CN105412935B - 一种基于n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物的纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物的可克服粘液屏障的纳米粒及其制备方法，该纳米粒由核壳两部分组成，其中，内核为生物相容性载体材料与活性成分所形成的纳米复合物，外壳则为HPMA聚合物及其衍生物。

Description

一种基于N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物的纳米粒及其制 备方法

技术领域

本发明涉及一种克服粘液屏障的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物，具体涉及一种基于N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物的穿过粘液屏障的纳米粒及制备方法，属于药物制剂领域。

背景技术

粘液是一种复杂的水凝胶，由蛋白、碳水化合物、脂类、无机盐、抗体、细菌及细胞残骸组成(Adv. Drug. Deliv. Rev., 2012, 64: 557-570)，覆盖在人体胃肠道、呼吸道、眼部及子宫颈等粘膜表面。一方面，粘液层可通过吸附及快速清除病原体和外来物质对人体健康起着至关重要的作用；同时，粘液层也构成了粘膜给药必须跨越的重要生理屏障。

生物可降解的、无毒的聚合物纳米粒体系由于具有可有效减少药物降解、调节药物释放以及增加药物与上皮细胞接触等特性，将其作为各类药物的载体具有很好的应用前景(Biomaterials., 2012, 33: 1573-1582; Adv. Drug. Deliv. Rev.,2013, 65: 811-821)。然而，大部分的纳米载体由于静电作用或疏水作用而被吸附在粘液中，最终随粘液的更新机制而被排除体外(Adv. Drug. Deliv. Rev., 2009, 61:158-171)。因此，设计一种可快速穿过粘液层的纳米载体很有必要。

大量研究表明，表面亲水且电中性的微粒可避免粘液层的吸附。据此，Hanes等将亲水性聚乙二醇与聚合物材料共价相连作为可克服粘液屏障的纳米载体，但该载体对聚乙二醇的分子量及修饰度均有一定的要求(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2009, 106:19268-19273; Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2008, 47:9726-9729; US20130323313Al；US 20140329913 Al)，同时聚乙二醇的共价连接会引起聚合物内核结构和性质的改变(Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2011, 50: 2597-2600)及限制载体与上皮细胞间的相互接触(ACS Nano., 2012, 6: 771-781)。另外，也有报道通过局部稀释粘液来增加聚合物纳米粒在粘液中地扩散(Eur. J. Pharm. Biopharm., 2014, 87:125-131;Biomacromolecules., 2014, 15:2294-2300)，但关于粘液稀释剂的非靶向稀释作用及局部稀释作用所带来的安全性问题还有待进一步的研究。

N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物作为药物载体的研究开始于上世纪七十年代。作为纳米级别（5-20nm）的水溶性材料，具有结构简单、生物相容性好、无免疫原性以及可根据使用目的对结构进行修饰等特点(Adv. Drug. Deliv. Rev.,2010,62: 122-149; US 20060014695 Al; WO 01/36002 Al)。

目前，已有多种HPMA聚合物作为抗肿瘤药物的载体进入了临床试验(Br. J.Cancer., 2004, 91: 50-55; Int. J.Oncol.,2009, 34: 1629-1636)。但是还未见将其作为粘附惰性材料的报道。

发明内容

为了解决现有技术中可克服粘液屏障纳米载体存在的上述问题，本发明人通过创造性的研究将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物引入可克服粘液屏障的纳米制剂如纳米粒中，不仅能显著增加穿过粘液层的纳米粒的量，同时HPMA聚合物及其衍生物包裹可防止活性成分的泄露，提高其稳定性，并且可通过胃肠道以及非胃肠道途径给药，显著提高其生物利用度。

本发明的目的之一是提供，一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物穿透粘液屏障（粘液层）的应用。

本发明的目的之一是提供，一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物作为穿透粘液屏障（粘液层）的活性成分的载体的应用。

本发明的目的之一是提供，一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物及其衍生物在制备穿透粘液屏障（粘液层）的药物组合物/药物制剂中的应用。

本发明的目的之一是提供，一种克服粘液屏障/穿透粘液屏障（粘液层）的活性成分的纳米载体，以解决目前粘膜给药制剂中的应用缺陷，获得稳定性高，生物相容性好且能快速穿过粘液层的给药纳米载体。

本发明的目的之一是提供，一种克服粘液屏障/穿透粘液屏障（粘液层）的纳米粒，所述纳米粒基于HPMA聚合物及其衍生物，进一步优选地，所述纳米粒是用HPMA聚合物及其衍生物包裹。

本发明的目的之一是提供，一种基于HPMA聚合物及其衍生物的克服粘液屏障的纳米粒，其是一种核壳结构，主要由两部分构成，其中核芯/内核部分是由活性成分与生物相容性载体材料形成的纳米复合物，外壳是由HPMA聚合物及其衍生物所形成。

作为具体的实施方案之一，所述纳米粒平均粒径范围为10~1000nm；所述核壳结构的纳米粒是由纳米复合物核芯/内核与HPMA聚合物及其衍生物外壳按重量比1:99~95:5（w/w）制成；所述活性成分含量占纳米粒总重的0.1%~90%（w/w）。

在核芯/内核部分中与活性成分形成纳米复合物的生物相容性载体材料包括但不限于：穿膜肽、乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、聚苯乙烯、聚癸二酸、聚乙烯亚胺、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、无机硅材料、无机碳材料、过渡金属元素、壳聚糖及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、树枝状聚合物、聚氨基酸、透明质酸、明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、胆固醇、脂肪酸、磷脂、鞘脂及脂肪酸甘油酯的一种或多种的组合。

进一步优选地，生物相容性载体材料可进行配体修饰包括但不限于：叶酸、维生素B12等维生素类配体；半乳糖、乳糖、海藻糖、甘露糖、透明质酸等糖类配体；或小麦凝集素、荆豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素等凝集素类配体；或转铁蛋白、白蛋白、穿膜肽、CSKSSDYQC肽、CKSTHPLSC肽、Claudin-1模拟肽、CTGKSC肽、PAVLG肽、LRVG肽、ACDCRGDCFCG肽、RGD直链肽、RGD环肽等蛋白多肽类配体的一种或多种的组合。

本发明的实施例中进一步优选乳酸-羟基乙酸共聚物、穿膜肽、壳聚糖的衍生物、胆固醇、磷脂及脂肪酸甘油酯作为生物相容性载体材料与活性成分制备成核芯/内核。

作为优选的实施方案之一，所述活性成分包括蛋白多肽类药物、核酸类药物及化学药物中的至少一种，其含量为纳米粒总重的0.1%~90%（w/w），优选1%~80%（w/w）；

所述蛋白多肽类药物包括但不限于胰岛素、奥曲肽、醋酸生长抑素、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素、单克隆抗体和疫苗；

所述核酸类药物包括但不限于小分子干扰核糖核酸和质粒DNA；

所述化学类药物包括但不限于：阿司匹林、对乙酰氨基酚、贝诺酯、布洛芬、萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛等解热镇痛药及非甾体抗炎药；或苯唑西林钠、四环素、阿莫西林、氨苄西林、甲硝唑、替硝唑、左氧氟沙星、加替沙星、呋喃唑酮、庆大霉素、利福霉素、红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等抗生素及其它抗菌药物；或阿霉素、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、羟喜树碱、常春碱、吉西他滨、硫酸长春碱等抗肿瘤药；或米索前列醇、雌二醇、己烯雌酚、他莫昔芬、左炔诺孕酮、炔诺酮、米非司酮、氢化可的松、地塞米松等激素类药物；或地西泮、异戊巴比妥、苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸钠、氯丙嗪、氟哌啶醇、盐酸哌替啶、左旋多巴等中枢神经系统药物；或氯贝胆碱、溴新斯的明、硫酸阿托品、溴丙胺太林、肾上腺素、盐酸麻黄碱、普鲁卡因、利多卡因等外周神经系统药物；或普萘洛尔、硝苯地平、卡托普利、氯沙坦、地高辛、洛伐他汀、吉非贝齐等循环系统药物；或甲苯磺丁脲、二甲双胍、那格列奈、氢氯噻嗪、螺内酯、呋塞米、依地尼酸等降血糖药及利尿药。

作为本发明具体实施方案之一，优选胰岛素、降钙素及洛伐他汀作为活性成分。

本发明所述的纳米粒外壳，是由甲基丙烯酰胺类化合物单体中的一种或多种，通过聚合反应形成中性、负电荷、正电荷、疏水性修饰或配体修饰的HPMA聚合物及其衍生物，其分子量范围是1kDa~800kDa；

关键地，作为纳米粒外壳的HPMA聚合物及其衍生物可通过酰胺键或酯键与纳米粒的核芯/内核部分相连；还可通过静电作用或疏水作用吸附在核芯/内核的表面，与现有共价修饰的可克服粘液屏障的纳米载体相比，可避免由于共价连接引起的核芯/内核结构及性质的改变。

本发明所述甲基丙烯酰胺类化合物单体包括但不限于：N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺、3-（氨基丙基）甲基丙烯酸盐、2-（硫代乙基）甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸、N,N-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯、N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸对-硝基苯酯、N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸、N-甲基丙烯酰甘氨酰苯丙胺酰亮胺酰甘氨酸对-硝基苯酯、N-甲基丙烯酰甘氨酰苯丙胺酰亮胺酰甘氨酸。

用于修饰HPMA聚合物及其衍生物的负电荷化合物，包括羧酸类化合物，如C3~C22烯酸、C3~C22羟基酸、C2~C20二元酸及多元酸；或磺酸类及亚磺酸类化合物，如C3~C20氨基磺酸；或氨基酸类化合物，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天胺酰胺、谷胺酰胺、苏氨酸、半胱氨酸及上述氨基酸的单聚或共聚物；优选地，所述负电荷化合物的修饰量为HPMA聚合物的1%~95%（mol/mol）。

用于修饰HPMA聚合物及其衍生物的正电荷化合物，包括胺类化合物；或氨基酸类化合物，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、酪氨酸、天胺酰胺、谷胺酰胺、苏氨酸及半胱氨酸的单聚或共聚物；优选地，所述正电荷化合物的修饰量为HPMA聚合物的1%~95%（mol/mol）。

用于修饰HPMA聚合物及其衍生物的疏水性化合物，包括十胺~二十胺、十二~二十二烷酸、甾醇、胆甾酸及氨基酸类化合物中的至少一种修饰的HPMA聚合物。其中，氨基酸类化合物包括但不限于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及其衍生物；优选地，所述疏水性化合物的修饰量为HPMA聚合物的0.5%~80%（mol/mol）。

用于修饰HPMA聚合物及其衍生物的配体，包括维生素类配体，如叶酸、维生素B12及上述配体的混合物；或糖类配体，如半乳糖、乳糖、海藻糖、甘露糖、透明质酸及上述配体的混合物；或凝集素类配体，如小麦凝集素、荆豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素及上述配体的混合物；或蛋白多肽类配体，如转铁蛋白、白蛋白、穿膜肽、CSKSSDYQC肽、CKSTHPLSC肽、Claudin-1模拟肽、CTGKSC肽、PAVLG肽、LRVG肽、ACDCRGDCFCG肽、FQSIYPpIK肽、RGD直链肽、RGD环肽及上述配体的混合物；优选地，配体修饰量为HPMA聚合物的0.1%~90%（mol/mol）。

作为本发明优选的实施方案之一，本发明优选甘氨酰甘氨酸（负电荷）、十二胺（疏水性）、3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐（正电荷）修饰的HPMA聚合物作为外壳。

本发明的目的之一是提供一种制备基于HPMA聚合物及其衍生物的克服粘液屏障纳米粒的方法，包括以下步骤：

（1）将活性成分与生物相容性载体材料混合，采用药剂学领域的常规方法，如离子交联法、高压匀化法、乳化溶剂挥发法、薄膜法、超临界萃取法等，以形成纳米复合物核芯/内核。下面以离子交联法为例进行说明：称取处方量的生物相容性载体材料，用水溶解，再加入处方量的活性成分水溶液，搅拌即得纳米复合物核芯/内核。在此过程中，可加入一定量的交联剂，如三聚磷酸钠、硫酸镁、γ-多聚谷氨酸等。

（2）再将处方量的HPMA聚合物及其衍生物与纳米复合物核芯/内核混合，继续搅拌，即得。

本发明的目的之一是提供一种制备基于HPMA聚合物及其衍生物的克服粘液屏障纳米粒的方法，包括以下步骤：

（1）HPMA聚合物及其衍生物通过酰胺键、酯键等共价键与载体材料相连。下面以HPMA聚合物与载体材料穿膜肽反应为例进行说明：称取适量含对硝基苯酯的HPMA聚合物及穿膜肽分别溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，二者摩尔比1:1.2，将穿膜肽溶液滴加至HPMA聚合物溶液，磁力搅拌5h，反应结束后，利用透析的方法除去未反应的穿膜肽，冷冻干燥即得。

（2）HPMA聚合物共价修饰的载体材料可采用药剂学领域的常规方法制备纳米粒，如离子交联法、高压匀化法、乳化溶剂挥发法、薄膜法、超临界萃取法等。

本发明目的之一是提供一种可用于口服给药的克服粘液屏障的纳米粒及其制备方法。

具体地，本发明提供了一种可克服胃肠道粘液屏障的纳米粒制剂，主要是由本发明的纳米粒与药学上可以接受的辅料制备成溶液型液体制剂、高分子溶液剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、滴剂、散剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂等口服给药制剂。

本发明目的之一是提供吸入给药、眼部给药、阴道给药及直肠给药等多种胃肠外给药形式的可克服粘液屏障的纳米粒制剂及其制备方法。

具体地，本发明提供了一种可克服呼吸道粘液屏障的纳米粒制剂，主要是由本发明的纳米粒与药学上可以接受的辅料制成气雾剂、喷雾剂或粉雾剂，装入适于吸入给药的装置，用于肺部给药。

具体地，本发明提供了一种可克服眼部粘液屏障的纳米粒制剂，主要是由本发明的纳米粒加入药学上可接受的辅料，制成滴眼剂、眼膏剂、眼用注射剂、眼用膜剂、眼用脂质体、眼用凝胶剂等眼粘膜给药制剂。

具体地，本发明提供了一种可克服直肠或宫颈粘液屏障的纳米粒制剂，主要是由本发明的纳米粒加入药学上可接受的辅料，制成栓剂、灌肠剂、阴道凝胶剂及阴道泡腾片剂，供直肠或阴道给药。

有益效果：

1. 本发明中的活性成分主要位于核芯/内核，表面为HPMA聚合物形成的外壳，可有效减少药物在制备与储存过程中的泄露，以提高药物的稳定性，保持其活性。

2. 本发明中内核的载体材料可具备多种性质，而且可通过共价连接或物理吸附作用与药物交联，因此可对具有不同性质的药物进行包封，包括水溶性药物及脂溶性药物。

3. 相同条件下，包裹HPMA聚合物及其衍生物的纳米粒与未包裹的纳米粒相比，可显著增加穿过粘液层纳米粒的量，进而提高粘膜给药制剂的生物利用度。

4. 本发明中将HPMA聚合物作为粘附惰性材料，与现有的粘附惰性材料聚乙二醇相比，其结构更易于修饰，可形成不同性质的HPMA聚合物，如正电荷、负电荷及疏水修饰等，从而增强了内核中活性成分的稳定性。

5. 本发明中的HPMA聚合物及其衍生物不仅可与纳米复合物核芯/内核进行共价连接，还可通过静电作用或疏水作用等物理吸附作用包裹在纳米复合物核芯/内核表面，与现有共价修饰的可克服粘液屏障的纳米载体相比，可避免由于共价连接引起的核芯/内核结构及性质的改变。

6. 本发明中的HPMA聚合物及其衍生物具有生物相容性好，无免疫原性，无毒等特点，与现有通过粘液稀释作用促进纳米粒的粘液扩散行为相比，可有效提高纳米载体的安全性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表示HPMA聚合物包裹前后纳米粒的粒径、电位变化图。

图2表示载胰岛素纳米粒在HPMA聚合物包裹前后，胰岛素在胰酶中的稳定性图。

图3表示粘蛋白对HPMA聚合物包裹前后纳米粒的吸附作用图。

图4表示大鼠口服胰岛素原药及HPMA聚合物包裹前后纳米粒的药效学研究图。

图5表示大鼠口服胰岛素原药及HPMA聚合物包裹前后纳米粒的药动学研究图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1 甘氨酰甘氨酸（负电荷）修饰的HPMA聚合物的合成

将新蒸的甲基丙烯酰氯30mL与15mL二氯甲烷混合，缓缓滴入含有1-氨基-2-丙醇21mL和碳酸钠32g的二氯甲烷溶液77mL中，滴加完毕后升至室温，搅拌1h。然后将反应液置于-50℃的低温冷浴槽中1h，产生白色沉淀。过滤后将沉淀用丙酮重结晶，得白色晶体即为HPMA单体。

将甲基酰丙烯酰氯8.71mL与30mL二氯甲烷混合，于-15℃搅拌下缓缓滴入含9.79g甘氨酰甘氨酸的氢氧化钠溶液中，同时滴入1M氢氧化钠溶液调节pH9-10，室温搅拌1.5h。分离二氯甲烷层后以20mL水洗涤，合并水层，以6M盐酸水溶液调节pH1-2。沉淀以50％乙醇水溶液重结晶，得白色结晶即为甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸单体（MA-GG-OH）。

以2，2’-偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，甲醇为溶剂，聚合物单体HPMA、MA-GG-OH（HPMA：MA-GG-OH = 80：20mol%）通过自由基聚合溶液反应生成HPMA聚合物前体（聚合物单体:引发剂:溶剂= 12.5:2:85.5 wt%）。按上述比例将AIBN、HPMA及MA-GG-OH称量至安瓿中，加入适量甲醇溶解，通氮气后熔封，50℃搅拌24h。乙醚中沉淀纯化，除去残存的溶剂及醚溶性沉淀，以去离子水溶解产物，透析，冷冻干燥即得甘氨酰甘氨酸修饰的HPMA聚合

实施例2 3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐（正电荷）修饰的HPMA聚合物的合成

以2，2’-偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，甲醇为溶剂，聚合物单体HPMA、3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐（APMA）（HPMA：APMA= 80:20 mol%）通过自由基聚合溶液反应生成HPMA聚合物前体（聚合物单体:引发剂:溶剂= 12.5:2:85.5 wt%）。

按上述比例将AIBN、HPMA及APMA称量至安瓿中，加入适量甲醇溶解，通氮气后熔封，50℃搅拌24h。乙醚中沉淀纯化，除去残存的溶剂及醚溶性沉淀，以去离子水溶解产物，透析，冷冻干燥即得3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐修饰的HPMA聚合物。

实施例3 十二胺（疏水性）修饰的HPMA聚合物的合成

取8g实施例1中结晶后的MA-GG-OH单体溶于80mL 二甲基甲酰胺（DMF），再加入6.11g对-硝基苯酚（简称ONp）和9.07gN,N-二环己基碳二胺，-10℃搅拌3h，升至室温搅拌8h，过滤除去沉淀。50℃减压除去DMF，加入乙酸乙酯，回收溶剂，乙醚洗涤所得固体，以乙醇:水（2:1）的混合液重结晶，4℃放置，得白色晶体即为MA-GG-ONp单体。

以2，2’-偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，丙酮为溶剂，聚合物单体HPMA、MA-GG-ONp（HPMA：MA-GG-ONp= 80:20 mol%）通过自由基聚合沉淀反应生成HPMA聚合物前体（聚合物单体:引发剂:溶剂= 12.5:2:85.5 wt%）。按上述比例将AIBN、HPMA（实施例1）及MA-GG-ONp称量至安瓿中，加入适量丙酮溶解，通氮气后熔封，50℃搅拌24h。反应得到的沉淀除去大部分溶剂后用DMF溶解，加入一定量的十二胺，50℃搅拌5h，将反应液透析纯化，冷冻干燥即得十二胺修饰的HPMA聚合物。

实施例4内核为固体脂质复合物的纳米粒的制备

配制0.01mol/L HCl 0.5 mL，加入25mg胆酸钠及4mg降钙素，溶解完全，形成内水相。精密称取30mg大豆磷脂、1mg硬脂酸和10mg三棕榈酸甘油酯，溶于1mL 二氯甲烷，形成油相。将内水相加入到油相，探头超声3次，功率为40W，形成初乳，再加入4mL含0.25% HPMA聚合物（实施例2中制备的正电荷修饰的HPMA聚合物）的F68，探头超声3次，功率为80W，形成复乳。旋蒸至二氯甲烷除净，用0.1% F68稀释至8mL，即得HPMA聚合物包裹后的纳米混悬液。

实施例5 内核为乳酸-羟基乙酸共聚物的纳米粒的制备

称取50mg洛伐他汀和150mg乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶于5mL丙酮中，形成有机相，另取上述实施例3中的HPMA聚合物溶于水中（0.5%），形成水相，在搅拌下，将有机相缓慢滴加至水相中，继续搅拌1h，挥发除尽丙酮，既得HPMA聚合物包裹后的纳米混悬液。

实施例6 内核为三甲基壳聚糖的纳米粒的制备及表征

配制2mg/mL的三甲基壳聚糖溶液，2mg/mL的三聚磷酸钠溶液，1mg/mL的实施例1的HPMA聚合物溶液以及1mg/mL 胰岛素溶液。

在700转/分搅拌下，将胰岛素与三聚磷酸钠溶液适量，逐滴缓慢加入2mL三甲基壳聚糖溶液中，继续搅拌10min，即得三甲基壳聚糖纳米粒。再将该制备好的纳米混悬液适量逐滴缓慢加入实施例1中所述的HPMA聚合物溶液中，继续搅拌10min，即得HPMA聚合物包裹的纳米混悬液。

采用粒径、zeta电位、包封率及载药量对HPMA聚合物包裹前后的纳米粒进行表征，结果见下表1：

表1：HPMA聚合物包裹前后纳米粒的表征：

样品	粒径（nm）	Zeta电位（mV）	包封率%	载药量%
					HPMA聚合物包裹前	207.7±5.3	32.7±1.5	54.3±1.3	31.01±1.0
HPMA聚合物包裹后	276.7±5.3	-3.49±0.3	53.7±1.8	26.6±1.2

由表1可以看出，包裹HPMA聚合物后，纳米粒的粒径有所增加，电位发生了翻转，这表明HPMA聚合物成功包裹在纳米粒内核表面。

实施例7内核为穿膜肽的纳米粒的制备及表征

配制1mg/mL的穿膜肽溶液，1mg/mL的胰岛素溶液。在500转/分搅拌下，穿膜肽溶液缓慢滴加至胰岛素溶液中（体积比4:10），继续搅拌5min，既得穿膜肽/胰岛素纳米复合物。再将该复合物滴加至实施例1中所述的HPMA聚合物溶液中，继续搅拌10min，即得HPMA聚合物包裹的纳米混悬液。采用粒径及zeta电位对HPMA聚合物包裹前后的纳米粒进行表征，结果见说明书附图1。

由图1可见，HPMA聚合物包裹后，纳米粒的粒径增加，电位发生翻转，这表明穿膜肽/胰岛素复合物内核被HPMA聚合物成功包裹。

实施例8 HPMA聚合物包裹后对所载胰岛素的保护作用

将实施例6中制备得到的HPMA聚合物包裹前后的纳米粒分散于含25IU/mL胰酶的介质中，在37℃、100转/分的条件下振摇，以游离胰岛素作为对照。分别在0.5、1、2、3、4h取出0.2 mL溶液，加入0.1M盐酸终止胰酶活性，同时破坏纳米粒结构，离心分离，以高效液相色谱法测定上清液中胰岛素含量，结果见说明书附图2。

图2表明，两种纳米粒均可在一定程度增加胰岛素的稳定性；包裹HPMA聚合物后，胰岛素在胰酶中的稳定性进一步增加。

实施例9粘蛋白对HPMA聚合物包裹前后纳米粒的吸附性研究

猪粘蛋白溶解在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，配成1 % （m/v）的储备液，最终稀释成0.5%，0.3%和0.1%三个浓度。按体积比1：1加入实施例7中制备得到的纳米粒（胰岛素，0.2mg/mL），在37℃、10转/分的条件下振摇30min，沉淀用5M氢氧化钠溶液分散 30min，10000转/分离心5min，测定上清液中的荧光强度。

以没有包裹HPMA聚合物的纳米复合物在0.5%粘蛋白中的荧光强度为对照，设为100%。结果如说明书附图3所示。

图3可见无论粘蛋白的浓度高低，HPMA聚合物包裹后均可显著降低粘蛋白对纳米粒的吸附。

实施例10尤斯室实验评价HPMA聚合物包裹前后两种纳米粒的穿粘液能力

取50 μL新鲜宫颈粘液装填在两张聚碳酸酯膜之间（孔径2.0 μm），固定于样本夹上，插入尤斯室两室中间。向供药室分别加入2.5 ml相同荧光强度的HPMA聚合物包裹前后的纳米粒（实施例6中以三甲基壳聚糖为内核制备的纳米粒），接收室加入相同体积的空白缓冲液，分别在15、30、45、60、90、120、150、180min从接收室取样0.2mL进行荧光分析，并立即向接收室中补充等体积的空白缓冲液。纳米粒的表观渗透系数（Papp）值按下述式计算：Papp =（dQ/dt）×[1/（A×C₀）]（dQ/dt表示纳米粒的扩散速度，A为膜面积，C₀为药物初始浓度），结果见下表2：

表2：HPMA聚合物包裹前后两种纳米粒的Papp值

样品	Papp/cm.s<sup>-1</sup>(×10<sup>7</sup>)
		HPMA聚合物包裹前	8.2±0.13
HPMA聚合物包裹后	37.2±0.80

由表2可以看出，HPMA聚合物包裹后可极大增加纳米粒的穿粘液能力，其表观渗透系数（Papp）是包裹前的4.6倍。

药效学研究及药动学研究

试验例1

（1）随机取已禁食12小时的wistar大鼠（200-300g）15只，随机分为3组，原药组5只，HPMA聚合物包裹前后的纳米粒组各5只（实施例6中以三甲基壳聚糖为内核制备的纳米粒）。分别灌胃给予胰岛素原药及HPMA聚合物包裹前后的纳米粒2.0 ml (含胰岛素50 IU/kg)，按预定的时间点（0、1、2、4、6、8及10h）测定大鼠的血糖值，以给药前大鼠的血糖值作为100%，各时间点降血糖百分数按下述公式计算：血糖变化百分数%=Gt/G0×100（Gt和G0分别表示t时间点的大鼠血糖值和给药前大鼠的血糖值），以血糖变化百分数%对时间t做曲线得血糖百分数-时间曲线，结果见说明书附图图4。

由图4可见纳米粒组的降血糖效果明显高于原药组，同时HPMA聚合物包裹后纳米粒组的降血糖效果显著性区别于包裹前的纳米粒组。

（2）随机取已禁食12小时的wistar大鼠（200-300g）20只，随机分为4组，原药组皮下注射给药5只，原药组灌胃给药5只，HPMA聚合物包裹前后的纳米粒组各5只（实施例6中以三甲基壳聚糖为内核制备的纳米粒）。分别皮下注射给予胰岛素（含胰岛素5IU/kg），灌胃给予胰岛素原药及HPMA聚合物包裹前后的纳米粒2.0 ml (含胰岛素50 IU/kg)，按预定的时间点（0、1、2、4、6、8及10h）取血0.2 ml，加入已涂抹肝素的EP管中，4℃，5000rmp，离心5min，取上清10ul，采用猪胰岛素酶联免疫试剂盒测定不同时间血浆中胰岛素的浓度，根据血药浓度值采用Das软件计算得药动学参数见下表3：

表3：药动学参数，其中s.c.表示皮下注射，i.g.表示灌胃给药；AUC表示时间曲线下面积；FR%为相对生物利用度，以皮下注射胰岛素原药作为100%，按下述公式计算可得相对生物利用度：FR%=AUC（i.g.）×给药剂量（s.c.）/AUC（s.c.）×给药剂量（i.g.）

样品	给药剂量（IU/kg）	AUC(μIU*h/mL)	FR%
				胰岛素原药（s.c.）	5	261.9±50.7	100
胰岛素原药（s.c.）	50	35.5±6.1	1.35
				HPMA聚合物包裹前（i.g.）	50	80.9±14.4	3.09
HPMA聚合物包裹后（i.g.）	50	224.2±39.0	8.57

由表3可以看出，HPMA聚合物包裹后纳米粒的相对生物利用度相对于原药组（i.g.）、HPMA聚合物包裹前的纳米粒组分别提高了6.3倍、2.8倍。

试验例2

随机取已禁食12小时的wistar大鼠（200-300g）15只，随机分为3组，原药组5只，HPMA聚合物包裹前后的纳米粒组各5只（实施例7中以穿膜肽为内核制备的纳米粒）。分别灌胃给予胰岛素原药及HPMA聚合物包裹前后的纳米粒2.0 ml (含胰岛素50 IU/kg)，按预定的时间点（0、1、2、3、4、6、8及10h）取血0.2ml，加入已涂抹肝素的EP管中，4℃，5000rmp，离心5min，取上清10ul，采用猪胰岛素酶联免疫试剂盒测定不同时间血浆中胰岛素的浓度，其血药浓度-时间图见说明书附图5。

结果表明HPMA聚合物包裹后可显著增加药物的吸收，其相对生物利用度分别是原药组、HPMA聚合物包裹前纳米粒组的3.7倍，1.6倍。

Claims (11)

1.一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物及其衍生物作为穿透粘液屏障的活性成分的载体的应用，所述衍生物选自甘氨酰甘氨酸、3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺、十二胺修饰的HPMA聚合物。

2.一种N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物及其衍生物在制备穿透粘液屏障的药物组合物/药物制剂中的应用，所述衍生物选自甘氨酰甘氨酸、3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺、十二胺修饰的HPMA聚合物。

3.一种基于HPMA聚合物及其衍生物的克服粘液屏障的纳米粒，其特征在于所述纳米粒是核壳结构，其中，核芯/内核部分是由活性成分与生物相容性载体材料形成的纳米复合物；外壳是由HPMA聚合物及其衍生物所形成，所述衍生物选自甘氨酰甘氨酸、3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺、十二胺修饰的HPMA聚合物。

4.根据权利要求3所述的纳米粒，其特征在于所述核壳结构的纳米粒是由纳米复合物的内核与HPMA聚合物及其衍生物的外壳按重量比1∶99～95∶5(w/w)制成；所述活性成分含量占纳米粒总重的0.1％～90％(w/w)。

5.根据权利要求3或4所述的纳米粒，其特征在于所述生物相容性载体材料选自穿膜肽、乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、聚苯乙烯、聚癸二酸、聚乙烯亚胺、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、无机硅材料、无机碳材料、壳聚糖及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨基酸、透明质酸、明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、胆固醇、脂肪酸、磷脂、鞘脂、蜡质及脂肪酸甘油酯中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的纳米粒，其特征在于所述的活性成分选自蛋白多肽类药物、核酸类药物及化学药物中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的纳米粒，其特征在于所述活性成分选自：

(1)所述蛋白多肽类药物，选自胰岛素、奥曲肽醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素和单克隆抗体中的至少一种；

(2)所述核酸类药物，选自小分子干扰核糖核酸和质粒DNA中的至少一种；

(3)所述化学类药物，选自解热镇痛药及非甾体抗炎药、抗菌药物、抗肿瘤药、激素类药物、中枢神经系统药物、外周神经系统药物、循环系统药物、降血糖药及利尿药。

8.根据权利要求7所述的纳米粒，其特征在于所述活性成分选自以下药物中的一种或多种：疫苗、醋酸生长抑素、阿司匹林、对乙酰氨基酚、贝诺酯、布洛芬、萘普生、双氯芬酸钠、吲哚美辛、苯唑西林钠、四环素、阿莫西林、氨苄西林、甲硝唑、替硝唑、左氧氟沙星、加替沙星、呋喃唑酮、庆大霉素、利福霉素、红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、阿霉素、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、羟喜树碱、常春碱、吉西他滨、硫酸长春碱、米索前列醇、雌二醇、己烯雌酚、他莫昔芬、左炔诺孕酮、炔诺酮、米非司酮、氢化可的松、地塞米松、地西泮、异戊巴比妥、苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸钠、氯丙嗪、氟哌啶醇、盐酸哌替啶、左旋多巴、氯贝胆碱、溴新斯的明、硫酸阿托品、溴丙胺太林、肾上腺素、盐酸麻黄碱、普鲁卡因、利多卡因、普萘洛尔、硝苯地平、卡托普利、氯沙坦、地高辛、洛伐他汀、吉非贝齐、甲苯磺丁脲、二甲双胍、那格列奈、氢氯噻嗪、螺内酯、呋塞米、依地尼酸。

9.根据权利要求4所述的纳米粒，其特征在于所述纳米粒的外壳，是由甲基丙烯酰胺类化合物单体中的一种或多种，通过聚合反应形成中性、负电荷、正电荷、疏水性修饰或配体修饰的HPMA聚合物及其衍生物，其分子量范围是1kDa～800kDa。

10.一种制备权利要求3所述的纳米粒的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将活性成分与生物相容性载体材料通过化学键、静电力或疏水力形成的纳米复合物作为内核；

(2)再将HPMA聚合物通过共价连接、疏水作用或静电作用包裹在纳米复合物内核表面。

11.一种用于克服粘液屏障的纳米粒制剂，其特征在于主要是由上述权利要求3-9任一项所述的纳米粒与药学上可以接受的辅料制成；所述制剂选自乳剂、混悬剂、糖浆剂、滴剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、滴眼剂、眼膏剂、眼用注射剂、眼用膜剂、眼用脂质体、眼用凝胶剂、栓剂、灌肠剂、阴道凝胶剂及阴道泡腾片剂。