KR101415311B1

KR101415311B1 - 대마 종자 구분용 마커 단백질 및 이를 이용한 대마 종자 구분용 키트

Info

Publication number: KR101415311B1
Application number: KR1020100035241A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 박슬기
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2014-07-04
Also published as: KR20110115742A

Abstract

본 발명은 대마 종자 중 청삼 종자와 보성 종자를 구분할 수 있는 마커에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 마취성분인 테트라하이드로카나비놀 함량이 낮은 청삼 종자와 테트라하이드로카나비놀 함량이 높은 보성 종자를 간단한 방법으로 구분할 수 있는 마커와 이를 이용한 키트에 관한 것이다.

Description

대마 종자 구분용 마커 단백질 및 이를 이용한 대마 종자 구분용 키트{Marker Proteins for Identifying Hempseed and An Identification Kit for Hempseed}

본 발명은 대마 종자 중 청삼 종자와 보성 종자를 구분할 수 있는 마커에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 마취성분인 테트라하이드로카나비놀 함량이 낮은 대마인 청삼의 종자와 테트라하이드로카나비놀 함량이 높은 대마인 보성의 종자를 간단한 방법으로 구분할 수 있는 마커와 이를 이용한 키트에 관한 것이다.

대마(hemp)는 학명이 카나비스 사티바(Cannabis sativa)이고, 삼이라고도 불리며 줄기의 인피섬유는 캔버스, 리넨, 티백, 지폐, 담배 마는 종이 그리고 의류 등으로 사용되고(Callaway, J. C. (2004) Hempseed as a nutritional resource: An overview. Euphytica, 140, 65-72), 종자는 조미용이나 기름을 짜는데 사용되며, 꽃으로부터 생리활성물질을 분리하여 일부 의약품으로 사용되기도 하었다.

대마의 줄기, 잎 그리고 꽃에는 테트라하이드로카나비놀(Tetrahydrocannabinol; THC)이라는 마취성분의 물질이 포함되어 있다고 알려져 있어 대마의 이용이 감소하였다. 하지만 대마의 뿌리와 종자 및 섬유에는 테트라하이드로카나비놀 성분이 거의 포함되어 있지 않으며 대마의 유효성분들에 대한 연구와 이를 바탕으로 한 제품개발이 일부 선진국에서 활발하게 진행되고 있다.

대마섬유는 오래 전부터 사용해온 천연섬유의 하나로 인장강도가 크고 섬유길이가 길며 셀룰로오스의 함량이 매우 높고 리그닌의 함량은 매우 낮은 우수한 섬유소재로 특히 염분에 강하고 물에 젖게 되면 더욱 질겨지는 특성이 있다. 또한 대마섬유는 향균작용, 탈취, 방충효과가 뛰어나고 자외선을 잘 흡수하며 통풍성이 좋기 때문에 각종 의류용 섬유 및 산업용 필터소재, 식품포장재로서 개발이 가능하다. 또한, 실내 장식용품, 커튼, 침구제품, 카페트 등과 기능성 특수제지, 건축용 단열재 생산에도 대마섬유가 이용되고 있으며 자동차의 내, 외장재로도 사용되고 있다.

대마섬유의 많은 장점과 더불어 대마 종자의 일종인 청삼에는 양질의 불포화 지방산인 리놀산과 리놀렌산이 80% 이상 함유되어 있고 다른 식물류에서 흔히 찾아볼 수 없는 감마 리놀렌산(GLA)을 함유하고 있으면서도 포화지방산은 함유하지 않는다. 이러한 불포화지방산은 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 청삼에는 특히 성장에 필수적인 아르지닌, 메티오닌, 히스티딘 그리고 시스테인이 다량 포함되어 있다. 또한, 트립신 억제제 및 올리고당이 포함되어 있지 않고 다량의 필수지방산이 포함되어 있으며 토코페롤 및 여러 가지 비타민 A, B, C, D 및 E가 함유되어 있다(Hullar, I., Meleg, I., Fekete, S. and Romvari, R. (1999) Studies on the energy content of pigeon feeds I. Determination of digestibility and metabolizable energy content. Poult. Sci., 78, 1757-1762).

뿐만 아니라, 대마 종자 오일은 피부와 모세혈관으로의 흡수가 빠르고 효과가 우수하므로 귀, 코와 목의 질병과 피부질환, 아토피 피부염 치료제 그리고 기능성 화장품으로 개발되고 있으며, 순환기관의 질병 치료, 노화 방지, 당뇨치료 효과와 심장혈관질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 나타낸다(Grigoriev, O. V. (2002) Application of hempseed (Cannabis sativa L.) oil in the treatment of ear, nose and throat (ENT) disorders. J. Ind. Hemp, 7, 5-15, Callaway, J., Schwab, U., Harvima, I., Halonen, P., Mykkanen, O., Hyvonen, P. and Jarvinen, T. (2005) Efficacy of dietary hempseed oil in patients with atopic dermatitis. J. Dermatolog. Treat. 16, 87-94).

그러나, 테트라하이드로카나비놀을 함유한 대마는 마약성분을 함유하였다는 이유로 관계 법령에 따라 재배가 엄격히 금지되고 있다. 그리하여, 최근에는 테트라하이드로카나비놀 함량이 낮은 저마약형 신품종인 청삼이 개발되었다.

그러나, 청삼 종자와 종래 테트라하이드로카나비놀을 함유한 보성 종자는 외관상으로는 크기와 색상 등이 동일하여 이를 구별하기가 매우 어렵다.

따라서, 본 발명은 대마 종자 중 청삼 종자와 보성 종자를 용이하게 구별할 수 있는 바이오마커를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 대마 종자 중 청삼 종자와 보성 종자를 구별할 수 있는 바이오마커를 포함하는 키트 및 이를 이용한 대마 종자 구별방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 2차원 전기영동기술을 이용하여 청삼과 보성 두 종자의 전체 단백질을 확인한 결과, 청삼 종자에서는 총 695개의 단백질을, 보성 종자에서는 총 722개의 단백질 스팟을 분리할 수 있었다(도 1, 2). 또한, 확인된 단백질 스팟 중에서 청삼 종자에서는 명확히 나타나지만, 보성 종자에서는 확인되지 않는 단백질을 선별하여 이를 청삼 종자를 확인하는 용도로 이용할 수 있음을 밝혀내어 이를 이용한 대마 종자 구분용 키트를 발명하기에 이르렀다.

이차원 전기영동한 겔을 12개의 구역으로 나누어 각 구역에서 발현한 단백질을 비교한 결과 두 종자에서 공통적으로 발현되는 단백질은 총 26개였다.

또한 청삼 종자에서만 발현되고 보성 종자에서는 발현되지 않는 단백질 중 청삼 종자 단백질의 8번과 12번 구역에서만 발현하는 특이 단백질 5개를 동정할 수 있었다(도 3).

본 발명에 따른 청삼 종자 확인 마커 단백질은 막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein; 분자량: 23kDa, 스팟 127번)과 펩타이도글라이칸 생합성에 관여하는 효소인 인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소(phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase; 분자량: 38kDa, 스팟 132번), 펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; 분자량: 18kDa, 스팟 133번), 엽록체 인산글리세르산 카이네이즈(chloroplast phosphoglycerate kinase; 분자량: 32kDa, 스팟 146번) 그리고 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 분자량: 21kDa, 스팟 147번)로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상이다. 이 마커 단백질들은 pH 8~10에서 발현되며, 보성 종자의 2차원 전기영동에서는 찾아볼 수 없었다. 따라서, 이 단백질들의 이차원 전기영동겔 상에서의 위치와 스팟 존재 여부를 통하여 청삼 종자와 보성 종자를 용이하게 구분할 수 있게 된다. 즉, pH 8~10, 분자량 40kDa 이하의 영역에서 상기 다섯 가지 단백질 스팟이 확인되면 청삼 종자이고, 그렇지 않은 경우 보성 종자임을 알 수 있는 것이다.

상기 다섯 가지 마커 단백질의 특징은 아래와 같다.

막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein)은 단백질 합성 후 단백질의 분비와 수송으로 인한 단백질 변형에 관련된 단백질로서 세포막 구성의 필수 요소 중 하나이다.

인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소(Phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase)는 UDP-Mur₂Ac(oyl-L-ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala) + 운데카프레닐 인산(undecaprenyl phosphate) UMP + Mur₂Ac(oyl-L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)-이인산운데카프레놀(diphosphoundecaprenol) 반응을 촉매하는 효소로서, 이 효소의 두 기질은 UDP-Mur₂Ac(oyl-L-ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)과 운데카프레닐 인산(undecaprenyl phosphate)이고, 산물은 UMP, Mur₂Ac(oyl-L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)- 그리고 이인산운데카프레놀(diphosphoundecaprenol)이다. 이 효소는 전이효소군에 포함되며, 막 구성에 필수적인 물질로 펩타이도글라이칸 생합성에 관여한다 (The initial stage in peptidoglycan synthesis. IV. Solubilization of phospho-N-acetylmuranyl-pentapeptide translocase. Heydanek, M. G. Jr & Neuhaus, F. C. Biochemistry, 8: 1474-1481 (1969)).

펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)는 접히지 않은(unfolded) 단백질과 올리고 펩타이드 내 프롤린 펩타이드(Xaa-Pro)의 시스-트랜스 이성체로 바꾸는 과정을 가속화시키는 효소이다. 시스(cis) 형태의 펩타이드 결합은 트랜스(trans) 형태의 결합과 비교해 불안정하다. 이 효소는 FK506-결합 단백질(FK506 binding proteins; FKBPs), 사이클로필린(cyclophilines), 파뷸린(parvulins) 그리고 세린/트레오닌 인산화효소 2A 활성인자(Ser/Thr phosphatase 2A activator)인 PIPA의 4개 그룹으로 나뉜다 (Engineering of monomeric FK506-binding protein 22 with peptidyl prolyl cis-trans isomerase. Importance of a V-shaped dimeric structure for binding to protein substrate. Budiman, C., Bando, K., Angkawidjaja, C., Koga, Y., Takano, K. and Kanaya, S. FEBS J., 276: 4091-4101 (2009)).

엽록체 인산글리세르산 카이네이즈(Chloroplast phosphoglycerate kinase)는 엽록체의 기질에 포함되어 있는 효소로 캘빈 회로의 가역반응을 촉매하여 ATP의 존재하에 3-인산글리세르산을 1,3-이인산글리세르산(diphosphoglycerate)으로 전환시킨다. 인산글리세르산 카이네이즈는 광합성 탄소 물질대사뿐 아니라 해당과정과 당신생과정에 관여하는 중요한 효소로 식물에서는 엽록체와 세포질에 주로 존재하지만 대부분의 식물에서 인산글리세르산 카이네이즈 활성은 주로 엽록체에 존재한다(purification and cDNA isolation of chloroplastic phosphoglycerate kinase from chlamydomonas reinhardtii, kitayama, M. & Togasaki, R. K. Plant Physiol., 107: 393-400 (1995)).

글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 산화환원효소로 해당과정에서 글리세르산-3-인산(glycerate-3-phosphate)을 1,3-이인산글리세르산(bisphosphoglycerate)으로 인산화시키고 유일한 산화 반응인 NAD⁺를 NADH로 환원시키는 반응을 촉매하여 세포 내에서 에너지 생산에 중추적인 역할을 한다. 세포 내에서 세포질과 핵 그리고 막에 고루 분포하고, 에너지 생산에 중요한 역할을 하며, 해당 기능(glycolytic function) 이외에도 막 융합, 인산전이 활성, 마이크로튜블 묶기(microtubule bundling), 핵 RNA를 외부로 전달(nuclear RNA export), DNA 복제 및 DNA 재생(repair) 등의 다양한 기능을 갖는다.

본 발명은

막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein; 분자량: 23kDa);

인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소(phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase; 분자량: 38kDa);

펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; 분자량: 18kDa);

엽록체 인산글리세르산 카이네이즈(chloroplast phosphoglycerate kinase; 분자량: 32kDa); 및

글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 분자량: 21kDa) 중 선택된 1종 이상의 마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 청삼 종자와 보성 종자 구분용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키트가 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein; 분자량: 23kDa);

글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 분자량: 21kDa) 중 선택된 1종 이상의 마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 미확인 종자 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 청삼 종자와 보성 종자를 구분하는 방법을 제공한다.

상기 방법은

a) 분석할 미확인 종자 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 청삼 종자 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 면역원성 단편은 외부 숙주에 주입하였을 때 반응성 항체를 생산할 수 있는 상기 단백질 중 일부를 말하는 것이다.

본 발명은 상기 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 본 발명의 항체는 종래 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명은 청삼 종자 대조군과 비교하여 상기 마커 단백질의 발현 여부 또는 발현량 비교로 청삼 종자인지 보성 종자인지를 구분하는 것을 특징으로 하는 대마 종자 구분용 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

본 발명에서 "마커"는 대마 종자인 청삼 종자를 다른 대마 종자인 보성 종자와 구분할 수 있는 물질로, 상기 마커 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 보성 종자에 비해 청삼 종자에서 발현이 증가하거나 2차원 전기영동시 그 단백질 스팟을 명확히 확인할 수 있는 특징을 나타낸다.

따라서, 종자 시료 중의 마커 단백질 존재 또는 발현량을 확인함으로써 청삼 종자인지 보성 종자인지를 구분할 수 있다. 종자 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 시료에서 청삼 종자에서 발현되거나 많이 발현되는 상기 마커 단백질의 발현 여부 또는 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 상기 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 청삼 종자의 항원-항체 복합체의 형성량과 미확인 대마 종자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 마커 단백질의 유의한 발현 또는 발현량 증가 여부를 판단하여 미확인 대마 종자가 청삼 종자인지 보성 종자인지를 확인할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 상기 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 청삼 종자 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 청삼 종자 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 마커에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 청삼 종자 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 청삼 종자의 마커 단백질 발현량과 미확인 종자에서의 마커 단백질의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. 단백질의 수준은 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대마 종자 구분용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 5종의 마커 단백질이 청삼 종자 확인 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 마커 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 마커 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 대마 종자 구분용 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 청삼 종자 확인용 마커는 5개의 단백질 중 1종 이상 단백질의 발현 여부 또는 발현량 변화를 탐지함으로써 미확인 대마 종자가 청삼 종자인지를 용이하게, 그리고 특이적으로 검출할 수 있다.

도 1은 청삼 종자 전체 단백질의 이차원 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 보성 종자 전체 단백질의 이차원 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 도 1과 도 2를 비교하여 청삼 종자에서만 발현하는 특이 단백질을 확인한 결과이다. (A): 청삼 종자 단백질, (B): 보성 종자 단백질

이하 본 발명의 구성을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 단백질 추출>

완전히 껍질을 제거한 청삼 종자와 보성 종자 각각 1g을 액체질소로 얼린 다음 균질기로 파쇄한 후, 0.01M 인산나트륨(sodium phosphate; pH 7.5)과 0.6M 수크로스가 포함되어 있는 0.01M 인산나트륨 완충용액(pH 7.5)에서 한 번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 4℃, 16,000rpm에서 30분 동안 원심분리한 뒤 얻어진 상등액에 차가운 10%(v/v) 트리클로로아세트산을 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질에 남아 있는 각각의 물질을 제거하기 위해 5회 반복하여 세척하였고, 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

<실시예 2: 등전점 전기영동>

청삼 종자와 보성 종자에서 추출한 단백질의 총량은 1㎎이 되게 하였고, 450㎕의 재수화용액(7M 우레아, 2M 티오우레아, 4.5% CHAPS, 0.25% 양쪽성 전해질(ampholytes), 100mM DTE)을 사용하여 단백질을 녹였다. 450㎕의 재수화용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG 홀더에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 24㎝ 고정 건조 스트립(immobilized dry strip, pH 3~10 NL, GE Healthcare Bio-Science)을 이용하여 18시간 동안 재수화시켰다. 200 V/ 200 Vhrs, 500 V/ 500 Vhrs, 1,000 V/ 1,000 Vhrs, 8,000 V/ 13,500 Vhrs, 8,000 V/ 100,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

<실시예 3: 평형화>

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1차 평형화 완충용액(6M 우레아, 0.375M Tris-HCl(pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아마이드, 2mM TBP)에서 각각 20분간 1차 평형화를 실시한 후, 2차 평형화 완충용액(6M 우레아, 0.375M Tris-HCl (pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아마이드, 2mM TBP)에서 20분간 2차 평형화를 실시하였다.

<실시예 4: SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동>

8% ~ 16% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 0.5% 아가로스 겔로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 2시간 동안 겔 당 5mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 10시간 동안 겔 당 18mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

<실시예 5: 겔 염색 및 탈색>

전개가 끝난 겔을 쿠마시 블루 G-250 염색 용액 (34% 메탄올, 0.1% 쿠마시 블루 G-250, 17% 황산암모늄, 3% 인산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12시간 이상 염색한 후 1% 아세트산을 이용하여 탈색하였다.

<실시예 6: 겔 이미지 분석>

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 ImageMaster 2D Platinum 6.0 (2D software, GE Healthcare Bio-Science)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3장의 겔을 분석하였다.

<실시예 7: NanoLC-MS/MS 분석>

NanoLC-MS/MS 분석을 위해 각 스팟을 트립신(trypsin)으로 인-젤 다이제스천(in-gel digestion)한 후, 스팟들의 펩타이드들을 agilent 110 Series nano-LC와 LTQ-mass spectrometer(Thermo Electron, San Jose, CA)로 분석하였다. LC-MS/MS 분석에 사용된 모세관 컬럼(150㎜×0.075㎜)은 Proxeon(Odense M, Denmark)에서 구입하였으며, 슬러리는 5㎛, 100Å 포어 사이즈의 Magic C18 정지상(stationary phase) (Michrom Bioresources, Auburn, CA)으로 패킹하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유하는 증류수이고, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유하는 아세토나이트릴이었다. 크로마토그래피 경사는 50분간 5% B에서 35% D 직선증가와 0 분간 541% B에서 61% B의 직선증가, 5분간 561% B에서 81% B 직선증가하는 것으로 셋업하였다. 유속은 분리(splitting) 분당 300㎖를 유지하였다. 매스 스펙트럼(Mass spectra)은 MS/MS 스캔 후 전체 매스 스캔으로 얻은 데이터(data-dependent acquisition with full mass scan:5410-1810 m/z)로 얻었다. 얻어진 수 MS/MS 스캔은 LTQ에서 rm마이크로스캔 (microscans)의 평균이었다. 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 200℃로 맞추어졌으며, 스프레이는 1.5.0-2.0kV였다. 정상화된 콜리전 (collision) 에너지는 MS/MS에 대해 35%로 맞추어졌다. Sequest 소프트웨어가 펩타이드 서열을 동정하기 위해 사용되었다. 신뢰성 높은 결과를 얻기 위해, delatCn = 0.1과 Rsp = 4의 조건을 적용하였고, Xcorr의 경우, 전하 상태(Charge state) 1+에서는 Xcorr = 1.5를 적용하였고, 전하 상태 2+에서는 Xcorr = 2.0, 전하 상태 3+에서는 Xcorr = 2.5를 적용하였으며, 펩타이드 확률(peptide probability) > 0.1을 적용하여 단백질 동정을 확정범위(cutoff)로 사용하였다.

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Claims

막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein; 분자량: 23kDa);
인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소(phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase; 분자량: 38kDa);
펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; 분자량: 18kDa);
엽록체 인산글리세르산 카이네이즈(chloroplast phosphoglycerate kinase; 분자량: 32kDa); 및
글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 분자량: 21kDa) 중 선택된 1종 이상의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 청삼 종자 구분용 진단 키트.
제1항에 있어서,
상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
막전이 수송단백질(Transmembrane trafficking protein; 분자량: 23kDa);
인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소(phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase; 분자량: 38kDa);
펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; 분자량: 18kDa);
엽록체 인산글리세르산 카이네이즈(chloroplast phosphoglycerate kinase; 분자량: 32kDa); 및
글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 분자량: 21kDa) 중 선택된 1종 이상의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 미확인 종자 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 청삼 종자를 구분하는 방법.
제3항에 있어서,
a) 분석할 미확인 종자 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 시료와 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;
c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계 검출 결과를 청삼 종자 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.