CN102066399B - 形成非免疫原性疏水蛋白纳米颗粒的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于通过控制纳米沉淀过程中的pH来从蛋白源产生非免疫原性纳米颗粒的方法。由所公开的方法产生的纳米颗粒的直径尺寸在约100nm至约400nm的范围，且优选的直径尺寸是约100nm至约300nm，由此使颗粒为非免疫原性的。本发明还公开了用于产生适于各种治疗、诊断和其他用途的纳米结合物的方法。

Description

形成非免疫原性疏水蛋白纳米颗粒的方法及其用途
技术领域
本发明涉及形成纳米颗粒的方法，且具体涉及由基于不溶于水的疏水蛋白的聚合物形成纳米颗粒以产生用于药物、治疗和诊断应用中的非免疫原性递送系统的方法。 
背景 
本文中讨论的参考文献仅仅是为了描述与本发明有关的领域而提供的。本文中没有内容应被解释为承认发明人没有资格通过现有发明来预测公开内容。 
玉米醇溶蛋白(zein)是从玉米或玉蜀黍(maize)分离的植物蛋白且属于醇溶谷蛋白类，醇溶谷蛋白类包括大量的疏水性氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。玉米醇溶蛋白是澄清的、无味的、无毒的、可生物降解的和不溶于水的。玉米醇溶蛋白已经被研究且在药品、医疗、食品、化妆品、粘合剂和包装行业中用作聚合物。 
在食品和药品行业，玉米醇溶蛋白已经用于如膜涂覆材料且用于形成颗粒体系，诸如微粒或纳米颗粒[1-5]。已经提出了形成玉米醇溶蛋白颗粒的多种方法。例如，美国专利5,330,778讨论了使用玉米醇溶蛋白来制备微粒的方法，并采用pH调节来形成玉米醇溶蛋白微粒[6]，该专利的内容并入本文。然而，美国专利5,330,778中描述的方法产生了具有较大的微米尺寸且具有宽的粒度分布的玉米醇溶蛋白颗粒，这于例如体内应用具有显著的缺陷。 
重要的是确保用于人类或动物应用的生物材料是安全的和非免疫原性的。一般而言，当体内施用(如，引入体内)颗粒时，血液和组织内的负责免疫识别和去除外来颗粒的吞噬细胞可以根据颗粒的物理化学特性来引发免疫应答。吞噬细胞的摄取取决于外来颗粒的粒度和表面疏水性。一般而言，直径尺寸范围大于约500nm的颗粒是易于吞噬的。具有疏水性表面的颗粒易于被吞噬细胞识别[7]。例如，Lopez和Murdan[8]最近报道了直径为1.36±0.036μm的玉米醇溶蛋白微球是免疫原性的，且因此不适于作为药物、疫苗或其他治疗载体。 
发明概述 
本发明提供一种产生非免疫原性纳米颗粒的方法，包括：提供不溶于水的疏水蛋白；用水醇溶剂溶解所述蛋白以提供第一水相溶液；在表面活性剂和磷脂存在下，将缓冲剂添加到所述第一水相溶液中以产生具有在约pH6.8至约pH7.4之间的pH的第二水相溶液；处理所述第二水相溶液以实现所述第二水相溶液内颗粒的直径尺寸的减小；蒸发任何残余溶剂以产生具有小于约400nm的直径尺寸的纳米颗粒；以及离心所述纳米颗粒。 
所述方法还可包括在离心之后，冻干所述纳米颗粒。所述方法还可包括在限制所述纳米颗粒暴露于大气压的条件下储存所述纳米颗粒。 
在本发明的方法中，所述不溶于水的疏水蛋白可以是选定级的玉米醇溶蛋白。所述选定级的玉米醇溶蛋白可以是白玉米醇溶蛋白。 
在本发明的方法中，所述缓冲剂可以是柠檬酸盐缓冲液。所述表面活性剂可以是泊洛沙姆且所述磷脂可以是卵磷脂。所述表面活性剂与所述磷脂的比率可以是2∶1。 
所述处理所述第二水相溶液以实现颗粒的直径尺寸的减小还可包括使所述纳米颗粒经受超声剪切、高压均化或其组合。 
本发明的方法还可包括在形成所述第一水相溶液时向所述蛋白中添加被选择用于纳米颗粒包封的分子。所述分子可以是被选择用于施用至受试者的治疗物质。所述方法还可包括将所述纳米颗粒施用至患者。所述蛋白可被聚乙二醇化。 
本发明的方法还可以包括交联所述纳米颗粒。所述纳米的施用可以是通过口服、胃肠外、静脉内、腹膜内、皮下、局部、鼻或眼部施用途径。 
本发明还提供一种治疗活性的非免疫原性纳米颗粒，所述纳米颗粒是通过如下方法形成的：提供不溶于水的疏水蛋白；用水醇溶剂溶解所述蛋白以提供第一水相溶液，并且在形成所述第一水相溶液时向所述蛋白中添加被选择用于纳米颗粒包封的分子；在表面活性剂和磷脂存在下，将缓冲剂添加到所述第一水相溶液中以产生具有在约pH6.8至约pH7.4之间的pH的第二水相溶液；处理所述第二水相溶液以实现所述第二水相溶液内颗粒的直径尺寸的减小；蒸发任何残余溶剂以产生具有小于约400nm的直径尺寸的纳米颗粒；以及离心所述纳米颗粒。 
本发明还提供一种治疗组合物，所述治疗组合物包含通过将治疗分子包封在不溶于水的疏水蛋白中而形成的非免疫原性纳米颗粒，所述纳米颗粒具有小于约400nm的直径尺寸。 
在所述治疗组合物中，所述纳米颗粒的所述直径尺寸在约100nm至约300nm之间。 
本发明还提供包括药理学上治疗量的含有治疗剂的非免疫原性纳米颗粒的物质在制备用于治疗罹患疾病或疾患或处于罹患疾病或疾患的风险的受试者的疾病或疾患的药物中的用途，其中所述纳米颗粒具有小于400nm的直径尺寸。其中所述纳米颗粒可具有约100nm至约300nm的直径尺寸。 
本发明还提供一种用于产生非免疫原性纳米颗粒的试剂盒，所述试剂盒包括：选定量的不溶于水的蛋白；水醇溶剂，其用于溶解所述蛋白；至少一种缓冲剂；以及选定的表面活性剂。所述试剂盒还可包括以提供与所述选定的表面活性剂组合的选定比率的量的至少一种选定的磷脂。 
在本公开内容的一个方面，本发明通常涉及一种用于产生非常小的颗粒或纳米颗粒的方法。该颗粒可以由不溶于水的疏水蛋白形成，包括例如玉米醇溶蛋白。 
在本公开内容的另一个方面，方法用于产生减少或基本上克服了在使用大尺寸纳米颗粒或微粒，包括由例如不溶于水的疏水蛋白形成的那些颗粒时经历的免疫原性的纳米颗粒。通过控制由本方法形成的颗粒的尺寸以及粒度范围实现了根据本发明的方法制备的纳米颗粒的非免疫原性效应。 
在本发明的一些实施中，颗粒直径尺寸的范围小于约400nm。在本发明的优选的实施中，颗粒直径尺寸的范围小于约300nm，且在一些另外的实施中，颗粒直径尺寸的范围是约100nm至约300nm。虽然此公开内容中是就直径来讨论尺寸的，但是这不应该被解释为意味着本文中所讨论的纳米颗粒优选是球形形状，虽然可以获得球形形状的纳米颗粒。应该理解，本文所公开的尺寸可以简单地在颗粒的相对侧之间进行测量，或横跨颗粒的相对侧的最大尺寸。 
在本发明的一个方面，可以使用可由包括植物、动物或合成来源的多种来源获得的不溶于水的疏水蛋白来实施本发明的方法。在多个方面，可以用醇溶谷蛋白类来实施本方法，醇溶谷蛋白类包括大量的疏水性氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。这些疏水性氨基酸使蛋白是不溶于水的。醇溶谷蛋白可以存在于各种谷物中，诸如玉米、小麦、大麦、稻米、高粱以及其他植物和动物来源中。合适的醇溶谷蛋白的一些示例是玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，虽然本方法的 应用不必不限于这些示例。为了此描述的目的，且仅仅作为本发明的一种示例性的阐释，本文中使用玉米醇溶蛋白仅通过示例的方式描述本方法。 
在本方法的多个实施中，白玉米醇溶蛋白用于产生在约100nm至约400nm的期望的直径尺寸范围内的纳米颗粒。还发现使用黄玉米醇溶蛋白可以产生具有相对较大的直径尺寸的颗粒，且还可以产生具有较宽的颗粒直径尺寸分布的颗粒。认为，黄玉米醇溶蛋白中的色素可以影响黄玉米醇溶蛋白的溶解度和使用黄玉米醇溶蛋白的纳米颗粒形成。 
本发明的方法比其他可能的方式产生具有大体上更小的直径尺寸和更窄的直径尺寸范围的纳米颗粒。通过使用一种或多种特定级的基础蛋白(base protein)诸如玉米醇溶蛋白来实施pH控制的纳米沉淀(nanoprecipitation)过程以及通过使用被选择以获得为纳米颗粒提供非免疫原性的纳米尺寸和直径的缓冲液、表面活性剂和磷脂的不同组合获得了这些较小的纳米颗粒。 
本公开内容的方法进一步适合于制备具有变化的物理化学性质的多种分子、颗粒或试剂的纳米颗粒，以形成具有纳米颗粒的包封的、吸收的、复合的或结合的材料。例如，该方法可以用于捕获小的亲水性分子、小的疏水性分子和大分子。在这些实例的每一个中，可以获得约60％至约80％的包封效率。根据本发明形成的纳米颗粒可以能够在体外或体内环境中提供高达一周或可能更长的包封分子(encapsulated molecule)的持续递送。 
在本发明的一个方面，方法用于产生治疗性和/或诊断性的纳米颗粒，如包含抗癌剂的纳米颗粒。这样的纳米颗粒可以提供活性剂的靶向递送和释放的时间控制，活性剂通常是治疗剂，诸如小分子药物、核酸、蛋白、疫苗、抗体、化学试剂或其他试剂或物质。除了所描述的治疗方法外，本发明提供了用于产生具有诊断部分的纳米颗粒的方法，所述诊断部分如成像剂、探针以及类似物。 
在本发明的另一个方面，提供了一种用于根据本发明的方法制备纳米颗粒的试剂盒。该试剂盒包含选定量的水溶蛋白、至少一种缓冲剂和至少一种表面活性剂。该试剂盒还可以包括水醇溶剂(hydroalcoholic solvent)。该试剂盒还可以包括至少一种磷脂，可以选择磷脂的量以提供磷脂与表面 活性剂的选定比率。 
附图简述 
图1通过流程图图示了根据本发明的方法形成空白的(blank)玉米醇溶蛋白纳米颗粒的一般步骤。 
图2通过流程图图示了根据本发明形成负载6，7-羟基香豆素的纳米颗粒的步骤。 
图3描绘了玉米醇溶蛋白纳米颗粒的不同的电子显微镜的显微照片。图3(a)是空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的扫描电子显微照片。颗粒显示为是球形的且具有光滑的表面。(比例尺代表1mm＝1.76μm。)图3(b)是空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的透射电子显微照片。(比例尺代表1mm＝8.038nm。)图3(c)是负载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的扫描电子显微照片。(比例尺代表1mm＝0.87μm。)图3(d)是负载6，7-羟基香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的透射电子显微照片。(比例尺代表1mm＝8.04nm。) 
图4描绘了根据本发明的方法的在空气中以轻敲模式(tapping mode)产生的空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。从左到右是代表性样品的高度、幅度和相的图像，且分别是14.19nm的z刻度、22.2V和45°。扫描尺寸(scan size)是1.14×1.14μm。以AFM测得50个颗粒的平均粒度是185nm。 
图5是图示了在冻干之前和之后，缓冲液类型对根据本发明的方法制备的负载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒度的影响的图。与使用磷酸盐缓冲液相比，在本发明的沉淀法中使用柠檬酸盐缓冲液在冻干之后总是产生较小尺寸的纳米颗粒。(*p＜0.05)。图上的每一个点表示平均±SD(n＝3)。柠檬酸盐缓冲液包括去离子水中的柠檬酸(0.0153g/L)和柠檬酸钠(2.91g/L)。磷酸盐缓冲液包括去离子水中的磷酸氢二钠(1.44g/L)、磷酸二氢钾(0.25g/L)和氯化钠(10g/L)。根据本发明，两种缓冲液都用于将第二水相维持在pH 7.4。 
图6通过流程图图示了本发明的用于制备负载阿霉素的纳米颗粒的方法的一般步骤。 
图7图示了由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中的负载6，7-羟基香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线。将由本发明的方法制备的负载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(10mg/ml)置于透析膜(SpectraporTM，5000道尔顿分子量)内且在胰蛋白酶(10mg/ml)不存在(非酶促)或存在(酶促)下孵育在由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中。向介质中添加乙醇(20％v/v)以维持沉降条件，且叠氮化钠(0.005％w/v)用作抗菌剂。使溶液在50rpm的水平振荡器水浴内保持在37℃。在7天内的不同时间点去除等份(1ml)的透析液并用新鲜介质替换以保持沉降条件。使用荧光分光光度术(λ激发＝490nm；λ发射＝520nm)来分析透析液中的从玉米醇溶蛋白纳米颗粒释放的香豆素。每一个数据点是三次实验的平均值(±SD)。在所有时间点处，酶促释放都比非酶促释放高(p＜0.05)。 
图8图示了阿霉素自由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线。由本发明的纳米沉淀方法制备的负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(10mg/ml)被孵育在离心管内1ml的由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中且使溶液在50rpm的水平振荡器水浴内保持在37℃。以10,000rpm离心样品10分钟且使用HPLC来分析上清液中的从纳米颗粒释放的阿霉素。使用A C-18柱且流动相(流速1ml/min)是0.1％的TFA∶乙腈(使用5％至80％的乙腈梯度)。荧光检测器(λ激发＝505nm；λ发射＝550nm)用于检测阿霉素。释放研究进行至多4天。每一个数据点是三次实验的平均值(±SD)。 
图9通过流程图图示了用于制备负载葡聚糖-FITC(氟代异硫氰酸酯)的纳米颗粒的本发明方法的一般步骤。葡聚糖的分子量是4000道尔顿。 
图10图示了葡聚糖-FITC自由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线。由本发明的方法制备的负载葡聚糖-FITC的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(10mg/ml)被孵育在离心管内1ml的由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中且在50rpm的水平振荡器水浴内保持在37℃。以10,000rpm离心样品10分钟且使用荧光分光光度术(λ激发＝490nm； λ发射＝520nm)来分析上清液中的从纳米颗粒释放的葡聚糖-FITC。研究进行8天。每一个点表示平均值±SD(n＝3)。 
图11通过流程图图示了本发明的用于制备负载质粒DNA的纳米颗粒的方法的一般步骤。使用生长在LB培养基中的大肠杆菌的DH5α菌株来扩增在本研究中使用的编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA(pDNA)。使用Qiagen的“无内毒素质粒大提试剂盒(EndoFree Plasmid Mega Kit)”来分离质粒。使用UV分光光度计，通过计算260nm/280nm的UV吸光度的比率来表征纯化的pDNA且还通过琼脂糖凝胶电泳来表征纯化的pDNA。 
图12图示了粒度对猪多形核细胞吸收玉米醇溶蛋白纳米颗粒的影响。该图显示了在玉米醇溶蛋白颗粒存在下鲁米那化学发光(luminalchemiluminescence)(超过90分钟)和阳性对照酵母聚糖的曲线下的面积百分比。每一个实验是四次实验的平均值(±SEM)。与其他组相比，吸收在较小粒度时是显著低的(p＜0.05)。 
图13图示了分别在玉米醇溶蛋白颗粒的初次和追加皮下注射的第三周和第五周之后所测得的抗玉米醇溶蛋白抗体(光密度)。每一个值表示平均值±SEM(n＝4)。与盐水组相比，初次和追加滴定度在统计学上并不显著(p＞0.05)。盐水中的粗玉米醇溶蛋白悬浮液或玉米醇溶蛋白颗粒(等同于100μg/50μl)被皮下注射在雌性Balb/c小鼠内。从眼血管丛抽取血液并使用小鼠ELISA试剂盒来测量稀释的血清(1/16)中的抗玉米醇溶蛋白抗体的水平。 
图14是图示了黄玉米醇溶蛋白(Y)和白玉米醇溶蛋白(W)对在使用二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)测定的处理4小时后，由线粒体脱氢酶的相对活性表达的猪的肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)(20,000细胞/孔)的细胞存活率的影响的图。未经任何处理的板用作对照且被认为是100％存活的。将玉米醇溶蛋白粉末溶解在55％v/v乙醇中且随后由不含血清的培养基中的5mg/ml的原料进行稀释。在所有浓度下，黄玉米醇溶蛋白和白玉米醇溶蛋白与未经处理的对照没有显著不同(p＜0.05)。每一个数据点是三次实验的平均值±SEM。 
图15图示了根据本发明制备的阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白纳米颗粒在OVACAR-3细胞(人类卵巢癌细胞)内的体外细胞毒性曲线。细胞被暴露于0.0001μM至10μM浓度的阿霉素溶液和负载阿霉素的纳米颗粒24小时。24小时后去除药物处理并用空白培养基培养细胞(每48小时更换培养基)5天，并在第5天通过MTT测定测量细胞存活率。每一个数据点是四次实验的平均值。阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白的IC50分别是3.1nM和0.20nM。(Dox＝阿霉素溶液；Dox-NP＝阿霉素纳米颗粒)。 
图16图示了根据本发明制备的阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白纳米颗粒在抗阿霉素人类乳腺癌细胞(NCI/ADR-RES细胞)内的体外细胞毒性曲线。细胞被暴露于0.0001μM至10μM浓度的阿霉素溶液和负载阿霉素的纳米颗粒24小时。24小时后去除药物处理并用空白培养基培养细胞(每48小时更换培养基)5天，并在第5天通过MTT测定测量细胞存活率。每一个数据点是四次实验的平均值。阿霉素溶液和负载阿霉素的纳米颗粒的IC50分别是81.73nM和6.41nM。(Dox＝阿霉素溶液；Dox-NP＝负载阿霉素的纳米颗粒)。 
图17通过流程图图示了本发明的用于制备交联的空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的方法。 
图18是表明24小时内玉米醇溶蛋白纳米颗粒的交联度(extent ofcross-linking)作为交联剂函数的图。采用TNBS测定来确定交联度。所使用的交联剂是GTA-戊二醛(500μl的25％w/v的储备溶液)、EDC：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(0.6％w/v)和NHS：N-羟基琥珀酰亚胺(0.6％w/v)。所使用的京尼平(genipin)的浓度是0.05％w/v。“空白”表示不含任何交联剂的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。数据是两次实验的平均值。 
图19通过流程图图示了本发明的用于制备负载若丹明-123的交联的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的方法。 
图20图示了在pH 7.4的由磷酸盐缓冲的盐水(0.1M)中若丹明-123自玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线。结果表示平均值±SEM(n＝4)。 NCS＝非交联的颗粒；CS＝交联的颗粒。从交联的纳米颗粒的药物释放显著低于非交联的纳米颗粒(p＞0.05)。将由本发明的方法制备的负载若丹明的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(20mg)置于透析膜(SpectraporTM，10,000道尔顿分子量)内并孵育在5ml的由磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)中。使溶液在100rpm的水平振荡器水浴内保持在37℃。在48小时内的不同时间点去除等份(1ml)的透析液并用新鲜介质替换以保持沉降条件。使用荧光分光光度术(λ激发＝485nm；λ发射＝530nm)来分析透析液中的从玉米醇溶蛋白纳米颗粒释放的若丹明。 
图21图示了在胰蛋白酶存在下，在pH 7.4时，若丹明-123自玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线。结果表示平均值±SEM(n＝4)。ENCS＝非交联的颗粒；ECS＝交联的颗粒。从交联的纳米颗粒的药物释放显著地低于非交联的纳米颗粒(p＞0.05)。将由本发明的方法制备的负载若丹明-123的玉米醇溶蛋白纳米颗粒(20mg)置于透析膜(SpectraporTM，10,000道尔顿分子量)内并孵育在5ml的包含205μg/ml的胰蛋白酶的由磷酸盐缓冲的盐水(0.1M，pH 7.4)中。使溶液在100rpm的水平振荡器水浴内保持在37℃。在48小时内的不同时间点去除等份(1ml)的透析液并用新鲜介质替换以保持沉降条件。使用荧光分光光度术(λ激发＝485nm；λ发射＝530nm)来分析透析液中的从玉米醇溶蛋白纳米颗粒释放的若丹明-123。 
图22以流程图图示了用于制备空白的聚乙二醇化(PEGylated)玉米醇溶蛋白纳米颗粒的一般方法。 
图23是图示了聚乙二醇化纳米颗粒的加权尺寸分布的强度的图。聚乙二醇化玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒度是131±1nm，且多分散度指数(PDI)是0.282±0.01。数据还显示了用PEG表面改性玉米醇溶蛋白纳米颗粒并不会增大粒度且显示了纳米颗粒在用于药物递送应用的期望的尺寸范围内。 
优选实施方案的详细描述 
正如本文中使用的，已知术语“纳米颗粒”通常指在至少一个维度不大于1000nm的颗粒。然而，由本发明的方法形成的纳米颗粒将具有如本文定义的规定值的直径。而且，术语“纳米颗粒”的使用还意在在属类上指空白的纳米颗粒和用分子负载且由本发明的方法形成的纳米颗粒。 
正如本文中使用的，除非另外定义(即，图18)，否则“空白的纳米颗粒”指且意指根据本发明的方法形成的不具有与其一起形成或与其结合的选定颗粒、分子或材料的纳米颗粒。 
正如本文中使用的，当在纳米颗粒尺寸上下文中使用时，术语“直径”指用于穿过颗粒的质量中心的线的颗粒的平均线性尺寸。可以提供非球形颗粒的直径的可接受的近似值，如，通过沿坐标系的三个正交轴且其中一个轴与颗粒的最长尺寸对齐，取颗粒厚度的平均值。 
正如本文中使用的，当在纳米颗粒的治疗和诊断用途的上下文中使用时，术语“施用(administered)”或“施用(administration)”指并包括为了例如将治疗剂递送至靶向部位的目的将选定量的纳米颗粒引入体内或体外环境中。 
正如本文中使用的，“体内”意指受试者的身体或身体内，诸如患者的身体或身体内，且包括通过多种方式施用纳米颗粒，这些方式包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、胃肠外、皮下、局部、眼部和鼻的施用途径。 
正如本文中使用的，“体外”意指或指受试者或患者的身体的外部的环境。 
正如本文中使用的，术语“受试者”或“患者”指或意指个体的复杂的生物体，如人类或非人类的动物。 
正如本文中使用的，“玉米醇溶蛋白的等级”指多种类型或形式的玉米醇溶蛋白，包括来源于各种方式的白玉米醇溶蛋白和黄玉米醇溶蛋白，诸如美国专利第5,254,673号中公开的，该专利的内容并入本文[9]。 
正如本文中使用的，术语“治疗剂”和指治疗或医疗功能的类似术语意指所指的分子、大分子、药物或其他物质可以有益地影响受试者的疾病或疾患的引发、过程和/或一种或多种症状且可以与纳米颗粒一起用于制备 治疗疾病或其他疾患的药物。 
正如本文中使用的，术语“生物相容的”意指当由本发明所公开的方法产生的纳米颗粒在体内施用至受试者时，不导致或诱发显著的副作用。可能的副作用的示例包括但不限于过度的炎症和/或过度的或不利的免疫应答，以及毒性。 
正如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文中另外清楚地表示，否则单数形式，如“一(a)”、“一(an)”和“一(the)”包括复数。例如，提及“纳米颗粒”时包括多个这样的纳米颗粒，且提及“分子”时是指多个分子及其等同物。 
正如本文中使用的，“约”或“近似”意指合理地接近或略大于或略小于所述的数或量。 
正如本文中使用的，“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”、“包含(containing)”、“特征为(characterized by)”及其语法上的等同物是包括式的或开放式的术语，它们不排除额外的、未引述的要素或方法步骤，还包括限制性更强的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。 
本发明涉及通过将纳米颗粒的粒度控制在约100nm至400nm的尺寸范围内，且最优选在约100nm至约300nm的尺寸范围内来从不溶于水的疏水蛋白产生非免疫原性纳米颗粒的方法。图1通过流程图图示了由本发明的方法制备非免疫原性纳米颗粒的一般步骤。 
在本方法的初始步骤或阶段中，将不溶于水的蛋白(0.4至1.25％w/v)溶解在可以包含乙醇和去离子水的水醇溶剂中。溶剂的组成可以是，如90∶10％v/v或92∶8％v/v。对其中选定的分子被包封在纳米颗粒中的方法来说，将待包封的分子(0.03至0.3％w/v)添加到此第一水相的溶液中。待包封的分子是蛋白聚合物的约5至50％w/v。 
可以通过添加0.01N NaOH或0.01N HCl改变溶液的pH以使溶液的pH在约pH 6至约pH 7之间。如果在添加诸如香豆素的酸性分子或碱性分子之后，水的pH改变，那么可以将pH调节到pH 6至7。第一相的溶液 可以被探针式超声(probe sonication)处理以有助于蛋白的溶解。 
在本方法随后的步骤中，在超声剪切下，将初始步骤或阶段的水性溶液添加到缓冲剂中。特别优选柠檬酸盐缓冲液。用于第二水相的缓冲剂的选择被认为对在纳米颗粒形成期间保持pH是重要的，且还对随后冻干所形成的纳米颗粒是重要的，正如下文在此公开内容中所描述的。如果不使用缓冲液，或如果使用例如0.1N HCl调节第二水相溶液的pH，那么所产生的颗粒趋于比那些用柠檬酸盐缓冲液产生的大，且颗粒趋于表现较宽的尺寸范围。使用柠檬酸盐缓冲液产生了一些最小的颗粒直径尺寸，诸如约100nm。使用其他缓冲液可以产生约100nm至约300nm的相同或类似的直径尺寸范围内的颗粒，但在冻干步骤之后，使用其他缓冲剂形成的纳米颗粒的尺寸趋于增大2至3倍。 
显著地，第二水相溶液的pH优选在约pH 6.8至约pH 7.4之间以获得纳米颗粒的期望的尺寸。如果pH在此范围之外，那么粒度趋于变大，且所产生的颗粒的多分散度指数(PDI)更高。PDI是颗粒在不同尺寸范围内的分布的量度。因而，该方法可以利用诸如玉米醇溶蛋白的蛋白在水醇溶液和具有约6.8至约7.4的接近玉米醇溶蛋白的等电点的选定pH的水性溶液中的溶解度差异。 
而且，向第二水相溶液中添加缓冲剂可以在高超声剪切下或在高压均化下，或超声剪切和高压均化的组合下进行。超声能和超声剪切的时长对形成在期望的直径尺寸范围内的颗粒可能是特别重要的。超声剪切能可以从0.6kW/h至1.39kW/h进行，持续约2至10分钟的时长且用有5至10秒钟作用时间和1至5秒钟间隔时间的脉冲。超声处理对产生在期望的尺寸范围内的颗粒可能是重要的。当采用高压均化时，该过程可以使用0.1mm至0.25mm之间的孔径，且在5000至40,000psi的压力下持续5至10分钟的时间段来进行。 
第二相的缓冲剂还可以优选包含以选定比率的表面活性剂和磷脂。表面活性剂对磷脂的比率可以是约2∶1％w/w，该比率可以被认为产生最期望的结果。该比率还可以是1∶0.5％w/w或1∶1％w/w或1∶2％w/w。显著地，表面活性剂与磷脂的组合的使用是高度期望的以使所产生的颗粒稳定并 有助于防止颗粒的聚集(aggregation)。仅通过举例，表面活性剂可以是泊洛沙姆，诸如 F68，且磷脂可以是卵磷脂。可以在本方法中使用的其他表面活性剂包括其他非离子型表面活性剂，诸如泊洛沙姆 、聚氧乙烯烷基酯(Brij)、脱水山梨醇酯(Span)、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(Tween)以及离子型表面活性剂，诸如琥珀酸二辛酯磺酸钠(sodium dioctyl sulfosuccinate)、十二烷基硫酸钠、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、正十二烷基三甲基溴化铵，以及聚合物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。可以在本方法中使用的其他磷脂包括非离子型和带电的脂质或磷脂，诸如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷。 
已经发现以选定比率(如，0.9％w/w∶0.45％w/w)的泊洛沙姆和卵磷脂的组合产生在约100nm至约300nm的期望的直径尺寸范围内的纳米颗粒。已经通常发现单独使用表面活性剂或磷脂导致在该期望的直径尺寸范围之外的较大的粒度。然而，根据本文所公开的方法使用表面活性剂或磷脂将会导致具有对于非免疫原性来说期望的尺寸的纳米颗粒。 
在向第二相的溶液应用超声剪切和/或高压均化之后，可以搅拌混合物以蒸发乙醇或其他溶剂以形成纳米颗粒。搅拌可以通过机械搅拌器来进行，且可以在室温下以约300rpm至约500rpm的速率进行约三个小时。 
然后，纳米颗粒可以优选为了将纳米颗粒与残余物质分离的目的经受超离心过滤。可以使用截留分子量约5000道尔顿的离心过滤器(或其他合适的具有高于或低于5000道尔顿的截留分子量的过滤器)来进行超离心，且以2000g至40000g之间，取决于包封的分子或药物，或取决于纳米颗粒的特定处理，诸如聚乙二醇化。超离心的时间可以在20分钟至50分钟之间变化。 
然后，可以向纳米颗粒中添加低温防护剂。例如，可以添加2％w/v的海藻糖作为低温防护剂。还可以使用其他低温防护剂或冻干防护剂，诸如糖，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、聚蔗糖、甜菜碱或甘露醇，或多元醇，诸如甘露醇、山梨糖醇可以用作冻干防护剂。纳米颗粒可以保持在-80℃以形成固体饼，固体饼随后被冻干，诸如通过在高真空下干燥冷冻态的纳米颗 粒。可以改变超声能的时长、表面活性剂的类型、表面活性剂的浓度以及缓冲液。 
以示例的方式，具有约100nm至约400nm的尺寸范围分布的纳米颗粒按照下述来制备： 
实施例I
在第一水相中，将0.0135g的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水的混合物中。所使用的玉米醇溶蛋白的浓度或溶剂的组合是任选的；然而，通过改变玉米醇溶蛋白的浓度或溶剂的组成可以产生期望的不同尺寸范围的纳米颗粒。通过应用探针式超声处理约20秒钟辅助玉米醇溶蛋白溶解。然后，将第一水相的所得到的溶液逐滴添加到pH为7.4的柠檬酸盐缓冲液和卵磷脂(0.45％w/v)与 F68(0.9％w/v)的组合的15ml溶液中，施加恒定的超声能(1.39kW/h，37％振幅)作用10分钟，用10秒钟的作用时间和1秒钟的间隔时间的脉冲。在超声剪切过程期间，将分散液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，将分散液在室温下置于300至500rpm的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。在乙醇完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除任何残余材料和/或表面活性剂。通过用去离子的pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器以3590g超离心50分钟来实现纯化。向所得到的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加2％w/v海藻糖作为低温防护剂并将纳米颗粒保持在-80℃下以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该材料12至14小时。然后，将纳米颗粒储存在干燥器中的10℃的冷藏室内。 
在本发明的可选择的方法中，可以通过高压均化器，使分散液在高压作用下穿过狭窄的孔以便减小粒度来补充或替代第二相溶液的超声剪切。当使用高浓度的玉米醇溶蛋白时，这对产生较小尺寸范围的纳米颗粒是特别有用的。而且，高压均化可以用作用于制备玉米醇溶蛋白纳米颗粒的放大方法。下面描述该方法的一个实施例。 
实施例II
将0.65％w/v的白玉米醇溶蛋白溶解在6ml乙醇与0.50ml水的混合物中。改变所得到的第一水相的溶液的组成以获得约pH 6至约pH 7的期望pH。通过应用探针式超声处理约20秒钟辅助玉米醇溶蛋白溶解。然后，将所得到的第一水相的溶液逐滴添加到pH为7.4的柠檬酸盐缓冲液和卵磷脂(0.45％w/v)与 F68(0.9％w/v)的组合的30ml溶液中，恒定地施加超声能(1.39kW/h，37％振幅)作用2分钟，用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲。在超声剪切过程期间，将分散液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，使所得到的粗悬浮液在20,000psi下通过具有0.1mm至0.25mm之间的孔径的高压均化器(Nano ，USA)5分钟。在高压均化过程期间，通过在高压均化器内使用冷却器来循环水使其温度保持在约10℃。随后，将分散液保持在300r.p.m至500r.p.m的磁力搅拌器上且在室温下，直到乙醇完全蒸发。在完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除任何残余材料或表面活性剂。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器以3590g超离心50分钟来实现纯化。将纳米颗粒的4毫升的水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)与35mg的2％w/v海藻糖混合，并将其保持在-80℃下以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该饼12至14小时。 
实施例I和II中所描述的本发明的方法可以适合形成其中诸如治疗药物的选定分子被包封在纳米颗粒内(图2)的纳米颗粒。本发明的用于形成包封分子的纳米颗粒的方法的实施例如下： 
实施例III
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml的0.01NNaOH的混合物中以将pH调节在6至7之间。向溶液中添加0.0066g的6，7-羟基香豆素并使混合物经受探针式超声处理20秒钟以确保溶解。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将所得到的溶液逐滴添加到15ml的包含0.0675g卵磷脂和0.135g F68的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，将分散液置于300r.p.m至500r.p.m的磁力搅拌器上且在室温下，直到乙醇 完全蒸发。在醇完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除任何过量的药物和/或表面活性剂。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器以3590g超离心50分钟来实现纯化。向负载香豆素的纳米颗粒的4毫升水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加35mg海藻糖并将其保持在-80℃下以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该固体饼12至14小时。 
已经显示出白玉米醇溶蛋白可以合适地用在本发明的方法中作为基础蛋白。白玉米醇溶蛋白得到了可重复的在约100nm至约400nm的期望的窄尺寸范围内的纳米颗粒，而黄玉米醇溶蛋白得到了具有较宽粒度分布的较大的颗粒。此差异阐释在下面的表1和表2中。表1提供了根据上面的实施例I和实施例III的方法的由黄玉米醇溶蛋白制备的纳米颗粒的数据。显示了空白的和负载香豆素的纳米颗粒。可以看出，每一种的粒度分别是约460nm和610nm。通过比较，如下面的表2所示，根据实施例I和实施例III的方法的由白玉米醇溶蛋白制备的空白的和负载香豆素的纳米颗粒是较小的。图3和4显示了空白的和负载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的电子显微图像和原子力图像。 
表1. 
每一个值是三次实验的平均值且具有±SD。 
表2. 
每一个值是三次实验的平均值且具有±SD。 
黄玉米醇溶蛋白中的色素似乎影响玉米醇溶蛋白的溶解度和具有期望的粒度分布的纳米颗粒的形成。现有技术已经发现使用天然聚合物诸如蛋白来制备始终在期望的尺寸范围内的颗粒受到特别的挑战。然而，本发明使用合适等级的蛋白诸如白玉米醇溶蛋白可以产生始终在期望的尺寸范围内的纳米颗粒。 
显著地，本发明的方法可以产生且已经产生了具有低至80nm至100nm的直径尺寸的纳米颗粒。如果一部分超声剪切被高压均化替换，正如上面的实施例II描述的，那么所得到的空白的纳米颗粒的粒度也相似于上面的表2所显示的粒度，即具有约220±15nm的粒度和0.4±0.07的PDI。 
已经发现由本发明的纳米沉淀方法产生的在期望的尺寸范围内的纳米颗粒的收率大于约60％。该方法是重要的，因为所产生的颗粒具有主要测得在小于约400nm的范围内的直径，且优选具有约100nm至约300nm的相对窄的直径尺寸分布以便当施用至体内时避免免疫原性反应。有利地是，当使用猪血在体外测试时，在约100至约400nm的直径尺寸范围内的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，诸如由本发明的方法产生的，并不被吞噬细胞摄取，而具有大于约400nm的直径尺寸的较大的颗粒迅速地被吞噬细胞摄取。这表明通过将玉米醇溶蛋白纳米颗粒的直径尺寸控制在较小的尺寸范围内避免纳米颗粒吞噬作用。 
小鼠的免疫原性研究显示出在约100nm至约400nm的直径尺寸范围内的玉米醇溶蛋白纳米颗粒是非免疫原性的，而具有大于约400nm的直径尺寸的玉米醇溶蛋白纳米颗粒产生了显著的免疫应答(抗玉米醇溶蛋白抗体比盐水对照高2至4倍)。这些结果显示出制备和使用具有小于约400nm的直径尺寸的纳米颗粒有助于避免由颗粒的疏水蛋白引起的任何显著的免疫原性。 
通过控制本方法的第二水相中的溶液的pH部分地实现了控制纳米颗粒尺寸的能力。下面的表3中的数据说明在6.8至7.4之间的pH时获得了具有较低PDI的较小尺寸的纳米颗粒。 
表3. 
  水相的pH   粒度(nm)  多分散度指数(PDI)
  1.5   362±24  0.392
  3   291±15  0.45
  6.8   208±10  0.289
  7.4   232±7  0.260
  10   256±20  0.317
  12   368±10  0.438
每一个值是三次实验的平均值且具有±SD。 
控制纳米颗粒形成的尺寸的另一个关键因素是表面活性剂与磷脂的 组合，其被需要以使纳米颗粒稳定并防止颗粒聚集。泊洛沙姆与卵磷脂的组合，诸如以2∶1的比率(如，0.9∶0.45％w/w)产生了在期望的尺寸范围内的纳米颗粒。如果单独使用表面活性剂或磷脂，那么获得了较大的颗粒，如由下面的表4的数据所表明的。 
表4. 
每一个值是三次实验的平均值且具有±SD。 
*冻干导致粘的粉末。 
对用于第二水相的缓冲剂的选择不仅对维持纳米颗粒形成期间的最佳pH是重要的，而且对随后的冻干也是重要的。例如，如果不在第二水相溶液中使用缓冲剂，或如果0.1N HCl用于调节pH，那么所得到的纳米颗粒的尺寸是较大的，具有较宽的尺寸范围或PDI。如图5所示，使用柠檬酸盐缓冲液得到了最小的粒径(109±12nm)。使用其他缓冲剂，尤其是磷酸盐，导致冻干之后，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径增大了2至3倍。 
图5的图图示了在第二水相的溶液中使用磷酸盐作为缓冲剂，由本方法制备的并在冻干之后获得的玉米醇溶蛋白纳米颗粒产生了比在第二水相中使用柠檬酸盐缓冲液作为缓冲剂制备的纳米颗粒大得多的颗粒。在磷酸盐缓冲液中的粒度增大可能是因为在冷冻-干燥温度下缓冲液的由pH下降引起的结晶和沉淀[10]。使用柠檬酸盐缓冲液解决了此问题，柠檬酸盐缓冲液有效地阻止了冷冻-干燥温度期间pH的变化。玉米醇溶蛋白中的氨基可以被柠檬酸交联且这还使玉米醇溶蛋白纳米颗粒稳定[11]。 
应注意的是，玉米醇溶蛋白是可生物降解的蛋白且比合成聚合物的生物相容性更强。玉米醇溶蛋白是由FDA标准列为GRAS(通常认为是安全的)聚合物的聚合物[12]。因此，本发明的方法适于制备具有被包封的不同物理化学性质的分子或药物的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。下面的表5通过示例图示了可以使用根据本发明的方法被纳米颗粒包封的一些分子的抽样。可以用在纳米颗粒包封中的分子的数目或类型并不限于本文所表明的那些。 
表5. 
  模型化合物   粒度(nm)   ξ电势   包封效率(％)
  6，7-羟基香豆素   173±20   -16±3   68±6
  阿霉素   171±45   -21±2   61±16
  葡聚糖FITC(4000道尔顿)   89±12   -15±2   79±8
  pDNA(GFP)   185±12   -17±0.4   86.2±3
每一个值是三次实验的平均值且具有±SD。 
上面的实施例III描述了且图2显示了由6，7-羟基香豆素形成的纳米颗粒的实施例。包含治疗剂的纳米颗粒的另一个实施例是负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，其一般步骤图示在图6中。用于制备负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的具体方法如下所示： 
实施例IV
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水的混合物中。向第一水相的此溶液中添加0.001g的盐酸阿霉素并探针式超声处理混合物20秒钟以溶解盐酸阿霉素。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将所得到的溶液逐滴添加到15ml的含有0.0675g卵磷脂和0.135g F68的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，将分散液在室温下置于300r.p.m至500r.p.m的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。在醇完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除残余材料。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器以3590g超离心50分钟来实现纯化。向阿霉素纳米颗粒的水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加35mg海藻糖并将混合物保持在-80℃下以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该材料12至14小时。 
在根据本方法制备负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒时(图6)，形成的颗粒具有约171±45nm的平均直径和约0.3的PDI。阿霉素被玉米醇溶蛋白纳米颗粒的包封效率是约61±16％。 
根据本发明制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒提供了被包封的分子或药物的有益的和/或有优势的持续释放，这部分地因为玉米醇溶蛋白纳米颗粒的水不溶性能够使颗粒在一段时间内维持药物释放。例如，图7描绘了根 据上面的实施例II描述的方法制备的负载香豆素的纳米颗粒的体外释放曲线。数据表明在体外存在药物在长达7天的时段内的持续释放，且在酶存在下观察到较高的释放速率。数据显示通过药物从纳米颗粒缓慢扩散出来和玉米醇溶蛋白纳米颗粒的缓慢酶分解，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的释放被调节。图8描绘了阿霉素自根据实施例IV制备的负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的体外释放曲线，显示了具有初始的爆发、然后在约24小时后持续释放的混合顺序。 
可以根据本发明形成为纳米颗粒的治疗剂或诊断剂的进一步的示例是葡聚糖-FITC(图9)。制备负载葡聚糖-FITC的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的实施例如下所示： 
实施例V
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水的混合物中。向玉米醇溶蛋白溶液中添加0.003g的用FITC标记的葡聚糖(4000道尔顿的分子量)并将葡聚糖-FITC溶解在上述溶液中。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将所得到的溶液逐滴添加到15ml的含有0.0675g卵磷脂和0.135g F68的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，将分散液在室温下置于300r.p.m至500r.p.m的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。在醇溶剂完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除残余材料。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器以3590g超离心50分钟来实现纯化。向负载葡聚糖-FITC的纳米颗粒的水性悬浮液(pH7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加35mg海藻糖并将混合物保持在-80℃下以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该物质12至14小时。 
根据本发明制备的葡聚糖-FITC纳米颗粒(图9)显示出持续的体外释放曲线，如图10所示。 
进一步根据本发明，适于基因治疗的分子也可以被包封在纳米颗粒中用于治疗和诊断用途，诸如，如质粒、DNA、寡核苷酸和siRNA。图11图示了用于制备包含基于基因的分子的纳米颗粒的一般方法。用于制备包 括被包封在纳米颗粒中的pDNA(质粒DNA)的纳米颗粒的具体实施例如下： 
实施例VII
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水的混合物中。向玉米醇溶蛋白溶液中添加0.187μg的pDNA GFP(绿色荧光蛋白)并将pDNA GFP溶解在上述玉米醇溶蛋白溶液中。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将所得到的溶液逐滴添加到15ml的含有0.0675g卵磷脂、0.135g F68和7.5mM CaCl2的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，将分散液在室温下置于300r.p.m至500r.p.m的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。在醇溶剂完全蒸发之后，通过使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器并以3590g处理50分钟来进行超离心以去除过量药物和表面活性剂来纯化纳米颗粒。进行两个循环的超声离心并用水洗涤纳米颗粒。向负载pDNA的纳米颗粒的水性悬浮液中添加35mg海藻糖并将混合物保持在-80℃以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该物质12至14小时。 
各种被包封的分子的药物释放曲线，例如如图6、8和10所显示的，表明玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以用作通过胃肠外和非胃肠外施用途径，包括口服、面颊、透皮、鼻、肺部和眼部递送途径，施用的通用且安全的药物递送载体。许多其他分子、颗粒和药物也可以被包封，包括但不限于用于治疗、诊断和美容应用或治疗的疫苗和化妆品物质(如米诺地尔、维生素C等) 
进一步，由于通过本发明的方法形成的相对较小尺寸的纳米颗粒，负载分子(如，负载药物)的玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以在体内循环延长的时间而不会被吞噬细胞识别和消除。图12的数据阐释了当使用猪血进行体外测试时，尺寸范围在100nm-400nm的玉米醇溶蛋白纳米颗粒不会被血液吞噬细胞吸收，而＞400nm的尺寸的较大的颗粒很快被吞噬细胞吸收。因而，可以显示出通过将玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒度控制在较小的 尺寸范围内避免了吞噬吸收。小鼠的免疫原性研究显示出在100nm至400nm的尺寸范围内的玉米醇溶蛋白纳米颗粒是非免疫原性的。另一方面，与对照相比，具有＞400nm的尺寸的玉米醇溶纳米颗粒产生了显著的免疫应答(2至4倍)，如图13所示。 
在利用猪的肠上皮细胞(IPEC-J2)的细胞增殖研究中研究了用于制备纳米颗粒的玉米醇溶蛋白的细胞毒性效应。示例性的细胞毒性研究的结果显示在图14中。与用任何浓度的缓冲液的对照处理相比，在白玉米醇溶蛋白与黄玉米醇溶蛋白之间未观察到显著程度的细胞毒性。 
使用负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒在体外测试了根据所公开的方法制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒对人类卵巢癌细胞(OVCAR-3)(图15)和抗阿霉素的人类乳腺癌细胞(NCI/ADR-RES)(图16)的治疗活性。以2000细胞/孔/0.1ml的接种密度将细胞铺板。在过夜附着之后，用0.07至70nM(OVCAR-3)和0.1至10000nM(NCI/ADR-RES)浓度的阿霉素溶液或阿霉素-纳米颗粒处理细胞24小时。24小时之后，去除了各自的药物处理。用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次并用新鲜培养基替换。每48小时替换培养基。使用MTT测定评估治疗之后第5天的细胞毒性(NCI和OVCAR-3)。结果显示负载阿霉素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒比游离阿霉素的溶液在人类癌细胞中具有明显高的效价。负载阿霉素的纳米颗粒比游离阿霉素的效价高约12至16倍。效价的差异被认为是因为游离药物和纳米颗粒中包封的药物的细胞吸收机理的差异。游离阿霉素被浓度梯度表示的被动扩散吸收，而负载阿霉素的纳米颗粒在主动的细胞内摄过程中被吸收。进一步认为，负载阿霉素的纳米颗粒的细胞内摄可以避免抗性癌细胞中的药物外排泵(drug efflux pump)，因而导致更好的效力。 
在本发明的另一个方面中，由本发明的公开方法产生的纳米颗粒的酶稳定性可以通过交联被进一步增强。图17图示了用于使用戊二醛作为交联剂来制备交联的空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的一般方法。这样的制备的具体实施例如下所示： 
实施例VIII
使用所公开的纳米沉淀法来制备空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。在探 针式超声处理第二水相之后，添加交联剂。进一步孵育纳米颗粒24小时。在孵育时间结束时，使用离心过滤纯化纳米颗粒，然后冻干。 
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水的混合物中。接着，用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将第一相溶液逐滴添加到15ml的具有pH 7.4且包含0.45％w/v的卵磷脂与 F68(0.9％w/v)的组合的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。向溶液中添加5ml的25％w/v的戊二醛并37℃孵育溶液3至24小时，同时以300rpm至500rpm搅拌。用10％w/v的偏亚硫酸氢盐中和残余的戊二醛。接着，将分散液置于300rpm至500rpm的磁力搅拌器上且在室温下，直到乙醇完全蒸发。在醇完全蒸发之后，纯化纳米颗粒以去除残余材料。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器并以3590g超离心50分钟。向纳米颗粒的水性悬浮液中添加35mg海藻糖并将溶液保持在-80℃以形成固体饼。随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该材料12至14小时。 
应注意，当诸如EDC/NHS和京尼平的其他交联剂在图13的方法中使用时，反应时间可以从24小时至70小时变化。玉米醇溶蛋白中的表面氨基参与交联。三硝基苯磺酸(TNBS)用于估计交联之前和之后的玉米醇溶蛋白中的游离氨基。以非交联的和交联的玉米醇溶蛋白的递增浓度对440nm波长的吸光度产生标准曲线。使用公式计算交联效率， 
％交联效率＝[a-b/a]×100， 
其中a＝非交联的玉米醇溶蛋白对吸光度的斜率，且b＝交联的玉米醇溶蛋白对吸光度的斜率。用于构建标准曲线的玉米醇溶蛋白的浓度范围是0.357mg/ml至12mg/ml，且相关系数是0.9994。 
图18显示了使用不同交联剂的玉米醇溶蛋白纳米颗粒中的交联度。交联效率从约70％至约100％变化。可以根据交联剂的不同，通过将反应时间改变为约3小时至3天的范围来改变交联度。此处所显示的交联剂仅仅是示例且本发明的方法并不限于使用仅仅是所公开的交联剂。可以使用其他交联剂，诸如多元羧酸(柠檬酸或1，2，3，4-丁烷四羧酸)。 
另外，虽然该方法被图示为有关制备空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，但是可以在形成包含特定分子的纳米颗粒中提供交联。制备在纳米颗粒中的若丹明(一种水溶性的染料)的具体实施例如下所示： 
实施例IX
将0.0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml水(0.25ml)的混合物中。向第一水溶液中添加0.005g的若丹明-123。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将所得到的溶液逐滴添加到15ml的具有pH 7.4且包含0.0675g的卵磷脂与 F68(0.135g)的组合的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，添加0.5ml的25％w/v的戊二醛并在37℃下孵育溶液3小时，同时以300rpm至500rpm搅拌。用10％w/v的偏亚硫酸氢钠中和残余的交联剂。接着，在室温下将分散液置于300rpm至500rpm的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。在醇完全蒸发之后，超离心地纯化纳米颗粒。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为5000道尔顿的离心过滤器并以3590g超离心50分钟来实现纯化。向负载若丹明的纳米颗粒的水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加35mg海藻糖并将溶液保持在-80℃以形成固体饼，随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该固体饼12至14小时。 
表6显示了非交联的和交联的(使用戊二醛作为交联剂)若丹明颗粒的粒度、多分散度指数和ξ电势。 
表6. 
  模型化合物   粒度(nm)   多分散度指数   ξ电势(mV)
  若丹明   352±20   0.72±0.20   -14±7
  若丹明(交联的颗粒)   130±35   0.72±0.32   -12±2
每一个值是三次实验的平均值(±SD)。 
当玉米醇溶蛋白纳米颗粒被交联时(图20)，pH 7.4的体外药物释放是较慢的，且相似地，酶促释放也是较慢的(图21)。游离氨基在玉米醇溶蛋白纳米颗粒的表面上的交联减小了粒度，且还减少了溶剂的接触并减缓了纳米颗粒的酶促降解。交联还显著降低了爆发释放。因此，交联可以 进一步稳定化纳米颗粒并且持续药物释放。 
通过将聚乙二醇(PEG)连接到纳米颗粒可以进一步增强由本发明的方法产生的纳米颗粒的治疗活性和效力。聚乙二醇化的额外益处之一是增加了纳米颗粒的循环半衰期。PEG的额外优势在于如果直接结合不可行的话，那么PEG可以作为间隔物(spacer)将靶向配体、药物和成像剂连接到玉米醇溶蛋白纳米颗粒。 
图22图示了根据本发明方法的另一个方面制备聚乙二醇化玉米醇溶蛋白纳米颗粒的方法。用于制备纳米颗粒的聚乙二醇化玉米醇溶蛋白的优势在于其可以仅使用诸如 F68的表面活性剂制备，而不是对非聚乙二醇化玉米醇溶蛋白来说使用表面活性剂与磷脂的组合。形成聚乙二醇化玉米醇溶蛋白纳米颗粒的具体方法如下所示： 
实施例X
通过向在5ml的90％乙醇中的0.1g白玉米醇溶蛋白中添加0.1g的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(methoxy PEG-succinimidyl succinate)(5000道尔顿分子量)来产生聚乙二醇化玉米醇溶蛋白。在37℃下，将混合物孵育3小时至24小时之间的时段。然后在室温下，在磁力搅拌器(以100rpm搅拌的磁力搅拌棒)内针对水透析(截留分子量为10,000道尔顿)溶液24小时以去除任何残余材料。将所得到的产物冷冻到-80℃，然后在-47℃、60毫托真空下冷冻干燥12至14小时。下面的表7显示了在不同的孵育时间内所观察到的聚乙二醇化的效率，其中使用先前描述的TNBS测定过程来确定效率百分比。可以使用其他分子量诸如500至5000道尔顿的PEG。相似地，可以使用PEG衍生物，诸如甲氧基PEG-N-羟基琥珀酸酯或其他衍生物。 
表7. 
  孵育时间(小时)   玉米醇溶蛋白∶mPEG酯的比率   聚乙二醇化效率(％)
  24   1∶1   65
  24   1∶2   93
  3   1∶1   52
将50克聚乙二醇化白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇与0.25ml去离子水的混合物中。用10秒钟作用时间和1秒钟间隔时间的脉冲，以1.39kW/h 和37％振幅的恒定超声能作用10分钟，将包含的聚乙二醇化玉米醇溶蛋白溶液逐滴添加到15ml的具有pH 7.4且包含 F68(0.9％w/v)的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程期间，将溶液保持在冰浴中以维持在约10℃的温度。接着，在室温下将玉米醇溶蛋白悬浮液置于300rpm至500rpm的磁力搅拌器上，直到乙醇完全蒸发。当蒸发完成时，纯化纳米颗粒。通过用pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用截留分子量为10000道尔顿的离心过滤器并以44,000g超离心35分钟来实现纯化。向玉米醇溶蛋白纳米颗粒的水性悬浮液(pH 7.4的柠檬酸盐缓冲液)中添加30g的2％w/v的海藻糖并将溶液保持在-80℃以形成固体饼，随后，在-47℃和60毫托真空下冻干该固体饼12至14小时。上面公开的聚乙二醇化过程可以使用上面的实施例II中公开的高压均化来进行。图23显示了聚乙二醇化纳米颗粒的尺寸分布。 
由于玉米醇溶蛋白是蛋白，所以实现了在形成纳米颗粒时使用玉米醇溶蛋白的另一个优势，即玉米醇溶蛋白具有可以用于连接靶向配体、成像剂、药物和用于药物靶向至具体组织以及其他生物医学应用的其他聚合物的大量的表面官能团。 
使用所公开的方法形成的玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以具有其他用途，尤其是体外的用途。例如，负载药物的玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以用作心血管器件和其他生物医学器件的涂覆材料。虽然在本文中针对药物递送被描述，但是由所公开的方法产生的纳米颗粒还可以用于包封食品、乳制品和化妆品行业的感兴趣的分子以及持续这些分子的释放。除了人类药物外，使用所公开的方法还可以将兽医药物包封在纳米颗粒中。玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以用于保护分子免受诸如湿气、氧化、光等的不利的环境剂的影响。此利用可以包括对药物、食品、乳制品和化妆品行业来说感兴趣的分子。 
玉米醇溶蛋白可以与其他天然的和合成的聚合物结合以设计具有用于生物医学、药物、食品、乳制品和化妆品行业的各种应用的独特性能的新颖的纳米颗粒。例如，通过将pH敏感的聚合物或接头连接到玉米醇溶蛋白，可以制备响应pH刺激释放药物的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。 
本文中引用的包括出版物、专利和专利申请在内的所有参考文献在此通过引用而并入，引用的程度如同每篇参考文献被分别地和专门地通过引用而并入并在本文中全文提出，包括： 
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Claims (21)

1.一种产生非免疫原性纳米颗粒的方法，包括：
提供醇溶谷蛋白；
用水醇溶剂溶解所述醇溶谷蛋白以提供第一水相溶液；
在表面活性剂和磷脂存在下，将缓冲剂添加到所述第一水相溶液中以产生具有在pH6.8和pH7.4之间的pH的第二水相溶液，其中存在的磷脂的量大于提供的所述醇溶谷蛋白的量；
处理所述第二水相溶液以实现所述第二水相溶液内颗粒的直径尺寸的减小；
蒸发任何残余溶剂以产生具有小于400nm的直径尺寸的纳米颗粒；以及
离心所述纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在2000g至40,000g之间离心之后，冻干所述纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在冻干之后不聚集。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括在限制所述纳米颗粒暴露于大气压的条件下储存所述纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述醇溶谷蛋白是选定级的玉米醇溶蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述选定级的玉米醇溶蛋白是白玉米醇溶蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆且所述磷脂是卵磷脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂与所述磷脂的比率是2:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理所述第二水相溶液以实现颗粒的直径尺寸的减小还包括使所述纳米颗粒经受超声剪切、高压均化或其组合。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括在形成所述第一水相溶液时向所述醇溶谷蛋白中添加被选择用于纳米颗粒包封的分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分子是被选择用于施用至受试者的治疗物质。
12.根据权利要求11所述的方法产生的非免疫原性纳米颗粒在制备用于治疗罹患疾病或病患或处于罹患疾病或病患的风险的受试者的疾病或病患的药物中的用途。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述醇溶谷蛋白被聚乙二醇化。
14.根据权利要求2或权利要求10所述的方法，还包括交联所述纳米颗粒。
15.一种治疗活性的非免疫原性纳米颗粒，其是根据权利要求10所述的方法形成的，其中所述纳米颗粒是通过权利要求6所述的方法制备的，和其中所述纳米颗粒在冻干后不聚集。
16.一种治疗组合物，其包含通过将治疗分子包封在醇溶谷蛋白中而形成的非免疫原性纳米颗粒，所述纳米颗粒具有小于400nm的直径尺寸，其中所述纳米颗粒是通过权利要求6所述的方法制备的，和其中所述纳米颗粒在冻干后不聚集。
17.根据权利要求16所述的治疗组合物，其中所述纳米颗粒的所述直径尺寸在100nm和300nm之间。
18.包括药理学上治疗量的含有治疗剂的通过权利要求7所述的方法形成的非免疫原性纳米颗粒的物质在制备用于治疗罹患疾病或疾患或处于罹患疾病或疾患的风险的受试者的疾病或疾患的药物中的用途，所述纳米颗粒具有小于400nm的直径尺寸，其中所述纳米颗粒在冻干后不聚集。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述纳米颗粒具有100nm至300nm的直径尺寸。
20.一种用于产生非免疫原性纳米颗粒的试剂盒，包括：
选定量的醇溶谷蛋白；
水醇溶剂，其用于溶解所述醇溶谷蛋白；
柠檬酸盐缓冲剂；
选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺的磷脂；以及
选定的表面活性剂。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，还包括用于产生包括一个或多个柠檬酸交联的氨基的纳米颗粒的方法的说明，其中所述纳米颗粒具有小于400nm的直径尺寸。
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