KR101184085B1

KR101184085B1 - 이산화티타늄 나노입자의 검출 마커 및 검출 방법

Info

Publication number: KR101184085B1
Application number: KR1020090121717A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 전유미
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2012-09-18
Also published as: KR20110064931A

Abstract

이산화티타늄 나노입자에 의해 단백질 발현량이 증가 또는 감소되는 단백질들을 포함하는 이산화티타늄 나노입자 검출 마커 및 검출 방법이 개시된다. 상기 마커를 이용하여, 이산화티타늄 나노입자를 효과적으로 검출할 수 있다.

이산화티타늄, 나노입자, 단백질 발현, 마커, 진단용 키트, 검출방법

Description

이산화티타늄 나노입자의 검출 마커 및 검출 방법{Detecting Marker for Titanum Dioxide Nanoparticles and Detecting Method using the Same Marker}

이산화티타늄 나노입자의 검출 마커 및 검출 방법에 관한 것이다.

나노 산업의 발전에 따라, 나노입자에 대한 안전성 문제가 야기되고 있으며, 특히 나노입자의 잠재적 독성에 대한 연구가 대두되고 있다. 나노입자는 일반 입자에 비해 더 많은 활성산소를 생산하며, 이로 인해 전구염증 매개인자(pro-inflammatory mediator)의 전사와 산화적 손상을 야기시킨다. 특히, 나노입자는 사람의 폐중독을 유발할 수 있으며, 랫드를 이용한 만성흡입 실험에서는 나노입자에 의해 폐 염증과 세포독성, 세포분열, 폐 섬유증 및 폐 암을 유발할 수 있다. 이처럼 나노입자는 입자크기가 작아질수록 그 생물학적 활성으로 침투성이 높아지게 되어 새로운 건강문제를 야기할 수 있다. 나노입자 유해성의 심각성은, 물질의 접촉 부위뿐 아니라 전신 독성을 유발할 가능성이 있다는 것이다. 나노입자가 폐에 침착하면 폐 염증 뿐 아니라 혈관 내 혈전을 유발할 수 있으며, 피부를 통한 나노입자의 침투는 면역계를 자극할 가능성이 높고, DNA 구조와 안정성을 변형시킬 가능성도 제기되고 있다.

이산화티타늄 나노입자에 노출되면, 세포독성, 산화적 손상, 폐 염증, 세포 분열 및 폐독성에 의한 조직병리학적 변화가 야기될 수 있으며, 폐암으로 발전될 가능성도 있다. 또한, 이산화티타늄 나노입자는 세포내 과산화수소 및 산화질소의 생산을 증가시키며, 세포자살을 유발시키기도 한다.

또한, 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 변화를 관찰한 실험 결과 핵 근처에 나노입자가 응집(aggregation)된 것을 관찰할 수 있으며, 흰쥐에 이산화티타늄 나노입자를 복강투여한 실험에서는 비장, 폐, 신장, 간 조직에 축적되는 것으로 확인되었다. 이처럼 이산화티타늄 나노입자에 의해 주요 병리학적 변화가 유도된다(Bregoli, L. et al., Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology, 2009, 262(2):121-129).

이산화티타늄 나노입자가 쥐의 중추신경계 신경교의 일종이자 외부자극으로부터 뇌를 보호하는 세포인 소교세포(microgila)에 영향을 주기도 한다. 신경세포를 보호하는 면역세포는 외부에서 이물질이 들어오면 활성산소를 분비해 태워버리는데, 이산화티타늄 나노입자에 1 시간 이상 노출되면 활성산소가 과다 분비돼 주변의 신경세포에 손상을 입히게 된다(Thrall, L. (2006) Study links TiO₂ nanoparticles with potential for brain-cell damage. Environ . Sci . Technol . 40:4326-4327).

일부 연구자료에 의하며, 고농도의 이산화티타늄 나노입자 처리에 의해 마우 스의 간 기능 손상 및 산화적 손상이 유도되며, 간세포의 괴사가 유도된다고 보고된다(Wang, J. X. et al., Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particels in mice after aral administration. Toxicol . Lett., 2007, 168:176-185). 고농도의 이산화티타늄 나노입자를 마우스에 복강투여한 결과, 간 내 조직병리학적 변화가 유도되며, 바셀룸(vascellum)의 충혈, 혈관확장, 미토콘드리아 팽창, 공포형성, 세포자살등의 조직병리학적 변화가 관찰된다. 이러한 결과를 바탕으로 이산화티타늄 나노입자에 의해 간기능 손상이 유도될 수 있다는 보고가 있다(Ma, L. et al., The acute liver injury in mice caused by nano-anatase TiO₂. Nanoscale Res . Lett ., 2009, 4:1275-1285).

본 발명의 일실시예의 목적은 이산화티타늄 나노입자 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 이산화티타늄 나노입자의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 마커는, 물질대사 단백질로서 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor) 및 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase); 수송 단백질로서 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2) 및 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor); 산환 환원 단백질로서 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1) 및 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor); 이화과정 단백질로서 디메틸글리신 디하 이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases); 당신생 단백질로서 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1); 항산화효소로서 카탈라제(Catalase); 및 생합성 단백질로서 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 또한, 상기 마커를 이용한 이산화티타늄 나노입자의 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 마커를 이용하여, 이산화티타늄 나노입자를 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 이산화티타늄 나노입자 마커는, 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가 또는 감소되는 단백질 마커들을 포함한다. 일실시예에서, 이산화티타늄 나노입자 마커는, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1), 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

구체적으로는, 이산화티타늄 나노입자에 의해서 변화되는 마우스 간 조직내 단백질의 발현 양상의 변화를 프로테오믹스(Proteomics)기술을 이용하여 분석하였다. 이차원 전기영동과 펩타이드와 아미노산수준에서 정확한 질량분석이 가능한 LC MS/MS를 사용하여 단백질의 발현양상을 정확하게 관측하였다. 예를 들어, 검출대상의 간 조직 시료를 채취하고, 채취된 생체 시료를 대상으로 본 발명에 따른 단백질 마커의 발현량을 비교 분석함으로써, 이산화티타늄 나노입자에 의한 오염여부를 판별할 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가 또는 감소되는 단백질을 포함하며,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가되는 단백질은, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1, 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소되는 단백질은, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor) 및 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 수송 단백질, 산화 환원 단백질, 이화과정 단백질, 당신생 단백질, 항산화 효소 및 생합성 단백질을 포함한다. 본 발명에서는 이산화티타늄 나노입자에 의해서 변화되는 단백질의 발현 양상의 변화를 측정한 결과, 이산화티타늄 나노입자에 의해 유효범위 내에서 발현량이 증가 또는 감소되는 마커들을 선별하였다. 선별된 단백질의 종류를 구체적으로 개시하면 다음과 같다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 수송 단백질을 포함하며, 상기 수송 단백질은, 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕 타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2) 및 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 산화 환원 단백질을 포함하며, 상기 산환 환원 단백질은 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1) 및 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 이화과정 단백질을 포함하며, 상기 이화과정 단백질은 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases)일 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 당신생 단백질을 포함하며, 상기 당신생 단백질은 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1)일 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 항산화 효소를 포함하며, 상기 항산화 효소는 카탈라제(Catalase)일 수 있다.

일실시예에서, 상기 이산화티타늄 나노입자 마커는, 생합성 단백질을 포함하 며, 상기 생합성 단백질은 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)일 수 있다.

본 발명은 이산화티타늄 나노입자 진단용 키트를 제공한다. 구체적으로는, 상기 이산화티타늄 나노입자 진단용 키트는, 위에서 언급된 이산화티타늄 나노입자 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 이산화티타늄 나노입자의 검출방법을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 검출 방법은, 당업계에 널리 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 면역침강기법과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다.

일실시예에서, 이산화티타늄 나노입자의 검출방법은:

(a) 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구 체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1), 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 이산화티타늄 나노입자 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 시료를 반응시키는 단계; 및

(b) 상기(a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군(이산화티타늄 나노입자를 함유하지 않은 시료와 반응시켜 형성된 항원-항체 복합체)과 비교하는 단계를 포함한다.

또 다른 일실시예에서, 상기 검출방법의(b) 단계에서는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 경우에는 이산화티타늄 나노입자의 존재에 대하여 양성 판정을 하며,

구체적으로는, 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가되는 단백질은, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이 토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1, 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,

일실시예에서, 본 발명에서 사용되는 검출대상 시료는 간 조직으로부터 채취된 시료일 수 있다. 구체적으로는, 검출대상의 간 조직 시료를 채취하고, 채취된 생체 시료를 본 발명의 일실시예에 따른 단백질 마커의 발현량을 비교 분석함으로써, 이산화티타늄 나노입자에 의한 오염여부를 판별할 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 검출 마커에 대하여 구체적으로 살펴본다. 또한, 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 단백질들의 차별적 발현 양상을 이차원 전기영동으로 관측하였다. 관측결과는 도 1에 나타내었으며, 이를 함께 살펴본다.

디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenase)는, 콜린 물질대사를 포함하는 미토콘드리아 메트릭스 효소이며, 디메틸글리신(dimethylglycine)을 사르코신(sarcosine)으로 전환시키게 된다. 미토콘드리아 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Mitochondrial dimethylglycine dehydrogenase)의 발현은 다양한 조직, 간세포, 랫드의 발생 단계에서 분석되었다(Otto, A. et al., Biogenesis of the covalentyl flavinylated mitochondrial enzyme dimethylglycine dehydrogenase. J. Biol . Chem ., 1996, 271: pp 9823-9829). 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenase)의 결핍은 소변과 혈청내 디메틸글리신(dimethylglycine)의 축적을 야기시키며, 그 결과 디메틸글리신 디하이드로게나아제(dimethylglycine dehydrogenase) 유전자의 점 돌연변이를 유발한다. 또한, 디메틸글리신 디하이드로게나아제(dimethylglycine dehydrogenase)과 관련하여, 메틸(methyl) 그룹의 대사과정에 이상이 있을 경우에는, 사르코신(sarcosine)이 글리신 메틸트렌스퍼라아제(glycine methyltransferase)의 작용으로 글리신(glycine)으로부터 직접 만들어지게 된다. 이와 관련된 연쇄반응에 의하여 혈청내 크레틴 키나아제(creatine kinase)의 상승이 근육 파괴를 유발하였다는 보고가 있다(Barbara, A. et al ., Cloning of dimethylglycine dehydrogenase and a new human inborn error of metabolism, dimethylglycine dehydrogenase difieiceny. Am . J. Hum . Genet ., 2001, 68:839-847). 디메틸글리신 디하이드로게나아제, 미토콘드리아 전구체(Dimethylglycine dehydrogenase, mitochondrial precurosr; 도 1의 스팟 1)는 이산화티타늄 나노입 자에 의해 발현량이 감소하였다.

프락토스-1,6-비스포스파타아제(Fructose-1,6-bisphosphatase)는 해당과정의 중간매개체로서 사이토카인 생성 또는 아데노신 생성 억제와 관련된 염증의 약리작용에 이용되고 있다. 프락토스-1,6-비스포스파타아제(Fructose-1,6-bisphosphatase)는 간조직의 손상에 대하여 보호작용을 하며, 염증을 감소시키는 역할을 한다. 프락토스-1,6-비스포스파타아제(Fructose-1,6-bisphosphatase)의 약리학적 항염증 역할은 세포간 활성산소종, 프로스타글란딘 E₂,사이클로옥시게나아제 2를 포함하는 염증 분자의 생산 억제와 연관되어 있으며, 염증 통증 감소를 위한 치료로도 응용될 수 있다(Valerio, D.A. et al., Fructose-1,6-bisphosphate reduces inflammatory pain-like behaviour in mice: role of adenosine acting on A₁ receptors. Br . J. Pharmacol ., 2009, 158:558-568). 프락토스-1,6-비스포스파타아제(Fructose-1,6-bisphosphatase 1; 도 1의 스팟 2)은 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소하였으며, 이는 이산화티타늄 나노입자에 의해 유도되는 염증 심화와 관련 있을 것으로 판단된다.

프로피오닐-CoA 카르복실라아제(Propionyl-CoA carboxylase)는 이화작용에 관여하는 효소로, 아미노산, 콜레스테롤, 외사슬 지방산 대산의 필수적인 단계를 촉매한다. 또한, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제(Propionyl-CoA carboxylase)는 프로피오닐-CoA(propionyl-CoA)를 메틸말로닐-CoA(methylmalonyl-CoA)를 거쳐 석시닐-CoA(succinyl-CoA)로 전환하여 TCA 회로에 들어가게 함으로써 홀수지방산 대사 에 관여한다(Hsia, Y. E. et al ., Human propionyl CoA carboxylase: some properties of the partially purified enzye in fibroblasts from controls and patients with propionic acidemia. Pediat . Res ., 1979, 13:746-751). 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인, 미토콘드리아 전구체(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain, mitochondirial precursor; 도 1의 스팟 3)는 이산화티타늄 나노입자에 의하여 발현량이 감소하였으므로, 이산화티타늄 나노입자에 의한 지방산대사의 억제를 예상할 수 있다.

일렉트론 트랜스퍼 플로보프로테인-유비퀴논 옥시토리덕타아제(Electron transfer flavoprotien-ubiquinone oxidoreductase; ETF-QO)는 이너미토콘드리아 멤브레인(innermitochondrial membrane) 내에 위치한 내재성 막단백질이다. ETF-QO의 결핍은 아실-CoA 디하이드로게나아제(acyl-CoA dehydrogenase)의 결핍을 초래하며, 이는 에너지 생산과 관련된 각종 대사성 질환을 야기시킨다(Zhang, J. et al., Structure of electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase and electron transfer to the mitochondrial ubiquinone pool. Proc . Natl . Acad . Sci. USA ., 2006, 103:16212-16217). 일렉트론 트랜스퍼 플로보프로테인-유비퀴논 옥시토리덕타아제(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial precursor; 도 1의 스팟4)는 이산화티타늄 나노입자에 노출된 마우스 간에서 단백질의 발현량이 감소하였다.

카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2; 도 1의 스팟 5) 단백질은 이산화티타늄 나노입자에 의해 간에서 발현량이 감소하였다. 카보닉 언하이드라아 제(Carbonic anhydrase)는 대부분의 조직에서 발견되는 아연을 함유한 금속성 효소로 이산화탄소를 이탄산과 프로톤으로의 전환을 촉매하여 호흡, 산염기 평형, 이온 수송 등과 같은 다양한 생리학적 및 생물학적 활성에 관여한다(Sly, W.S. and Hu. P.Y., Human carbonic anhydrases and corbonic anhydrase deficiencies. Annu . Rev. Biochem ., 1995, 64:375-401). 카보닉 언하이드라아제(Carbonic anhydrase)는 현재까지 10 여종의 동위효소가 알려져 있으며, 세포내 카보닉 언하이드라아제와 세포외 카보닉 언하이드라아제로 분류되며, 그 중에서 카보닉 언하이드라아제 2은 세포내 세포질에 존재한다. 카보닉 언하이드라아제(carbonic anhydrase)는 염증 통증과 관련하여 조직내 pH의 감소 및 근육내 pH의 세포외 조절과도 관련되어 있다.

설파이트 옥시다아제(Sulfite oxidase, 아황산염산화효소)는 모든 진핵생물 미토콘드리아에 존재하며, 아황산염이 황산염으로 전환되는 것을 촉매하는데, 이는 시스테인과 같은 황을 포함하는 아미노산 대사에 필요하며, 천식으로 인한 발작의 위험을 감소시킨다. 아황산염산화 효소 결핍의 경우에는 미량원소의 대사이상으로 각각 구리, 아연, 등의 결핍이 발생하게 된다. 또한, 미량원소 간 또는 다른 영양소와의 상호작용으로 특정 미량원소 흡수가 저해되기도 한다(Lind, T. et al., A community-based rando- mized controlled trial of iron and zinc supplementation in Indonesian infants: interactions between iron and zinc. Am. J. Clin . Nutr ., 2003, 7:883-90). 아황산염산화효소는 간재생과 관련이 있으며, 세포자살과 관련된 사이토크롬 C(cytochrome C) 단백질과 상호작용을 하는데, 이는 아황산염산화효소가 세포자살과 관련 있는 사이토크롬 C를 통해 간세포 재생에 영향을 줄 것으로 예상된다(Deng, X. et al., Exploring the priming mechanism of liver regeneration: proteins and protein complxes. Proteomics, 2009, 9:2202-2216). 이산화티타늄 나노입자에 의해 아황산염 산화효소(Suox Sulfite oxidase, mitochondrial precursor; 도 1의 스팟 6)의 발현량이 감소하였다.

아르기나아제(Arginase)는 간세포에 존재하는 효소로, 요소 회로내에서 아르기닌을 요소 및 오르니틴으로 가수분해한다. 아르기아나제(Arginase) A1과 A2의 동위효소를 가지며, 그 중 A1은 간에서 가장 높은 활성을 보이고, 요소 회로의 핵심적 역할을 하는 효소이다. 아르기나아제 A2(Arginase A2)는 오르니틴과 폴리아민의 생합성에 관여한다. 아르기나아제 A1(Arginase A1) 활성과 mRNA 발현량은 간경화증에서 두드러지게 감소하는 반면, A2의 활성과 발현은 일반 간세포에서 높아짐을 보였다(Chrzanowska, A. et al., Arginase isoenzymes in human cirrhotic liver. Acta Biochim . Pol ., 2009, 56:465-469). 아르기나아제 1(Arginase 1; 도 1의 스팟 7)은 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소하였으며, 이산화티타늄 나노입자에 의한 간 손상과 간경화와 관련 있을 것으로 생각된다.

알데히드 디하이드로게나아제(Aldehyde dehydrogenase)는 지방족(aliphatic) 또는 방향족(aromatic) 알데히드(aldehyde)를 산화시켜 카르복실산(carboxylic acid(formic acid))으로의 전환을 촉매하는 효소이며 간 해독과정 뿐만 아니라 신경전달물질의 분해대사에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Jelski, W. and Szmitkowski, M., Alcohol dehydrogenase(ADH) and aldehyde dehydrogenase(ALDH) in the cancer diseases. Clin . Chim . Acta, 2008, 395:1-5). 알데히드 디하이드로게나아제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1; 도 1의 스팟 8)은 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소하였으며, 이는 간해독 능력의 감소와 관련되어 있을 것으로 보인다.

카탈라제(Catalase)는 과산화수소를 물과 산소로 분해하여 유리기에 의한 손상을 막아주는 효소로, 효소활성시에는 산화 상태로 존재하고, 거의 모든 유기 호흡 생물에서 볼 수 있으며 항산화 효소 종류 중의 하나이다. 카탈라제는 간세포에 풍부하게 존재하고 과산화수소의 독성제거에 중요한 역할을 한다(Vijayan, V. and Helen, A., Protective activity of Bacopa monniera Linn. on nicotine-induced toxicity in mice. Phytother . Res ., 2007, 21:378-381). 이산화티타늄 나노입자에 의해 카탈라제(Catalase; 도 1의 스팟 9)의 발현양이 감소하였다. 따라서 이산화티타늄 나노입자에 의해 과산화수소의 독성제거가 감소될 것으로 예상된다.

엘로게이션 팩터-1알파(Elongation factor-1a; EF-1a)는 세포손상시 세포 재생을 위한 단백질로, 세포 주기의 주요 조절인자이며, 췌장이나 직장, 유방, 폐, 위의 종양 조직에서 과발현된다. 특히, EF-1 알파 mRNA의 과발현은 전이와 관련이 있으며, 최근 연구에서는 EF-1 알파2의 발현이 ER 발현, 종양 크기, p53 돌연변이와 관련있다고 알려져 있다(Pecorari, L. et al., Elongation factor 1 alpha interacts with phospho-Akt in breast cancer cells and regulates their proliferation, survival and motility. Mol . Cancer, 2009, 8:58). 엘롱게이션 팩터1-알파2(Elongation factor 1 alpha 2; 도 1의 스팟 10)는 이산화티타늄 나노 입자에 의하여 발현양이 감소하였는데 이는 이산화티타늄 나노입자에 의한 발암화 조절기전과 관련되어 있을 것으로 보인다.

사이토크롬 b(Cytochrome b)는 동물, 식물, 곰팡이 등에서 발견되는 유비퀴토스 일렉트론 트랜스포트 헤모프로테인(ubiquitous electron transport hemoproteins)으로 산화 환원을 전환하는 능력을 가지고 있으며, 특히 세포내의 산화적 인산화 반응에서 에너지를 생산하는데 도움을 주는 단백질이다(Trumpower, B. L., Cytochrome bc1 complexes of microorganisms. Microbiol . Mol . Biol . Rev., 1990, 54:101-129). 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial precursor; 도 1의 스팟 11 및 15)는 이산화티타늄 나노입자에 의하여 발현양이 감소하였다.

아폴리포프로테인 A-1(Apolipoprotein A-1; Apo A-1)은 고밀도 지방 단백질의 주요 구성 단백질로서, 심장순환계의 방어기작 역할을 해왔다. 더욱이 세포 매개 염증과정에서 전구염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 생산의 강력한 억제제 역할을 한다. 게다가, Apo A1은 항염증 분자로서, 대식세포로부터 T세포 신호를 막고, 종양괴사인자 알파 및 인터루킨 1의 생산을 억제한다. 이 결과 Apo A1 레벨이 증가하면 염증을 감소 시킬 수 있음을 보여준다(Hyka, N. et al., Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha by blocking contact-m ediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood, 2001, 97(8): 2381-2389). 이산화티타늄 나노입자에 의하여 Apo A1 전구체(도 1의 스팟 12) 발현량이 감소하였으며, 이산화티타늄 나노입 자에 의해 유도되는 염증유발과 관련되어 있을 것으로 보인다.

이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제(Isovaleryl-CoA dehydrogenase)는 이소발레릴-CoA(isovaleryl-CoA)를 3-메틸크로토닐-CoA(3-methylcrotonyl-CoA)로의 전환을 촉매하는 호모테트라메릭(homotetrameric) 미토콘드리아 플라보엔자임이다. 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제(Isovaleryl-CoA dehydrogenase)의 결핍이 되면 혈중 이소발레르산(isovaleric acid)가 현저히 증가하여 식욕저하, 구토, 저체온, 경련, 지능저하 등을 일으키는 상염색체 열성 대사이상 질환이 생긴다(Mohsen, A. W. et al ., Characterization of molecular defects in isovaleryl-CoA dehydrogenase in patients with isovaleric acidemia. Biochemistry , 1998, 37:10325-10335). 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제, 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial precursor; 도 1의 스팟 13)는 이산화티타늄 나노입자에 의하여 발현량이 증가하였다.

베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase)는 피리미딘 염기인 티민과 우라실의 이화작용과 관련된 효소로, 가수분해 효소 구성원 중에 하나이다. 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase)가 결핍되면 피리미딘 퇴화과정 및 대사장애와 같은 선천성 결손이 야기되며, 그 결과 정신지체와 같은 뇌이상의 문제를 야기하게 된다(van Kuilenburg, A. B. et al., beta-Ureidopropionase deficiency: an inborn error of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities. Hum . Mol . Genet., 2004, 13:2793-2801). Upb1 베타-우레이도프로피오나아제(도 1의 스팟 14)는 이산화티타늄 나노입자에 의하여 그 발현량이 증가하였다.

몇몇 마우스를 사용한 이산화티타늄 나노입자 주입 실험들에 의하면, 이산화티타늄 나노입자가 비장, 폐, 신장, 간 조직에 남아 축적되며, 이산화티타늄 나노입자에 의하여 중요 병리학적 변화를 보이게 된다. 투과전자현미경적 관찰을 통한 실험결과, 이산화티타늄이 마우스 간 조직내로 들어가 세포질이나 핵 근처에 나노입자들이 응집되어 클러스터(cluster)를 형성하는 모습이 뚜렷하게 관찰되었다.

본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 마커는, 이산화티타늄 나노입자를 검출하는 데에 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 또한, 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 진단용 키트에 있어서, "항체"는 이산화티타늄 나노입자에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 항체를 생산하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있으므로, 당업계에 널리 공지된 항체 생산 방법 중 어느 하나를 선택하여 항체를 생산할 수 있다.

다클론 항체는 이산화티타늄 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 1976, 6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 이산화티타늄 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 이산화티타늄 나노입자 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

단클론 항체는 이산화티타늄 마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 이산화티타늄 마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다. 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예컨대, 미국 등록특허 제5,223,409호 등에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 2 개의 항체 또는 "샌드위치" ELISA를 사용하여 생체 시료 샘플에서 이산화티타늄 나노입자를 검출할 수 있다. 상기 "샌드위치" 또는 "두 부위" 면역분석은 당업계에 알려져 있다(John Wiley & Sons, Current Protocols in Immunology. Indirect Antibody Sandwich ELISA to Detect Soluble Antigens, 1991 참조). 이러한 측면에서, 본 발명은 하나의 이산화티타늄 나노입자 마커상에 서로 상이한 항원 형성 부위 2 곳에 특이적인 항체 2 개를 사용한다. "서로 상이한 항원 형성 부위"는 항체들은 목적한 이산화티타늄 나노입자 마커 단백질상의 상이한 부위에 특이적이어서, 하나의 항체의 결합은 이산화티타늄 나노입자 마커 단백질에 다른 항체의 결합을 현저하게 방해하지 않는 것을 의미한다. 제1 항체, 이른바 "포획 항체"는 고형 지지체에 고정 또는 결합된다. 예컨대, 목적한 이산화티타늄 나노입자 마커에 대한 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰, 비드, 큐벳 또는 그 외 반응 용기에 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 바람직한 예에서, 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰에 결합된다. 고형 지지체에 항체를 부착하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 신체 샘플, 특히 혈청 샘플을 고형 지지체와 접촉시켜, 결합된 포획 항체와 복합체를 이룰 수 있도록 한다. 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 이차 항체, 이른바 "검출 항체"를 고형 매트릭스에 첨가한다. 검출 항체는 목적한 이산화티타늄 나노입자 마커상의 개별적인 항원 형성 부위에 특이적이며, 검출가능한 신호를 제공하는 물질로 커플링되거나 또는 표지된다. 이러한 항체 표지물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 검출 항체와 인큐베이션한후, 결합되지 않은 항체는 제거하고, 고형 지지체에 결합된 표지된 검출 항체를 정량하여 이산화티타늄 나노입자 마커의 발현 수준을 측정한다. 포획 및 검출 항체를 신체 샘플과 전술한 바와 같이 연속적으로 또는 동시에 접촉시킬 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 나아가, 고정된 포획 항체와 샘플을 접촉하기 전에 먼저 신체 샘플을 검출 항체와 인큐베이션할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루 시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 진단용 키트에 대하여 설명하면 다음과 같다. "키트"는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 임의의 또는 모든 키트 시약을 외부 환경으로부터 이를 보호하는 밀폐된 용기 또는 파우치와 같은 용기에 포함시킬 수 있다.

특정 예로, 본 발명의 면역세포화학 키트는 적어도 2 가지 이상의 개별 단백질 마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 2 가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 추가적으로 포함한다. 각 항체는 개별 시약으로써 또는 목적한 상이한 단백질 마 커에 대한 모든 항체를 포함한 항체 칵테일로서 키트에 제공될 수 있다.

바람직한 예로, 면역화학적인 방법 특히 "샌드위치" ELISA 을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 수동 또는 자동화된 면역화학적인 기법과 함께 사용가능하다. 이러한 키트는 목적한 단백질 마커에 대한 하나 이상의 제1포획 항체, 단백질 마커의 다른 항원성 부위에 특이적인 표지된 제2 검출 항체, 및 단백질 마커에 항체 결합을 검출하기 위한 화합물을 포함한다. 제1 포획 항체는 이후 고형 지지체에 부착하기 위해 용액중으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 포획 항체는 고형 지지체, 예컨대 비드나 마이크로타이터 플레이트의 웰에 이미 결합된 키트로 제공될 수 있다. 항원-항체 복합체를 검출하는 임의의 화합물을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 제 2 검출 항체는 기질의 비색 변환을 촉매하는 효소가 접합된다. 이러한 효소 및 항체 결합을 검출하기 위한 이의 이용 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 예로, 키트는 HRP가 접합된 제 2 검출 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP-표지된 제 2 검출 항체의 경우, 테트라메틸벤지딘)와 황산과 같이 효소 반응을 중지시키는 용도의 용액과 같이 사용할 수 있는 기질, 특히 발색단을 추가적으로 제공할 수 있다. 특정 예에서, 항체 결합을 검출하기 위한 화합물은 상업적으로 이용가능한 시약 및 키트를 포함한다. 또 다른 예로, 본 발명의 "샌드위치" ELISA 키트는 목적한 2 이상의 상이한 바이오마커를 검출하기 위한 항체들을 포함한다. 이러한 키트는 2 이상의 제1 포획 항체와 각각의 바이오마커에 대한 2차 검출 항체를 포함한다. 상기 포획 항체는 개별적인 시약으로서 또는 대안적으로는 목적한 여러가지 바이오마커에 대한 모든 항체들의 혼합물 로 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 채택된 시약의 정확한 사용과 활성을 검증하기 위해, 키트내에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 목적한 바이오 마커가 있거나 없는 것으로 알려진 조직 단편, 글라스 슬라이드에 고정된 세포 등과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 특정 예로, 양성 대조군은 목적한 바이오마커 단백질을 포함하는 용액이다. 대조군의 제작 및 사용은 당업자의 일반적인 능력 내에서 표준적이며 자명하다.

이하, 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 실험동물 배양 및 이산화티타늄 나노입자 준비

6주령 수컷 ICR 마우스는 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다. 실험동물은 무작위로 그룹을 나누어 사용하였으며, 사육 조건은 온도 21~23℃, 습도 40~60%, 조명 12시간 명암으로 유지시켰으며, 실험동물은 분양받은 다음날 사용하였다. 본 실험에 사용한 실험동물은 중앙실험 동물 사육장으로 부터 공급받아 실험에 사용하였으며, 사용한 이산화티타늄 나노입자의 크기는 25 nm 미만으로 시그마알드리치사에서 구입하였다.

2. 감작 및 유도

모든 ICR 수컷 마우스는 대조군과 처리군으로 각각 6 마리씩 나누었다. 처리군에는 2.5 mg의 이산화티타늄 나노입자를 0.2 ml의 PBS 완충용액에 넣고 섞은 후 복강주사로 주입하였으며, 응집(aggregation)을 막기 위해 마우스에 처리하기 전, 초음파 진동을 10 분간 가하였다. 마우스에 복강주사 후 30 분이 지난 시점에서 0.1 mg/0.1 ml의 이산화티타늄 나노입자를 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 녹인 후 코에 넣어 주었다. 대조군은 똑같은 방법으로 마우스에 PBS로만 주사하였다. 위와 같은 실험을 7 일간 반복하였다.

3. 단백질 추출

프로테옴 분석을 위해서 PBS로 처리한 대조군, 이산화티타늄 나노입자로 반응을 유도한 처리군에서 분리한 간 조직을 액체질소로 얼린 다음 파쇄하였다. 파쇄한 조직 샘플들을 7M 우레아(urea), 2 M 티오우레아(thiourea), 4% CHAPS, 0.5% 양쪽성 전해질(ampholytes), 100 mM DTE가 포함되어 있는 40 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.8)에서 한번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 10℃, 16,500 rpm에서 90 분 동안 원심분리한 뒤 얻어진 상등액을 사용하였으며, 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

4. 이차원 전기영동(2- dimensional gel electrophoresis )

이차원 전기영동을 위해서 이산화티타늄 나노입자가 처리된 마우스 간 조직 을 모은 뒤 총 단백질을 분리하였다. 그리고, 차가운 10% TCA / 아세톤 용액을 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 남아 있는 TCA를 제거하기 위해서 차가운 아세톤으로 5 회 반복하여 세척하였고, 남아있는 아세톤을 상온에서 증발시켰다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

4-1. 일차원 전기영동( Isoelectrofocusing : IEF ; 등전점 전기영동)

이산화티타늄 나노입자가 처리된 마우스 간 조직에서 분리한 총 단백질 양은 각각 700 ㎍ 이상이 되게 하였고, 250 ㎕의 재수화(rehydration) 용액(7 M 유레아, 2 M 티오유레아, 4% CHAPS, 0.5% ampholytes, 100 mM DTT, 0.01% 브로모페놀 블루)을 사용하여 단백질을 녹였다. 250 ㎕의 재수화 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG holder에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 13 cm 고정된 드라이 스트립(immobilized dry strip)(pH 3-10 NL, Amer sham Bioscience)를 이용하여 12 시간 동안 재수화시켰다. 250 V/ 100 Vhrs, 500 V/ 500 Vhrs, 1,000 V/ 1,000 Vhrs 및 8,000 V/ 38,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

4-2. 이차원전기영동( SDS - PAGE : SDS - polyacrylamide gel electrophoresis )

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1 차 평형화 완충용액 [6 M urea, 0.4 M Tris-HCl(pH 8.8), 2% SDS, 2% DTT, 10% 글리세롤]에서 각각 15 분간 1 차 평형화를 실시한 후, 2 차 평형화 완충용액 [6 M 유레아, 0.4 M Tris-HCl(pH 8.8), 2% SDS, 2.5% 요오도아세트아미드, 10% 글리세롤]에서 15 분간 2 차 평형화를 실시하였다. 12.5% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 1% 아가로스 젤로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 15 분 동안 겔 당 25 mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 5 시간 동안 겔 당 50 mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

4-3. 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 Coomassie Blue G-250 염색 용액(34% 메탄올, 0.1% Coomassie G-250, 17% 암모늄 설페이트, 3% 포스포릭산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12 시간 이상 염색한 후 5% 아세트산을 사용하여 탈색하였다.

4-4. 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLoook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 Image Master^TM(2D software, Amersham)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3 장의 겔을 분석하였다.

5. 액체 크로마토그래피/질량 분광법( LC / MS ) 및 단백질 확인

샘플을 비규격 5-20 ㎛ C18 수지로 패킹된 360 ㎛ o.d. x 75 ㎛ i.d. 미세 모세관 융합 실리카 예비컬럼에 로딩하였다. 샘플 로딩 후에, 예비컬럼을 15 분 동안 0.1％ 아세트산으로 세척하여 임의의 완충액 염 또는 겔 오염물질을 제거하였다. 이어서, 예비컬럼을 통합된 전자분사 방출구가 구축된 규격 5 ㎛ C18 수지로 패킹된 360 ㎛ o.d. x 50 ㎛ i.d. 분석용 컬럼에 연결시켰다. 샘플을 1100 시리즈 2-원 HPLC 용매 전달 시스템(아질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 이용하여 써모피니간 LTQ 이온 트랩 질량 분광분석기(써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corp.), 미국캘리포니아주 산 로즈 소재)로 직접 60 nL/분의 유속으로 구배 용리하였다. 다른 실시예에서는, 우수한 질량분해능을 제공하는 써모피니간 LTQ-FT 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다. 사용되는 HPLC 계단식 구배는 처음에 100％ A, 5％ B(5분), 50％ B(220분), 100％ B(240분)이였으며, 280분에 다시 100％ A로 회복된다(용매A = 0.1 M 아세트산, 용매 B = 0.1 M 아세트산 중 70％ 아세토니트릴). LTQ 질량 분광분석기는 데이타-의존적방식으로 작동시켰으며, 여기서 우선 처음 MS 스캔은 질량 범위 300 내지 2000 Da에 걸친 이온의 질량 대 전하(m/z) 비를 기록한 후에, 10종의 최대 풍부한 이온을 이후의 충돌에 의해 활성화되는 해리에 대해 자동적으로 선별하여 MS/MS 스펙트럼을 기록하였다.

6. 투과전자현미경 표본제작

이산화티타늄 나노입자를 처리한 마우스 간 조직의 미세구조의 변화 및 침착 정도를 관찰하기 위하여 투과전자현미경 표본을 제작하였다. 투과전자현미경 관찰은 마우스에서 폐 조직을 적출한 즉시 3% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에 3 시간 동안 전고정하고 1% OsO₄에 2 시간 동안 후 고정하였다. 고정 후, 수분 제거를 위해 60% 에탄올로부터 무수에탄올까지 농도 상승 순으로 각 20 분씩 탈수한 후, 프로필렌옥사이드(propylene oxide)로 30 분간 치환하였다. Epon 혼합물에 포매하였다. 포매가 완료된 조직은 100 nm 두께로 초박절편을 제작하여 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 구연산 납(lead citrate)으로 이중 전자염색하여 투과전자현미경(JEM-1010, JEOL Co.)으로 가속전압 80 kV 하에서 관찰하였다.

7. 실험 결과 및 고찰

이산화티타늄 나노입자에 의해서 변화되는 마우스 간 조직내 단백질의 발현 양상의 변화를 프로테오믹스(Proteomics)기술을 이용하여 분석하였다. 이차원 전기영동과 펩타이드와 아미노산수준에서 정확한 질량분석이 가능한 LC MS/MS를 사용하여 단백질의 발현양상을 정확하게 관측하였다.

도 1은, 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 단백질들의 차별적 발현양상을 나타내는 이차원 전기영동 사진을 나타낸 것이다. 도 1에 개시된 스팟들은 대조군(control)과 비교하여 단백질 발현량이 변화된 경우를 의미한다. 각각의 스팟(spot)들에 해당하는 구체적인 단백질의 종류는 도 2에 나타내었다. 도 1 및 2에 개시된 스팟들의 구체적인 단백질의 종류 및 발현량의 증가 또는 감소여부에 대하여, 하기 표 1에 정리하였다. 또한, 이산화티타늄 나노입자를 처리한 마우스 간 조직의 투과전자 현미경의 관찰결과는 도 3과 같다.

[표 1]

본 실험에 의한 결과인 도 1 내지 3 및 표 1의 결과를 종합하면, 본 발명의 일실시예에 따른 이산화티타늄 나노입자 마커는,

물질대사 단백질로서 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase);

수송 단백질로서 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor);

산환 환원 단백질로서 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor);

이화과정 단백질로서 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases);

당신생 단백질로서 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1);

항산화효소로서 카탈라제(Catalase); 및

생합성 단백질로서 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.

도 1은 이산화티타늄 나노입자에 의한 마우스 폐 조직내 단백질들의 차별적 발현 양상을 나타낸 이차원 전기영동 사진이다.

도 2는 이산화티타늄 나노입자 처리에 의해 발현량이 감소한 단백질(A)과 발현량이 증가한 단백질(B)를 나타낸 것이다.

도 3은 이산화티타늄 나노입자 처리 전후의 마우스 간 조직의 투과전자현미경 관찰결과를 나타낸 것이다.

Claims

프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1), 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가 또는 감소되는 단백질을 포함하며,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가되는 단백질은, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1, 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소되는 단백질은, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor) 및 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 수송 단백질을 포함하며,

상기 수송 단백질은, 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2) 및 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 산화 환원 단백질을 포함하며,

상기 산환 환원 단백질은 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1) 및 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 이화과정 단백질을 포함하며,

상기 이화과정 단백질은 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases)인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 당신생 단백질을 포함하며,

상기 당신생 단백질은 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1)인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 항산화 효소를 포함하며,

상기 항산화 효소는 카탈라제(Catalase)인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물은, 생합성 단백질을 포함하며,

상기 생합성 단백질은 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출용 마커 조성물.
제 1 항에 따른 이산화티타늄 나노입자 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이산화티타늄 나노입자 진단용 키트.
시료 중의 이산화티타늄 나노입자 포함 여부에 대한 정보를 제공하기 위한 이산화티타늄 나노입자 검출방법으로서,

(a) 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1), 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 이산화티타늄 나노입자 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 시료를 반응시키는 단계; 및

(b) 상기(a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군(이산화티타늄 나노입자를 함유하지 않은 시료와 반응시켜 형성된 항원-항체 복합체)과 비교하는 단계를 포함하는 이산화티타늄 나노입자 검출방법.
제 10 항에 있어서,

상기(b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 경우에는 이산화티타늄 나노입자의 존재에 대하여 양성 판정을 하며,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 증가되는 단백질은, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제 알파 체인(Propionyl-CoA carboxylase alpha chain), 아르기나아제-1(Arginase-1), 아폴리프로테인 A-1 전구체(Apoliprotein A-1 precursor), 일렉트론 트랜스퍼 플라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 전구체(Electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase mitochondrial precursor), 카보닉 언하이드라아제 2(Carbonic anhydrase 2), 사이토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 1 미토콘드리아 전구체(Cytochrome b-c1 complex subunit1 mitochondrial precursor), 설파이트 옥시데이즈 미토콘드리아 전구체(Sulfite oxidase mitochondrial precursor), 알데히드 디하이드로게나제 패밀리 8 멤버 A1(Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1), 디메틸글리신 디하이드로게나아제(Dimethylglycine dehydrogenases), 프락토스-1,6-비스포스파타아제 1(Fructose-1,6-bisphosphatase 1, 카탈라제(Catalase) 및 엘롱게이션 팩터 1-알파 2(Elongation factor 1-alpha 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,

이산화티타늄 나노입자에 의해 발현량이 감소되는 단백질은, 이소발레릴-CoA 디하이드로게나아제 미토콘드리아 전구체(Isovaleryl-CoA dehydrogenase mitochondrial precursor) 및 베타-우레이도프로피오나아제(Beta-ureidopropionase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출방법.
제 10 항에 있어서,

상기 시료는, 간 조직으로부터 채취한 시료인 것을 특징으로 하는 이산화티타늄 나노입자 검출방법.