WO2020071641A1 - Tsp1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Tsp1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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Definitions

  • FB-iPSC induced pluripotent stem cells
  • FIG. 12 is a diagram confirming the expression distribution of KDR protein in vascular endothelial cells differentiated from FB-iPSC derived from Fabry disease patients (Fab # 1).
  • FIG. 15 is a diagram showing the change in expression level of TSP1 protein and angiogenesis-related protein by activin A treatment in vascular endothelial cells differentiated from normal iPSC (ACTA: activin A).
  • Figure 21a is a diagram confirming the change in cell morphology by SB431542 compound treatment in vascular endothelial cells differentiated from normal iPSC (FZ: Fabrazyme, SB: SB431542).
  • FIG. 36 is a diagram showing the expression levels of TSP1, KDR, and eNOS proteins and phosphorylation levels of SMAD proteins in vascular endothelial cells differentiated from FB-iPSC derived from Fabry disease patients (Fab # 1) knocked out with TSP1 gene (agal : Fabrazyme).
  • FIG. 37 is a diagram showing the tube formation of vascular endothelial cells differentiated from FB-iPSC from Fabry disease patients (Fab # 1) knocked out with TSP1 gene (agal: Fabrazyme).
  • the aptamer refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure in itself and having a characteristic of being capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity, molecular organic substance, peptide It can be considered as a kind of chemical antibody that replaces a single antibody because it can bind to membrane proteins and block its function.
  • the aptamer can be obtained by isolating an oligomer that has high affinity and selectivity for specific chemical or biological molecules using an oligonucleotide library called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment). .
  • the pharmaceutical composition may include 10 to 95% by weight of the inhibitor of the expression of the TSP1 gene or the inhibitor of the activity of the TSP1 protein according to the present invention, which is an active ingredient relative to the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the active ingredients.
  • an isotype control cell line of FB-iPCS was prepared (FIGS. 25 to 27), and differentiated vascular endothelial cells were prepared therefrom to restore GLA activity (FIG. 28) and angiogenesis (FIGS. 29 to 31).
  • the FB-iPCS cell line in which the gene of the TSP1 protein was knocked out was prepared (FIGS. 32 and 33), and differentiated vascular endothelial cells were prepared therefrom to confirm the recovery of angiopathy (FIGS. 34 to 37).
  • the present invention provides a method for screening a candidate for treating Fabry disease using TSP1 protein.
  • Another method comprises the steps of: 1) treating the test substance with TSP1 protein; 2) measuring the activity level of the TSP1 protein; And 3) selecting a test substance in which the activity level of the TSP1 protein is reduced compared to a control group not treated with the test substance.
  • the activity level of the protein in step 2) can be measured by any one or more methods selected from the group consisting of enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, SDS-PAGE, mass spectrometry, and protein chip. .
  • TGF beta signaling pathway inhibitor means a substance that inhibits signaling by TGF beta.
  • TGF beta is a protein that regulates various physiological processes such as cell proliferation, differentiation, cell death, migration, and production of extracellular matrix (ECM) angiogenesis and development in vivo.
  • ECM extracellular matrix
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of Fabry disease, which contains the TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor SB-431542 as an active ingredient.
  • dermal tissue was obtained by performing skin tissue biopsy using a punch biopsy method after local anesthesia with the consent of a patient with Fabry disease at Asan Medical Center (Asan Medical Center, Korea).
  • Asan Medical Center Asan Medical Center, Korea.
  • Table 1 The clinical information of four Fabry disease patients is shown in Table 1 below. All experiments were conducted under the deliberation of the Clinical Research Ethics Review Committee at the hospital.
  • the FB-iPSC prepared in Example 1 was cultured for 3 days in a feeder-free state. Thereafter, the medium was changed to RPMI-1640 medium containing 1% B27, and 50 ng / ml of activin A and 20 ng / ml of BPM4 were added as growth factors, followed by incubation for 2 days. Differentiation into mesoderm cells. Thereafter, the medium was changed to RPMI-1640 medium containing 0.5% B27, and 50 ng / ml of VEGFA and 50 ng / ml of bFGF were added as growth factors, followed by incubation for 2 days to vascular progenitors. Differentiated with.
  • CD34 positive cells capable of differentiating into vascular endothelial cells were isolated by performing magnetic activated cell sorting (MACS) using CD34 magnetic beads on the induced vascular progenitors.
  • the isolated CD34 positive cells, vascular progenitors were added for 2 days in EGM-2 medium (Lonza, USA) to which 100 ng / ml VEGF-A and 100 ng / ml bFGF were added as growth factors. Further cultured to differentiate into vascular endothelial cells.
  • TSP1 protein in vascular endothelial cells differentiated from FB-iPCS was confirmed by immunostaining.
  • the experiment was performed in the same manner as in Experimental Example 1-1, using the vascular endothelial cells prepared in Example 2.
  • an anti-TSP1 antibody (1: 200 dilution, Santacruz, USA) was used.
  • angiogenesis-related protein by Gb3 protein was confirmed using Western blot.
  • LysoGb3 protein was treated with vascular endothelial cells differentiated from normal iPCS for 3, 6, or 9 days, and then Western blot was performed in the same manner as in Experimental Example 3-1.
  • Antibodies include anti-TSP1 antibody (1: 1000 dilution, Santacruz, USA), anti-KDR antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA), anti-eNOS antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA ), Anti-AKT antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA)), and anti-phospho-AKT antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA) were used.
  • the morphological changes of vascular endothelial cells by the TGF- ⁇ inhibitor SB431542 compound were confirmed by the following method.
  • the vascular endothelial cells formed a tube shape on the Matrigel well by the SB431542 compound.
  • Antibodies include anti-TSP1 antibody (1: 1000 dilution, Santacruz, USA), anti-SMAD2 antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA), and anti-phospho-SMAD2 antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling) Technologies, USA), anti-KDR antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA) and anti-eNOS antibody (1: 1000 dilution, Cell Signaling Technologies, USA) were used.
  • the expression position of the anti-angiogenic factor protein in vascular endothelial cells differentiated from the isotype control cells of FB-iPSC was confirmed by immunostaining.
  • a TB1 gene knocked out FB-iPSC cell line was obtained.
  • Example 5 Using the FB-iPSC cells in which the TSP1 gene prepared in Example 5 was knocked out, differentiation was induced in the same manner as in Example 2 to prepare vascular endothelial cells.

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Abstract

본 발명은 TSP1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서 파브리 병 환자로부터 유래된 유도만능줄기세포에 TSP1 유전자를 녹아웃시켜 제조된 혈관내피세포에서 세포 형태의 회복, TSP1 유전자 발현의 감소, 항 혈관형성 인자인 TSP1 단백질 및 인산화-SMAD 단백질의 발현량 감소, 혈관신생 인자인 KDR 단백질 및 eNOS 단백질의 발현량 증가를 확인함으로써, TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제는 파브리 병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TSP1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 TSP1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
파브리 병(Fabry disease)은 알파 갈락토시다제(α-galactosidase, GLA)를 암호화 하는 유전자인 GLA의 변이가 원인이 되어 나타나는 X-유전자 관련의 열성 유전 질병이다. GLA 유전자는 인간의 7번 엑손의 xq22.1 위치에 존재하는 유전자로서, 총 429개의 아미노산으로 구성되는 전구체 단백질(precursor protein)로부터 가공된 370개의 아미노산으로 구성되는 당단백질(glycoprotein)을 암호화한다(Schiffmann, R. Pharmacology & therapeutics 122, 65-77 (2009)).
현재까지 GLA 유전자에서 나타날 수 있는 것으로 알려져 있는 변이 위치는 400여개가 보고되었으며(http://www.hgmd.cf.ac.uk), 파브리 병은 GLA 유전자의 변이 위치에 따라 질병 증상의 정도가 다양하게 나타난다. 대부분의 변이에 의해 알파-갈락토시다제의 활성이 전혀 나타나지 않으나, 몇몇의 미스센스 변이(missense mutation)에서는 5 내지 10%의 잔여 효소 활성을 나타내, 이러한 변이를 가진 환자는 임상적으로 중요한 병태생리(pathophysiology)를 나타내지 않는다(Clarke, J. T. Annals of internal medicine 146, 425-433 (2007)).
파브리 병은 또한 리소좀 효소(lysosomal enzyme)의 결핍을 보이는데, 이러한 효소 결핍은 버킷 림프종 세포(Burkitt lymphoma cells)에서 시가 독소(Shiga toxin) 수용체로서 작용하는 중성당스핑고지질(neutral glycosphingolipid)인 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide, Gb3, CD77)의 과도한 축적에서 비롯되는 것으로 알려져 있다(Nudelman, E. et al. Science New York, N.Y 220, 509-511 (1983)). 파브리 병 환자의 혈관 세포(vascular cells), 심장 세포(cardiac cells), 신장 내피 세포(kidney epithelial cells) 또는 신경 세포(neuronal cells)와 같은 다양한 세포에서 Gb3의 축적이 나타난다. 특히, 혈관 세포에서 Gb3의 축적은 뇌졸중(stroke) 또는 심근 경색증(myocardial infarction)과 같은 심혈관계 기능장애(systemic cardiovascular dysfunction)를 유발한다.
과거 파브리 병은 117,000명의 남성 중 1명에서 발병하는 것으로 보고되었다(Meikle, P. J. et al. Jama 281, 249-254 (1999)). 그러나, 최근 발병빈도가 급격히 상승하여, 3,100 내지 3,700명의 남자 아이 중 1명에서 발병하는 것으로 보고되었다(Spada, M. et al. American journal of human genetics 79, 31-40 (2006)).
파브리 병을 치료하기 위한 유일한 방법으로, 반복적인 효소 대체 치료법(enzyme replacement therapy)이 사용된다. 구체적으로, 알파-갈락토시다제로서 아갈시다제 베타(agalsidase beta)인 파브라자임(Fabrazyme)(Eng, C.M. et al. The New England journal of medicine 345, 9-16 (2001)) 또는 아갈시다제 알파(agalsidase alpha)인 레플라갈(Replagal)(Schiffmann, R. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 365-370 (2000))을 투여하여 파브리 병 환자의 다양한 세포 종류에서 축적된 Gb3를 제거한다. 정맥주사로 투여된 효소는 세포막(plasma membrane)의 만노오즈 6-인산(mannose 6-phosphate, M6P) 수용체를 통해 세포 내로 유입되어, 리소좀(lysosome)으로 이동한다. 이와 같은 치료적 효소의 투여는 파브리 병의 치료에 중추적인 역할을 나타내나, 파브라자임 또는 레플라갈과 같은 재조합 효소는 혈액 내에서 불안정하며, 반복적인 투여를 통해 알러지 반응이 유발될 가능성이 있다는 문제가 있다(Eng, C. M. et al. The New England journal of medicine 345, 9-16 (2001); Schiffmann, R. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 365-370 (2000); Sakuraba, H. et al. Journal of human genetics 51, 180-188 (2006)).
파브리 병의 연구 및 치료제 개발을 위해, 쥐에서 GLA의 녹아웃을 유발한 후, 내피세포 장애(endothelial dysfunction)에 대해 Gb3 축적의 역할을 연구하는 것이 일반적이다. GLA의 녹아웃을 유발한 쥐 모델에서는 대동맥 내피 세포(aortic endothelial cell)의 카베올레(caveolae)에서 비정상적인 Gb3의 축적이 관찰되었다(Shu, L. & Shayman, J. A. The Journal of biological chemistry 282, 20960-20967 (2007)). 이러한 비정상적인 Gb3의 축적은 GLA가 녹아웃된 내피세포에서 칼슘 채널의 기능 저하를 유발할 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Park, S. et al. Cardiovascular research 89, 290-299 (2010)). 그럼에도 불구하고, GLA 녹아웃을 유발한 쥐의 Gb3 축적 정도는 파브리병 환자의 축적 정도와 다소 차이가 있기 때문에, GLA 녹아웃 쥐 모델은 파브리병 환자에서 유발되는 여러가지 합병증들을 재현할 수 없는 한계가 있다(Taguchi, Maruyama et al, Biochemical Journal 456, 373-383 (2013)).
한편, 줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있을 수 있으며, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation, expansion)하는 특성이 있고, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 갖는 것이 특징이다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSC)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(Human pluripotent stem cells; hPSCs)는 다양한 세포 종류로 분화할 수 있다. iPSC를 시험관 내에서 분화시켜 면역 거부반응 없이 질병을 치료하는 데 사용할 수 있고, 질병의 초기 메커니즘을 이해하고 평가하는 수단으로 사용할 수도 있다(Muotri, A. R. Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85 (2009); Marchetto, M. C., B. Winner, et al. Hum Mol Genet 19(R1): R71-76 (2010)).
다양한 유전적 질병을 가지는 환자로부터 유래된 iPSC가 질병과 관련있는 세포 종류로 직접 분화되었을 때, 질병 특이적인 표현형(phenotypes)을 나타낸다(Park, I. H. et al. Cell 134, 877-886 (2008); Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)). 이러한 질병 특이적인 iPSC는 질병과 관련있는 세포 종류로 분화될 수 있으며, 이에 따라 질병의 구체적인 기전을 확인하거나 치료제를 스크리닝 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이에 본 발명자들은, 기존에 파브리 병의 치료제로 사용되고 있는 파브라자임의 문제점을 인식하고 이를 극복할 수 있는 환자 특이적인 치료제를 개발하기 위해 노력하던 중, 유도만능줄기세포(iPSC)를 이용하여 파브리 병을 연구하기 위한 줄기세포 모델을 확립하고, 이를 이용해 TSP1(Thrombospondin1) 단백질이 파브리병에서 혈관병증의 원인임을 규명하였으며, 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 세포 형태의 회복, TSP1(Thrombospondin1) 유전자 발현의 감소, 항 혈관형성 인자인 TSP1 단백질 및 인산화-SMAD 단백질의 발현량 감소, 혈관신생 인자인 KDR(kinase insert domain receptor) 단백질 및 eNOS(endothelial Nitric oxide synthase) 단백질의 발현량 증가를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TSP1 단백질 억제제의 파브리 병의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TSP1(Thrombospondin1) 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1(Thrombospondin1) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) TSP1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 세포주에서 TSP1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 TSP1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) TSP1 단백질에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 피검체 유래 시료에서 TSP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 2) TSP1 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 파브리 병에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 파브리 병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 파브리 병 환자로부터 유래된 유도만능줄기세포에 TSP1 유전자를 녹아웃시켜 제조된 혈관내피세포에서 세포 형태의 회복, TSP1 유전자 발현의 감소, 항 혈관형성 인자인 TSP1 단백질 및 인산화-SMAD 단백질의 발현량 감소, 혈관신생 인자인 KDR 단백질 및 eNOS 단백질의 발현량 증가를 확인함으로써, TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제는 파브리 병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4)의 세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포(FB-iPSC)에서 줄기세포성 마커인 OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, Tra-1-81 및 Tra-1-60 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 2는 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4)의 세포로부터 제조된 FB-iPSC의 핵형을 나타낸 도이다.
도 3은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4)의 세포로부터 제조된 FB-iPSC에서 알파 갈락토시다제(GLA) 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4)의 세포로부터 제조된 FB-iPSC에서 LC3 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 5는 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 LC3, 베클린 1 및 유비퀴틴 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 6은 FB-iPSC로부터 혈관내피세포를 분화시키는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 7은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 CD34 및 CD31을 동시에 발현하는 세포 비율을 나타낸 도이다.
도 8은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 KDR, CD31 및 VE-카데린 단백질의 발현분포와, CD31 및 CD105 단백질 발현의 FACS 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 형태를 확인한 도이다.
도 10은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 튜브 형성을 확인한 도이다(FZ: 파브라자임).
도 11은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 GLA 활성을 나타낸 도이다.
도 12는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 KDR 단백질의 발현분포를 확인한 도이다.
도 13은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1, KDR 및 eNOS 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 14는 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SMAD2 단백질의 인산화 수준을 나타낸 도이다(agal: 파브라자임).
도 15는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 액티빈 A 처리에 의한 TSP1 단백질 및 혈관형성과 관련된 단백질의 발현량 변화를 나타낸 도이다(ACTA: 액티빈A).
도 16은 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현분포를 확인한 도이다.
도 17은 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 LysoGb3 단백질 처리에 의한 세포형태 변화를 확인한 도이다.
도 18a는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 1일 동안 처리한 뒤 TSP1, KDR 및 eNOS 유전자의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 18b는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 3일 동안 처리한 뒤 TSP1, KDR 및 eNOS 유전자의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 18c는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 5일 동안 처리한 뒤 TSP1, KDR 및 eNOS 유전자의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 19는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 LysoGb3 단백질 처리에 의한 TSP1, KDR, eNOS 단백질의 발현량 변화, 및 AKT 단백질의 인산화 수준 변화를 나타낸 도이다.
도 20은 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 LysoGb3 단백질 처리에 의한 TSP1 단백질의 발현 분포 변화를 확인한 도이다.
도 21a는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 세포 형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 21b는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 세포 형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 21c는 파브리 병 환자(Fab#2) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 세포 형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 21d는 파브리 병 환자(Fab#3) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 세포 형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 21e는 파브리 병 환자(Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 세포 형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 22는 4명의 파브리 병 환자(Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 TSP1, KDR, 및 eNOS 단백질의 발현량 변화를 나타낸 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 23a는 정상의 iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 튜브 형성 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 23b는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 튜브 형성 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 23c는 파브리 병 환자(Fab#2) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 튜브 형성 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 23d는 파브리 병 환자(Fab#3) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 튜브 형성 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 23e는 파브리 병 환자(Fab#4) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 처리에 의한 튜브 형성 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542).
도 24a는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 또는 로자탄(losartan) 처리에 의한 세포형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542, Los: 로자탄).
도 24b는 파브리 병 환자(Fab#2) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 SB431542 화합물 또는 로자탄(losartan) 처리에 의한 세포형태 변화를 확인한 도이다(FZ: 파브라자임, SB: SB431542, Los: 로자탄).
도 25은 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC에서 돌연변이된 GLA 유전자의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 26은 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 아이소타입 대조군(isotype control) 세포주를 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 27은 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 제조된 아이소타입 대조군 세포주에서 GLA 유전자의 교정을 확인한 도이다.
도 28은 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 제조된 아이소타입 대조군 세포주 및 이로부터 분화된 혈관내피세포에서 GLA 활성을 나타낸 도이다.
도 29은 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC 아이소타입 대조군 세포주로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질 및 혈관형성과 관련된 단백질의 발현량과, SMAD 단백질의 인산화 수준을 나타낸 도이다(agal: 파브라자임).
도 30는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC 아이소타입 대조군 세포주로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 및 VE-카데린 단백질의 발현분포를 확인한 도이다(agal: 파브라자임).
도 31은 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC 아이소타입 대조군 세포주로부터 분화된 혈관내피세포의 튜브 형성을 확인한 도이다(agal: 파브라자임).
도 32은 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 TSP1 유전자가 녹아웃된 세포주를 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 33는 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 제조된 TSP1 유전자가 녹아웃된 세포주에서 TSP1 유전자의 녹아웃을 서열분석 방법으로 확인한 도이다.
도 34은 TSP1 유전자가 녹아웃된 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 형태를 확인한 도이다(agal: 파브라자임).
도 35는 TSP1 유전자가 녹아웃된 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 유전자 발현량을 나타낸 도이다.
도 36는 TSP1 유전자가 녹아웃된 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1, KDR, 및 eNOS 단백질의 발현량, 및 SMAD 단백질의 인산화 수준을 나타낸 도이다(agal: 파브라자임).
도 37은 TSP1 유전자가 녹아웃된 파브리 병 환자(Fab#1) 유래 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 튜브 형성을 확인한 도이다(agal: 파브라자임).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TSP1 유전자는 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있고, 그 활성을 저하시키지 않는 하나 또는 그 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 본 발명의 TSP1 유전자 서열과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 TSP1 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 TSP1 유전자의 발현 억제제는 TSP1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA를 억제하는 것이면 당업계에 알려진 어떠한 물질도 포함할 수 있고, 화학적으로 합성하거나, 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 등 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 상기 발현 억제제는 TSP1 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것을 의미한다. 또한, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다.
상기 siRNA는 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA의 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 의미한다. 또한, 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분도 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하며, 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.
상기 shRNA는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 의미하며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. 또한, 상기 shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하여 세포로 전달될 수 있으며, 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의해 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합되고, 상기 복합체가 siRNA에 상응하는 mRNA에 결합하여 이를 분해시킬 수 있다.
상기 리보자임은 특이적 RNA 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자를 의미한다. 리보자임의 분자 서열과 상보적인 표적 RNA의 특이적 혼성화에 의해 핵산내부용해성 절단이 유도될 수 있고, 리보자임은 표적 RNA에 상보적인 하나 이상의 서열 또는 기능적 등가 서열의 절단을 담당하는 공지된 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 리보자임은 햄머-헤드(hammer-head) 리보자임 또는 리보핵산내부분해효소(endoribonuclease) RNA인 체크형(Cech type)리보자임일 수 있고, 변경된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성되어 안전성, 표적화 등이 개선될 수 있다. 한편, 상기 리보자임은 생체내에서 표적 유전자를 발현하는 세포에 분포될 수 있고, 형질감염된 세포가 내생성 표적 메신저를 파괴하고 번역을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생성하도록 강한 항시성 중합효소 III 또는 중합효소 II 프로모터의 조절 하에서 리보자임을 코딩하는 DNA 구축물이 사용될 수 있다. 리보자임은 촉매활성을 갖기 때문에, 다른 안티센스 분자와 달리 세포내에서 낮은 농도로 유지되어야 할 수 있다.
또한, 상기 TSP1 단백질은 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 이러한 변이체는 본 발명의 TSP1 단백질 서열과 80％, 90％, 95％, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 TSP1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 TSP1 단백질의 활성 억제제는 TSP1 단백질을 구성하는 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머(aptamer) 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 펩티드 및 펩티드 미메틱스는 TSP1 단백질이 다른 단백질과 결합하는 것을 억제함으로써 TSP1 단백질의 활성을 억제하는 것일 수 있다. 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 비가수분해성 펩티드 미메틱스는 주요 잔기로서 β-턴 디펩티드 코어, 케토-메틸렌 슈도펩티드류, 아제핀, 벤조디아제핀, β-아미노알콜 또는 치환 감마락탐환을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 앱타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하고, 분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질등에 결합하여 그 기능을 차단할 수 있으므로 단일 항체를 대체하는 일종의 화학 항체로 볼 수 있다. 또한, 상기 앱타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용하여, 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리함으로써 수득할 수 있다.
상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 특정 단백질에 대한 항체는 단백질의 서열이 공지되어 있다면 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로, 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜 등을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기 다클론항체는 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 파브리 병 환자의 세포를 이용한 유도만능 줄기세포(FB-iPSC)를 제조하여, 줄기세포의 특성(도 1 및 2), 알파 갈락토시다제(GLA) 활성의 저하(도 3), 및 리소좀 관련 단백질 발현량의 증가(도 4 및 5)를 확인하였고, FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여(도 6 및 7), 혈관내피세포의 특성(도 8 내지 10), GLA 활성의 저하(도 11), KDR 단백질 및 eNOS 단백질 발현량의 감소(도 12 및 13), 및 TSP1 단백질 발현량의 증가(도 14 내지 16)를 확인하였다.
또한, Gb3 단백질에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증이 유발됨을 확인하였고(도 17 내지 20), TGF-β 억제제인 SB431542 화합물에 의해 혈관병증 치료 효과가 있음을 확인하였으나(도 21 내지 23), 다른 TGF-β 억제제인 로자탄(losartan)에서는 치료 효과를 확인할 수 없었다(도 24).
나아가, FB-iPCS의 아이소타입 대조군 세포주를 제조하고(도 25 내지 27), 이로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여, GLA 활성의 회복(도 28) 및 혈관병증의 회복(도 29 내지 31)을 확인하였고, TSP1 단백질의 유전자가 녹아웃 된 FB-iPCS 세포주를 제조하고(도 32 및 33), 이로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여, 혈관병증의 회복을 확인하였다(도 34 내지 37).
따라서 본 발명의 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제는 파브리 병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부 내 주사 주입 방식 중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 내지 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 내지 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
또한, 본 발명은 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 TSP1 유전자 및 TSP1 유전자의 발현 억제제는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 TSP1 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 발현 억제제는 TSP1 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 TSP1 단백질 및 TSP1 단백질의 활성 억제제는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 TSP1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 활성 억제제는 TSP1 단백질을 구성하는 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 파브리 병 환자의 세포를 이용한 유도만능 줄기세포(FB-iPSC)를 제조하여, 줄기세포의 특성(도 1 및 2), 알파 갈락토시다제(GLA) 활성의 저하(도 3), 및 리소좀 관련 단백질 발현량의 증가(도 4 및 5)를 확인하였고, FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여(도 6 및 7), 혈관내피세포의 특성(도 8 내지 10), GLA 활성의 저하(도 11), KDR 단백질 및 eNOS 단백질 발현량의 감소(도 12 및 13), 및 TSP1 단백질 발현량의 증가(도 14 내지 16)를 확인하였다.
또한, Gb3 단백질에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증이 유발됨을 확인하였고(도 17 내지 20), TGF-β 억제제인 SB431542 화합물에 의해 혈관병증 치료 효과가 있음을 확인하였으나(도 21 내지 23), 다른 TGF-β 억제제인 로자탄(losartan)에서는 치료 효과를 확인할 수 없었다(도 24).
나아가, FB-iPCS의 아이소타입 대조군 세포주를 제조하고(도 25 내지 27), 이로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여, GLA 활성의 회복(도 28) 및 혈관병증의 회복(도 29 내지 31)을 확인하였고, TSP1 단백질의 유전자가 녹아웃 된 FB-iPCS 세포주를 제조하고(도 32 및 33), 이로부터 분화된 혈관내피세포를 제조하여, 혈관병증의 회복을 확인하였다(도 34 내지 37).
따라서 본 발명의 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제는 파브리 병의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 함량은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상및 환 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 건강기능식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용 될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 TSP1 단백질을 이용한 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 TSP1 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 TSP1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 1) TSP1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 세포주에서 TSP1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 TSP1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassays), 샌드위치 효소면역분석법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 형광면역법(fluoroimmunoassay), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다.
또 다른 방법은, 1) TSP1 단백질에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 효소면역분석법, 형광면역법, SDS-PAGE, 질량분석(mass spectrometry), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 파브리 병 환자로부터 유래된 유도만능줄기 세포(FB-iPSC)로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현량이 증가했고(도 14 내지 16), TSP1 단백질의 유전자가 녹아웃 된 FB-iPCS 세포주로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증의 회복을 확인하였으므로(도 34 내지 37), TSP1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 방법은 파브리 병 치료제 후보물질을 스크리닝하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 TSP1 단백질을 이용한 파브리 병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출방법을 제공한다.
상기 TSP1 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 TSP1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 1) 피검체 유래 시료에서 TSP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 2) TSP1 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 파브리 병에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 파브리 병 환자로부터 유래된 유도만능줄기 세포(FB-iPSC)로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현량이 증가했고(도 14 내지 16), TSP1 단백질의 유전자가 녹아웃 된 FB-iPCS 세포주로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증의 회복을 확인하였으므로(도 34 내지 37), TSP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 파브리 병 진단에 필요한 정보를 제공하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 TGF-β 신호전달경로 억제제인 SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
"TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달경로 억제제"는 TGF 베타에 의한 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. TGF 베타는 생체 내에서 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 세포외기질(ECM)의 생산 혈관형성, 발생 등 다양한 생리적 과정을 조절하는 단백질이다.
상기 TGF 베타 신호전달경로 억제제는 SB-431542일 수 있으나 TGF 신호전달을 억제시킬 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 TGF 베타 신호전달경로 억제제로 SB431542를 이용하였으며 이는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019011199-appb-I000001
상기 SB-431542는 파브리병 환자의 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현을 감소시킬 수 있고, KDR(kinase insert domain receptor) 및 eNOS(endothelial Nitric oxide synthase) 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Gb3 단백질에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증이 유발됨을 확인하였고(도 17 내지 20), TGF-β 억제제인 SB431542 화합물에 의해 혈관병증 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 21 내지 23). 따라서 본 발명의 SB-431542는 파브리 병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 TGF-β 신호전달경로 억제제인 SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 SB-431542는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, SB-431542는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있고, 파브리병 환자의 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현을 감소시킬 수 있으며, KDR 및 eNOS 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019011199-appb-I000002
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Gb3 단백질에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증이 유발됨을 확인하였고(도 17 내지 20), TGF-β 억제제인 SB431542 화합물에 의해 혈관병증 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 21 내지 23). 따라서 본 발명의 SB-431542는 파브리 병의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 파브리 병(Fabry disease) 환자로부터 유래된 유도만능 줄기세포(induced puripotent stem cells, iPSC)의 제조
파브리 병의 연구를 위해, 파브리 병 환자로부터 섬유아세포(fibroblast)를 분리하여 iPSC를 다음과 같은 방법으로 유도하였다.
구체적으로, 서울 아산병원(Asan medical center, 한국)의 파브리 병 환자의 동의를 얻어 국소 마취 후 펀치 생검법(punch biopsy method)으로 피부 조직 생검을 수행하여 진피(dermal) 조직을 수득하였다. 파브리 병 환자 4명의 임상정보는 하기 표 1과 같다. 모든 실험은 병원의 임상연구윤리 심의위원회의 심의하에 진행되었다.
환자번호 1 2 3 4
성별 남자 남자 남자 남자
나이 37세 28세 50세 28세
진단 18세 24세 32세 20세
표현형(Phenotype) Classical Classical Classical Classical
GLA 활성 0.0% 0.6% 0.0% 0.6%
GLA mutation c. c.803_806del c.658C>T c.334C>T c.1045T>C
GLA mutataion p. p.L268fs*1 p.Arg220* p.Arg112Cys p.Trp349Arg
효소대체요법기간(ERT duration) 0년 12년 0년 3년 0년 11년 0년 7년
혈청 GL3(3.9-9.9 ug/ml) 18 4.8 16 8.3 10 5.5 12 5.6
혈관각화종(Angiokeratoma) + + + + + + + +
윤생각막(cornea verticillata) + + + + + + + +
감각신경난청(sensorineural hearing loss) + + - + + + - -
심전도이상(EKG abnormality) WPW WPW SB WPW SB SB WPW WPW
심장비대(Cardiac hypertrophy) - - - - + + - -
좌심실질량(LV mass,g/m2) NA 89 89 98 126 153 94 105
무한증/발한감소증 (Anhidrosis/Hypohydrosis) + + + + + + + +
말단감각이상(Acroparesthesia) + + + + - - + +
단백뇨(Proteinuria, mg/day/m2) 11 106 0.03 73 109 98 72 35
사구체여과율(GFR, ml/min/1.73m2) 141 139 125 122 58 46 123 122
상기 수득된 진피 조직에서 섬유아세포를 분리하여 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 및 1% 비필수 아미노산(non-essential amino acid)을 포함하는 DMEM 배지에 배양하였다. 그런 다음, 다분화능 마커(pluripotent marker)인 OCT4, SOX2, KLF4 및 C-MYC를 발현하는 레트로바이러스(retrovirus)를 형질도입(transduction)하여 이소성 발현(ectopic expression)시키는 당업계의 공지된 기술(Takahashi, K et al, Cell 131(5): 861-872, 2007)을 사용하여, 상기 섬유아세포로부터 iPSC(FB-iPCS)의 발생을 유도하였다. 상기 세포를 3일 동안 배양 한 후, 마우스 태아 섬유아세포(mouse fetal fibrolast)를 배양 보조 세포(feeder cell)로 이용하여 계대배양 하였고, 20% KOSR(knockout serum replacement), 50 units/ml의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 0.1 mM의 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 1 mM의 L-글루타민(L-glutamine), 0.1 mM의 베타-메르갑토에탄올(β-mercaptoethanol), 및 10 ng/ml의 염기성 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F12 배지에 장시간 배양하였다. 이후, 줄기세포와 유사한 형태학적 특성을 갖는 콜로니(colony)를 분리해 FB-iPSC 세포주를 구축하였다.
실험예 1. 파브리 병 환자로부터 유래된 iPSC의 줄기세포 특성 확인
1-1. FB-iPSC의 다분화능 확인
미분화 상태인 FB-iPSC가 다분화능을 나타내는지 확인하기 위하여, FB-iPSC에서 줄기세포성 마커(stemness maeker)의 발현을 면역염색(immunostaining)을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 FB-iPSC를 포름알데히드(formaldehyde) 용액을 이용하여 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 세포막에 투과성(Permeability)를 부여하였다. 이후, 상기 처리한 세포를 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 PBS인 PBST로 3회 세척하고, 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 전처리(blocking)하였다. 이후 여기에 1차 항체로 항-OCT4 항체(1:300 희석, R&D Systems 사, 미국), 항-SOX2 항체(BD Transduction Laboratories, 미국), 항-NANOG 항체(1:300 희석, Cell signaling technology 사, 미국), 항-SSEA-4 항체(1:300 희석, R&D Systems 사, 미국), 항-TRA-1-81 항체(1:300 희석, Millipore 사, 미국) 또는 항-TRA-1-60 항체(1:300 희석, Millipore 사, 미국)를 각각 처리하여 4℃에서 반응시킨 후에 PBST로 3회 세척하였다. 세척 후, 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체(Invitrogen, 미국)를 각각 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 이를 PBST로 6회 세척하였다. 이때, 마지막 세척시, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)를 처리하여 핵을 형광염색하였다. 염색된 FB-iPSC를 형광 현미경(fluorescence microscope; olympus, 일본) 또는 자이스 LSM 510 공초점 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하여 OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81 및 TRA-1-60 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC에서 줄기세포성 마커인 OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, Tra-1-81 및 Tra-1-60 단백질이 정상 세포 수준으로 발현되었다. 상기 결과로부터, FB-iPSC가 배아줄기세포와 같은 전분화능이 있음을 알 수 있었다.
1-2. FB-iPSC의 핵형 확인
실시예 1에서 제조한 FB-iPSC의 염색체 분석을 젠딕스(한국)에 의뢰하여, 실시예 1에서 제조된 FB-iPSC가 정상 핵형을 가지는지 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC는 46, XY의 정상 핵형을 보였다.
실험예 2. FB-iPSC에서 알파-갈락토시다제(α-galactosidase, GLA)의 활성 저하 확인
파브리 병 환자에서는 GLA 활성이 0에 가깝게 나타나야 하므로, FB-iPCS의 GLA 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 FB-iPCS의 세포 펠렛(cell pellet)에 100 mM 구연산나트륨(sodium citrate) 및 200 mM 인산수소이나트륨(sodium phosphate dibasic)을 포함하는 pH 4.6의 GLA 분석 완충용액(GLA assay buffer)을 200 μl 가한 후, 1초 파쇄 및 1초 휴식의 프로그램으로 총 10초간 초음파(sonication) 파쇄하였다. 이후, 4℃에서 30분 동안 1300 rpm으로 원심분리하여 세포 파쇄물의 상층액을 수득한 후, 30 μl의 200 mM N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAC), 6 μl의 50 mM 4-MU-알파-D-갈락토피라노사이드(4-MU-α-D-galactopyranoside, 4MUaGal), 14 μl의 GLA 분석 완충용액 및 10 μl의 상기 수득한 세포 파쇄물 상층액을 혼합하여 GLA 분석을 위한 혼합물을 제조하였다. 제조된 혼합물을 96 웰 플레이트(96 well plate)에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, pH 10.32의 200 mM 글리신을 포함하는 GLA 정지 완충용액(GLA stop buffer)을 각각의 웰에 가하여 반응을 정지시키고, 빅터 플레이트 리더기(Victor plate reader; Perkin Elmer, 미국)를 사용하여 355 및 460 ㎚의 파장에서 형광을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군과 다르게 FB-iPSC에서는 GLA의 활성이 전혀 나타나지 않았다.
실험예 3. 파브리 병 환자에서 리소좀 관련 단백질 발현량의 확인
파브리 병은 리소좀 저장 질환으로 분류되므로, FB-iPCS 및 파브리 병 환자 샘플 각각에서 리소좀과 관련된 단백질의 발현량을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
3-1. FB-iPCS에서 LC3(autophagy-related protein light chain 3) 단백질 발현량의 확인
FB-iPCS에서 리소좀과 관련된 LC3 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 FB-iPCS에 파브리 병의 치료제인 파브라자임(fabrazyme) 및 기아 상태의 배양액(starvation media)을 다양한 조합으로 처리하였다. 각각의 샘플에 Pro-Prep Solution(Intron Biotechnology, 한국)을 가하여 4℃에서 반응시킨 후, 10분 동안 1300 rpm으로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액을 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하고 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시킨 후, 4% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹하였다. 이후, 항-LC3 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국)를 처리하고 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 트윈-20을 포함하는 TBS로 3회 세척하고 통상적인 웨스턴 블롯 방법으로 단백질 발현량을 확인하였다. 각 단백질은 GAPDH를 대조군으로 사용하여 발현량을 보정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 파브라자임 처리 유무와 무관하게 정상세포보다 FB-iPCS에서 LC3 단백질의 발현량이 높았다.
3-2. 파브리 병 환자 샘플에서 LC3, 베클린 1(Beclin 1) 및 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 발현량의 확인
파브리 병 환자 샘플에서 리소좀 신호전달체계와 관련된 LC3, 베클린 1 및 유비퀴틴 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 파브리 병 환자로부터 수득된 진피조직으로부터 혈관내피세포를 분리하고 파브라자임을 처리한 후, 상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 LC3, 베클린 1 및 유비퀴틴 단백질의 발현량을 확인하였다. 항체로는 항-LC3 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-베클린 1 항체(1:500 희석, Santacruz, 미국) 및 항-유비퀴틴 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 파브라자임 처리 유무와 무관하게 정상세포보다 파브리 병 환자의 혈관내피 세포에서 LC3, 베클린 1 및 유비퀴틴 단백질의 발현량이 높았다.
상기 결과로부터, 파브리 병 환자에서 리소좀이 정상적으로 작동하지 않고, 치료제인 파브라자임을 처리하더라도 리소좀 저장질환의 특성이 회복되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2. 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포의 제조
파브리 병 환자의 혈관병증을 확인하기 위해, 하기의 방법에 따라 FB-iPCS로부터 혈관내피세포를 분화시켰다(도 6).
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 FB-iPSC를 영양주가 없는(feeder-free) 상태에서 3일 동안 배양하였다. 이후, 배지를 1% B27을 포함하는 RPMI-1640 배지로 변경하고, 생장인자로서 50 ng/ml의 액티빈 A(activin A) 및 20 ng/ml의 BPM4를 첨가한 후, 2일 동안 배양하여 중배엽(mesoderm) 세포로 분화시켰다. 이후, 배지를 0.5% B27을 포함하는 RPMI-1640 배지로 변경하고, 생장인자로서 50 ng/ml의 VEGFA 및 50 ng/ml의 bFGF를 첨가한 후, 2일 동안 배양하여 혈관전구체(vascular progenitors)로 분화시켰다. 유도된 혈관전구체에 CD34 마그네틱 비드(CD34 magnetic bead)를 사용하는 자기 활성화 세포 분류(Magnetic activated cell sorting, MACS)를 수행하여, 혈관내피 세포로 분화될 수 있는 CD34 양성 세포를 분리하였다. 상기 분리된 CD34 양성 세포인 혈관전구체를, 생장 인자로서 100 ng/ml의 VEGF-A 및 100 ng/ml의 bFGF를 첨가한 EGM-2 배지(Lonza, 미국)에서 2일 동안 추가로 배양하여 혈관내피세포로 분화시켰다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 혈관내피세포의 분화가 유도되어, CD34 및 CD31을 동시에 발현하는 세포가 15% 이상 발생하였다.
실험예 4. 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포의 특성 확인
4-1. 혈관내피세포 마커 단백질의 발현 확인
파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포가 정상적으로 분화되었는지 확인하기 위해, 혈관내피세포 마커 단백질인 KDR(kinase insert domain receptor), CD31 및 VE-카데린(vascular endothelial cadherin)의 발현을 면역염색을 이용해 확인하였다. 실험은, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행되었다. 이떄, 1차 항체로는 항-KDR 항체(1:300 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-CD31 항체(1:300 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 및 항-VE-카데린 항체(1:300 희석, Abcam, 영국)를 각각 사용하였다.
한편, 혈관내피세포들 중 CD31 및 CD105를 발현하는 세포의 분포도를 FACS(fluorescense activated cell sorter)를 이용해 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포에 아큐타제(accutase)를 처리하고 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 상기 세포 펠렛에 2% 소태아 혈청을 포함하는 PBS(FACS 버퍼)를 첨가하여 재부유(resuspension)시킨 후, 40 μm의 포어 크기를 갖는 스트레이너(strainer)를 이용해 세포를 여과하였다. 상기 여과된 세포에 FACS전용 항체로서 항-CD31 항체(1:200 희석, Biolegend, 미국) 및 항-CD105 항체(1:200 희석, Biolegend, 미국)를 처리하고 4℃에서 3분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포는 FACS 버퍼로 5번 세척하고, FACS 칼리버 유세포 분석기(FACS Calibur flow cytometer, BD biosciences)를 이용해 세포 분포도를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 파브리 병 환자 유래의 혈관내피세포에서 혈관내피세포 마커인 KDR, CD31 및 VE-카데린 단백질이 정상 세포 수준으로 발현되었고, CD31 및 CD105 단백질의 발현도 단일하게 분포되었다. 상기 결과로부터, FB-iPSC로부터 혈관내피세포가 정상적으로 분화되었음을 알 수 있었다.
4-2. 혈관내피세포의 형태 및 혈관형성(vasculogenesis) 확인
파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포의 형태 변화 및 혈관형성 여부를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포를 13일 동안 배양하면서 위상차 현미경으로 9, 11, 및 13일째의 세포 형태를 확인하였다.
한편, 70 μl의 매트리겔(matrigel, corning) 원액을 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 굳힌 후, 그 위에 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 1x104개 및 EGM2 배지를 첨가하여 튜브 형성(tube formation) 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군과 다르게 파브리 병 환자 유래의 혈관내피세포는 배양이 진행될수록 넓게 퍼져가면서 비정상적인 모양으로 변했고, 매트리겔 위에서 튜브 형성가 형성되지 않았다. 상기 결과로부터, 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포는 혈관병증을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 5. 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 GLA의 활성 저하 확인
파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 GLA의 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 2와 동일한 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군과 다르게 파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서는 GLA의 활성이 전혀 나타나지 않았다.
실험예 6. 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 KDR 단백질의 발현 확인
파브리 병은 혈관과 관련된 합병증을 유발하므로, 파브리 병 환자의 혈관병증을 확인하기 위해 KDR 단백질의 발현을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
6-1. KDR 단백질의 발현 위치 확인
FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 KDR 단백질의 발현 위치를 면역염색을 이용해 확인하였다. 실험은, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행되었고, 1차 항체로는 항-KDR 항체(1:300 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 KDR 단백질의 발현 위치가 정상 대조군과 다른 것을 알 수 있었다.
6-2. KDR 단백질의 신호전달체계 확인
FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 KDR 단백질의 신호전달체계와 관련된 KDR, eNOS(endothelial Nitric oxide synthase) 및 TSP1(Thrombospondin type-1) 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조된 혈관내피세포에 파브라자임을 처리한 후, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국) 및 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 KDR 및 eNOS 단백질의 발현량은 정상 대조군에 비해 감소하였고, TSP1 단백질의 발현량은 정상대조군에 비해 증가했으나, 파브라자임 처리 유무와 무관하였다. 상기 결과로부터, 파브리 병에 의해 TSP1 단백질의 발현량이 증가하고, 이는 파브라자임에 의해 억제되지 않음을 확인하였다.
실험예 7. 파브리 병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현 확인
파브리 병에서 혈관과 관련된 합병증이 TSP1 단백질의 과발현에서 유발되는지 확인하기 위해, TSP1 단백질의 신호전달체계를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
7-1. TGF-β(Transforming growth factor beta)의 활성화 확인
FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 상위 신호전달체계인 TGF-β 단백질의 활성화를 확인하기 위해, SMAD2 단백질의 인산화를 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조된 혈관내피세포에 파브라자임을 처리한 후, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국) 및 항-phospho-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 SMAD2 단백질의 인산화가 파브라자임 처리 유무와 무관하게 정상 대조군에 비해 증가했다. 상기 결과로부터, FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 TGF-β 단백질이 활성화되었음을 알 수 있었다.
7-2. TGF-β의 활성화에 따른 TSP1 단백질의 발현량 증가 확인
TGF-β의 활성화가 TSP1 단백질의 발현량을 증가시키는지 확인하기 위해, TSP-1 단백질을 비롯한 관련 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에 액티빈 A를 처리하여 TGF-β를 활성화시킨 후, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-phospho-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-bFGF 항체(1:1000 희석 Bioss, 미국), 항-ANG2 항체(1:1000 희석 Bioss, 미국) 및 항-vEGF 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 액티빈 A에 의해 TSP1 단백질의 발현이 증가했다. 상기 결과로부터, TGF-β단백질의 활성화가 TSP1 단백질의 발현량을 증가시킴을 알 수 있었다.
7-3. TSP1 단백질의 발현 위치 확인
FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현 위치를 면역염색을 이용해 확인하였다. 실험은, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행되었다. 1차 항체로는 항-TSP1 항체(1:200 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군에 비해 파브리병 환자로부터 유래된 혈관내피세포에서 증가된 TSP1 단백질은 세포 전체에 걸쳐 분포하였다.
실험예 8. Gb3(Globotriaosylceramide 3) 단백질에 의한 혈관병증 유발 확인
파브리 병 환자의 세포 및 기관에 축적되는 Gb3 단백질이 혈관병증을 유발하는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
8-1. 혈관내피세포의 형태 변화 확인
Gb3 단백질에 의한 혈관내피세포의 형태 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질(MATREYA LLC, 미국)을 9일 동안 처리한 후 세포의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, Gb3 단백질에 의해 정상 혈관내피세포가 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포처럼 넓어지는 형태로 변했다.
8-2. 혈관병증 관련 유전자의 발현량 확인
Gb3 단백질에 의한 혈관병증 관련 유전자의 발현 변화를 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 1, 3, 또는 5일 동안 처리하고, easy-BLUE(intron 사)를 이용해 세포에서 RNA를 추출한 후, 통상적인 방법으로 RT-PCR을 수행하여 혈관병증과 관련된 KDR, eNOS 및 TSP1(Thrombospondin 1) 유전자의 RNA 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 18a 내지 18c에 나타낸 바와 같이, LysoGb3 단백질을 처리하고 1일 후에 KDR, eNOS 및 TSP1 유전자의 RNA 발현량이 증가했으며, 이후 점차 감소하여 3일 및 5일 후에 KDR 및 eNOS 유전자의 RNA 발현량은 정상 대조군보다 낮았고, TSP1 유전자의 RNA 발현량은 정상 대조군과 비슷했다.
8-3. 혈관병증 관련 단백질의 발현량 확인
Gb3 단백질에 의한 혈관병증 관련 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다. 실험은, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 3, 6, 또는 9일 동안 처리한 후, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-AKT 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)), 및 항-phospho-AKT 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, LysoGb3 단백질 처리에 의해 TSP1 단백질의 발현량이 증가했고, KDR 및 eNOS 단백질의 발현량과 AKT 단백질의 인산화는 감소했다.
8-4. TSP1 단백질의 발현 위치 확인
정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현 위치를 면역염색을 이용해 확인하였다. 실험은, 정상의 iPCS로부터 분화된 혈관내피세포에 LysoGb3 단백질을 처리하고, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 1차 항체로는 항-TSP1 항체(1:200 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, LysoGb3 단백질 처리에 의해 증가된 TSP1 단백질은 세포 전체에 걸쳐 분포하였다.
상기 결과로부터, Gb3 단백질이 파브리 병 환자에서 혈관병증을 일으키는 주요 물질임을 알 수 있었다.
실험예 9. 파브리 병 환자의 혈관병증에 대한 TGF-β 억제제의 치료 효과 확인
9-1. SB431542 화합물에 의한 혈관내피세포의 형태 변화 확인
TGF-β 억제제인 SB431542 화합물에 의한 혈관내피세포의 형태 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포에, 파브라자임만 처리한 대조군, SB431542 화합물(Cayman Chemical, 미국)만 처리한 실험군, 또는 파브라자임 및 SB431542 화합물을 함께 처리한 실험군을 이용하여, 세포의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 21a 내지 21e에 나타낸 바와 같이, SB431542 화합물에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포의 비정상적 형태가 정상으로 회복되었다.
9-2. SB431542 화합물에 의한 혈관내피세포의 신호전달체계 확인
SB431542 화합물에 의한 혈관병증 관련 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포에, 파브라자임만 처리한 대조군, 또는 파브라자임 및 SB431542 화합물을 함께 처리한 실험군을 이용하여, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국) 및 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, SB431542 화합물에 의해 TSP1 단백질의 발현량이 감소했고, KDR 및 eNOS 단백질의 발현량은 증가했다.
9-3. SB431542 화합물에 의한 혈관내피세포의 혈관형성 확인
SB431542 화합물에 의한 혈관내피세포의 혈관형성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포에, 파브라자임만 처리한 대조군, SB431542 화합물만 처리한 실험군, 또는 파브라자임 및 SB431542 화합물을 함께 처리한 실험군을 이용하여, 실험예 4-2과 동일한 방법으로 튜브 형성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 23a 내지 23e에 나타낸 바와 같이, SB431542 화합물에 의해 혈관내피세포는 매트리겔 위에서 튜브 모양을 잘 형성하였다.
9-4. 로자탄(losartan)에 의한 혈관내피세포의 형태 변화 확인
TGF-β 억제제인 로자탄에 의한 혈관내피세포의 형태 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포에, 파브라자임만 처리한 대조군, 파브라자임 및 SB431542 화합물을 함께 처리한 실험군, 또는 파브라자임 및 로자탄(Cayman Chemical, 미국)을 함께 처리한 실험군을 이용하여, 세포의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, SB431542 화합물에 의해 FB-iPCS로부터 분화된 혈관내피세포의 비정상적 형태가 정상으로 회복된 반면, 로자탄은 효과가 없었다.
상기 결과로부터, SB431542 화합물은 파브리 병 환자의 혈관병증 치료 효과를 나타내는 반면, 로자탄에서는 그 효과를 확인할 수 없었다.
실시예 3. FB-iPSC의 아이소타입 대조군(isotype control) 세포주 제조
파브리 병 환자의 혈관병증에 대한 객관적 실험을 위해, FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주를 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 제조하였다(도 25 및 26).
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 FB-iPSC에서, 하기 표 2의 서열을 타겟으로하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 통상적인 방법으로 GLA 유전자의 결함을 교정하였다. 타겟에 대한 indel 빈도(표 3)가 더 높게 나타나는 target 2를 이용하여 교정 세포주를 만들고, 이로부터 DNA를 추출해 서열을 분석하였다.
CRISPR/CAS9 타겟 유전자 염기서열(5'-3') 서열번호
GLA(target 1) TCATTCTTTTTCTCAGTNNNNGATTGG 3
GLA(target 2) TTCTCAGTNNNNGATTGGCAACTTTGG 4
Total reads Insert Deletion Indel(%) HDR(%)
Target 1 Cas9 alone 23233 0 3 3(0.0%) 0(0.0%)
Cas9+T1_sgRNA 22041 0 0 0(0.0%) 0(0.0%)
Cas9+T1_sgRNA+ssODN 24833 0 0 0(0.0%) 0(0.0%)
Target 2 Cas9 alone 23226 0 13 13(0.1%) 0(0.0%)
Cas9+T2_sgRNA 22636 339 2716 3055(13.5%) 0(0.0%)
Cas9+T2_sgRNA+ssODN 21316 1318 1766 3084(14.5%) 877(4.1%)
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, GLA 유전자가 교정된 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주를 수득하였다.
실시예 4. FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포의 제조
실시예 3에서 제조한 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터, 실시예 2와 동일한 방법으로 분화를 유도하여 혈관내피세포를 제조하였다.
실험예 10. FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주 및 혈관내피세포에서 GLA 활성 회복 확인
FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주 및 이로부터 분화된 혈관내피세포에서 GLA 활성이 회복되었는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, 실시예 3에서 제조한 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주 및 실시예 4에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포주 및 이로부터 분화된 혈관내피세포에서 GLA의 활성이 회복되었다.
실험예 11. FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증 회복 확인
*11-1. 혈관병증 관련 단백질의 발현량 확인
FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증 관련 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다. 실험은, GLA(Genzyme, 미국)가 처리된 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 4에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 및 항-phospho-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국) 및 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현량 및 SMAD 단백질의 인산화가 감소했고, KDR 및 eNOS 단백질의 발현량은 증가했다.
11-2. 항 혈관형성 인자 단백질의 발현 위치 확인
FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 항 혈관형성 인자 단백질의 발현 위치를 면역염색을 이용해 확인하였다.
구체적으로, GLA가 처리된 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 4에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 1차 항체로는 항-VE-카데린 항체(1:300 희석, Abcam, 영국) 및 항-TSP1 항체(1:200 희석, Santacruz, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 분포가 감소했다.
11-3. 혈관내피세포의 혈관형성 확인
FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포의 혈관형성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, GLA를 처리한 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 4에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 4-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 FB-iPSC의 아이소타입 대조군 세포로부터 분화된 혈관내피세포는 매트리겔 위에서 튜브 모양을 잘 형성하였다.
상기 결과로부터, GLA 유전자의 교정이 파브리 병 환자의 혈관병증을 회복시킴을 알 수 있었다.
실시예 5. TSP1 유전자가 녹아웃(Knock out)된 FB-iPSC 세포주 제조
파브리 병 환자의 혈관병증의 원인으로 확인된 TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포주를 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 제조하였다(도 32).
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 FB-iPSC에서 하기 표 4의 서열을 타겟으로하는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용해 통상적인 방법으로 TSP1 유전자를 녹아웃하였다. 타겟에 대한 indel 빈도(표 5)가 더 높게 나타나는 target 2를 이용하여 녹아웃 세포주를 만들고, 이로부터 DNA를 추출해 서열을 분석하였다.
CRISPR/CAS9 타겟 유전자 염기서열(5'-3') 서열번호
TSP1(target 1) GTCTGTGGAAGAAGCTCTCCTGG 5
TSP2(target 2) CTGGAGCGGAAAGACCACTCTGG 6
Total reads Insert Deletion Indel(%)
Target 1 Cas9 alone 28429 0 9 9(0.0%)
Cas9+T1_sgRNA 17769 117 1154 1271(7.2%)
Target 2 Cas9 alone 27483 0 3 3(0.0%)
Cas9+T2_sgRNA 21243 198 1880 2078(9.8%)
그 결과, 도 33에 나타낸 바와 같이, TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포주를 수득하였다.
실시예 6. TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포로부터 분화된 혈관내피세포의 제조
실시예 5에서 제조한 TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포를 이용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 분화를 유도하여 혈관내피세포를 제조하였다.
실험예 12. TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증 회복 확인
12-1. 혈관내피세포의 형태 변화 확인
TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포로부터 분화된 혈관내피세포의 형태 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, GLA를 처리한 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 6에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 세포의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 34에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포는 비정상적 형태를 보였으나, TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포는 정상적 형태를 보였다.
12-2. 혈관내피세포에서 TSP1 유전자의 발현량 확인
TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 유전자의 RNA 발현량을 RT-PCR을 이용해 확인하였다. 실험은, 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 6에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 8-2와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 35에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군 및 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 유전자의 RNA 발현량이 감소하였다.
12-3. 혈관병증 관련 단백질의 발현량 확인
TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 혈관병증과 관련된 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 이용해 확인하였다. 실험은, GLA를 처리한 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 6에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항체로는 항-TSP1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 미국), 항-KDR 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-eNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국), 항-phospho-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국) 및 항-SMAD2 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technologies, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 36에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현량 및 SMAD 단백질의 인산화가 감소했고, KDR 및 eNOS 단백질의 발현량은 증가했다.
*
12-4. 혈관내피세포의 혈관형성 확인
TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포로부터 분화된 혈관내피세포의 혈관형성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은, GLA를 처리한 실시예 2에서 제조한 혈관내피세포 및 실시예 6에서 제조한 혈관내피세포를 이용하여, 실험예 4-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 37에 나타낸 바와 같이, FB-iPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 비해 TSP1 유전자가 녹아웃된 FB-iPSC 세포로부터 분화된 혈관내피세포는 매트리겔 위에서 튜브 모양을 잘 형성하였다.
상기 결과로부터, TSP1 단백질이 파브리 병 환자에서 혈관병증을 일으키는 주요 단백질이고, 이의 발현을 억제하면 파브리 병을 치료할 수 있음을 확인하였다.

Claims (18)

  1. TSP1(Thrombospondin1) 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TSP1 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TSP1 유전자의 발현 억제제는 TSP1 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TSP1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 TSP1 단백질의 활성 억제제는 TSP1 단백질을 구성하는 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머(aptamer) 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. TSP1 유전자의 발현 억제제 또는 TSP1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 1) TSP1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포주에서 TSP1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 TSP1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassays), 샌드위치 효소면역분석법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 형광면역법(fluoroimmunoassay), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정되는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  10. 1) TSP1 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 TSP1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 효소면역분석법, 형광면역법, SDS-PAGE, 질량분석(mass spectrometry), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정되는, 파브리 병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  12. 1) 피검체 유래 시료에서 TSP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) TSP1 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 파브리 병에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 파브리 병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  13. SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, SB-431542는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019011199-appb-I000003
    .
  15. 제 13항에 있어서, SB-431542는 파브리병 환자의 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현을 감소시키는, 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제 13항에 있어서, SB-431542는 파브리병 환자의 혈관내피세포에서 KDR(kinase insert domain receptor) 및 eNOS(endothelial Nitric oxide synthase) 단백질의 발현을 증가시키는, 파브리병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. SB-431542를 유효성분으로 함유하는 파브리병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  18. 제 17항에 있어서, SB-431542는 파브리병 환자의 혈관내피세포에서 TSP1 단백질의 발현을 감소시키고, KDR 및 eNOS 단백질의 발현을 증가시키는, 파브리병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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