KR101090293B1

KR101090293B1 - 폐에서의 이산화티타늄 나노입자 오염 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR101090293B1
Application number: KR1020090123676A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 전유미
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR20110067187A

Abstract

본 발명은 폐에서 이산화티타늄 나노입자 오염을 진단하는 바이오마커 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 정상세포와 비교할 때 이산화티타늄 나노입자 노출 시험군에서 그 발현이 현저히 증가하거나 현저히 감소하는 단백질 바이오마커와 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.

이산화티타늄, 나노입자, 바이오마커, 폐, 독성, 오염

Description

폐에서의 이산화티타늄 나노입자 오염 진단용 바이오마커{Biomarkers for diagnosing the addiction of titanium dioxide nanoparticles in lung}

최근 나노 산업의 발전에 따라 그에 따른 안전성 문제가 야기되고 있으며 특히 나노입자의 잠재적 독성에 대한 문제가 대두되고 있다. 나노입자는 일반 입자에 비해 더 많은 활성산소를 생산하며 이로 인해 전염증 매개자(pro-inflammatory mediator)의 전사와 산화적 손상을 야기시킨다(Bregoli, L. et al., (2009) Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology 262(2):121-129). 특히 나노입자는 사람의 폐중독을 유발할 수 있으며, 랫트를 이용한 만성흡입 실험에서는 나노입자에 의해 폐 염증과 세포독성, 세포분열, 폐 섬유증 및 폐 암을 유발할 수 있다고 보고되었다 (Chen, H. W. et al., (2006) Titanium dioxide nanoparticles induce emphysema-like lung injury in mice. FASEB J. 20:E1732-E1741). 이처럼 나노입자는 입자크기가 작아질수록 그 침투성이 높아지게 되어 새로운 건강문제를 야기할 수 있다.

나노입자 유해성의 심각성은 물질의 접촉 부위 외에도 전신 독성을 유발할 가능성이 있다는 것이다. 나노입자가 폐에 침착하면 폐 염증뿐만 아니라 혈관 내 혈전을 유발할 수 있며, 피부를 통한 나노입자의 침투는 면역계를 자극할 가능성이 높고, DNA 구조와 안정성을 변형시킬 가능성도 제기되었다 (Zhao, X. et al., (2005) C60 binds to and deforms nucleotides. Biophys. J. 89:3856-3862).

이산화티타늄은 무독성 색소로서 화장품과 의약품 및 산업 분야에 널리 사용되어 왔다. 그러나 이산화티타늄 나노입자 사용이 증가함에 따라 그 독성에 대한 문제가 제기되어 이산화티타늄 나노입자의 잠재적 독성 및 환경에 미치는 영향에 대한 연구가 진행되어 왔다. Oberd(1994) (Oberd, G. et al., (1994) Correlation between particle size, in vivo particle persistence, and lung injury. Environ. Health Perspect. 102:173-179) 등은 화학성분이 동일한 나노입자의 경우 입경 100nm 이하의 입자가 100nm 이상의 입자에 비하여 일반적으로 독성이 높고, 21nm 이산화티타늄은 250nm 입자에 비하여 급성 염증을 43배 더 유발하였으며, 특히 입자 표면적이 독성과 관련 있다고 보고하였지만 (Borm, P. J. et al., (2006) Research strategies for safety evaluation of nanomaterials, Part V: Role of dissolution in biological fate and effects of nanoscale particles. Toxicol. Sci. 90:23-32), 이산화티타늄의 세포독성 유발능이 입자의 크기나 표면적과 반드 시 비례하지는 않는다고 보고되었다 (Sayes, C. M. et al., (2006) Correlating nanoscale titania structure with toxicity: a cytotoxicity and inflammatory response study with human dermal fibroblasts and human lung epithelial cells. Toxicol. Sci. 92:174-185).

Dunford 등은 이산화티타늄이 피부에 나노입자 내 유리기(free radicals)라는 유해요소를 점차 많이 발생시키고 DNA를 손상시키며, 이 유리기는 콜라겐 조직을 붕괴시킬 뿐만 아니라, 결과적으로는 피부에 깊은 주름을 패이게 한다고 보고하였다(Dunford, Salinaro et al., (1997) Chemical oxidation and DNA damage catalysed by inorganic sunscreen ingredients. FEBS Letters, 418:87-90).

이산화티타늄 나노입자에 노출되면 세포독성, 산화적 손상, 폐 염증, 세포 분열 및 폐독성에 의한 조직병리학적 변화를 야기하며, 폐암으로 발전될 가능성에 대하여 보고하였으며 더욱이, 이산화티타늄 나노입자는 세포내 과산화수소 및 산화질소의 생산을 증가시키며, 세포자살을 유발시킨다 (Park, E. J. et al., (2009) Induction of chronic inflammation in mice treated with titanium dioxide nanoparticles by intratracheal instillation. Toxicology 260: 37-46).

또한, 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 변화를 관찰한 실험 결과 핵 근처에 나노입자가 결집(aggregation)된 것을 관찰할 수 있었으며, 흰쥐에 이산화티타늄 나노입자를 복강투여한 실험에서는 나노입자가 비장, 폐, 신장, 간 조직에 축적되어 있었다. 이처럼 이산화티타늄 나노입자에 의해 주요 병리학적 변화가 유도된다 (Bregoli, L. et al., (2009) Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology 262(2):121-129).

Thrall은 이산화티타늄 나노입자가 쥐의 중추신경계 신경교의 일종이자 외부자극으로부터 뇌를 보호하는 세포인 소교세포(microgila)에 영향을 준다는 연구 결과를 내놓았다. 신경세포를 보호하는 면역세포는 외부에서 이물질이 들어오면 활성산소를 분비해 태워버리는데, 이산화티타늄 나노입자에 1시간 이상 노출되면 활성산소가 과다 분비되어 주변의 신경세포에 손상을 입힌다 (Thrall, L. (2006) Study links TiO₂ nanoparticles with potential for brain-cell damage. Environ. Sci. Technol. 40:4326-4327).

이산화티타늄 나노입자의 독성연구는 주로 세포독성과 유전독성에 치우쳐있어서 단백질 수준에서의 연구는 거의 진행되어 있지 않다. 따라서, 이산화티타늄 나노입자에 의한 단백질 발현양의 변화가 어떻게 질병을 유발하는지에 대하여 자세히 연구되어 있지 않다. 유전자는 세포 내에서 단백질 합성 후 변형(post translational modification) 여부에 따라 세포 내에서의 기능이 좌우될 뿐만 아니라 유전자 전사에 의해 합성된 mRNA가 실제로 단백질을 만드는 양은 세포나 조직 및 기관 내 생리적 조건에 따라서 매우 크게 변한다. 이러한 이유로 최근에는 최종 산물인 단백질 수준에서의 분석이 유전자 수준에서의 분석보다 중요한 것으로 받아들여지고 있다.

본 발명은 단백질 수준의 이산화티타늄 나노입자 오염 진단용 바이오마커를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 2차원 전기영동기술을 이용하여 정상 대조군 세포와 비교하여 이산화티타늄 나노입자 처리 시험군에서 그 발현이 현저히 높아지거나 또는 현저히 낮아지는 단백질을 선별하여 이를 이산화티타늄 나노입자 오염을 진단하는 용도로 이용할 수 있음을 밝혀내어 이를 이용한 진단용 키트를 발명하기에 이르렀다.

본 발명자들은 이산화티타늄 나노입자에 의해서 변화되는 마우스 폐 조질내 단백질의 발현 양상의 변화를 프로테오믹스(Proteomics)기술을 이용하여 분석하였다. 이차원 전기영동과 펩타이드와 아미노산수준에서 정확한 질량분석이 가능한 LC MS/MS를 사용하여 단백질의 발현양상을 정확하게 관측하였다.

본 발명에 따른 이산화티타늄 나노입자 오염 마커는, 스트레스 반응 단백질로서 열충격 단백질 90(Heat shock protein, Hsp90ab1) 및 퍼옥시레독신 6(Prdx6), 전사 조절 단백질로서 세포질 아코니테이즈(Cytoplasmic aconitase), 세포골격 및 운동성 단백질로서 모에신(Moesin, Msn), 해당과정 단백질인 피루브산 키나아제 아이소자임 M1/M2의 아이소폼 M2(Isoform M2 of Pyruvate kinase isozymes M1/M2, Pkm2)와 L-젖산 탈수소효소 A 사슬(lactate dehydrogenase A chain, Ldha), 대사과정 단백질로서 탄산 탈수소효소 1(Carbonic anhydrase 1, Car1), 지질 대사 단백질인 아포리포단백질 A-1 전구체(Apolipoprotein A-1 precursor, Apo1) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

세포질 아코니테이즈(Cytoplasmic aconitase) (스팟 2)는 세 개의 카르복실산 음이온의 상호전환을 촉매하는 효소로서 이산화티티늄 나노입자에 의해 발현량이 증가하였다. 세포질 아코니테이즈는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼에 의한 공격에 특히 민감한 반응을 보이며, 세포질 아코니테이즈 촉매활성이 감소되면 활성산소의 축적을 야기시킨다 (Qin, G. et al., (2009) Oxidative damage of mitochondrial proteins contributes to fruit senescence: a redox proteomics analysis. J. Proteome Res. 8(5):2449-2462). 그러므로 이산화티타늄 나노입자에 의한 세포질 아코니테이즈 효소 발현량 증가는 활성산소의 축적을 방지하기 위한 방어작용으로, 이산화티타늄 나노입자에 의해 유도되는 여러 산화적 스트레스와 연관있을 것으로 예상된다.

피루브산 키나아제(Pyruvate kinase)는 해당과정에 관여하는 효소로 잘 알려져 있으며, 조직 특이성을 가지는 여러가지 동종효소들이 존재하고, 포스포이놀피루브산(phosphoenolpyruvate)은 피루브산 키나아제의 작용으로 피루브산(pyruvate)이 되고 동시에 ADP에 인산을 전달하여 ATP를 생성한다 (DeSouza, L. V. et al., 2008. Multiple reaction monitoring of mTRAQ-labeled peptides enables absolute quantification of endogenous levels of a potential cancer marker in cancerous and normal endometrial tissues. J. Proteome Res. 7(8):3525-3534). 피루브산 키나아제는 동종효소 M1, M2로 발현되는데 특히, M2는 암세포내 호기성 당분해에 꼭 필요하다 (Christofk, H. R. et al., (2008) Pyruvate kinase M2 is a phosphotyrosine-binding protein. Nature 452(7184):181-186). 더욱이 피루브산 키나아제 M2의 발현이 다양한 종양에서 증가한다고 알려져 있다 (Schneider, J. et al., (2000) Quantitative detection of tumor M2-pyruvate kinase in plasma of patients with lung cancer in comparison to other lung diseases. Cancer Detect. Prev. 24(6):531-535). 그러므로, 본 발명의 결과에서 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현양이 증가된 것으로 검출된 피루브산 키나아제는 동종효소 M2일 것으로 예상되며, 이산화티타늄 나노입자에 의한 폐염증 및 폐질환 유발과 관련 있을 것으로 생각된다.

젖산 탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)는 피루브산(pyruvic acid)과 젖산(latic acid) 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, 세포내 에너지 생산과정에 중요한 역할을 한다. 최근 연구에서는 LDH가 말기 암 환자의 생존기간에 대한 예후지표로서 평가받고 있으며, LDH의 예후지표로서의 역할은 특정 암 그룹들에서 폭넓게 연구되어 왔다. LDH의 증가는 위암, 췌장암, 대장암, 전립선암 그리고 혈액종양 환자들의 낮은 생존율과 연관된 예후지표로서 보고되어 왔다 (Suh, S. Y., Ahn, H. Y. (2007) Lactate dehydrogenase as a prognostic factor for survival time of terminally ill cancer patients: a preliminary study. Eur. J. Cancer 43(6):1051-1059). 본 발명의 실험 결과 이산화티타늄 나노입자에 노출된 마우스 폐 조직 내에서 L-젖산 탈수소효소 A 사슬 (스팟 5) 단백질의 발현양이 증가하였다.

산화적 스트레스에 대한 방어기작으로 세포는 많은 수의 항산화 효소들을 발현한다. 퍼옥시레독신은 항산화 효소의 한 종류로 세포내 분포 위치에 따라 여러 그룹으로 분류되며, 사이토카인에 의해 유도되는 과산화물의 레벨을 조절하고, 인체의 거의 모든 세포에 존재한다. 또한, 체내에서 세포신호전달을 조절하는 과산화수소의 작용을 조절하며 세포 증식, 분열 그리고 세포 사멸과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 퍼옥시레독신 6는 폐손상 및 과산소 또는 파라콰트 노출과 관련된 마우스 사망율에서 효소의 발현양이 증가한다고 보고되었다 (Wang, Y. et al., (2008) Peroxiredoxin 6 as an antioxidant enzyme: protection of lung alveolar epithelial type II cells from H₂O₂-induced oxidative stress. J. Cell. Biochem. 104(4):1274-1285). 이산화티타늄 나노입자에 의해 퍼옥시레독신 6 (스팟 8) 단백질의 발현양이 증가하였고, 이는 이산화티타늄에 의해 유도되는 다양한 산화적 손상과 관련되었을 것으로 생각되며, 이산화티티타늄 독성에 대한 방어기작으로 퍼옥시레독신이 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

본 발명의 실험 결과 이산화티타늄 나노입자의 노출에 의해 탄산 탈수소효소(carbonic anhydrase 1, CA) (스팟 6)의 발현양이 증가하였다. 탄산 탈수소효소는 아연을 함유한 금속성 효소로 이산화탄소를 이탄산과 프로톤으로 전환을 촉매하여 호흡, 산염기 평형, 이온 수송 등과 같은 다양한 생리학적 및 생물학적 활성에 관여한다 (Sly, W. S., Hu, P. Y. (1995) Human carbonic anhydrases and corbonic anhydrase deficiencies. Annu. Rev. Biochem. 64:375-401). 탄산 탈수소효소는 현재까지 10여종의 동위효소가 알려져 있으며 크게 세포내 탄산 탈수소효소와 세포밖 탄산 탈수소효소로 분류되며, 그중 탄산 탈수소효소 1은 세포내 세포질에 존재한다. 탄산 탈수소효소는 염증 통증과 관련이 있고, 조직내 pH의 감소 및 근육내 pH의 세포외 조절과도 관련되어 있다 (Radhakrishnan, R., Sluka, K. A. (2005) Acetazolamide, a carbonic anhydrase inhibitor, reverses inflammation-induced thermal hyperalgesia in rats. J. Phrmacol. Exp. Ther. 313(2):921-927).

아포리포단백질(Apolipoprotein) A-1 (Apo A-1)은 고밀도 지방 단백질의 주요 구성 단백질로서, 심장순환계의 방어기작 역할을 해왔다. 더욱이 세포 매개 염증과정에서 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 생산의 강력한 억제제 역할을 한다. 게다가, Apo A1은 항염증 분자로서, 대식세포로부터 T세포 신호를 막고, 종양괴사인자 알파 및 인터루킨 1의 생산을 억제한다. 이 결과 Apo A1 레벨이 증가하면 염증을 감소시킬 수 있음을 보여준다 (Hyka, N. et al., (2001) Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha by blocking contact-m ediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood 97(8): 2381-2389). 이 단백질의 전구체인 아포리포단백질 A-1 전구체(Apolipoprotein A-1 precursor) (스팟 7)는 본 발명의 실험에서 이산화티타늄 나노입자에 의하여 발현량이 감소하였으며, 이산화티타늄 나노입자에 의해 유도되는 염증유발과 관련 있을 것으로 예상된다.

모에신(Moesin)은 ERM(ezrin/radixin/moesin) 단백질 구성원 중 하나로서, ERM 단백질은 액틴이 풍부한 특이 막 구조 즉, 미세융모(microvilli), fuffles, 분할 고랑(cleavage furrows) 등과 같은 구조에서 막-세포골격 연결자 역할을 하며, 세포의 형태, 부착, 운동성에 중요한 역할 및 세포를 원래의 상태로 유지시키는 역할도 한다. 모에신은 특히 세포-세포 인지, 신호, 세포 운동에 중요한 역할을 한다. 몇몇 실험에서는 모에신 단백질 발현이 갑상선암, 구강편평상피세포암 그리고 기저 유방암과 관련있을 것으로 지적하였다 (Charafe-Jauffret, E. et al., (2007) Moesin expression is a marker of basal breast carcinomas. Int. J. Cancer 121:1779-1785). 그러므로 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현양이 감소된 모에신(스팟 3)은 이산화티타늄 나노입자 의한 세포의 형질전환 및 암종과 관련 있는 것으로 생각된다.

열 쇼크 90kDa 단백질(Heat shock protein 90kDa, Hsp90) (스팟 1)은 이산화티타늄 나노입자에 의해 감소되는 단백질이다. 이는 분자량 크기에 따라 다양한 그룹으로 분류되며, 중금속, 열자극, 저산소증 등의 다양한 산화 스트레스에 의해 발현된다고 알려진 단백질로 정상적인 단백질 접힘과 집합에서 분자 샤프론으로 작용할 뿐만 아니라, 스트레스 상태에서의 단백질 복구와 세포 보호 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Krzysztof Laudanski et al., (2007) Exogenous heat shock protein 27 uniquely blocks differentiation of monocytes to dendritic cells. Eur. J. Immunol. 37, 2812-2824). 또한, Hsp90 단백질의 억제가 다양한 경로를 통해 세포자살을 유도한다는 연구가 보고되어 왔다.

몇몇 마우스를 사용한 이산화티타늄 나노입자 주입 실험들에서는 이산화티타늄 나노입자가 비장, 폐, 신장, 간 조직에 남아 축적되어 있다고 하였으며 이산화티타늄 나노입자에 의하여 중요 병리학적 변화를 보인다고 보고하였다. 투과전자현미경적 관찰을 통한 실험결과 이산화티타늄이 마우스 폐 조직내로 들어가, 세포질이나 핵 근처에 나노입자들이 응집되어 클러스터를 형성하는 모습이 뚜렷하게 관찰되었다.

본 발명은 정상세포와 비교할 때 이산화티타늄 나노입자 노출 시험군에서 그 발현이 현저히 증가하거나 현저히 감소하는 단백질 바이오마커 또는 그 면역원성 단편을 제공한다.

상기 단백질 바이오마커는 스트레스 반응 단백질로서 열충격 단백질 90kDa(Heat shock protein 90kDa, Hsp90ab1) 및 퍼옥시레독신 6(Prdx6), 전사 조절 단백질로서 세포질 아코니테이즈(Cytoplasmic aconitase), 세포골격 및 운동성 단백질로서 모에신(Moesin, Msn), 해당과정 단백질인 피루브산 키나아제 아이소자임 M1/M2의 아이소폼 M2(Isoform M2 of Pyruvate kinase isozymes M1/M2, Pkm2)와 L-젖산 탈수소효소 A 사슬(lactate dehydrogenase A chain, Ldha), 대사과정 단백질로서 탄산 탈수소효소 1(Carbonic anhydrase 1, Car1), 지질 대사 단백질인 아포리포단백질 A-1 전구체(Apolipoprotein A-1 precursor, Apo1) 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

상기 면역원성 단편은 외부 숙주에 주입하였을 때 반응성 항체를 생산할 수 있는 상기 단백질 중 일부를 말하는 것이다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 본 발명의 항체는 종래 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명은 정상 대조군과 비교하여 상기 바이오마커 단백질 양의 증가 또는 감소로 이산화티타늄 나노입자 오염을 진단하는 것을 특징으로 하는 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오마커 검출을 통한 이산화티타늄 나노입자 오염 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 마커 검출방법은

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 상기 1종 이상의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "마커"는 이산화티타늄 나노입자 오염 세포를 정상 세포와 구분 하여 진단할 수 있는 물질로, 상기 바이오마커 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 이산화티타늄 나노입자 오염 세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 특징을 나타낸다.

본 발명에서 "진단"은 이산화티타늄 나노입자 오염 상태의 특징을 확인하는 것을 의미한다.

생물학적 시료 중의 바이오마커 단백질 발현량의 증대 또는 감소는 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 바이오마커 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 이산화티타늄 나노입자 오염 세포에서 발현 증가 또는 감소한 상기 바이오마커 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 바이오마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 이산화티타늄 나노입자 오염 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 바이오마커 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 의심환자의 실제 오염 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 상기 바이오마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 상기 바이오마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 이산화티타늄 나노입자 오염 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질 의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 중독 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 바이오마커에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 오염 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 바이오마커 단백질 발현량과 염화메틸렌 중독 세포에서의 마커 단백질의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. 단백질의 수준은 바이오마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이산화티타늄 나노입자 오염 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 8종의 바이오마커 단백질이 이산화티타늄 나노입자 오염 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 상기 바이오마커 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 바이오마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 바이오마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 바이오마커 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 바이오마커 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

Spot No.	Identified protein	Annotation	Score	Cov %	MW	Change
1	Hsp90ab1(Heat shock protein 90)	IPI00229080.7	218.30	36.05	83280.7	↘
2	Cytoplasmic aconitase	IPI00622780.1	190.29	31.59	99102.0	↗
3	Msn(Moesin)	IPI00110588.4	70.29	17.16	67766.5	↘
4	Pkm2(Isoform M2 of Pyruvate kinase isozymes M1/M2)	IPI00407130.4	230.31	45.76	57844.6	↗
5	Ldha(L-lactate dehydrogenase A chain)	IPI00319994.6	146.30	43.67	36498.3	↗
6	Car1(Carbonic anhydrase 1)	IPI00230320.6	90.25	47.51	28320.3	↗
7	Apo1(Apolipoprotein A- precursor)	IPI00121209.1	148.22	49.24	24870.5	↘
8	Prdx6(Peroxiredoxin-6)	IPI00555059.2	60.33	32.59	24870.5	↗

본 발명에 의한 이산화티타늄 나노입자 중독 진단용 바이오마커는 8개의 단백질 중 1종 이상 단백질의 발현량 변화를 탐지함으로써 이산화티타늄 나노입자 중독 여부를 민감하게, 그리고 특이적으로 검출할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명의 구성을 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 실시예의 기재 범위에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실험방법

<실시예 1: 실험동물 배양 및 이산화티타늄 나노입자 준비>

6주령 수컷 ICR 마우스는 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다. 실험동물은 무작위로 그룹을 나누어 사용하였으며, 사육 조건은 온도 21~23℃, 습도 40~60%, 조명 12시간 명암으로 유지시켰으며, 실험동물은 분양 받은 다음날 사용하였다. 본 실험에 사용한 실험동물은 중앙실험 동물 사육장으로 부터 공급받아 실험에 사용하였으며, 사용한 이산화티타늄 나노입자의 크기는 <25㎚로 시그마알드리치사에서 구입하였다.

<실시예 2: 감작 및 유도>

모든 ICR 수컷 마우스는 대조군과 처리군으로 각각 6마리씩 나누었다. 처리군에는 2.5㎎의 이산화티타늄 나노입자를 0.2㎖의 PBS 완충용액에 넣고 섞은 후 결집(aggregation)을 막기 위해 마우스에 처리하기 전, 초음파 진동을 10분간 가하였다. 마우스에 복강주사 30분이 지난 후 0.1㎎/0.1㎖의 이산화티타늄 나노입자를 PBS에 녹인 후 코에 넣어주었다. 대조군은 똑같은 방법으로 마우스에 PBS로만 주사하였다. 위와 같은 실험을 7일간 반복해 주었다.

<실시예 3: 단백질 추출>

프로테옴 분석을 위해서 PBS로 처리한 대조군, 이산화티타늄 나노입자로 반응을 유도한 처리군에서 분리한 폐 조직을 액체질소로 얼린 다음 파쇄한 후, 7M 우레아, 2M 티오우레아(thiourea), 4% CHAPS, 0.5% 앰폴라이트(ampholytes), 100mM DTE가 포함되어 있는 40mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8)에서 한번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 10℃, 16,500rpm에서 90분 동안 원심분리한 뒤 얻어진 상등액을 사용하였으며, 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

<실시예 4: 이차원 전기영동>

이차원 전기영동을 위해서 100μM의 HCHO가 처리된 세포를 모은 뒤 총 단백질을 분리하였다, 그리고 차가운 10% TCA/아세톤 용액을 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 남아 있는 TCA를 제거하기 위해서 차가운 아세톤으로 5회 반복하여 세척하였고, 남아있는 아세톤을 상온에서 증발시켰다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

4-1. 일차원 전기영동(Isoelectrofocusing: 등전점 전기영동)

100μM의 HCHO가 처리된 세포에서 분리한 총 단백질 양은 각각 700㎍ 이상이 되게 하였고, 250㎕의 재수화(rehydration) 용액 (7M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.5% 앰폴라이트, 100mM DTT, 0.01% 브로모페놀 블루)을 사용하여 단백질을 녹였다. 250㎕의 재수화 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG 홀더에 주입하였 고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 13cm 고정 건조 스트립(immobilized dry strip) (pH 3-10 NL, Amersham Bioscience)을 이용하여 12시간 동안 재수화시켰다. 250V/100 Vhrs, 500V/500Vhrs, 1,000V/1,000Vhrs, 8,000V/38,000Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

4-2. 이차원전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1차 평형화 완충용액 [6M 우레아, 0.4 M Tris-HCl(pH 8.8), 2% SDS, 2% DTT, 10% 글리세롤]에서 각각 15분간 1차 평형화를 실시한 후, 2차 평형화 완충용액[6M 우레아, 0.4M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 2.5% 요오도아세트아미드, 10% 글리세롤]에서 15분간 2차 평형화를 실시하였다. 12.5% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 1% 아가로스 젤로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 15분 동안 겔 당 25mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 5시간 동안 겔 당 50mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

4-3. 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 쿠마시 블루 G-250 염색 용액(34% 메탄올, 0.1% 쿠마시 G-250, 17% 암모늄 설페이트, 3% 포스포릭산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12시간 이상 염색한 후 5% 아세트산을 사용하여 탈색하였다.

4-4. 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLoook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 Image Master^TM(2D software, Amersham)로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3장의 겔을 분석하였다.

<실시예 5: 액체 크로마토그래피/질량 분광법 (LC/MS) 및 단백질 확인>

샘플을 비규격 5-20㎛ C18 수지로 패킹된 360㎛ o.d. × 75 ㎛ i.d. 미세 모세관 융합 실리카 예비컬럼에 로딩하였다. 샘플 로딩 후에, 예비컬럼을 15분 동안 0.1％ 아세트산으로 세척하여 임의의 완충액 염 또는 겔 오염물질을 제거하였다. 이어서, 예비컬럼을 통합된 전자분사 방출구가 구축된 규격 5㎛ C18 수지로 패킹된 360㎛ o.d. × 50㎛ i.d. 분석용 컬럼에 연결시켰다. 샘플을 1100 시리즈 2-원 HPLC 용매 전달 시스템(아질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주)을 이용하여 써모피니간 LTQ 이온 트랩 질량 분광분석기(써모 일렉트론 코포레이션 (Thermo Electron Corp.), 미국캘리포니아주)로 직접 60nl/분의 유속으로 구배 용리하였다. 다른 실시예에서는, 우수한 질량분해능을 제공하는 써모피니간 LTQ-FT 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다. 사용되는 HPLC 계단식 구배는 처음에 100％ A, 5％ B (5분), 50％ B (220분), 100％ B (240분)이였으며, 280분에 다시 100％ A로 회복된다 (용매A = 0.1M 아세트산, 용매 B = 0.1M 아세트산 중 70％ 아세토니트릴). LTQ 질량 분광 분석기는 데이타-의존적방식으로 작동시켰으며, 여기서 우선 처음 MS 스캔은 질량 범위 300 내지 2000 Da에 걸친 이온의 질량 대 전하(m/z) 비를 기록한 후에, 10종의 최대 풍부한 이온을 이후의 충돌에 의해 활성화되는 해리에 대해 자동적으로 선별하여 MS/MS 스펙트럼을 기록하였다.

<실시예 6: 투과전자현미경 표본제작>

이산화티타늄 나노입자를 처리한 마우스 폐 조직의 미세구조의 변화 및 침착 정도를 관찰하기 위하여 투과전자현미경 표본을 제작하였다. 투과전자현미경 관찰은 마우스에서 폐 조직을 적출한 즉시 3% 글루타르알데하이드 용액에 3시간 동안 전고정하고 1% OsO₄에 2시간 동안 후고정하였다. 고정 후, 수분 제거를 위해 60% 에탄올로부터 무수에탄올까지 농도 상승 순으로 각 20분씩 탈수한 후, 프로필렌옥사이드(propylene oxide)로 30분간 치환하였다. Epon 혼합물에 포매하였다. 포매가 완료된 조직은 100㎚ 두께로 초박절편을 제작하여 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 시트르산납(lead citrate)으로 이중 전자염색하여 투과전자현미경(JEM-1010, JEOL Co.)으로 가속전압 80 kV 하에서 관찰하였다.

도 1a(정상군), 1b(이산화티타늄 나노입자 처리군)는 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 단백질들의 차별적 발현 양상을 나타내는 이차원 전기영동 사진이다.

도 2는 이산화티타늄 나노입자 처리시에 발현량이 증가 또는 감소한 단백질 변화를 나타낸 도면이다.

(A) 이산화티타늄 나노입자 처리에 의해 발현량이 증가한 단백질

(B) 이산화티타늄 나노입자 처리에 의해 발현량이 감소한 단백질

도 3은 이산화티타늄 나노입자 처리에 의한 마우스 폐 조직의 투과전자현미경 관찰 사진이다.

(A) 타입 Ⅱ 폐포세포(alveolar cell)

(B) 폐포 대식세포(Alveolar macrophage)

(C) 폐포세포

Claims

열충격 단백질 90kDa(Heat shock protein 90kDa, Hsp90ab1);

퍼옥시레독신 6(Prdx6);

세포질 아코니테이즈(Cytoplasmic aconitase);

모에신(Moesin, Msn);

피루브산 키나아제 아이소자임 M1/M2의 아이소폼 M2(Isoform M2 of Pyruvate kinase isozymes M1/M2, Pkm2);

L-젖산 탈수소효소 A 사슬(lactate dehydrogenase A chain, Ldha);

탄산 탈수소효소 1(Carbonic anhydrase 1, Car1);

아포리포단백질 A-1 전구체(Apolipoprotein A-1 precursor, Apo1); 중 선택된 1종 이상의 바이오마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐의 이산화티타늄 나노입자 오염 진단키트.
제1항에 있어서,

상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
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