酶底物溶液：显色剂A和显色剂B
(现配现用)
(现配现用)
（6）终止液：2mol/L H2SO4溶液
（配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀）
4、ELISA法测定血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体的浓度，以辅助早期诊断胃癌：
具体操作步骤如下：
（1）包被：将纯化的人BFAR蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。
（2）封闭：加入封闭液200μL，室温保温2小时；洗涤液洗板3次，甩干。
（3）标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样将样品加于梅标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多，建议使用多管微量加液器加样。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。
（4）温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。
（5）加酶：每孔加辣根过氧化物酶标记的anti-HumanIgA抗体100μL，37℃，60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。
（6）显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
（7）终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
（8）结果判定：
i.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
*A450是450nm处吸光度的缩写。
*目前BFAR抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。
ii.血清中抗BFAR值的判定
iii.质量控制
每个检测结果必须符合以下标准：
标准血清1的A450：≤0.100
标准血清2的A450：≥0.700
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
iv.检验结果的解释
对50例健康人血清、37例胃癌患者血清、14例高危患者血清的ROC分析确立了以上参考值。
5、特异性和敏感性检测：采用900份胃癌相关患者的血清（胃癌患者300份，高危人群300份，健康人300份）对本发明的诊断试剂盒进行了特异性和敏感性检测（如图3）。本发明的诊断试剂盒辅助早期诊断胃癌的特异性为84%，敏感性为85%，均大大高于现有技术中胃癌诊断的指标。
本发明还提供人蛋白质BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的新用途。
以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。
Claims (10)
1.一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，其特征在于，所述诊断试剂盒包括酶标板、人蛋白质BFAR、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述人蛋白质BFAR包被于所述酶标板上。
2.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述人蛋白质BFAR是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为10μg/mL。
3.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述标准血清包括0U/mL标准血清1和100U/mL标准血清2，所述0U/mL标准血清1为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述100U/mL标准血清2为BFAR抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
4.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述酶标试剂含HRP-二抗0.1-1μg/mL。
5.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30%双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB 350mg、DMSO 20mL和柠檬酸·H2O 5.1g。
6.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述封闭液为0.5%BSA的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）溶液，即1升溶液中含5g BSA（牛血清白蛋白）、8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2g KCl。
7.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）；所述洗涤液为0.01mol/L pH7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0.05%Tween-20，即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5mL Tween-20；所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
8.如权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。
9.一种诊断试剂盒，用于胃癌早期的诊断，其特征在于，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质BFAR的IgA抗体；具体是：用人蛋白质BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中加入待测血清，再与HRP标记的二抗结合，形成BFAR-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质BFAR的IgA抗体的水平呈正相关。
10.人蛋白质BFAR在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
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