KR20210126521A - 소변 샘플을 이용한 신장 질환 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소변 샘플을 이용한 신장 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 소변 샘플로부터 앰피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는, 신장 질환 진단을 위한 소변 검사용 조성물, 키트 및 상기 조성물을 이용한 신장 질환 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 조기 진단이 중요한 신장 질환에 대해 소변 샘플을 이용하여 비침습적 방법으로 간편하게 신장 질환을 진단할 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 만성신부전증으로 진단받은 환자에 본 발명을 적용하면 말기신부전으로의 진행 가능성을 미리 예측할 수 있는 장점이 있다.

Description

소변 샘플을 이용한 신장 질환 진단용 조성물 {Composition for diagnosing kidney disease using urine sample}
본 발명은 소변 샘플을 이용한 신장 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 소변 샘플로부터 앰피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는, 신장 질환 진단을 위한 소변 검사용 조성물, 키트 및 상기 조성물을 이용한 신장 질환 진단방법에 관한 것이다.
최근 식생활을 중심으로 한 생활 습관의 큰 변화 및 고령화 추세에 따라 고혈압이나 당뇨병 등의 생활 습관 질병 발생률이 증가하고, 그에 따라 신장 질환, 나아가 신부전의 위험이 증가하고 있다.
신장은 노폐물의 배설, 체액, 전해질 및 산 염기 평형의 조절 등을 통해 내부 환경의 항상성을 유지하는데 중요한 장기이다. 신장은 수소, 나트륨, 칼륨 및 규소 등의 혈액에 있는 다양한 화합물의 농도를 제어하고 노폐물을 소변으로 배출한다. 신장 기능 저하는 어떠한 것이든, 혈액에서 대사 산물을 충분히 제거하는 신체 능력을 방해할 수 있으며, 신체의 전해질 평형을 파괴할 수 있다. 신장 기능의 저하 또는 부전은 그 증상이 치명적이다.
만성신부전이란, 이러한 신장 기능이 단방향(불가역성)으로 점차 감소하고, 생체의 항상성을 유지하지 못하는 상태이다. 만성신부전은 당뇨병성 신부전, 만성 사구체신염, 악성신장 경화증, 다발성낭포신 등을 원인으로 생기는 것으로 알려져 있다. 모든 신장 질환은 신장의 섬유화를 수반하며 결국 말기신부전에 이른다. 특히 만성적인 신장 기능 저하는 신장 섬유화의 진행과 깊게 관련되고 있기 때문에, 섬유화의 진행 억제는, 만성신부전의 진행 억제로 이어질 수 있다고 생각된다.
일반적으로, 신장 섬유증은 내피 세포 장애에 의한 염증 반응을 수반하여, 결국 과잉 생산된 세포외 매트릭스(Extracellular matrix;ECM)는 섬유화가 발생하여 일어나는 것이다. 예를 들면, 사구체 경화증에서, 원사구체 내피 세포 장애에 의해 발생되며, 케모카인(chemokine) 증식 인자 등의 사이토카인을 분비하며 단구 세포나 마크로파지(macrophage)가 염증반응을 일으킨다. 이어서, 메산지움 (mesangial) 세포의 활성화, 증식, 형질 전환이 일어나고 메산지움 (mesangial) 세포 등의 세포외 매트릭스 생산 세포에서 과다한 양의 세포외 매트릭스가 생산되어 섬유화가 발생하고 사구체 경화증에 이른다.
특히 당뇨병성 신부전은, 만성신부전에 이르는 가장 큰 원인이며, 당뇨병의 심각한 합병증의 하나이다. 당뇨병성 신부전의 특징은 사구체 메산지움 (mesangial)을 증식시키고, 이는 주로 I형 및 IV 형 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 등의 ECM 단백질의 축적 증가와 관련있다 (Verena Klemis et al., Kidney International (2017) 91, 1374-1385).
만성신부전이 악화되어 신장이 완전히 기능을 못할 때까지 진행되면 말기신부전 (ESRD)에 이르게 되는데, 말기신부전에 빠질 경우 회복은 불가능하며, 말기신부전 환자들은 신장 기능을 복원하기 위해 투석(혈액투석 또는 복막 투석)을 하거나 이식을 통해 새로운 신장을 얻어야 한다.
한편, 엠피레귤린은 상피세포성장인자 수용체에 결합하여 상피세포 수용체 경로(EGFR pathway)를 활성화시키며, 세포증식에 관여한다는 사실이 알려져 있고, 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의해 엠피레귤린의 발현을 저해시킬 수 있으며, 이는 특정 타입의 유방암에서 치료효과를 나타낸다고 개시되었다(Cancer Res 2008;68:225-2265) 또한, 엠피레귤린에 대한 shRNA를 이용하여 염증성 유방암에서의 세포 침투를 억제할 수 있으며(J Cell Physiol 2011 226(10):2691-2701), 엠피레귤린 특이적 shRNA를 이용하여 엠피레귤린 발현을 억제하면 담배연기에 노출된 쥐에서의 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling)이 억제된다는 사실이 보고된 바 있다. 기도평활근(airway smooth muscle; ASM) 과증식(hyperplasia)과 혈관신생에 엠피레귤린이 관련이 있으며, 특히 천식환자의 기도 재형성(airway remodeling)을 촉진한다는 것과 급성 천식에 따른 조직 재형성에서 과다 분비되는 표피세포성장인자(EGF)와 엠피레귤린이 관여하는 것이 보고된 바 있다.
엠피레귤린을 이용한 진단방법으로는 융모양막염(chorioamnionitis) 진단방법 (WO 2008-029664), 염증성 질환 진단방법 (US 2006-0286586)이 공지되었으나, 엠피레귤린을 이용하여 신장 질환을 진단한 연구는 아직까지 진행되지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 신장 질환이 중증으로 진행되면 회복이 쉽지 않다는 점에 착안하여 초기 진단의 중요성을 인지하고, 침습적 행위 없이 채취 가능한 소변으로부터 간편하게 신장 질환을 진단할 수 있는 방법을 모색하던 중 소변 중 엠피레귤린 농도를 확인하면 용이하게 신장 질환을 진단하고 말기신부전 진행 여부를 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
국제공개특허 WO 2008-029664 미국공개특허 US 2006-0286586
Kidney International (2017) 91, 1374-1385 Cancer Res 2008;68:225-2265 J Cell Physiol 2011 226(10):2691-2701
본 발명의 목적은 소변 샘플로부터 신장 질환을 조기에 간편하게 진단할 수 있는 신장질환 진단용 조성물, 키트, 진단을 위한 정보제공 방법 및 말기신부전 진행 가능성을 예측하기 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엠피레귤린 또는 그 mRNA를 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는, 신장 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 신장 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 신장 질환 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다;
(a) 개체로부터 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린을 검출하는 단계; 및
(c) 소변 샘플에서 검출된 엠피레귤린이 5 pg/mgCr 이상일 경우, 상기 개체는 신장 질환이 있는 것으로 판단하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 말기신부전 진행 가능성을 예측하기 위한 정보 제공방법을 제공한다:
(a) 신장 질환을 앓고 있는 환자의 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린 양을 측정하는 단계: 및
(c) 측정된 엠피레귤린 양이 30 pg/mgCr 이상인 경우 상기 환자는 말기신부전으로 진행 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계.
본 발명에 따르면, 조기 진단이 중요한 신장 질환에 대해 소변 샘플을 이용하여 비침습적 방법으로 간편하게 신장 질환을 진단할 수 있는 장점이 있다. 또한, 만성신부전증으로 진단받은 환자에 본 발명을 적용하면 말기신부전의 진행가능성을 미리 예측할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 신장과 폐조직에서 엠피레귤린의 mRNA 발현율을 나타낸 결과이다.
도 2는 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 신장과 폐조직에서 콜라겐 1의 mRNA 발현율을 나타낸 결과이다.
도 3은 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 신장과 폐조직에서 피브로넥틴의 mRNA 발현율을 나타낸 결과이다.
도 4는 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 소변에서 ELISA를 통해 엠피레귤린/크레아티닌 비율을 나타낸 결과이다.
도 5는 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 소변에서 ELISA를 통해 알부민/크레아티닌 비율을 측정한 결과이다.
도 6a는 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 폐 조직을 H&E 염색 또는 MT 염색한 결과이다.
도 6b는 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 신장 조직을 H&E 염색 또는 MT 염색한 결과이다.
도 7은 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 혈청 샘플에서의 혈중요소질소를 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 동물(Normal)과 폐 섬유화의 동물 모델(BLM)의 혈청 샘플에서의 크레아티닌 수치를 나타낸 그래프이다.
도 9는 신장조직검사를 시행한 환자 중 소 사구체 이상 (minor glomerular change)이 심한 신장 병리소견을 갖는 IgA 신증 (immunoglobulin A nephropathy), 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy)으로 진단된 환자의 혈청 (A) 및 소변 (B) 엠피레귤린 농도를 비교한 그래프이다.
도 10은 도 9의 환자군을 대상으로 신장 섬유화와 관련된 조직검사 소견 (A: 간질섬유증(Interstitial fibrosis), B: 내막 점도(intimal thickening), C: 관형 위축(Tubular atrophy), C: 혈관 사이 확대(mesangial expansion))의 중증도에 따른 소변 엠피레귤린 농도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 11A는 정상 대조군과 제2형 당뇨 환자군을 대상으로 혈장에서 엠피레귤린 농도를 분석한 것이고, 도 11B는 추가적으로 제2형 당뇨 환자군을 알부민뇨 정도에 따라 세 그룹으로 구분하여 혈장에서 엠피레귤린 농도를 분석한 것이다. 도 11C는 정상 대조군과 제2형 당뇨 환자군을 대상으로 소변에서 엠피레귤린 농도를 분석한 것이고, 도 11D는 추가적으로 제2형 당뇨 환자군을 알부민뇨 정도에 따라 세 그룹으로 구분하여 소변에서 엠피레귤린 농도를 분석한 것이다.
도 12는 신장조직검사를 시행한 환자군의 만성신질환 단계에 따른 소변의 엠피레귤린 양을 확인한 결과이다.
도 13은 신장조직검사를 시행한 환자군에서 엠피레귤린 농도에 따른 말기신부전 진행을 비교한 카플란-마이어 생존곡선 그래프이다. 소변 엠피레귤린 농도를 삼분위수를 통해 세 개의 군으로 나누고, 가장 낮은 농도부터 T1, T2, T3로 명명하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 각종 질환으로 인해 신장 손상이 의심되는 환자에서 신장조직검사를 시행하고, 이 환자군의 소변 내 엠피레귤린은 신장 내부의 섬유화 정도를 반영하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 엠피레귤린 또는 그 mRNA를 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는, 신장 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 소변 샘플로부터 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제는 엠피레귤린 특이적 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 소변 샘플에서 엠피레귤린 mRNA 또는 단백질 유무를 검출하거나 그 양을 측정할 수 있는 제제라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 엠피레귤린 특이적 항체가 적용된 ELISA 방법을 이용하였으나, 엠피레귤린 mRNA 양을 측정하기 위한 프라미어 및/또는 PNA 프로브 등을 이용한 PCR 법을 이용할 수도 있을 것이다.
본 발명에서, "엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제"란 신장 기능 이상에 의해 발현이 변화하는 바이오마커(즉, 엠피레귤린의 mRNA 또는 단백질)의 발현수준을 측정함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 해당 바이오마커의 발현수준은 마커 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 신장기능 진단용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "단백질의 발현수준 측정"이란 신장질환을 진단하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장기능 이상 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 해당 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 복합체의 검출에 의하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발명에서, “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 신장질환의 발병여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에서, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커, 또는 진단 마커"란 신장기능 이상이 발생한 또는 발생 가능성이 있는 시료를 건강한 개체로부터의 시료와 구분할 수 있는 물질로, 신장 기능 이상이 있는 개체로부터의 시료는 진단용 마커(즉, 엠피레귤린)가 건강한 개체로부터의 시료와 비교할 때 증가를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 단백질을 포함한다.
본 발명에서 제공하는 신장질환 진단용 바이오마커의 단백질 또는 유전자 정보는 공지된 유전자데이터베이스를 통하여 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오마커 단백질 엠피레귤린의 아미노산 서열은 공지된 유전자 데이터베이스인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있고 하기와 같다.
서열번호 1
MRAPLLPPAPVVLSLLILGSGHYAAGLDLNDTYSGKREPFSGDHSADGFEVTSRSEMSSGSEISPVSEMPSSSEPSSGADYDYSEEYDNEPQIPGYIVDDSVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKSMKTHSMIDSSLSKIALAAIAAFMSAVILTAVAVITVQLRRQYVRKYEGEAEERKKLRQENGNVHAIA
본 발명에 있어서, 상기 엠피레귤린은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 신장질환은 신장 섬유화, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신증, 급성 신우신염, 급성 신부전, 말기 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는, 신장 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 신장 질환 진단용 마커 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 신장질환 진단용 키트에는 신장기능 진단용 마커의 발현수준을 측정하기 위해 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 신장질환 진단용 단백질 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트 또는 면역진단키트인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 신장 질환 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다:
(a) 개체로부터 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린을 검출하는 단계: 및
(c) 소변 샘플에서 검출된 엠피레귤린이 5 pg/mgCr 이상일 경우, 상기 개체는 신장 질환이 있는 것으로 판단하는 단계.
본 발명에 있어서, 소변 샘플에서 검출된 엠피레귤린이 5 pg/mgCr 이상인 경우, 바람직하게는 6 pg/mgCr 이상인 경우, 더욱 바람직하게는 6.3 pg/mgCr 이상인 경우, 가장 바람직하게는 6.5 pg/mgCr 이상인 경우, 상기 개체는 신장 질환이 있는 것으로 판단될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엠피레귤린의 검출은 엠피레귤린 특이적 항체 또는 압타머를 이용한 엠피레귤린 특이적 결합 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 신장 질환을 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 소변 샘플로부터 엠피레귤린을 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로는, 유전자의 발현을 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체" 란 자연계에 존재하는 생명체들 중에서 신체 장기 중 신장을 갖고 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유류를 의미하고, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다. 상기 포유류의 예로는 쥐(랫트, 마우스 등), 토끼, 말, 소, 양, 개, 고양이, 원숭이 및 인간 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 개체의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 엠피레귤린을 검출하는 시료는 엠피레귤린의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상인과 신장 질환이 있는 개체에서 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변과 같은 시료 등을 포함하나, 이중 소변 샘플이 바람직하다.
본 발명에서, 마커 단백질을 검출하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 신장질환 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 신장질환 진단용 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 신장질환 의심 개체의 실제 신장질환 발생 여부를 예측 또는 확인할 수 있다. 상기 항원-항체 복합체란 신장질환 진단용 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 신장질환 진단용 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장 질환 발생 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 신장질환 진단용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하는 것이다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 신장기능 이상이 발생한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 신장질환 진단용 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 예를 들어, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현수준을 신장질환 의심 개체에서의 유전자 발현수준과 비교함으로써 신장질환 의심 환자의 실제 신장기능 이상 여부를 확인 또는 예측할 수 있다. 즉, 신장 질환이 예상되는 개체의 소변 샘플로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하고, 건강한 개체의 소변 샘플로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현수준이 건강한 개체의 것보다 유의적으로 증가된 것이 확인될 때, 해당 개체는 신장 질환이 있는 것으로 예측할 수 있다.
한편, 본 발명자들의 실험 결과에 따르면 소변 내 엠피레귤린은 기저 신기능을 잘 반영하고 있어, 측정 당시 신장 손상의 정도를 예측할 수 있고, 추적관찰 자료를 이용한 분석에서, 측정 당시뿐 아니라 미래의 신장 손상의 진행을 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다. 소변 내 엠피레귤린 양의 측정은 신장질환 환자에서 말기신부전을 예측하는 생체표지자로서 적용이 가능하다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 다음 단계를 포함하는 말기신부전 진행 가능성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 신장 질환을 앓고 있는 환자의 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린 양을 측정하는 단계: 및
(c) 측정된 엠피레귤린 양이 30 pg/mgCr 이상인 경우 상기 환자는 말기신부전으로 진행 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 측정된 엠피레귤린 양은 30 pg/mgCr 이상인 경우, 바람직하게는 35 pg/mgCr 이상인 경우, 더욱 바람직하게는 39 pg/mgCr 이상인 경우, 가장 바람직하게는 39.9 pg/mgCr 이상인 경우, 상기 환자는 말기신부전으로 진행 가능성이 있는 것으로 판단될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신장 질환을 앓고 있는 환자는 만성신부전 환자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에 있어서, 상기 말기신부전으로 진행 가능성은 소변 엠피레귤린을 측정한 후 2년 이내에 말기신부전으로 진행될 확률이 50%, 바람직하게는 60% 이상인 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 엠피레귤린 또는 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는 조성물의 신장 질환 진단 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서 본 발명은 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는 신장 질환 진단용 시약를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 신장 질환의 진단 방법에 관한 것이다:
(a) 개체로부터 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린을 검출하는 단계: 및
(c) 소변 샘플에서 검출된 엠피레귤린이 5 pg/mgCr 이상일 경우, 상기 개체는 신장 질환이 있는 것으로 판단하는 단계.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 말기신부전 진행 가능성 예측 방법에 관한 것이다:
(a) 신장 질환을 앓고 있는 환자의 소변 샘플을 채취하는 단계;
(b) 소변 샘플의 엠피레귤린 양을 측정하는 단계: 및
(c) 측정된 엠피레귤린 양이 30 pg/mgCr 이상인 경우 상기 환자는 말기신부전으로 진행 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신장 기능이 정상인 폐 섬유화 동물모델 소변 샘플에서의 엠피레귤린의 발현 검증
폐 섬유화 동물모델의 소변 샘플을 이용하여 신장 기능의 이상 여부를 판단하기 위하여 소변 샘플에서 엠피레귤린을 검출하는 실험을 진행하였다.
1.1 동물실험 방법
폐 섬유화 동물 모델을 제작하기 위해, C57BL/6(Mouse) 블레오마이신(Bleomycin, BLM) (B5507, Sigma, USA) 15 Unit stock을 5ml PBS로 녹여 3 Unit/ml로 만든 후 마우스 체중을 기준으로 1.5 Unit/kg이 되도록 50ul를 C57BL/6(Mouse)에 기관내 주입(Intra-Tracheal Instillation) 경로로 투여하였다. 블레오마이신 유도하여 폐 섬유화 동물 모델을 제작한 후 14일 경과 후에 다음의 매개변수를 측정하였다: 체중(Weight)과 소변(Urinary) 내 알부민/크레아티닌 비율(albumin/creatinine ratio), 혈청 크레아티닌(Serum creatinine). 추가적으로, 폐 조직 및 신장 조직에 대해 조직학적 분석(Histological analysis)을 진행하였다. 또한, 폐 조직과 신장 조직에서 섬유화가 일어났는지 확인하기 위하여 피브로넥틴(Fibronectin), 콜라겐 1(Collagen1)을 분석하였다. 그리고 엠피레귤린이 각 조직에서 어느 정도 발현되고 있는지 유전자 발현 분석을 실시하였다.
1.2 RNA 분리 및 섬유화 질환 유전자 및 엠피레귤린 유전자 발현 분석
희생시킨 쥐의 폐와 신장 조직을 얻어 Homogenizer을 이용하여 조직을 분쇄하였다. RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 분광 광도계로 1ug을 정량하였다. RNA 역전사 효소(AccuPower® RocketScript™Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 제조자 지시에 따라 cDNA를 제조하였다. 제조된 cDNA를 주형으로 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 각 군의 전체 mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 각 유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower®GreenStar™ (한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, 각 유전자 특이적 qPCR 프라이머; 10 pmole/㎕ 각각(BIONEER, 한국)을 3 ㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 피브로넥틴, 콜라겐1 및 엠피레귤린 유전자를 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A를 표준 유전자로 사용하였다. 각 조직의 유전자 발현을 확인하기 위한 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 서열
Forward Primer Reverse Primer
RPL13A 5'-CGATAGTGCATCTTGGCCTTT-3'(서열번호 2) 5'-CCTGCTGCTCTCAAGGTTGTT-3'(서열번호 3)
amphiregulin 5'-GAGGCTTCGACAAGAAAACG-3'(서열번호 4) 5'-ACCAATGTCATTTCCGGTGT-3'(서열번호 5)
fibronectin 5'-TGGTGGCCACTAAATACGAA-3'(서열번호 6) 5'-GGAGGGCTAACATTCTCCAG-3'(서열번호 7)
Collagen Ⅰ 5'-TCATCGTGGCTTCTCTGGTC-3'(서열번호 8) 5'-GACCGTTGAGTCCGTCTTTG-3'(서열번호 9)
그 결과, 도 1에서와 같이 신장조직에서는 블레오마이신을 유도한 마우스와 건강한 마우스의 유전자 발현 차이가 존재하지 않는 반면, 폐 조직에서는 블레오마이신을 유도한 마우스에서 AREG의 차이가 통계적으로 유의하게 증가하였다. 한편, 도 2와 도 3에서와 같이 각 조직에서 섬유화가 진행되었는지 확인하기 위하여 섬유화 질환 마커(Marker)인 콜라겐1과 피브로넥틴을 확인한 결과, 콜라겐1과 피브로넥틴은 신장조직에서는 건강한 마우스와 블레오마이신 유도 마우스에서 발현 차이가 없었으나 폐조직에서는 블레오마이신으로 폐 섬유화를 유도한 마우스에서 건강한 마우스에 비해 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 블레오마이신으로 유도한 폐 섬유화 마우스에서는 유전자 발현분석으로 폐 조직에서만 섬유화가 일어났고, 신장 조직에서는 섬유화가 유도되지 않았음을 확인하였다.
1.3. 소변 샘플의 엠피레귤린 및 알부민/크레아티닌 비율 검출
1-3-1. 마우스 엠피레귤린 ELISA 방법
Mouse 소변에 엠피레귤린을 검출하기 위하여 Mouse Amphiregulin Duoset ELISA(DY989, R&D systems, USA)를 사용하였다. Mouse capture 엠피레귤린 항체(DY989, R&D systems, USA)를 800ng/ml 농도로 각 웰에 100ul씩 넣어 코팅하였다. 그 후 1% BSA를 각 웰에 100ul씩 넣어준 후 1시간 동안 상온에서 반응시켜 샘플-항체의 반응 외에 비 특이적인 반응을 제거하였다. Tween 20이 0.05% 들어간 PBST를 Washing buffer로 사용하여 각 웰을 3번씩 세척하였다. 그 다음으로 코팅이 되어있는 96웰-플레이트에 마우스의 소변을 100ul씩 각 웰에 넣어 2시간 상온에서 반응하였다. 반응 후 소변 샘플들을 각 웰에서 제거한 후 Tween 20이 0.05% 들어간 PBST를 Washing buffer로 사용하여 각 웰을 3번씩 세척하였다. 그리고 각 웰에 Detection 항체(DY989, R&D systems, USA)를 농도 25.0ng/ml 상태로 100ul씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켜 주었다. 반응 후 Detection 항체 용액을 제거하고 PBST로 3번씩 세척하였다. Streptavidin-HRP(DY989, R&D systems, USA) 인 2차 항체를 1:200의 비율로 희석하여 각 웰에 100ul씩 넣고 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 PBST를 이용하여 각 웰 당 5분씩 3회 세척하였다. 그리고 1-step Ultra TMB(34028, Thermo, USA)을 각 웰에 100ul 넣어주고 상온에서 반응시켰다. 그 후 황산(H2SO4)을 각 웰에 100ul씩 넣어주어 반응을 정지시킨 후 분광 광도계를 이용하여 450nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도 값을 이용하여 표준 곡선에 대한 식을 만들어 각 샘플의 정량적인 값을 계산하였다. 그 결과, 크레아티닌 값으로 보정한 엠피레귤린/크레아티닌 비율은 건강한 마우스와 폐 섬유화 유도된 마우스에서 큰 차이가 없는 것으로 나타나, 신장 기능이 정상인 폐 섬유화 모델에서는 소변 내 엠피레귤린/크레아티닌 수치가 건강한 마우스와 비교할 때 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다 (도 4).
1-3-2. 소변 내 마우스 알부민/크레아티닌 비율 검출
Albumin ELISA kit (Excocell, Phila, PA19103, Cat:1011)을 이용하여 실험을 진행하였다. 알부민을 측정하기 위하여 NHE buffer(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1011)을 이용하여 소변샘플을 1:13 비율로 희석하여 각 웰에 50ul 넣어주었다. 그리고 각 웰에 Primary Ab(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1011) 50ul씩 넣어주어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 증류수를 이용하여 10회 세척하고, 2 Color Developer(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1011)를 각 웰에 100ul 씩 넣어주어 상온에서 20분 동안 반응하였다. 2 Color Stopper(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1011)을 100ul씩 넣어 반응을 정지시키고 분광 광도계를 이용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 측정한 흡광도 값을 이용하여 표준 곡선에 대한 계산식을 만들어 각 샘플의 정량적인 값을 계산하였다.
소변 내 크레아티닌을 측정하는 이유는 소변의 농축 정도에 따라 urine amphiregulin의 양이 측정시마다 바뀔 수 있기 때문에 이를 보정해주기 위해서이다. 그래서 다음과 같이 크레아티닌을 측정하기 위하여 Creatinine ELISA kit(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1012)을 이용하였다. 증류수를 이용하여 소변샘플을 1:10 비율로 희석하여 각 웰에 넣어주었다. 그리고 Picrate solution(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1012) 을 만들어 각 웰에 100ul씩 넣어주고 상온에서 반응시킨 후 분광 광도계를 이용하여 500nm에서 1차로 흡광도를 측정한 후, Acid Reagent(Excocell, Phila, PA19103, Cat:1012) 100ul씩 웰에 넣어주고 5분 후 2차로 흡광도를 측정하였다. 최종 결과 값은 1차 흡광도 값에서 2차 흡광도를 뺀 값을 사용하였다. 크레아티닌 스탠다드 농도인 10mg/dL, 3mg/dL, 1mg/dL 측정한 흡광도 값을 이용하여 표준 곡선에 대한 계산식을 만들어 각 샘플의 정량적인 값을 계산하였다.
또한, 알부민/크레아티닌 비율도 폐 섬유화 유도된 마우스와 건강한 마우스에서 큰 차이가 나타나지 않아 (도 5), 폐 섬유화 유도된 마우스에서 신장기능이 정상적으로 유지됨을 알 수 있었다.
1.4. 조직병리학적 분석
상기 제조된 동물 모델에서 폐 조직과 신장 조직에 대하여 조직 병리학적인 검증을 위하여 면역조직화학염색을 실시하였다. 동물 모델을 각 군별로 희생시켜 조직고정, 수세, 탈수, 투명, 침투, 포매 및 박절 과정을 통하여 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 절편을 박절기로 얇게 잘라 조직을 슬라이드에 접착하였다. 접착시킨 조직을 탈파라핀, 함수, 수세, 염색, 탈수, 투명, 봉입을 거쳐 해마톡실린 및 에오신 염색을 실시하였고, Masson's trichrome 염색을 실시하였다. 다음에 조직염색은 케이피엔티 분석기관에 의뢰하여 실시하였다.
그 결과, 폐 섬유화 유도된 마우스에서는 건강한 마우스보다 폐 조직의 섬유화 세포가 많이 분화되어 있는 것을 알 수 있었고, MT 염색을 통한 콜라겐 1의 발현량 분석 결과, 건강한 마우스보다 폐 섬유화 유도된 마우스에서 콜라겐이 많이 침착되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 6A). 그러나 신장 조직에서는 건강한 마우스와 폐 섬유화 유도된 마우스 사이의 큰 차이가 확인되지 않고 유사한 조직 상태가 유지되었으며, 폐 섬유화 유도된 마우스에서 콜라겐 1의 침착도 확인되지 않았다 (도 6B).
1-5. 혈중 요소질소 및 크레아티닌 수치 측정
신장기능이 악화되면 신장을 통해 배설되는 물질들이 체내에 축적되는데, BUN, 크레아티닌이 가장 대표적인 물질들이고 이 물질들의 농도가 신장기능을 잘 반영한다고 알려져 있다. 이에 신장기능을 확인하기 위하여 혈청 샘플에서의 혈중요소질소(BUN)와 크레아티닌(Creatinine) 수치를 측정하였다.
도 7에서 볼 수 있듯이, 블레오마이신으로 유도한 마우스와 건강한 마우스의 혈중요소질소를 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 도 8에서 볼 수 있듯이, 크레아티닌 수치를 비교하였을 때, 건강한 마우스와 블레오마이신으로 유도한 마우스에서도 차이가 존재하지 않았다. 따라서 블레오마이신으로 유도된 폐 섬유화 동물모델의 신장기능은 정상적으로 유지하고 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 신장조직검사를 시행한 환자군을 대상으로 혈청과 소변에서 엠피레귤린 발현 검증
신장 조직검사를 시행하였던 환자군의 혈청과 소변에서 ELISA 방법을 통해 엠피레귤린의 농도를 측정하였다. 정상 신장과 유사한 병리소견을 갖는 소 사구체 이상 (Minor glomerular change) 환자와 더 진행된 병리소견을 갖고 있는 IgA 신증 (immunoglobulin A nephropathy), 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy) 환자를 비교하여 혈청과 소변 엠피레귤린 발현을 분석하였다. 또한, 위 환자들을 대상으로 신장 조직검사 결과를 검토하여 신장 섬유화와 관련된 조직 소견 정도에 따라 네 그룹을 나누었고, 이 그룹에 따라 소변의 엠피레귤린 발현 정도를 비교하였다.
2-1. 환자 혈청과 소변 샘플에서 ELISA를 통한 엠피레귤린 분석
인간 혈청 또는 소변에서 엠피레귤린을 검출하기 위하여 Human Amphiregulin Duoset ELISA(DY262, R&D systems, USA)를 사용하였다. 구체적으로, 엠피레귤린 항체를 2.00 ug/ml 농도로 96웰-플레이트 각 웰에 100ul씩 넣어 코팅하였다. 그 후 1% BSA를 각 웰에 100ul씩 넣어준 후 1시간 동안 상온에서 반응시켜 샘플-항체의 반응 외에 비 특이적인 발현을 억제하였다. Tween20이 0.05% 들어간 PBST를 세척 버퍼로 사용하여 각 웰을 3번씩 세척하였다. 환자 혈청 또는 소변 원액 샘플 100ul씩 각 웰에 넣어 2시간 상온에서 반응시킨 후 혈청 또는 소변 샘플을 각 웰에서 제거하고 Tween20이 0.05% 들어간 PBST를 세척 버퍼로 사용하여 각 웰을 3번씩 세척하였다. PBST를 이용하여 각 웰을 3번씩 세척하고, Detection 항체(DY262, R&D systems, USA)를 100 ng/ml 농도로 각 웰에 100ul씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 Detection 항체의 용액을 제거하고 PBST로 3번씩 세척하고 Streptavidin-HRP(DY262, R&D systems, USA) 2차 항체를 1:200의 비율로 희석하여 각 웰에 100ul씩 넣어주어 상온에서 20min 동안 반응시켜 주었다. 반응 후 PBST를 이용하여 각 웰 당 5분씩 3회 세척하고 1-step Ultra TMB(34028, Thermo, USA)를 각 웰에 100ul 넣어주고 상온에서 반응시켰다. 그 후 황산(H2SO4)을 각 웰에 100ul씩 넣어 반응을 정지시켰다. 분광 광도계를 이용하여 450nm 파장에서의 각 웰의 흡광도를 측정하고, 측정한 흡광도 값을 이용하여 표준 곡선에 대한 식을 만들어 각 샘플의 정량적인 값을 계산하였다.
그 결과, 소 사구체 이상 (minor glomerular change) 환자, IgA 신증 (immunoglobulin A nephropathy) 환자 그리고 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy) 환자의 혈청 엠피레귤린의 발현은 큰 차이가 나타나지 않은 반면, 소변 엠피레귤린의 경우, 좀 더 심한 신장 병리소견을 갖고 있는 IgA 신증 (immunoglobulin A nephropathy)과 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy) 환자군에서 minor glomerular change 환자에 비해 그 발현이 증가한 것을 알 수 있었다 (도 9).
한편, 상기 환자군을 대상으로 신장 섬유화와 관련된 조직검사 소견들을 중증도에 따라 비교하여 섬유화 소견 없음(absent), 경증(mild), 중증(moderate), 심각(severe) 그룹으로 나누고 환자의 소변 샘플에서 엠피레귤린의 농도를 확인하였다. 간질섬유증(Interstitial fibrosis)과 내막 점도(intimal thickening)의 경우 섬유화 소견 없음(absent)에 비하여 중증(moderate) 단계의 환자에서 소변 엠피레귤린의 발현이 유의하게 증가하였다. 관형 위축(Tubular atrophy)과 혈관 사이 확대(mesangial expansion)의 경우 섬유화 소견 없음(absent)에 비하여 중증(moderate), 심각(severe) 단계의 환자에서 소변 엠피레귤린의 발현이 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 따라서 신장조직에서 신장 섬유화가 더 심하게 진행될수록 소변 엠피레귤린의 발현이 더 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 10).
상기 조직검사를 기초로, 신장 섬유화를 반영하는 대표적인 척도인 interstitial fibrosis 결과를 기초로 환자를 신장 섬유화가 전혀 없는 환자 (interstitial fibrosis 가 관찰되지 않음)와 신장 섬유화가 확인되는 환자 (interstitial fibrosis 가 관찰됨)의 두 그룹으로 나누고, 소변 엠피레귤린 농도를 통해 ROC (Receiver operating characteristic) curve analysis를 시행하였다. 그 결과, 엠피레귤린의 최적 컷-오프 값은 민감도와 특이도의 합을 최대화 시키는 값으로 6.55 pg/mg가 도출되었다.
따라서, 개체의 소변 샘플에서 발현되는 엠피레귤린이 6.55 pg/mgCr 이상인 경우, 신장 질환 중에서도 특히 신장 섬유화가 진행되어 있는 것으로 확인되었다 (민감도, 0.84; 특이도, 0.78).
실시예 3. 당뇨 환자군을 대상으로 혈장과 소변에서 엠피레귤린 발현 검증
정상대조군과 제2형 당뇨 환자에서 분리된 혈장과 소변 샘플의 엠피레귤린 발현 양상을 확인하였다. 제2형 당뇨 환자의 경우 알부민뇨의 양에 따라 당뇨병성 신증의 중증도를 알 수 있기 때문에, 위 환자들을 알부민뇨 정도에 따라 정상단백뇨 (normoalbuminuria), 미세알부민뇨 (microalbuminuria), 단백뇨 (macroalbuminuria) 그룹으로 나누고 그룹별로 혈장과 소변의 엠피레귤린 발현 정도를 비교하였다. ELISA 분석은 실시예 2-1에 기술된 방법과 동일 제품(DY262, R&D systems, USA)으로 진행하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 혈장 엠피레귤린의 경우 정상대조군과 제2형 당뇨 환자 사이에 농도 차이가 뚜렷하지 않았고, 알부민뇨 그룹에 따라서도 유의한 농도 차이를 보이지 않았다. 이에 반해, 소변 엠피레귤린 농도는 정상대조군과 비교하여 제2형 당뇨 환자에서 확연히 증가하였고, 제2형 당뇨 환자에서도 알부민뇨가 심해짐에 따라, 즉 당뇨병성 신증의 중증도가 증가함에 따라 소변 엠피레귤린의 농도도 같이 증가하는 양상을 확인하였다.
실험군에 대한 Amphiregulin-to-creatinine ratio 값 값은 다음과 같이 분석되었다.
Diabetic Kidney Disease Study 코호트에서 natural log of urine amphiregulin-to-creatinine ratio
진단명 Log AREG-to-creatinine ratio (pg/mgCr)
정상 대조군 2.08 ± 0.55
제2형 당뇨병 2.98 ± 0.76
신장조직검사 코호트에서 natural log of urine amphiregulin-to-creatinine ratio
진단명 Log AREG-to-creatinine ratio (pg/mgCr)
Minor glomerular change 1.90 ± 1.03
Ig A nephropathy 2.67 ± 1.38
Diabetic nephropathy 3.82 ± 1.08
실시예 4. 신장조직검사를 시행한 환자군을 대상으로 소변 내 엠피레귤린 농도를 통한 말기신부전 진행 예측 검증
신장조직검사를 시행한 환자 중 소 사구체 이상 (minor glomerular change), IgA 신증 (immunoglobulin A nephropathy), 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy)으로 진단되었던 72명의 환자를 대상으로 조직검사 당시 소변 샘플을 이용하여 소변 내 앰피레귤린을 ELISA 방법을 통해 정량화하였다. 이후 환자들의 예후를 관찰하며 만성신부전 단계에 따라 분류하였다. 만성신부전의 분류는 만성신부전 진단 및 치료에 있어 대표적인 가이드라인 중 하나인 KDIGO guideline을 참고하였다 (Kidney Int Suppl 2012; 2013:1-150).
만성신부전 단계에 따른 조직검사 당시 분석한 소변 내 엠피레귤린 농도를 도식화하고, 이 환자군을 소변 엠피레귤린 농도의 삼분위수에 따라 세 개의 군(T1: 0.598 - 9.472 pg/mgCr, T2: 9.473 - 39.904 pg/mgCr, T3: 39.905 - 597.252　pg/mgCr)으로 나누었다. 세 군에서 향후 말기신부전 진행 확률에 차이가 있는지 확인하기 위해 카플란-마이어 생존분석을 시행하였다. ELISA 분석 방법은 실시예 2-1에 기술된 방법과 동일하게 진행하였다.
그 결과는 도 12와 같이 나타났으며, 신장조직검사를 시행한 환자 군의 만성 신질환은 1 내지 4 단계에 분포하여 있었고, 비교적 신기능이 양호한 1~2단계 환자에 비해 신기능이 저하되어 있는 3~4 단계 환자들에서 소변 내 엠피레귤린의 농도가 높게 측정되었다. 또한, 도 13에 나타난 바와 같이 카플란-마이어 생존곡선을 보면, 조직검사 당시 소변 엠피레귤린 농도의 삼분위수에서 높은 소변 엠피레귤린 농도를 보인 T3 그룹에서 말기신부전 발생률이 유의하게 높게 나타났다 (1000 person-years당 ESRD 발생률: T1, 0.0 [95% CI, 0.0-117.3]; T2, 71.4 [95% CI, 14.2-229.0]; T3, 600.0 [95% CI, 296.3-1095.1]).
한편, 실험의 정확도를 향상시키고자 나이, 성별, 소변 baseline 24hr 단백질(크레아틴), baseline GFR 보정을 진행해 본 결과, 삼분위 그룹 중 T1/T2를 통합한 그룹과 T3 그룹간에 말기신부전 진행율이 T3 그룹에서 유의하게 높게 나타났다 (T3 그룹과 T1/T2 그룹 사이의 hazard ratio: 11.7 [95% CI 1.6-86.5]). 또한, 소변 엠피레귤린 (Log urine amphiregulin-to-creatinine ratio)을 연속변수로 설정하여 분석하였을 때, 위 변수들 보정 후에도 유의하게 만성신부전 발생과 연관성이 있음을 알 수 있었다 (log urine amphiregulin-to-creatinine ratio가 1 증가할 때마다의 hazard ratio: 5.1 [95% CI 1.814.8]). 본 실험에 참가한 환자군을 대상으로 보았을 때 소변 앰피레귤린 양이 39.905 pg/mgCr 이상인 경우, 2년 후에 말기신부전으로 발전될 확률이 62.2%로 나타났다 (도 13 참조).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 엠피레귤린 또는 그 mRNA를 특이적으로 검출하는 제제를 포함하는, 신장 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 소변 샘플로부터 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엠피레귤린은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엠피레귤린을 특이적으로 검출하는 제제는 엠피레귤린 특이적 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신장질환은 신장 섬유화, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신증, 급성 신우신염, 급성 신부전, 말기 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신장 질환 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트 또는 면역진단 키트인 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 신장질환은 신장 섬유화, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신증, 급성 신우신염, 급성 신부전, 말기 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단용 키트.
  9. 다음 단계를 포함하는 신장 질환 진단을 위한 정보 제공방법:
    (a) 개체로부터 소변 샘플을 채취하는 단계;
    (b) 소변 샘플의 엠피레귤린을 검출하는 단계: 및
    (c) 소변 샘플에서 검출된 엠피레귤린이 5 pg/mgCr 이상일 경우, 상기 개체는 신장 질환이 있는 것으로 판단하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 엠피레귤린의 검출은 엠피레귤린 특이적 항체 또는 압타머를 이용한 엠피레귤린 특이적 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 신장질환은 신장 섬유화, 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신증, 급성 신우신염, 급성 신부전, 말기 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신장 질환 진단 방법.
  12. 다음 단계를 포함하는 말기신부전 진행 가능성을 예측하기 위한 정보 제공방법:
    (a) 신장 질환을 앓고 있는 환자의 소변 샘플을 채취하는 단계;
    (b) 소변 샘플의 엠피레귤린 양을 측정하는 단계: 및
    (c) 측정된 엠피레귤린 양이 30 pg/mgCr 이상인 경우 상기 환자는 말기신부전으로 진행 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계.
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