发明内容
本发明所要解决的技术问题为克服现有的胃癌诊断试剂缺乏足够的敏感性和特异性的问题,而提供一种敏感性和特异性较好的胃癌诊断试剂。
一种胃癌诊断试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、标记物偶联抗体,其特征在于所述抗体为抗H2B组蛋白抗体。
在一实施方案里,本发明胃癌诊断试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、生物素修饰的抗体以及标记物偶联的抗生物素蛋白,其特征在于所述抗体为抗H2B组蛋白抗体。
在一实施方案里,本发明的胃癌诊断试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、2,4-二硝基苯酚修饰的抗体以及标记物偶联的标记的抗2,4-二硝基苯酚抗体,其特征在于所述抗体为抗H2B组蛋白抗体。
本发明的试剂盒,根据需要也可包含用于检测上述标记的抗生物素蛋白或标记的2,4-二硝基苯酚抗体的试剂。
H2B组蛋白是构成真核细胞核小体的基本成分。核小体核心组蛋白有H2A、H2B、H3和H4四种,它们形成的八聚体构成核心颗粒,DNA分子盘绕在外。组蛋白N端尾部进化上极为保守,含有大量赖氨酸和精氨酸残基,伸出核小体外,很容易受乙酰化酶、甲基化酶和激酶等作用发生修饰。组蛋白通过翻译后修饰在细胞周期中引起染色质结构改变,从而参与基因表达调控、肿瘤形成、细胞凋亡等重要生命过程。目前,国内外仅见一篇关于IPO-38用于牙源性肿瘤增殖活性研究的报道【Oral Dis,2004,10(1):22-6】,缺乏有关该抗原本质的研究信息,极大地限制了其临床应用研究范围,同时存在对IPO-38试剂依赖进口的局面。
在一些实施方案里,所述抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体,其中优选IPO-38单克隆抗体。
在一些实施方案里,所述标记物偶联抗体中标记物为酶、核素、荧光素。
所述酶选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶及6-磷酸葡糖脱氢酶。
在实施方式里,所述标记物为酶时,本发明试剂盒还包括辅助试剂,包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液。
一种辅助试剂配制方法如下:
1.底物溶液:磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3%H2O2。
2.显色液:0.1mg/ml TMB甲醇溶液.
3.反应终止液:2M硫酸。
4.清洗缓冲液:PBS溶液。
所述核素选自3H、188Re、131I。
所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、3价镧系螯合物如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等
另一方面,本发明还提供所述胃癌诊断试剂盒在胃癌诊断中的应用。
其应用步骤如下:
提取患者手术前外周血样本;
离心分离得到上清液血清;
采用上述胃癌诊断试剂盒检测;
分析结果。将手术后组织病理学获得的诊断作为“金标准”,将胃癌诊断试剂盒检测的结果与“金标准”按照以下计算公式计算获得该试剂盒的敏感性与特异性。
表中a为真阳性,b为假阳性,c为假阴性,d为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算:
敏感性(%)=a/(a+c)×100%
特异性(%)=b/(b+d)×100%
符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d)×100%
本发明所提供的试剂盒的敏感性为55.4%,特异性为93.3%,优于其他几种传统的肿瘤标记物CA 199、CA724和癌胚抗原(CEA),能利用少量生物液如人血清有效地便捷地诊断胃癌。
具体实施方式
如本文所用,所说“抗H2B组蛋白抗体”是指将H2B组蛋白或其片段或其修饰衍生物作为抗原制备得到的抗体。该抗体与H2B组蛋白或其片段或其修饰衍生物具有结合能力,而抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体。优选与H2B组蛋白或其片段或其修饰衍生物特异性结合的多克隆抗体、单克隆抗体等。
采用过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶及6-磷酸葡糖脱氢酶等酶标记、荧光标记或用放射性同位素标记,可以使抗H2B组蛋白抗体定量化,将这样的抗体称其为「标记的抗H2B组蛋白抗体」。采用酶标记时,该酶在合适的底物存在下进行反应时,将酶反应生成物作为标记物,可检测出与已经参与结合的抗H2B组蛋白抗体。另外,应用荧光标记和放射性同位素标记时,将荧光和放射活性作为标记物时,也可检测出与已经参与结合的抗H2B组蛋白抗体。
在「标记的抗H2B组蛋白抗体」中进一步包含通过生物素、2,4-二硝基苯酚等标记的抗H2B组蛋白抗体。生物素与抗生物素蛋白特异地结合,而2,4-二硝基苯酚与抗2,4-二硝基苯酚抗体特异地结合。进而,把上述标记的抗H2B组蛋白抗体可通过过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶及6-磷酸葡糖脱氢酶等酶标记的抗生物素蛋白和2,4-二硝基苯酚抗体进行定量测定。
用作抗原或符合ELISA标准的H2B组蛋白或其片段或其衍生物可在市场上购入、或者用以下方法制备。
基于基因工程学的方法,将编码人H2B组蛋白的基因重组到合适的载体上,在合适的宿主中导入该重组体进行基因转导,可从该转导体的细胞中或培养物上清液中得到重组的H2B组蛋白,本方法适合生产大量的均匀的H2B组蛋白或片段。虽然对上述的宿主细胞无特别的限定,但可依据现有的基因工程学方法应用各种宿主细胞,例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物或动物细胞。
抗H2B组蛋白抗体的制备可通过H2B本身或其片段及衍生物为抗原,可以通过以下方法获得相应的各种抗体,但不只限于下列方法。采用该抗原免疫家兔,在检测兔血清中相应的特异抗体的含量后,处死动物获得抗血清,经过常规的抗体纯化即可获得抗上述的人H2B抗原的多克隆抗体。采用该抗原免疫小鼠,在检测鼠血清中相应的特异抗体的含量后,处死动物获得脾脏细胞,经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,再经抗原特异性试验筛选,即可获得鼠单克隆抗体。
标记的抗H2B组蛋白抗体可通过生物素标记的试剂(NHS-LC-Biotin,Pirece公司)和/或如带有偶联剂的过氧化物酶(Maleimide activated HRP,Pirce公司)与抗H2B组蛋白抗体反应制得。
如本文所用,“生物液”是指任何含有生物来源的材料的液体。本发明使用的优选生物液,包括动物(尤其是哺乳动物)体液,优选为人。所述体液可以是任何体液,包括但不局限于,血浆、血清、淋巴液、脑脊液(CSF)和其它类似物。
如本文所用,“固相”是指能用本发明的方法在其上对多个液体样品进行分别检验的任何固体基质,如ELISA试验平板、蛋白芯片载体如薄膜、玻璃片等。如本文所用,固相的“反应孔”是指固相上作为平板样品接受区的范围。典型的固相的反应孔,是通过在平板表面形成凹陷来得到的,该凹陷足够接收并容纳样品体积和检测过程中任一步中所加入的缓冲液或洗涤液的体积。如本文所用,对于靶分子的“测量”,是指检测、定量或者测定某一分析物或靶分子的量。
检测方式
抗体是许多应用于医学、兽医学和其它领域的检测技术中的关键试剂。这类测定包括许多常规使用的免疫测定技术,例如蛋白芯片、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定。
免疫测定法可以是酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定(RI A)、以及如ELISPOT (酶联免疫斑点测定)、狭线印迹和western印迹等的免疫检测试验。这些技术的一般指导,参见Ausubel等(eds)(1987)的“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons,New York,N.Y。另外,免疫测定也可是一种用来观测组织样品中的免疫组织化学(IHC)染色或免疫荧光(IF)方法。参见“Principles and Practice ofImmunoassay”(1991)Christopher P.Price和David J.Neoman(eds),Stockton Press,New York,N.Y。
以下是对本发明的分析方法(免疫酶分析法)的详细说明,所述分析方法通过使用针对待测的特定分子形式的H2B组蛋白或其片段或其修饰衍生物有特异性的单克隆和/或多克隆抗体,来测定如人血浆等的生物液中总的(非复合的加上与抗体复合的)或游离的(非复合的)H2B组蛋白或其片段或其修饰衍生物量。在下述的检测中,使用了NUNC Maxisorp,F 96ELISA plate(目录号439454)试验平板,抗体包被溶液为硼酸缓冲溶液(20mM,pH8.0,含有0.1%叠氮化钠)。
1.平板包被:用抗H2B组蛋白抗体,以最佳浓度包被于试验平板的反应孔的表面。最佳抗体浓度是通过用已知浓度的H2B绘制一条标准曲线来确定的,该曲线在所要求的有效浓度范围中具有所要求的灵敏度和精确度。对于H2B,本试剂盒可以检测的有效H2B浓度范围为0pg/ml到2998.5pg/ml。本领域的普通技术人员,可以方便地确定在所要求范围内是否具有合适灵敏度和精确度,而无须进行多余的实验。
2.平板洗涤:将包被溶液倒去,加入洗涤缓冲液(每孔大约400微升)然后倒去。按要求将这个洗涤循环重复多次。洗涤缓冲液为0.010M磷酸缓冲液(0.0027M氯化钾,0.137M氯化钠,pH7.4,含有0.01%w/v TritonX-100)。
3.平板封闭:将含有蛋白质和去垢剂封闭缓冲液(含1%BSA/0.1%TritonX-100的包被缓冲溶液)加入反应孔。平板可以此形式储存。
4.样品和标准品的加入:平板按上述方式进行洗涤。
向平板反应孔内分别加入标准品与待测血清样本各100μl,然后每孔分别加入偶联物试剂50μl,轻轻混合15秒后置37℃孵育60分钟,丢弃反应液,用双蒸馏水清洗反应板5次,吸干多于水分,向反应孔内加入50μl显色液,置于37℃孵育15分钟,终止反应。将反应板置于酶标仪上在450nm波长读取光密度值。每一孔内成色反应不同,光密度值也不同。
5.用于定量复合物显色的合适酶底物的例子有:用于碱性磷酸酶的硝基-苯磷酸,或用于辣根过氧化物的四甲基联苯胺磺酸盐(TMBS)。显色的程度可通过吸光度单位(AU,如果是对硝基酚,读取405nm的吸光度;如果是TMBS,读取450nm的吸光度)读出,可以作为测试样品中H2B的含量的指标,其确切浓度可以通过读取测试样品的吸光度、再参考由H2B标准品所作出的标准曲线来换算得出。
6.读数当得到足够检测信号时,使用如全波长酶标仪或荧光酶标仪等仪器对信号进行测量。
7.数据处理用已知浓度的H2B标准溶液所获得的检测信号,来建立一条校正曲线(信号一浓度)。该校正曲线用于换算出试验样品中H2B的浓度。
以下结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量,除非特别说明。
实施例1IPO-38抗体的敏感性和特异性实验
IPO-38抗体的ROC曲线绘制与临界值计算
利用该试剂盒检测了56例胃癌与15例健康人血清IPO-38结合抗原水平,同时检测了传统肿瘤标志物CEA,CA72-4与CA19-9水平。56例胃癌IPO-38抗原平均水平为156.175±48.00pg/ml;15例健康人IPO-38抗原平均水平为117.109±26.80pg/ml。将各组检测数据绘制ROC曲线,求出曲线下面积(area under curve,简称AUC)。AUC值越大,表明该试剂作为诊断标志物的潜力也越大。从附图1可以看出,IPO-38的AUC较另外几种传统肿瘤标志物均大(附图1)。利用Youden指数计算获得IPO-38检测肿瘤与正常的临界点。经计算,IPO-38的临界点为140.399pg/ml。(参见Epidemiology,2005,16:73-81)
参见附图1对56例胃癌血清利用本试剂盒与传统肿瘤标记物CEA、CA72-4、CA19-9同时检测,作出的ROC曲线图。本试剂盒的敏感性优于其他几种传统的肿瘤标记物。
IPO-38抗体免疫沉淀试验
对体外培养胃癌细胞株裂解液采用IPO-38抗体进行免疫沉淀,取沉淀产物进行MALDI-TOF质谱鉴定。鉴定结果显示,IPO-38沉淀产物为H2B组蛋白(附图2)。
参见附图2.对胃癌细胞株提取的蛋白质采用IPO-38抗体进行免疫沉淀产物的MALDI-TOF质谱鉴定结果,鉴定序列提示为H2B组蛋白(14kDa)。
IPO-38抗体与H2B抗体蛋白印迹试验
按常规细胞培养方法和生化蛋白提取方法,培养胃癌细胞系KATOIII和SUN-16,然后分别提取KATOIII和SUN-16的蛋白。
为了明确IPO-38与H2B的相互关系,对于体外培养胃癌细胞的蛋白提取液,分别利用IPO-38抗体与H2B抗体进行Western blot检测,结果显示,IPO-38与H2B电泳条带定位于14kDa同一水平(附图3)。
参见附图3.对胃癌细胞株KATOIII和SUN-16提取蛋白质同时利用IPO-38抗体与H2B抗体进行蛋白印迹检测。两种抗体检测物均位于14Kda水平,符合H2B组蛋白分子质量。
IPO-38抗体与H2B组蛋白抗体荧光组化试验
按常规细胞培养方法和免疫组化方法,培养胃癌细胞系KATOIII,然后收集养胃癌细胞,PFA固定,涂片,再分别利用IPO-38抗体(FITC标记,绿色荧光)与H2B抗体(Cy3标记,红色荧光)进行免疫荧光标记,然后利用激光共聚焦显微镜观察,发现两者均定位于细胞核,双抗体共定位区显示为黄色(附图4)。
附图4.体外培养胃癌细胞株的IPO-38抗体与H2B组蛋白抗体双标记荧光染色,激光共聚焦显微镜观察结果,两种抗体呈共定位标记染色。
实施例2胃癌诊断试剂盒
一种胃癌诊断试剂盒,包括:
H2B组蛋白标准品1瓶;
HRP标记的IPO-38单克隆抗体1瓶;
IPO-38单克隆抗体包被平板(96孔)1块;
正常人血清1瓶;
底物溶液:磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3%H2O21瓶;
显色液:0.1mg/ml TMB甲醇溶液1瓶;
反应终止液:2M硫酸1瓶;
清洗缓冲液:PBS溶液1瓶。
实施例3胃癌诊断试剂盒临床预后预测试验
对于56例术前检测过IPO-38的胃癌手术后跟踪随访,随访期1-21个月,平均随访时间11.34个月。将随访结果进行Kaplan-Meier生存曲线分析与Log-Rank检验,IPO-38阴性组平均生存时间为18.40±1.18月;而IPO-38阳性组平均生存时间为15.66±1.41月(附图5)
附图5.对于术前进行过本试剂盒检测的胃癌术后随访显示,本检测试剂阳性病例手术后预后较阴性病例差(P=0.0467)。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上,除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。