JP5851550B2 - 非免疫原生の疎水性タンパク質ナノ粒子の形成方法、及びその利用 - Google Patents
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Description
mの直径のゼインのマイクロスフェアが免疫原性であり、結果として、薬、ワクチンまたは他の治療用の担体として適さないことを近年報告している[8]。
この記載の目的のために、及び単に本発明の一つの例示的な説明として、本方法は、ほんの一例として、本明細書においてはゼインを用いて説明される。
zein)を使用すると、比較的大きな直径サイズを有する粒子が製造され得、また、より
広い直径サイズ分布を有する粒子が製造され得ることが分かっている。黄色ゼインの色素が黄色ゼインの可溶性、及び黄色ゼインを用いたナノ粒子の形成に影響を及ぼしているかもしれないと考えられている。
他の物質が、被検体の病気又は疾患の発症、経過、及び/又は一つ以上の症状に有益な影響を及ぼすことが可能であり、並びに、病気又は他の状態を治療するための薬剤の製造においてナノ粒子とともに使用され得ることを意味する。
」,及び「the」)は、文脈において明確に別の定めがない限りは、複数を含むものとす
る。例えば、「ナノ粒子」と言った場合には複数のそのようなナノ粒子を含み、また、「分子」と言った場合には複数の分子及びその均等物を言及する。
の文法的な均等物は、包括的な用語又はオープンエンド(open‐ended)な用語であり、追加の構成要素、列挙していない構成要素、又は追加の方法ステップ、列挙していない方法ステップを排除するものではなく、より限定的な用語「〜からなる」及び「本質的に〜からなる」を包含する。
加後、又は、塩基性分子によってこの水のpHが変化する場合、このpHをpH6〜7に調節すべきである。第1のフェーズの溶液は、タンパク質の溶解を促進するために、プローブ超音波(probe sonication)によって処理され得る。
サイズのナノ粒子を得るためには約pH6.8から約pH7.4の間であることが好ましい。pHがこの範囲の外側にある場合、粒子サイズはより大きくなる傾向があり、また、製造される粒子の多分散指数(PDI)はより高くなる。PDIは、異なるサイズ範囲の粒子の分布の評価基準である。それ故、本方法は、ゼインの等電点の付近の約6.8〜約7.4の選択されたpHを有する水アルコール溶液及び水性溶液において、例えばゼインなどのタンパク質の溶解度の違いを利用し得る。
、或いは、例えば卵レシチン、大豆レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、1,2‐ジオレイル‐3‐トリメチル・アンモニウム・プロパンなどのリン脂質を含む。
、硬い固形物を形成するために−80°Cに保持され得、この固形物はその後、例えば高真空下において凍結状態でナノ粒子を乾燥させることによって凍結乾燥される。超音波エネルギーの期間、界面活性剤の種類、界面活性剤の濃度、及びバッファーは様々であり得る。
第1の水性フェーズでは、0.0135gの白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの水との混合物に溶解された。ゼインの濃度又は使用される溶媒の組合せは、最適であった;しかしながら、望まれる別のサイズ範囲のナノ粒子を、ゼインの濃度又は溶媒の組成を変更することで製造することができる。ゼインの溶解は、約20秒間のプローブ超音波の適用で促進された。結果として得られる第1の水性フェーズの溶液は、その後、10秒のパルス・オンタイムと1秒のパルス・オフタイムを有する10分間の超音波エネルギー(1.39kW/h,振幅37%)の一定した適用の下で、pH7.4のクエン酸バッファーと、レシチン(0.45%w/v)及びPluronicR F68(0.9%w/v)の組み合わせとの溶液15mlへと滴下された。超音波剪断処理の間、その温度を約10°Cに維持するために、この分散系は氷浴に保持された。この分散系は、その後、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、300rpm〜500rpmの間で磁気撹拌器に置かれた。エタノールの完全な揮発の後、ナノ粒子は残留物及び/又は界面活性剤を除去するために精製された。精製は、脱イオン化したpH7.4のクエン酸バッフ
ァーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。結果として得られるゼインのナノ粒子の水性懸濁液(pH7.4のクエン酸バッファー)の4mlに対して、抗凍結剤として2%w/vのトレハロースが加えられ、その後、ナノ粒子は、硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この材料は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。ナノ粒子は、その後、10°Cの冷蔵室内のデシケーター(dessicator)中に保存された。
或る量の0.65%w/v白色ゼインが、6mlのエタノールと、0.50mlの水との混合物に溶解された。結果として得られる第1の水性フェーズの溶液の組成は、所望の約pH6から約pH7を得るために変更された。ゼインの溶解は、約20秒間のプローブ超音波の適用によって促進された。結果として得られる第1の水性フェーズの溶液は、その後、10秒のパルス・オンタイムと1秒のパルス・オフタイムを有する2分間の超音波エネルギー(1.39kW/h,振幅37%)の一定した適用の下で、pH7.4を有するクエン酸バッファーと、レシチン(0.45%w/v)及びPluronicR F68(0.9%w/v)の組み合わせとの溶液30mlへと滴下された。超音波剪断処理の期間中、この分散系は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。結果として得られる粗懸濁液は、その後、20,000psiで5分間、0.1mmから0.25mmの間の開口部サイズを有する高圧ホモジナイザー(Nano DebeeR、USA)に通された。高圧ホモジナイゼーション処理の期間中、冷却装置を用いて高圧ホモジナイザー内に水を循環することで温度が約10℃に維持される。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで保持された。完全に揮発した後、ナノ粒子は残留物又は界面活性剤を除去するために精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。ナノ粒子の4ミリリットルの水性懸濁液(pH7.4クエン酸バッファー)は、35mgの2%w/vトレハロースと混合され、硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この固形物は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
0.0135gの量の白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの0.01N
NaOHとの混合物に溶解され、pH6からpH7の間に調節された。この溶液には、0.0066gの6,7‐ヒドロキシクマリンが加えられ、その後、この混合物は溶解を保証するために20秒間のプローブ超音波処理にかけられた。結果として得られる溶液は、10秒のパルス・オンタイムと、1秒のオフタイムとを有する10分の間、1.39kW/h及び振幅37%の一定した超音波エネルギーの下で、0.0675gのレシチンと
0.135gのPluronicR F68とを含む15mlのクエン酸バッファー(pH7.4)へと滴下された。超音波処理の期間中、この溶液は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコールの完全な揮発後、ナノ粒子は余分な薬及び/又は界面活性剤を除去するために精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。クマリンがロードされたナノ粒子の4ミリリットルの水性懸濁液(pH7.4クエン酸バッファー)は、35mgのトレハロースが加えられ、硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この固形物は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
るナノ粒子を製造する、及び製造している可能性がある。上記の実施例2に記載されるように、超音波剪断の部分が高圧ホモジナイゼーションと取り替えられた場合、結果として得られるブランクナノ粒子の粒径はまた、上記した表2に示される粒径と似たようなものとなる(即ち、約220±15nmの粒径と0.4±0.07のPDIを有する)。
0.0135gの量の白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの水との混合物に溶解された。第1の水性フェーズのこの溶液に、0.001gのドキソルビシン塩酸塩が加えられ、そして、この混合物はドキソルビシン塩酸塩を溶解するために20秒間のプローブ超音波にかけられた。結果として得られる溶液は、10秒のパルス・オンタイムと、1秒のオフタイムとを有する10分の間、1.39kW/h及び振幅37%の一定した超音波エネルギーの下で、0.0675gのレシチンと0.135gのPluronicR F68を含む15mlのクエン酸バッファー(pH7.4)へと滴下された。超音波処理の期間中、この溶液は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコールが完全に揮発した後、このナノ粒子は残留物を除去するために精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーを用いて、及び分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心にかけて、繰り返し洗浄することによって達成された。ドキソルビシンのナノ粒子の水性懸濁液(pH7.4クエン酸バッファー)に、35mgのトレハロースが加えられ、そして、この混合物は硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この材料は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
0.0135gの量の白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの水との混合物に溶解された。このゼインの溶液に、FITCでラベルされたデキストラン(Mwt4000Da)を0.003g加え、そして、デキストラン‐FITCはこの溶液に溶解された。結果として得られる溶液は、10秒のパルス・オンタイムと、1秒のオフタイムとを有する10分の間、1.39kW/h及び振幅37%の一定した超音波エネルギーの下で、0.0675gのレシチンと0.135gのPluronicR F68とを含む15mlのクエン酸バッファー(pH7.4)へと滴下された。超音波処理の期間中、この溶液は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。続いて、この分散系は、
エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコール溶媒が完全に揮発した後、ナノ粒子は残留物を除去するために精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gでの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。デキストラン‐FITCがロードされたナノ粒子の水性懸濁液(pH7.4クエン酸バッファー)に、35mgのトレハロースが加えられ、そして、この混合物は硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この材料は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
0.0135gの量の白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの水との混合物に溶解された。このゼインの溶液に0.187μgのpDNA GFP(緑色蛍光タンパク質)を加え、このpDNA GFPはこのゼインの溶液に溶解された。結果として得られる溶液は、10秒のパルス・オンタイムと、1秒のオフタイムとを有する10分の間、1.39kW/h及び振幅37%の一定した超音波エネルギーの下で、0.0675gのレシチン、0.135gのPluronicR F68、及び7.5mMのCaCl2を含む15mlのクエン酸バッファー(pH7.4)へと滴下された。超音波処理の期間中、この溶液は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコール溶媒が完全に揮発した後、過剰な薬及び界面活性剤を除去するために、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用し、50分間、3950gの処理で超遠心することで、ナノ粒子は精製された。2サイクルの超遠心が実行され、ナノ粒子は水で洗浄された。pDNAがロードされたナノ粒子の水性懸濁液に、35mgのトレハロースが加えられ、そして、この混合物は硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この材料は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
経眼経路による配送を含む)によって、ゼインのナノ粒子が万能で安全な薬配送媒体(ドラッグデリバリー媒体)として使用できることを示す。多くの他の分子、粒子、及び薬が同様にカプセル化され得、これらには、治療用途、診断用途、美容用途、又は療法のためのワクチン、化粧用の物質(例えば、ミノキシジル、ビタミンC、など)が、限定されることなく含まれる。
迅速に取り込まれるが、100nm‐400nmのサイズ範囲のゼインのナノ粒子は血液の食細胞によって取り込まれないことを図12のデータは例示する。それ故、より小さいサイズ範囲内にゼインのナノ粒子の粒子サイズを制御することで、食細胞の取り込みが回避されることが示唆され得る。マウスにおける免疫原性の研究は、100nm〜400nmのサイズ範囲のゼインのナノ粒子が非免疫原性であることを示した。その一方で、図13で示されるように、>400nmのサイズを有するゼインのナノ粒子は、対照と比較して深刻な免疫反応(2倍〜4倍)を引き起こす。
は、ドキソルビシン溶液又はドキソルビシンのナノ粒子のいずれかを0.07〜70nM(OVCAR‐3)と、0.1〜10000nM(NCI/ADR‐RES)の濃度で用いて24時間処理された。24時間後に、それぞれの薬処理は取り除かれた。この細胞は、氷で冷やしたリン酸バッファーで2度洗浄され、新しい媒体と交換された。媒体は、48時間おきに交換された。MTT分析は、処置後5日目に細胞毒性を評価するために用いられた(NCI及びOVCAR‐3)。この結果は、ヒトのガン細胞において、ゼインのナノ粒子にロードされたドキソルビシンが遊離したドキソルビシン溶液よりも著しく高い効能を有したことを示す。ドキソルビシンがロードされたナノ粒子は、遊離したドキソルビシンよりも約12〜約16倍高い効能であった。効能の差は、遊離した薬の細胞取り込み機構と、ナノ粒子にカプセル化された薬の細胞取り込み機構の違いに起因すると考えられる。ドキソルビシンがロードされたナノ粒子は能動的なエンドサイトーシス過程で取り込まれるが、遊離したドキソルビシンは濃度勾配によって決まる受動的な拡散によって取り込まれる。更に、ドキソルビシンがロードされたナノ粒子のエンドサイトーシスは、耐性ガン細胞における薬剤排出ポンプを回避することができると考えられており、それ故より良い効能がもたらされる。
ブランクゼインのナノ粒子は、開示したナノ析出方法を使用して調製された。架橋剤は、第2の水性フェーズのプローブ超音波処理以降に加えられた。ナノ粒子は、更に24時間インキュベートされた。インキュベートの終わりに、ナノ粒子は遠心濾過を用いて精製され、その後、凍結乾燥された。
音波処理の期間中、この溶液は温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。この溶液に、25%w/vのグルタルアルデヒドを0.5ml加え、300〜500rpmで撹拌しながら、37°Cで3〜24時間インキュベートした。残存するグルタルアルデヒドは、10%w/vメタ重亜硫酸塩で中和された。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコールが完全に揮発した後、ナノ粒子は残留物を除去するために精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。ナノ粒子の水性懸濁液に、35mgのトレハロースを加え、そして、この溶液は硬い固形物を形成するために−80°Cに保持された。この材料は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
架橋効率%=[a−b/a]×100
ここで、a=非架橋ゼイン対吸光度の傾きであり、また、b=架橋ゼイン対吸光度の傾きである。検量線を作成するために使用されるゼインの濃度範囲は0.357mg/ml〜12mg/mlであり、また、相関係数は0.9994である。
0.0135gの量の白色ゼインは、3mlのエタノールと0.25mlの水(0.25ml)との混合物に溶解された。この第1の水性の溶液に0.005gのローダミン‐123が加えられた。結果として得られる溶液は、10秒のパルス・オンタイムと、1秒のオフタイムとを有する10分の間、1.39kW/h及び振幅37%の超音波エネルギーの一定した適用の下で、0.0675gのレシチンと0.135gのPluronicR F68とを含む、pH7.4のクエン酸バッファー15mlへと滴下された。超音波処理の期間中、この溶液は、温度を約10°Cに維持するために氷浴に保持された。その後、25%w/vのグルタルアルデヒド0.5mlが加えられ、300〜500rpmで撹拌しながら、37°Cで3時間インキュベートされた。残存する架橋剤は、10%w/vメタ重亜硫酸ナトリウムで中和された。続いて、この分散系は、エタノールが完全に揮発するまで、室温で、磁気撹拌器に300r.p.m〜500r.p.mで置かれた。アルコールが完全に揮発した後、ナノ粒子は超遠心で精製された。精製は、pH7.4のクエン酸バッファーと、分子量5000Daのカットオフの遠心フィルタを使用する、50分間、3950gの超遠心とを用いて、繰り返し洗浄することによって達成された。ローダミンがロードされたナノ粒子の水性懸濁液(pH7.4のクエン酸バッファー)に、3
5mgのトレハロースが加えられ、そして、この溶液は硬い固形物を形成するために−80°Cに保たれ、この固形物は、その後、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥された。
PEG化ゼインは、5mlの90%エタノール中の白色ゼイン0.1gに、メトキシPEG‐スクシンイミドコハク酸(methoxy PEG‐succinimidyl succinate)(Mwt50
00Da)を0.1g加えることによって製造された。この混合物は、37°Cで3時間から24時間の間インキュベートされた。この溶液は、その後、残留物を除去するために、24時間に亘って室温で磁気撹拌器(100rpmでかき回す磁気撹拌子)において、水に対して透析された(分子量のカットオフ10,000Da)。結果として得られる産物を、その後、−80°Cで凍結した後で、−47°C、真空度60mTorrで12時間〜14時間に亘って凍結乾燥した。様々なインキュベート時間で観察されたPEG化効率が以下の表7に示されており、表7において、効率のパーセンテージは、前述したTNBS分析工程を使用して測定された。他の分子量のPEG(例えば500Daから5000Da)を使用することもできる。同様に、メトキシPEG‐N‐ヒドロキシコハク酸エステル(methoxy PEG‐N‐hydroxyl succinate ester)などのPEG誘導体又は他の誘導体を使用することもできる。
組み込まれるものとし、これらの引用文献には以下が含まれる:
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Claims (8)
- 黄色ゼイン又は白色ゼインを含むナノ粒子内で薬剤をカプセル化して形成したナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子は400nm未満の直径サイズを有し、前記組成物は前記ゼイン、界面活性剤、リン脂質、及び前記薬剤を含み、リン脂質の濃度がゼインの濃度よりも大きいことを特徴とする組成物。
- 病気又は疾患を患う、或いは患う危険性のある被検体における、病気又は疾患の治療に使用するための薬剤を製造するための治療用組成物であって、400nm未満の直径サイズを有し、且つ 治療剤を含む非免疫原性ナノ粒子を薬理学的に治療効果のある量で含む治療用組成物であって、
前記ナノ粒子は白色ゼイン、リン脂質、及び界面活性剤を含み、リン脂質の濃度がゼインの濃度よりも大きいことを特徴とする治療用組成物。 - 選択された量の選択された等級のゼインであって、前記選択された等級のゼインは白色ゼイン又は黄色ゼインであり;
前記等級のゼインを溶解するための水アルコール溶媒;
少なくとも1つの緩衝剤;
選択された界面活性剤;
前記選択された界面活性剤と組み合わせて選択された比率を与える量の少なくとも1つの選択されたリン脂質;
を含む非免疫原性のナノ粒子であって、
前記ナノ粒子の直径は約400nm未満であることを特徴とする非免疫原性のナノ粒子を製造するためのキット。 - 前記界面活性剤と前記リン脂質の比率は2:1である請求項3に記載のキット。
- 前記緩衝剤がクエン酸バッファーであることを特徴とする請求項3に記載のキット。
- 前記界面活性剤がポロキサマーであることを特徴とする請求項3に記載のキット。
- 前記リン脂質がレシチンであることを特徴とする請求項3に記載のキット。
- 前記水アルコール溶媒がエタノールを含むことを特徴とする請求項3に記載のキット。
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