CN111239398B - 一种血清ethe1蛋白自身抗体检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的血清ETHE1蛋白自身抗体的检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括固相载体以及包被于固相载体上的抗原,所述抗原是ETHE1蛋白。本发明能够检测出与所述抗原蛋白有亲和力的ETHE1自身抗体的水平,提供了一种以自身抗体为指标进行癌症筛选的新方法。
Description
技术领域
本发明属于体外医学诊断技术领域,更特定的,涉及一种新的血清ETHE1 蛋白自身抗体检测的方法。
背景技术
根据世界卫生组织数据显示,2018年,全球新患癌症人数达1810万人, 960万人因癌症死亡。2018年全球发生209万例肺癌新病例,在所有癌症类型中排名第一。肺癌在组织学上可分为两大类:小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC约占诊断出肺癌的79%,包括腺癌,鳞状细胞癌和大细胞癌。尽管近年来针对肺癌的靶向疗法和免疫疗法取得了巨大进步,但外科切除,辅助放疗和/或化疗仍然是早期治疗NSCLC患者的首选方法。当前,胸部高分辨率(或小剂量)计算机断层扫描(LDCT)是唯一可有效降低肺癌早期死亡率的筛查试验。但其临床转化仍然是问题。LDCT的问题还在于较高的假阳性率一定程度上会导致过度诊断。重复暴露于放射线也可能会导致潜在的健康危害。因此,发现用于早期肺癌诊断的非侵入性血清学生物标记物将大大有利于肺癌的干预和预防。采用基于生物标志物的初始筛选后进行 LDCT或将生物标志物测试与LDCT相结合的方法成为了更好的肺癌诊断手段。
近年来研究发现,有望通过在癌症患者血清内检测到高表达(相对于健康人和良性肿瘤)的自身抗体来实现肿瘤相关自身抗体检测。当前的在临床中运用得比较多的是肿瘤相关抗原,例如碳水化合物抗原(CA)125,CA19-9,癌胚抗原(CEA)和α胎儿蛋白(AFP)。这些标志物在血清中的含量是随着肿瘤大小的增长而增高的,所以肿瘤相关抗原在癌症早期的灵敏度和特异性都非常差。自身抗体在肿瘤发生的早期产生,可在出现临床症状之前五年被检测到。在癌症早期,检测出来的肿瘤相关抗原的信号非常弱,但由于自身抗体的浓度远远高于抗原,所以检测自身抗体相当于得到了一个放大的信号。自身抗体在血液循环中的半衰期达到了30天,在体外也比其他的标志物要稳定。自身抗体检测具有经济合算、操作简便等优点。自身抗体检测可以直接在现有的临床检测平台利用存档的血清实现。
ETHE1(Ensembl:ENSG00000105755 MIM:608451)由19号染色体上的 ETHE1基因编码,在结肠(RPKM 85.9),十二指肠(RPKM 30.9)和其他20 个组织中广泛表达。ETHE1蛋白催化过硫化物底物氧化为亚硫酸盐。目前已有一些研究显示ETHE1蛋白自身抗体水平与癌症发生存在相关性,但仍未有将其作为癌症诊断标志物的确切报道。发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种新的自身抗体生物标志物,发展出一套适用于癌症检测的方法。
本发明的检测方法和原理为将ETHE1蛋白固相在固相载体上,血清孵育后,血清中ETHE1自身抗体(主要包括IgG、IgA型抗体,也有一些其它类型的抗体)会结合上去,清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质,通过检测显色或发光信号来判断ETHE1自身抗体的数量。
本发明提供了以下技术方案:
一种用于检测哺乳动物血清ETHE1蛋白自身抗体的试剂盒,包括固相载体、包被于固相载体上的抗原以及检测试剂,所述抗原为ETHE1蛋白。
进一步的,如上所述的试剂盒检测的自身抗体为IgG、IgA和/或其它类型的抗体。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述固相载体包括:酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、玻片、试纸条和塑料球。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述ETHE1蛋白是通过直接包被法固定在固相载体上的,所述直接包被法是将ETHE1蛋白直接固定于固相载体上。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述ETHE1蛋白是通过间接包被法固定在固相载体上的,所述间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将ETHE1蛋白间接固定于固相载体上。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述检测试剂是用于可见光显色法、化学发光法或荧光发光法的检测。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述检测试剂包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
进一步优选的,如上所述的试剂盒中所述检测试剂包括包被缓冲液、清洗缓冲液、封闭液、稀释液、终止液、显色底物。
进一步优选的,如上所述的试剂盒包含包被缓冲液:0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液、清洗缓冲液:PH7.4 1×PBST、封闭液:含3%BSA的1×PBST、稀释液:含1%BSA的1×PBST、终止液:2M H2SO4、显色底物:康为世纪TM TMB底物显色试剂盒。
再进一步可选的,如上所述的试剂盒中所述有标记物的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG或者抗人IgA抗体。
另一方面,如上所述的试剂盒所针对的哺乳动物为人类。
进一步的,如上所述的试剂盒是用于癌症的辅助诊断,尤其是肺癌的辅助诊断
本发明还提供了ETHE1蛋白自身抗体作为肿瘤标志物在制备癌症检测试剂盒中的应用,其中所述自身抗体为IgG、IgA和/或其它类型的抗体,所述癌症优选的为肺癌。
本发明还提供了一种用于检测哺乳动物血清ETHE1蛋白自身抗体的检测方法。
如前述的检测方法,所述ETHE1蛋白固定于固相载体上。
进一步可选的,该检测方法中的固相载体包括:酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、玻片、试纸条和塑料球。
进一步可选的,该检测方法中ETHE1蛋白的固定方法包括直接包被法和间接包被法,其中,直接包被法是将ETHE1蛋白直接固定于固相载体上,间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。
进一步可选地,该检测方法所用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。
进一步可选地,该检测方法检测的自身抗体为IgG和/或IgA。
进一步可选地,该检测方法所用试剂包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和 /或清洗缓冲液。
进一步可选的,该检测方法所用试剂包括包被缓冲液、清洗缓冲液、封闭液、稀释液、终止液、显色底物。
进一步优选的,该检测方法所用试剂为,包被缓冲液:0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液、清洗缓冲液:PH7.4 1×PBST、封闭液:含3%BSA的1×PBST、稀释液:含1%BSA的1×PBST、终止液:2M H2SO4、显色底物:康为世纪TM TMB底物显色试剂盒。
进一步可选地,该检测方法的用途为癌症的辅助诊断;优选的,该检测方法的用途为肺癌的辅助诊断。
进一步优选的,该检测方法具体步骤为:
1)包被ETHE1蛋白:用包被缓冲液将蛋白稀释,在聚苯乙烯板的反应孔中加入稀释后的蛋白50ng/孔,4℃过夜;
2)复温:将酶标板从4℃冰箱取出,置于室温复温半小时,洗涤四次。
3)封闭:加封闭液,37℃孵育一小时,洗涤两次;
4)加入血清样本:加入1:200稀释的血清样品,放置于侧摆摇床 12rpm室温孵育2.5h,洗涤四次(血清需提前放置于4℃冻融,稀释后的血清先震荡混匀再加样);
5)加酶标抗体:于各反应孔中,加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 或者抗人IgA抗体(4μg/ml)。放置于侧摆摇床12rpm室温避光孵育1小时,洗涤两次;
6)加显色底物:于各反应孔中加入50μl临时配置的TMB底物溶液;
7)终止:待孔中液体变蓝后,于各反应孔中加入25μl 2M H2SO4;
8)上机读数:在TECAN F50酶标仪中测量0D 450的读数,并保存数据。
另一方面,该检测方法所述哺乳动物为人类。
本发明提供了一种新的癌症检测标记物和一种新的癌症检测方法,能够实现癌症的有效筛查和辅助诊断;且能以血清作为检测样品,对患者伤害很低。本发明具备良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下文中“ETHE1自身抗体”,指的是“ETHE1蛋白自身抗体”。
附图说明
可通过参考实施方式来获得能详细了解本文的上述特征的方式和简短地在前面概述过的本文的更具体描述,所述实施方式的一些实施方式在附图中示出。但是应注意的是,附图仅示出本文的典型实施方式,并且因此附图不应被视为会对本发明范围构成限制,这是因为本文可允许其他等效实施方式。
图1:肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体水平对比。
图2:肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体水平对比。
图3:一期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体水平对比。
图4:一期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体水平对比。
图5:二期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体水平对比。
图6:二期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体水平对比。
图7:三期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体水平对比。
图8:三期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体水平对比。
图9:四期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体水平对比。
图10:四期肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体水平对比。
图11:肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgG型自身抗体ROC分析。
图12:肺癌患者与健康对照血清浆中ETHE1 IgA型自身抗体ROC分析。
具体实施方式
实施例1血浆中ETHE1自身抗体与肺癌的关系
1.检测原理
酶标孔板上固定有ETHE1蛋白,加血清孵育后,血清中ETHE1自身抗体 (主要包括IgG、IgA型抗体,也有一些其它类型的抗体)会结合上去,清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质,再加入抗人IgA辣根过氧化物酶标记二抗或者抗人IgG辣根过氧化物酶标记二抗孵育后,洗去未结合二抗,加入辣根过氧化物酶底物,待底物显色后,通过酶标仪检测,信号的强弱与ETHE1自身抗体的数量呈正相关。
2.研究对象
选取肺癌患者202例,健康对照107例,基本信息如下:
3.材料和方法
3.1材料
实验所用试剂如下:
包被缓冲液 | 0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液 |
洗涤缓冲液 | PH7.4 1×PBST |
封闭液 | 含3%BSA的1×PBST |
稀释液 | 含1%BSA的1×PBST |
终止液 | 2M H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> |
显色底物 | 康为世纪<sup>TM</sup> TMB底物显色试剂盒 |
3.2实验方法
1)包被ETHE1蛋白:用包被缓冲液将蛋白稀释,在聚苯乙烯板的反应孔中加入稀释后的蛋白50ng/孔,4℃过夜;
2)复温:将酶标板从4℃冰箱取出,置于室温复温半小时,洗涤四次。
3)封闭:加封闭液,37℃孵育一小时,洗涤两次;
4)加入血清样本:加入1:200稀释的血清样品,放置于侧摆摇床 12rpm室温孵育2.5h,洗涤四次(血清需提前放置于4℃冻融,稀释后的血清先震荡混匀再加样);
5)加酶标抗体:于各反应孔中,加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 或者抗人IgA抗体(4μg/ml)。放置于侧摆摇床12rpm室温避光孵育1小时,洗涤两次;
6)加显色底物:于各反应孔中加入50μl临时配置的TMB底物溶液;
7)终止:待孔中液体变蓝后,于各反应孔中加入25μl 2M H2SO4;
8)上机读数:在TECAN F50酶标仪中测量0D 450的读数,并保存数据。
4.结果
4.1 肺癌患者血浆中的ETHE1 IgG型自身抗体(图1)的表达水平与健康对照组有显著统计学差异。
4.2 肺癌患者血浆中的ETHE1 IgA型自身抗体(图2)的表达水平和健康对照组有显著统计学差异。
4.3 I期肺癌患者IgG型自身抗体(图3)和IgA型自身抗体(图4)水平均与健康人无统计学差异。
4.4 II期肺癌患者中IgG型自身抗体(图5)和IgA型自身抗体(图6)水平与健康人均存在统计学差异。
4.5 III期肺癌患者IgG型自身抗体(图7)和IgA型自身抗体(图8)水平均与健康人无统计学差异。
4.6 IV期肺癌患者IgA型自身抗体(图9)水平与健康人存在显著差异,而IgG型(图10)无统计学差异。
4.7 肺癌组与健康组的ETHE1 IgG型自身抗体ROC分析(图11)特异性为 90.30%,灵敏度为13.13%。
4.8 在肺癌组与健康组的ETHE1 IgA型自身抗体ROC分析(图12)中,特异性为91.59%,灵敏度为17.82%。
由以上结果可知,肺癌患者与健康人的血清中ETHE1自身抗体的水平差异显著,通过检测血清中ETHE1自身抗体的水平,能够达到肺癌检测的目的。
尽管上述说明涉及本文的实施方式,但可设想出其他与进一步的实施方式而不悖离本文的基本范围,并且本文的范围由随附的权利要求来确定。
Claims (5)
1.ETHE1蛋白自身抗体作为肿瘤标志物在制备癌症检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述自身抗体为IgA,所述的试剂盒用于II期肺癌的辅助诊断,所述的试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的抗原以及检测试剂,所述抗原为ETHE1蛋白。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述ETHE1蛋白是通过直接包被法固定在固相载体上的,所述直接包被法是将ETHE1蛋白直接固定于固相载体上。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述ETHE1蛋白是通过间接包被法固定在固相载体上的,所述间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将ETHE1蛋白间接固定于固相载体上。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述检测试剂是用于可见光显色法、化学发光法或荧光发光法的检测。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述检测试剂包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
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