KR101070526B1

KR101070526B1 - 페난트렌 오염 검출을 위한 마커 및 키트

Info

Publication number: KR101070526B1
Application number: KR1020080118711A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 남석우; 류재천; 박슬기
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-27
Filing date: 2008-11-27
Publication date: 2011-10-05
Also published as: KR20100060208A

Abstract

페난트렌 오염 마커, 그 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 페난트렌 오염 여부 진단용 키트, 항원-항체 복합체 형성을 통하여 페난트렌 오염 마커를 검출하는 방법이 개시되며, 이를 이용하면, 효과적으로 페난트렌 오염을 검출할 수 있다.

페난트렌, 오염, 마커, 단백질, 검출, 키트, 항체

Description

페난트렌 오염 검출을 위한 마커 및 키트{Marker and kit for detecting contamination of phenanthrene}

본 발명은 페난트렌에의 노출 내지는 오염을 검출하기 위한 마커에 관한 것이다. 또한 본 발명은 페난트렌에의 노출 내지는 오염을 검출하는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 페난트렌에의 노출 내지는 오염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

페난트렌(Phenanthrene)은 PAH (Polycyclin aromatic hydrocarbons)의 일종으로서, 세 개의 벤젠고리로 구성된 안정한 물질이며, 페닐(phenyl)과 안트라센(anthracene)의 합성물이다. 화학식은 C₁₄H₁₀, 분자량은 178.24 인 광택이 나고 청색의 형광이 있는 무색의 판상 결정이다. 비중은 1.063(101℃), 융점은 99.15℃, 비점은 340℃, 증기압은 193, 7 mmHg이며 굴절률은 1.645이다. 벤젠과 에테르에는 녹지만 알코올에는 잘 녹지 않으며, 주로 석탄 타르에서 얻는 안트라센유 속에 함유되어 있다. 이러한 소수성 화합물은 소수성 친지질 특성을 지니고 있어 유기화합 물이 풍부한 해양 지질토, 토양에 축적된다. 이런 이유로 먹이 사슬을 통한 생물 농축의 가능성도 매우 높으며, 급성 독성효과나 돌연변이, 암, 기형을 유발하기도 하는 유해물질로 규정되어 있다.

PAHs는 자연계에서 발견할 수 있지만 제조도 가능하다. PAHs는 석탄, 오일, 가스, 그리고 쓰레기와 같은 물질이 연소하는 과정에서 야기되며, 불완전 연소시 발생된다. 페난트렌은 염료, 플라스틱, 구충제, 폭약 또는 약품 제조에 사용되며 담즙산, 콜레스테롤 또는 스테로이드 제조에도 사용되었다.

페난트렌이 신체에 흡수되는 경로는 오염된 공기 흡입에 의해서이다. 호흡 시 폐로 유입될 수 있다. PAHs로 오염된 음식이나 물을 먹거나 마시는 과정에서 노출되기도 한다. 또한 PAHs로 오염된 흙 또는 다량의 오일, 석탄 타르 또는 크레오소트(creosote)와 피부 접촉 시 노출될 수 있다. PAHs가 한 번 몸에서 퍼지면 지방 조직이 표적이 되며, 표적이 되는 기관은 신장, 간 그리고 지방이 포함된다. 그러나, 하루가 지나면 PAHs는 소변이나 배설물을 통해 몸 밖으로 빠져나간다.

PAHs에 의한 노출은 담배 연기의 흡입, 오염된 토양에서 자란 음식의 섭취 뿐 아니라 그릴에서 조리되는 고기나 다른 음식의 섭취 시 가능한데 그릴에 굽거나 태운 음식은 실제로 음식 내 PAHs의 양을 증가시킨다.

낮은 분자량의 PAHs는 면역 억제, 광독성, 신경학적, 실험 동물의 생식 기능 이상 등을 유발한다. PAHs는 음식이나 오염된 공기를 통해 흡입되고 다른 영향으로는 피부, 체액, 그리고 체내에서 질병에 대한 저항성에 도움을 주는 면역 시스템의 손상을 포함한다.

유전자는 세포 내에서 단백질 합성 후 변형(post translational modification) 여부에 따라 세포내에서의 기능이 좌우될 뿐만 아니라 유전자 전사에 의해 합성된 mRNA가 실제로 단백질을 만드는 양은 세포나 조직 및 기관내 생리적 조건에 따라서 매우 크게 변한다. 이러한 이유로, 최근에는 최종 산물인 단백질 수준에서의 분석이 유전자 수준에서의 분석보다 중요한 것으로 받아들여지고 있다.

본 발명의 일실시예의 목적은, 페난트렌 오염 여부를 검출하는 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 페난트렌 오염 여부를 진단하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 페난트렌 오염 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커는, 생체의 페난트렌 오염 여부를 진단하기 위한 마커로서, 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor); 알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1); 페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase); 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17); 아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase); 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1); 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈; 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2); 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit); 및 디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 여부 진단용 키트는 상기 페난트렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커 검출 방법은,

a) 상기한 페난트렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

b) 상기 a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용하면 페난트렌에의 오염 여부를 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 페난트렌에 의해서 변화되는 세포 내 단백질의 발현 양상의 변화를 프로테오믹스(Proteomics)기술을 이용하여 분석하였다. 이차원 전기영동과 펩타이드와 아미노산수준에서 정확한 질량분석이 가능한 MALDI-TOF를 사용하여 단백질의 발현양상을 정확하게 관측함으로써 페난트렌 검출을 위한 마커로서의 이용을 확인하였다.

본 명세서에서 "생물학적 시료"는 페난트렌 오염 마커를 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액 샘플을 의미한다. 예로써, 혈액, 뇨, 림프, 여성 체액, 생검, 땀, 대변 및 눈물 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "대조군의 정상 범위"란, 페난트렌에 오염되지 아니한 정상 대조군이 해당될 수 있는 최대 범위를 가리킨다.

페난트렌에 의해 감소되는 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor)(스팟 1)는 화학반응을 촉매하는 효소로 이 효소의 기질은 N,N-디메틸글리신(N,N-dimethylglycine), 억셉터(acceptor), H₂O인데 반해 생성물은 사르코신(sarcosine), 포름알데히드(formaldehyde), 환원된 억셉터(reduced acceptor)이다. 이 효소는 산화환원효소의 일원으로, 특히 또 다른 수용체와 함께 CH-NH 그룹의 제공자로 작용하며, 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine) 대사와 관계가 있다. 과사르코신혈증(hypersarcosinemia)은 디메틸글리신 디히드로지네이즈의 결핍에 의한 것으로 예측되며, 사르코신의 혈중, 조직(간, 뇌) 농도의 상승, 요중 배설량 증가 등이 일어난다.

페난트렌 처리시 증가된 알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1)인 스팟 2 번은, 지방족 또는 방향족 알데히드를 산화시켜 카르복실산(포름산)으로의 전환을 촉매하는 효소이며, 간 해독과정 뿐만 아니라 신경전달물질의 분해대사에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

스팟 3 번은 페닐알라닌 히드록실레이즈(phynylalanine hydroxylase)로 페난트렌에 의해 감소하였는데, 이는 생물학적 촉매제로 과량의 페닐알라닌을 다른 아미노산인 타이로신으로 전환시켜 페닐알라닌의 양을 미세하게 조절한다. 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria) 라는 질병은 페닐알라닌 가수분해효소의 활성이 선천적으로 저하되어 있기 때문에 페닐알라닌과 그 대사산물이 혈액에 축적되어 지능 장애, 담갈색 모발, 피부의 색소 결핍을 초래한다.

증가된 스팟 중 4 번인 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17)은 재생을 위한 세포 성장에 단백질 합성 기구를 활성화하는데 관여한다고 밝혀져 있다. 케라틴 단백질은 일반적으로 머리털, 손톱, 피부 등 상피구조의 기본을 형성하는 단백질로 세포가 물리적인 손상에 저항할 수 있도록 도와주는 것으로 보고되어 있다.

아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase)(스팟 5, 6 번) 역시 페난트렌 처리시 증가하였는데, 1964년 골블라트(Golblatt)는 아플라톡신 B1은 쥐에는 간문맥주위에 괴사를 일으키고 마우스에서는 중심 소엽성 괴사(centrilobular necrosis)를 유발한다고 보고하였다(Goldblatt, L. A. (1969) "Aflatoxin", Academic Press, New York, pp. 472).

페난트렌에 의해 감소된 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1)(스팟 7)은 N-히드록실아민 설포트랜스퍼레이즈(N-hydroxyarylamine sulfotransferase, HAST-I)라고도 한다. 이 단백질은 호르몬, 신경전달물질, 약물과 지노바이오틱(xenobiotic) 화합물의 설페이트 결합을 촉매한다.

스팟 8 번인 체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈 의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver)의 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈는 산화적 손상에 대항하는 중요한 방어기작의 역할을 하며 트리펩티드 글루타티온(tripepteide glutathione)(GSH, γ-glutamyl-cysteinyl-glycine)의 결합을 촉매하며, 생물체내 또는 외부의 화합물을 무독화시키는 역할을 한다. 이 단백질은, 세포 내에서 아주 중요한 항산화제인 글루타티온(GSH)과의 컨쥬게이션(conjugation)을 통해 다양한 지노바이오틱(xenobiotic) 화합물의 무독화(detoxification)를 일으킨다고 알려져 있다. 또한 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈는 폭넓은 기질 특이성을 가지고 있어서 광범위한 유독성 화학물질들로부터 세포를 보호하기도 한다.

스팟 9, 10 번은 헤모글로빈 베타-2(hemoglobin beta-2)로, 헤모글로빈 내의 헴(heme)을 지니며 혈액 내 가스교환에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2), 헤모글로빈 베타-2 체인(Hemoglobin beta-2 chain), 베타-2-글로빈(Beta-2-globin), 헤모글로빈 베타 체인 마이너 폼(Hemoglobin beta chain, minor-form)이라고도 한다. 스팟 10은 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit)이다.

디아제팜 결합 단백질(Diazepam binding protein)(스팟 11)은 페난트렌 처리시 감소하였는데, 이 단백질은 호르몬으로 조절되고 지질 대사에 포함된다. 췌장 분비액의 반응을 조절하고 식사 후 콜레시스토키닌(cholecystokinin)의 방출과 부신피질선 내 스테로이드의 부신피질 자극 호르몬에 의한 합성 매개체 역할도 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커는 페난트렌 오염을 검출하는 데에 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 또한, 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커 검출 방법에 있어서, "항체"는 페난트렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 항체를 생산하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있으므로, 당업계에 널리 공지된 항체 생산 방법 중 어느 하나를 선택하여 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커 검출 방법은, 당업계에 널리 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA, 또는 면역침강기법과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다.

다클론 항체는 상기한 페난트렌 오염 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 페난트렌 오염 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같 은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 페난트렌 오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

단클론 항체는 페난트렌 오염 마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 페난트렌 오염 마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01;and the Stratagene SurβAPS Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예컨대 미국 특허 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619;WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; 및 90/02809; Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 2개의 항체 또는 "샌드위치" ELISA를 사용하여 환자 샘플에서의 페난트렌 오염 마커의 과다 발현을 검출한다. 상기 "샌드위치" 또는 "두 부위" 면역분석은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Current Protocols in Immunology. Indirect Antibody Sandwich ELISA to Detect Soluble Antigens, John Wiley & Sons, 1991를 참조한다. 이러한 측면에서, 본 발명은 하나의 페난트렌 오염 마커상에 서로 상이한 항원 형성 부위 2곳에 특이적인 항체 2개를 사용한다. "서로 상이한 항원 형성 부위"는 항체들은 목적한 페난트렌 오염 마커 단백질상의 상이한 부위에 특이적이어서, 하나의 항체의 결합은 페난트렌 오염 마커 단백질에 다른 항체의 결합을 현저하게 방해하지 않는 것을 의미한다. 제1 항체, 이른바 "포획 항체"는 고형 지지체에 고정 또는 결합된다. 예컨대, 목적한 페난트렌 오염 마커에 대한 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰, 비드, 큐벳 또는 그외 반응 용기에 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 바람직한 예에서, 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰에 결합된다. 고형 지지체에 항체를 부착하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 신체 샘플, 특히 혈청 샘플을 고형 지지체와 접촉시켜, 결합된 포획 항체와 복합체를 이룰 수 있도록 한다. 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 이차 항체, 이른바 "검출 항체"를 고형 매트릭스에 첨가한다. 검출 항체는 목적한 페난트렌 오염 마커상의 개별적인 항원 형성 부위에 특이적이며, 검출가능한 신호를 제공하는 물질로 커플링되거나 또는 표지된다. 이러한 항체 표지물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 검출 항체와 인큐베이션한후, 결합되지 않은 항체는 제거하고, 고형 지지체에 결합된 표지된 검출 항체를 정량하여 페난트렌 오염 마커의 발현 수준을 측정한다. 포획 및 검출 항체를 신체 샘플과 전술한 바와 같이 연속적으로 또는 동시에 접촉시킬 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 나아가, 고정된 포획 항체와 샘플을 접촉하기 전에 먼저 신체 샘플을 검출 항체와 인큐베이션할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 마커 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페 린, 루시퍼라아제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 페난트렌 오염 진단용 키트에 대하여 설명하면 다음과 같다. "키트"는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 임의의 또는 모든 키트 시약을 외부 환경으로부터 이를 보호하는 밀폐된 용기 또는 파우치와 같은 용기에 포함시킬 수 있다.

특정 예로, 본 발명의 면역세포화학 키트는 적어도 2가지 이상의 개별 단백질 마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 2가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 추가적으로 포함한다. 각 항체는 개별 시약으로써 또는 목적한 상이한 단백질 마커에 대한 모든 항체를 포함한 항체 칵테일로서 키트에 제공될 수 있다.

바람직한 예로, 면역화학적인 방법 특히 "샌드위치" ELISA 을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 수동 또는 자동화된 면역화학적인 기법과 함께 사용가능하다. 이러한 키트는 목적한 단백질 마커에 대한 하나 이상의 제1포획 항체, 단백질 마커의 다른 항원성 부위에 특이적인 표지된 제2 검출 항체, 및 단백질 마커에 항체 결합을 검출하기 위한 화합물을 포함한다. 제1 포획 항체는 이후 고형 지지체에 부착하기 위해 용액중으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 포획 항체는 고형 지지체, 예컨대 비드나 마이크로타이터 플레이트의 웰에 이미 결합된 키트로 제공될 수 있다. 항원-항체 복합체를 검출하는 임의의 화합물을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 제2 검출 항체는 기질의 비색 변환을 촉매하는 효소가 접합된다. 이러한 효소 및 항체 결합을 검출하기 위한 이의 이용 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 예로, 키트는 HRP가 접합된 제2 검출 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP-표지된 제2 검출 항체의 경우, 테트라메틸벤지딘)와 황산과 같이 효소 반응을 중지시키는 용도의 용액과 같이 사용할 수 있는 기질, 특히 발색단을 추가적으로 제공할 수 있다. 특정 예에서, 항체 결합을 검출하기 위한 화합물은 상업적으로 이용가능한 시약 및 키트를 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 "샌드위치" ELISA 키트는 목적한 2 이상의 상이한 바이오마커를 검출하기 위한 항체들을 포함한다. 이러한 키트는 2 이상의 제1 포획 항체와 각각의 바이오마커에 대한 2차 검출 항체를 포함한다. 상기 포획 항체는 개별적인 시약으로서 또는 대안적으로는 목적한 여러가지 바이오마커에 대한 모든 항체들의 혼합물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 채택된 시약의 정확한 사용과 활성을 검증하기 위해, 키트내에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 목적한 바이오마커가 있거나 없는 것으로 알려진 조직 단편, 글라스 슬라이드에 고정된 세포 등과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 특정 예로, 양성 대조군은 목적한 바이오마커 단백질을 포함하는 용액이다. 대조군의 제작 및 사용은 당업자의 일반적인 능력 내에서 표준적이며 자명하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 단백질 추출

프로테옴 분석을 위해서 옥수수 오일(corn oil)로 처리한 정상군, 1/10 LD₅₀(180 mg/kg)과1/2 LD₅₀(900 mg/kg)의 페난트렌으로 72 시간동안 처리한 랫트로부터 간 조직을 분리하여 균질기로 파쇄한 후, 7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4.5% CHAPS, 100 mM DTE가 포함되어 있는 40 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8)에서 한 번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 15℃, 12,000xg에서 50 분 동안 원심분리한 뒤 얻어 진 상등액을 사용하였다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

2. 등전점 전기영동

정상군과 실험군의 랫트 간 조직에서 분리한 총 단백질은 1 mg이 되게 하였고, 450 ul의 재수화(rehydration) 용액 (7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4.5% CHAPS, 0.25% 암폴라이트(ampholytes), 100 mM DTE)을 사용하여 단백질을 녹였다. 450 ul의 재수화 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG 홀더(holder)에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 24 cm 고정화된 드라이 스트립(immobilized dry strip) (pH 3-10 NL, GE Healthcare Bio-Science)를 이용하여 18 시간동안 재수화 시켰다. 200 V/ 200 Vhrs, 500 V/ 500 Vhrs, 1,000 V/ 1,000 Vhrs, 8,000 V/ 13,500 Vhrs, 8,000 V/ 100,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

3. 평형화

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1 차 평형화 완충용액 (6 M 우레아, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아미드, 2 mM TBP)에서 각각 20 분간 1 차 평형화를 실시한 후, 2 차 평형화 완충용액 (6 M 우레아, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아미드, 2 mM TBP)에서 20 분간 2 차 평형화를 실시하였다.

4. SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동

9% - 16% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 0.5% 아가로오스 겔로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 2 시간 동안 겔 당 5 mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 10 시간 동안 겔 당 18 mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

5. 겔 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 쿠마시에 블루(Coomassie Blue) G-250 염색 용액 (34% 메탄올, 0.1% 쿠마시에 G-250, 17% 암모늄 설페이트, 3% 인산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12 시간 이상 염색한 후 1% 아세트산을 이용하여 탈색하였다.

6. 겔 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 ImageMaster 2D Platinum 6.0 (2D software, GE Healthcare Bio-Science)으로 이미 지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3 장의 겔을 분석하였다.

7. NanoLC-MS/MS 분석

NanoLC-MS/MS 분석을 위해 각 스팟을 트립신(trypsin)으로 인-겔 다이제스천(in-gel digestion)한 후, 스팟들의 펩타이드들을 agilent 110 Series nano-LC와 LTQ-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA)에 의해 분석하였다. LC-MS./MS 분석에 사용된 capillary 컬럼 (150 mm x 0.075 mm)은 Proxeon (Odense M, Denmark)에서 구입하였으며, 슬러리는 5 μm, 100 Å pore size Magic C18 stationary phase (Michrom Bioresources, Auburn, CA)으로 로 패킹하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 0.1% 포믹에시드를 함유하는 증류수 [0.1%의 탈이온수 중의 포믹에시드(formic acid in deionized water)]이었고, 이동상 B는 0.1% 포믹에시드를 함유하는 아세톤니트릴 (0.1% formic acid in acetonitrile)이었다. 크로마토그래피 경사는 50 분간 5% B에서 35% D 직선증가와 20 분간 40% B에서 60% B의 직선증가, 5 분간 60% B에서 80% B 직선증가 하는 것으로 셋업하였다. 유속은 분리 (splitting) 분당 300 mL를 유지하였다. 매스 스펙트럼 (Mass spectra)은 MS/MS 스캔 후 전체 매스 스캔으로 얻은 데이터 (data-dependent acquisition with full mass scan: 400-1800 m/z)로 얻었다. 얻어진 각각 MS/MS 스캔은 LTQ에서 1 마이크로스캔 (microscans)의 평균이었다. 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 200℃로 맞추어졌으며, 스프레이는 1.5.0-2.0 kV였다. 정상화된 콜리전 (collision) 에너지는 MS/MS에 대해 35%로 맞추어졌다. Sequest 소프트웨어가 펩타이드 서열을 동정하기 위해 사용되어졌다. 신뢰성 높은 결과를 얻기 위해, delatCn ≥ 0.1과 Rsp ≤ 4의 조건을 적용하였고, Xcorr의 경우, Charge state 1+에서는 Xcorr ≥ 1.5를 적용하였고, charge state 2+에서는 Xcorr ≥ 2.0, charge state 3+에서는 Xcorr ≥ 2.5를 적용하였으며, 펩티드 확률(peptide probability) > 0.1을 적용하여 단백질동정을 확정범위 (cutoff)로 사용하였다. 펩타이드들은 메티오닌 (methionine) 잔기에서 다양하게 산화 (oxidization) 되었으며, 시스테인 (cystein)에서는 다양하게 카르복시아미도메틸레이션 (carboxyamidomethylation)과 카르복시메틸레이션 (carboxymethylation) 되었다.

8. 결과

페난트렌을 처리한 랫트의 간을 분리하여 이차원 단백질 전기영동을 한 결과 정상군에서는 총 1170 개의 스팟이 발현되었고, 1/10 LD₅₀의 페난트렌을 처리했을 때는 총 1147 개, 1/2 LD₅₀의 페난트렌을 처리한 경우 1289 개의 스팟을 확인 할 수 있었다. 그 중 정상군과 페난트렌 처리군의 발현 차이를 보이는 단백질 스팟은 총 11 개였다. 그 11개의 스팟은 하기 표 1에 나타나 있다.

Spot No.	Identified protein	NCBI GI No.	Cov %	pI	M.W	Change
Spot No.	Identified protein	NCBI GI No.	Cov %	pI	M.W	1/10 LD₅₀	1/2 LD₅₀
1	디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor)	55742723	13	6.8	96240	↘	↘
2	알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1)	62664437	39	7.99	58748	↗	↗
3	페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase)	50926235	21	5.8	52320	↗	↘
4	타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17)	47087085	51	4.97	48122	↗	↗
5	아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase)	433611	45	6.83	36742	↗	↗
6	아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase)	433611	44	6.83	36742	↗	↗
7	설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1) (N-hydroxyarylamine sulfotransferase) (HAST-I)	1711569	47	6.1	35860	-	↘
8	체인 A, 래트 간 유래의 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver)	442967	52	8.6	25940	↗	↗
9	헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2) (Hemoglobin beta-2 chain) (Beta-2-globin) Hemoglobin beta chain, minor-form)	122529	46	9.2	16080	↗	↗
10	헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit) (Hemoglobin beta-2 chain) (Beta-2-globin) (Hemoglobin beta chain, minor-form)	109459168	82	8.91	15982	↗	↘
11	디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor)	13937379	51	8.8	10010	↘	↘

도 1은 정상군의 프로테옴 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는 1/10 LD₅₀의 페난트렌을 처리한 프로테옴 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은 1/2 LD₅₀의 페난트렌을 처리한 프로테옴 결과를 나타내는 사진이다.

Claims

디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor: GenBank GI No. 13937379) 단백질을 포함하는 생체의 페난트렌 오염 진단용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor: GenBank GI No. 55742723); 알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1: GenBank GI No. 62664437); 페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase: GenBank GI No. 50926235); 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17: GenBank GI No. 47087085); 아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase: GenBank GI No. 433611); 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1: GenBank GI No. 1711569); 체인 A, 래트 간 유래의 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver: GenBank GI No. 442967); 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2: GenBank GI No. 122529);및 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit: GenBank GI No. 109459168)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 더 포함하는 생체의 페난트렌 오염 진단용 조성물.
디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor: GenBank GI No. 13937379) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 생체의 페난트렌 오염 진단용 키트.
제3항에 있어서,

상기 진단용 키트는 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor: GenBank GI No. 55742723); 알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1: GenBank GI No. 62664437); 페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase: GenBank GI No. 50926235); 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17: GenBank GI No. 47087085); 아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase: GenBank GI No. 433611); 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1: GenBank GI No. 1711569); 체인 A, 래트 간 유래의 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver: GenBank GI No. 442967); 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2: GenBank GI No. 122529);및 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit: GenBank GI No. 109459168)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 생체의 페난트렌 오염 진단용 키트.
a) 디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor: GenBank GI No. 13937379)단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

b) 상기 a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 페난트렌 오염 마커 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 a)단계는 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor: GenBank GI No. 55742723); 알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1: GenBank GI No. 62664437); 페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase: GenBank GI No. 50926235); 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17: GenBank GI No. 47087085); 아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase: GenBank GI No. 433611); 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1: GenBank GI No. 1711569); 체인 A, 래트 간 유래의 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver: GenBank GI No. 442967); 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2: GenBank GI No. 122529);및 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit: GenBank GI No. 109459168)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 것을 더 포함하는 페난트렌 오염 마커 검출 방법.
제6항에 있어서,

상기 페난트렌 오염 마커는,

알데히드 디히드로지네이즈 패밀리 7 멤버 A1 유사체(similar to aldehyde dehydrogenase family 7, member A1: GenBank GI No. 62664437); 타입 I 케라틴 KA17(Type I keratin KA17: GenBank GI No. 47087085); 아플라톡신 B1 알데히드 리덕테이즈(aflatoxin B1 aldehyde reductase: GenBank GI No. 433611); 체인 A, 래트 간 유래의 Mu 클래스 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver: GenBank GI No. 442967);및 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2: GenBank GI No. 122529)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 증가된 경우 페난트렌 오염의 양성 판정을 하는 것을 특징으로 하는 페난트렌 오염 마커 검출 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,

상기 페난트렌 오염 마커는,

디아제팜 결합 저해제(diazepam binding inhibitor: GenBank GI No. 13937379); 디메틸글리신 디히드로지네이즈 전구체(dimethylglycine dehydrogenase precursor: GenBank GI No. 55742723);및 설포트랜스퍼레이즈 1C1(Sulfotransferase 1C1: GenBank GI No. 1711569)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 적은 경우 페난트렌 오염의 양성 판정을 하는 것을 특징으로 하는 페난트렌 오염 마커 검출 방법.
제6항에 있어서,

상기 페난트렌 오염 마커는,

페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase: GenBank GI No. 50926235);및 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사체(similar to Hemoglobin beta-2 subunit: GenBank GI No. 109459168)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b)단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 페난트렌 오염이 양성인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 페난트렌 오염 마커 검출 방법.