BRPI0908686B1 - Método de produção de nanopartículas não-imunogênicas, nanopartícula nãoimunogênica terapeuticamente ativa, composição terapêutica, uso de uma nanopartícula nãoimunogênica e kit para a produção de nanopartículas não-imunogênicas - Google Patents

Abstract

método de produção de nanopartículas não-imunogênicas, nanopartícula não-imunogênica terapeuticamente ativa, composição terapêutica, uso de uma substância que compreende uma quantidade farmacologicamente terapêutica de uma nanopartícula não-imunogênica e kit para a produção de nanopartículas não-imunogênicas são decritos métodos para a produção de nanopartículas não-imunogênicas a partir de fontes de proteínas mediante o controle de ph em um processo de nanopreciitação. as nanopartículas que são produzidas pelos métodos descritos variam no tamanho do diâmetro de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 400 nm, com um tamanho de diâmetro preferido de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, desse modo tornando as mesmas não-imunogênicas. a invenção também apresenta métodos para a produção de nanoconjugados que são apropriados para uma variedade de usos terapêuticos, de diagnóstico e outros ainda.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001]A presente invenção refere-se a métodos de formação de nanoparticulas e, especificamente, ela se refere a métodos de formação de nanoparticulas de polímeros com base em proteína insolúvel em água e hidrofóbico para produzir sistemas de aplicação não-imunogênicos para uso em aplicações diagnósticas, terapêuticas e farmacêuticas.

ANTECEDENTES

[002]As referências discutidas no presente documento são providas somente para o propósito de descrição do campo em relação à invenção. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não estejam autorizados a antecipar uma apresentação em virtude da invenção anterior.

[003]A zeina é uma proteína de planta isolada de milho ou milho em grão e pertence a uma família de prolaminas, as quais são compostas de altas quantidades de aminoácidos hidrofóbicos, tais como prolina, glutamina e asparagina. A zeina é transparente, inodora, não-tóxica, biodegradável e insolúvel em água. A zeina tem sido investigada e utilizada como um polímero nas indústrias farmacêuticas, médicas, alimentícias, de cosméticos, adesivas e de empacotamento.

[004]Nas indústrias alimentícias e farmacêuticas, zeina é utilizada, por exemplo, para revestir com filme os materiais e para formar sistemas de partículas como micropartículas ou nanoparticulas [1-5]. Vários métodos de formação de partículas de zeina foram propostos. Por exemplo, a patente norte-americana 5.330.778, cujo conteúdo está incorporado no presente documento, discute um método para a preparação de microparticulas com o uso de zeina e usa a alteração de pH para formar as microparticulas de zeina [6]. Entretanto, o método descrito na patente norte- americana 5.330.778 produz partículas de zeina com maiores tamanhos de micra e com uma ampla distribuição de tamanho de partícula, o que tem desvantagens significativas, por exemplo, para o uso in vivo.

[005]É importante garantir que um biomaterial utilizado para aplicações em animais ou seres humanos seja seguro e não- imunogênico. Em geral, mediante a administração in vivo (por exemplo, introdução no corpo) de partículas, as células fagociticas no sangue e tecidos, que são responsáveis pelo reconhecimento imunológico e remoção de partículas estranhas, podem iniciar uma resposta imunológica dependendo das características fisico-quimicas das partículas. A absorção através de células fagociticas é dependente tanto do tamanho da partícula quanto da hidrofobicidade da partícula estranha. Em geral, as partículas situadas em uma faixa de tamanho de diâmetro maior do que aproximadamente 500 nm são predispostas à fagocitose. As partículas com uma superfície hidrofóbica são facilmente reconhecidas pelas células fagociticas [7]. Por exemplo, Lopez e Murdan [8] relataram recentemente que microesferas de zeina de um diâmetro de l,36+-0,036 pm são imunogênicas e, consequentemente, não são adequadas como uma droga, vacina ou outro carreador terapêutico.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006]Em um aspecto da apresentação, a presente invenção refere-se de maneira geral a um método para a produção de partículas muito pequenas ou nanoparticulas. As partículas podem ser formadas de proteínas insolúveis em água hidrofóbicas incluindo, por exemplo, zeina.

[007]Em outro aspecto da apresentação, métodos são empregados para produzir nanoparticulas que reduzem ou se submetam substancialmente à imunogenicidade que é experimentada no uso de micropartícuias ou nanoparticulas de tamanho maior, incluindo aquelas formadas de, por exemplo, proteínas insolúveis em água hidrofóbicas. O efeito não-imunogênico das nanoparticulas produzido de acordo com os métodos da presente invenção é alcançado pelo controle do tamanho das partículas formadas pelo método, bem como a faixa de tamanhos da partícula.

[008]Em algumas implantações da invenção, a faixa de tamanhos de diâmetro da partícula é menor do que aproximadamente 400 nm. Em implantações preferenciais da invenção, a faixa de tamanhos de diâmetro da partícula é menor do que aproximadamente 300 nm e, em algumas implantações adicionais, a faixa de tamanhos de diâmetro da partícula é aproximadamente de 100 nm a aproximadamente 300 nm. Embora o tamanho seja discutido nessa apresentação em termos de um diâmetro, isso não deve ser interpretado a fim de implicar que as nanoparticulas discutidas no presente documento sejam perfeitamente esféricas no formato, embora os formatos esféricos nas nanoparticulas possam ser atingidos. Deve ser compreendido que as dimensões apresentadas no presente documento devem ser simplesmente medidas entre lados opostos da partícula ou a dimensão mais larga através da partícula de lados opostos.

[009]Em um aspecto da invenção, os métodos da invenção podem ser executados com o uso de proteínas hidrofóbicas insolúveis em água que podem ser derivadas de uma variedade de fontes incluindo fontes vegetais, animais e sintéticas. Em vários aspectos, o método pode ser executado com uma familia de prolaminas que são compostas de altas quantidades de aminoácidos hidrofóbicos como, por exemplo, prolina, glutamina e asparagina. Esses aminoácidos hidrofóbicos produzem a proteína insolúvel em água. As prolaminas podem ser encontradas em vários grãos como milho em grão, trigo, cevada, arroz, sorgo e outras fontes vegetais e animais. Alguns exemplos de prolaminas adequados incluem a zeina, gliadina, hordeina e kafirina, embora a aplicação do método não seja necessariamente limitada a esses exemplos. Para os propósitos dessa descrição e, meramente como uma ilustração exemplificadora da invenção, os métodos são descritos no presente documento com o uso de zeina, apenas a titulo de exemplo.

[010]Em várias implantações do método, a zeina branca é utilizada para produzir nanoparticulas em uma faixa de tamanho de diâmetro desejável de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 nm. Foi descoberto que o uso de zeina amarela pode produzir partículas com tamanho de diâmetro relativamente maior e, também pode produzir partículas com distribuição de tamanho de diâmetro de partícula mais ampla. Acredita-se que os pigmentos em zeina amarela possam afetar a solubilidade da zeina amarela e a formação de nanoparticula com o uso de zeina amarela.

[011]Os métodos da invenção produzem nanoparticulas de um tamanho de diâmetro geralmente menor e faixa de tamanho de diâmetro mais estreita do que seria possível de outra forma. Essas nanoparticulas menores são alcançadas através da implantação de um processo de nanoprecipitação de pH controlado com o uso de um ou mais graus particulares de uma proteína de base, como zeina e, pelo uso de várias combinações de tampões, tensoativos e fosfolipidios que são selecionados para alcançar diâmetros e tamanhos de nanoparticula que rendem as nanopartículas não-imunogênicas.

[012]Os métodos da apresentação também são adequados para a preparação de nanopartículas com uma ampla variedade de moléculas, partículas ou agentes, que têm propriedades fisico- quimas de variação, para formar materiais encapsulados, absorvidos, complexados ou conjugados com as nanopartículas. Por exemplo, o método pode ser utilizado para capturar pequenas moléculas hidrofilicas, pequenas moléculas hidrofóbicas e macromoléculas. Em cada um desses exemplos, uma encapsulação eficiente de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 % pode ser alcançada. As nanopartículas formadas de acordo com a presente invenção podem ser capazes de prover uma aplicação prolongada da molécula encapsulada por até uma semana ou, possivelmente mais, em um ambiente in vitroe in vivo.

[013]Em um aspecto da invenção, os métodos são empregados para produzir nanopartículas terapêuticas e/ou diagnósticas, por exemplo, nanopartículas contendo um agente anti-câncer. Tais nanopartículas podem prover uma aplicação de alvo e controle temporal da liberação de um agente ativo, que é frequentemente um agente terapêutico como uma pequena droga molecular, ácidos nucléicos, proteína, vacina, anticorpo, agente quimico ou outra substância. Em adição aos métodos terapêuticos descritos, a invenção provê meios para a produção de nanopartículas com porções de diagnóstico, por exemplo, agentes de formação de imagem, sondas e similares.

[014]Em um aspecto adicional da invenção, um kit é provido para a preparação de nanopartículas de acordo com os métodos da invenção. O kit contém uma quantidade selecionada de uma proteína solúvel em água, pelo menos um agente de tampão e pelo menos um tensoativo. 0 kit também pode incluir um solvente hidroalcoólico. 0 kit também pode incluir pelo menos um fosfolipidio, sendo que a quantidade deste pode ser selecionada para prover uma razão selecionada de fosfolipidios para tensoativo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015]A Figura 1 ilustra por meio de um fluxograma as etapas gerais de formação de nanoparticulas de zeina padrão, de acordo com o método da presente invenção.

[016]A Figura 2 ilustra por meio de um fluxograma as etapas de formar nanoparticulas carregadas de 6,7 hidróxi cumarina, de acordo com a invenção.

[017]A Figura 3 mostra várias microfotografias de microscopia eletrônica de nano partículas de zeina. A Figura 3(a) é uma microfotografia eletrônica de varredura de nanoparticulas de zeina padrão. As partículas aparentam ser esféricas e com uma superfície lisa. (Representação em escala 1 mm = 1,76 pm. ) A Figura 3(b) é uma microfotografia eletrônica de transmissão de nanoparticulas de zeina padrão. (Representação em escala 1 mm= 8,038 pm. ) A Figura 3(c) é uma microfotografia eletrônica de varredura de nanoparticulas de zeina carregadas de cumarina. (Representação em escala de 1 mm= 0,87 pm) . A Figura 3(d) é uma microfotografia eletrônica de transmissão de nano partículas de zeina carregadas com 6,7 hidróxi-cumarina. (Representação em escala 1 mm = 8,04 pm).

[018]A Figura 4 mostra imagens de microscopia de força atômica (AFM) de nanoparticulas de zeina padrão, de acordo com os métodos da invenção no modo de contato intermitente no ar. Da esquerda para a direita estão à altura, a amplitude, e as imagens de fase de uma amostra representativa com escala-z de 14,19 nm, 22,2 V, e 45°, respectivamente. 0 tamanho de varredura é de 1,14 x 1,14 pm. 0 tamanho de partícula padrão dentre 50 partículas medidas em AFM é de 185 nm.

[019]A Figura 5 é um gráfico gue ilustra a influência do tipo tampão no tamanho de partícula nas nanoparticulas de zeina carregadas com cumarina feitas de acordo com o método da invenção antes e depois da liof ilização. O uso de tampão de citrato no método de precipitação da presente invenção produz tamanhos consistentemente menores de nanoparticulas seguindo a liofilização, se comparado ao uso de tampão de fosfato. (* p<0,05). Cada ponto no gráfico representa a média ±SD (n=3). O tampão de citrato foi composto de ácido citrico (0,0153 g/1) e citrato de sódio (2,91 g/1) em água deionizada. O tampão de fosfato foi composto de fosfato de sódio dibásico (1,44 g/1), fosfato de potássio monobásico (0,25g/l) e cloreto de sódio (10 g/1) em água deionizada. Ambos os tampões foram utilizados para manter a segunda fase aquosa a pH de 7,4 de acordo com a invenção.

[020]A Figura 6 ilustra, por meio de um fluxograma, as etapas gerais do método da presente invenção para o preparo de nanoparticulas carregadas de doxorrubicina.

[021]A Figura 7 ilustra um perfil de liberação in vitro de nanoparticulas de zeina carregadas com 6,7-hidróxi-cumarina em salina tamponada com fosfato (pH 7,4). Nanoparticulas de zeina carregadas com cumarina (lOmg/ml) preparadas pelo método da presente invenção foram colocadas em uma membrana de diálise (Spectrapor™, M.wt. 5000 Da) e incubadas em salina tamponada com fosfato (pH 7,4) na ausência (não enzimática) ou presença (enzimática) de tripsina (10 mg/ml). Etanol (20% em volume/volume) foi adicionado ao meio para manter as condições de esgotamento, e azida sódica (0,005%p/v) foi utilizada como um agente anti-microbiano. A solução foi mantida a 37 °C em um agitador horizontal de banho maria as 50 rpm. Uma parte alíquota (1 ml) do dialisato foi removida em diferentes pontos no tempo por sete dias e substituídas por meio fresco para manter as condições de esgotamento. O dialisato foi analisado por cumarina liberada das nanopartículas de zeina com o uso de espectrofluometria (Àex= 490nm; Àem= 520 nm) . Cada ponto de dados é uma média de três experimentos (±SD). A liberação enzimática foi mais alta comparada à liberação não-enzimática em todos os pontos de tempo (p< 0,05).

[022]A Figura 8 ilustra um perfil de liberação in vitro de doxorrubicina a partir de nanopartículas de zeina em salina tamponadas com fosfato (pH 7,4). Nanopartículas de zeina carregadas com doxorrubicina (10mg/ml) preparadas pelo método de nanoprecipitação da presente invenção foram incubadas em 1 ml de salina tamponada com fosfato (pH 7,4) em um tubo centrifugo e a solução foi mantida a 37°C em um agitador horizontal em banho maria a 50 rpm. A amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por dez minutos e o sobrenadante foi analisado para doxorrubicina liberada das nanopartículas com o uso de HPLC. A coluna A C- 18 foi utilizada e a fase móvel (taxa de fluxo de 1 ml/min) foi de 0,1 % de TFA: Acetonitrila (gradiente de acetonitrila de 5 a 80% foi utilizada) . um detector de fluorescência (Àex= 505 nm; Àem= 550 nm) foi utilizado para detectar a doxorrubicina. O estudo de liberação foi conduzido por te quatro dias. Cada ponto de dados é uma média de três experimentos (±SD).

[023]A Figura 9 ilustra, por meio de um fluxograma, as etapas gerais de um método da presente invenção para a preparação de nanopartículas carregadas com dextrano-FITC (fluoroisotiocianato) . 0 peso molecular do dextrano é de 4000 Da.

[024]A Figura 10 ilustra um perfil de liberação in vitro de dextrano-FITC de nanoparticulas de zeina em salina tamponada com fosfato (pH 7,4). Nanoparticulas de zeina carregadas de dextrano-FITC (10 mg/ml) foram preparadas por um método da presente invenção, foram incubadas em 1 ml de salina tamponada com fosfato (pH 7,4) em um tubo centrifugo e foram mantidas a 37°C em um agitador horizontal em banho maria a 50 rpm. A amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por dez minutos e o sobrenadante foi analisado para dextrano-FITC liberado das nanoparticulas com o uso de espectofluorimetria (Àez= 490nm; Àem= 520 nm) . O estudo foi conduzido por oito dias. Cada ponto representa a média ±SD (n=3).

[025]A Figura 11 ilustra por meio de um fluxograma as etapas gerais do método da presente invenção para a preparação de nanoparticulas carregadas de DNA de plasmideo. O DNA do plasmideo (pDNA) que encodifica proteina fluorescente verde (GFP) que foi utilizada no estudo foi propagado como uso de um filamento DH5a de E. coli, que foi cultivado em meio LB. O plasmideo foi isolado com o uso de EndoFree Plasmid Mega Kit, da Qiagen. 0 pDNA purificado foi caracterizado com o uso de espectofotômetro UV, ao calcular a razão de absorbância de UV a 260/280 nm, e também caracterizado por eletroforese em gel de agarose.

[026]A Figura 12 ilustra a influência do tamanho de partícula na absorção de nanoparticulas de zeina por células polimorfonucleares porcinas. A Figura mostra a área percentual sobre a curva para quimiluminescência luminal (por 90 minutos) na presença de partículas de zeina e zymosan de controle positivo. Cada experimento é uma média de quatro experimentos (±SEM). A absorção é significativamente baixa em partículas de tamanhos menores (p<0,05) se comparado a outros grupos.

[027]A Figura 13 ilustra anticorpos anti-zeina (densidade óptica) medidos após a terceira e a quinta semanas de injeções subcutâneas primárias e intensificadoras de partículas de zeina, respectivamente. Cada valor é representado como a média ±SEM (n=4) . Ambas as titulações primária e intensificadora foram estatisticamente não significativas (p>0,05) se comparadas ao grupo salino. Uma suspensão de zeina áspera ou partículas de zeina na salina (equivalentes a 100 pg/50 pl) foi injetada subcutaneamente em camundongos fêmeas Balb/c. Sanguefoi retirado do plexo orbital e os niveis de anticorpo anti-zeina no soro diluido (1/16) foram medidos com o uso de um kit ELISA para camundongos.

[028]A Figura 14 é um gráfico que ilustra a influência de zeina amarela (Y) e zeina branca (W) na viabilidade celular de células epiteliais intestinais porcinas (células IPEC- J2) (a 20.000 células/cavidade) expressa como as atividades relativas de dehidrogenase mitocondrial após quatro horas de tratamento com o uso de um ensaio de brometo de dimetiltiazol-2-il-2, 5- difeniltetrazolio (MTT). A placa sem nenhum tratamento foi utilizada como um controle e foi considerada como 100% viável. Pó de zeina foi dissolvido em 55% em volume/volume de etanol e diluições subsequentes foram feitas de 5 mg/ml de estoque em meio isento de soro. Em todas as concentrações, ambas a zeina amarela e a branca não se diferenciam significativamente do controle sem tratamento (* p<0, 05) . Cada ponto de dados é uma média de três experimentos ±SEM.

[029]A Figura 15 ilustra um perfil de citotoxicidade in vitrode solução de doxorrubicina e nanoparticulas de doxorrubicina-zeina preparadas de acordo com a invenção em células OVACAR-3 (células cancerosas de ovário humano). As células foram expostas à solução de doxorrubicina e nanopartículas carregadas com doxorrubicina a uma concentração de 0, 0001 a 10 pM por 24 horas. O tratamento por droga foi removido após 24 horas e as células foram incubadas com meio padrão (o meio era trocado a cada 48 horas) por cinco dias, e a viabilidade celular foi medida no quinto dia por ensaio MTT. Cada ponto de dados é uma média de quatro experimentos. Os valores de IC50 para a solução de doxorrubicina e as nanopartículas de doxorrubicina-zeina estavam em 3,1 hM e 0,20 hM, respectivamente. (Dox = solução de doxorrubicina; Dox-NP = nanopartículas de doxorrubicina.)

[030]A figura 16 ilustra um perfil de citotoxicidade in vitrode solução de doxorrubicina e nanopartículas de doxorrubicina-zeina de acordo com a invenção em células cancerosas de mama humana resistentes à doxorrubicina (células NCI/ ADR-RES). As células foram expostas à solução de doxorrubicina e as nanopartículas carregadas com doxorrubicina a uma concentração de 0,0001 a 10 pM por 24 horas. O tratamento por droga foi removido após 24 horas e as células foram incubadas com meio padrão (meio trocado a cada 48 horas) por cinco dias, e a viabilidade celular foi medida no quinto dia por um ensaio MTT. Cada ponto de dados é uma média de quatro experimentos. Os valores de IC50 para a solução de doxorrubicina e nanopartículas carregadas de doxorrubicina eram de 81,73 hM e 6,41 hM, respectivamente. (Dox = solução de doxorrubicina; Dox-NP = nanopartículas carregadas com doxorrubicina.)

[031]A FIGURA 17 ilustra através de um fluxograma um método da presente invenção para a preparação de nanopartículas de zeina branco reticuladas.

[032]A FIGURA 18 é um gráfico que demonstra a extensão da reticulação das nanoparticulas de zeina em função do agente de reticulação por 24 horas. A extensão da reticulação foi determinada com o uso de um ensaio TNBS. 0 agente de reticulações utilizado foi GTA- Glutaraldeido (500 p) de uma solução mãe de 25% em peso), EDC: l-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (0,6% em peso) e NHS: N-hidroxil succinimida (0,6% em peso). A concentração de genipina utilizada foi 0,05% em peso. "Em branco" representa as nanoparticulas de zeina sem qualquer agente de reticulação. Os Dados são um meio de dois experimentos.

[033]A FIGURA 19 ilustra através de um fluxograma um método da presente invenção para a preparação de rodamina-123-carregada nanoparticulas de zeina reticuladas.

[034]A FIGURA 20 ilustra o perfil de liberação in vitro de rodamina-123 a partir de nanoparticulas de zeina em salina tamponada de fosfato (0,1 M) pH 7,4. Os resultados representam o meio +- SEM (n=4). NCS = partículas ligadas não reticuladas; CS = partículas reticuladas. A liberação de droga a partir das nanoparticulas reticuladas foi significantemente (p>0,05) mais baixa do que nas nanoparticulas não reticuladas. As nanoparticulas de zeina carregadas com rodamina (20 mg) preparadas pelo método da presente invenção foram dispostas em uma membrana de diálise (Spectrapor™) , M.wt. 10.000 Da) e incubadas na mesma 5ml de salina tamponada de fosfato (pH 7,4). A solução foi mantida a 37°C em um agitador em banho maria horizontal a 100 rpm. Uma alíquota (1 ml) do residue do processo de diálise foi removida em pontos diferentes de tempo por 48 horas e substituída por meio fresco a fim de manter as condições de dissipação. O residue do processo de diálise foi analisado para a liberação de rodamina a partir das nanoparticulas de zeina com o uso de espectrofluorimetria (Àex= 4 85nm; Àem= 530 nm) .

[035]A FIGURA 21 ilustra o perfil de liberação in vitro de rodamina-123 a partir de nanoparticulas de zeina na presença de tripsina com pH 7,4. Os resultados representam meios +- SEM (n=4). ENCS = partículas ligadas não reticuladas; ECS = partículas reticuladas. A liberação de droga a partir de nanoparticulas reticuladas foi significantemente (p>0,05) mais baixo do que nas nanoparticulas não reticuladas. As nanoparticulas de zeina carregadas com rodamina-123 (20 mg) preparadas pelo método da presente invenção foram dispostas em uma membrana de diálise (Spectrapor™, M.wt. 10.000 Da) e incubadas em 5 ml de salina tamponada de fosfato (0,lM, pH 7,4) que contém 205pg/ml de tripsina. A solução foi mantida a 37°C em um agitador horizontal em banho Maria a 100 rpm. Uma alíquota (1 ml) do residuo do processo de diálise foi removida em pontos de tempo diferentes por 48 horas e substituída por meio fresco a fim de manter as condições de dissipação. O residuo do processo de diálise foi analisado para rodamina-123 liberada a partir das nanoparticulas de zeina com o uso de espectrofluorimetria (Àez= 485nm; Àm= 530 nm).

[036]A FIGURA 22 ilustra em um fluxograma o método geral para a preparação de nanoparticulas de zeina Pegiladas modelo.

[037]A FIGURA 23 é um gráfico que ilustra uma intensidade de distribuição de tamanho equilibrada de Nanoparticulas Pegiladas. O tamanho de particular das nanoparticulas de zeina Pegiladas foi de 131+-1 nm, com um indice de polidispersidade (PDI) de 0,282 +- 0,01. Os dados mostram ainda que a modificação da superfície de nanoparticulas de zeina com PEG não aumenta o tamanho da partícula e que as nanopartículas estão na faixa de tamanho desejado para as aplicações de entrega de droga.

[038]DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERENCIAIS

[039]Conforme aqui utilizado, o termo "nanopartícula" é, em geral, conhecido por referir-se a partícula cujo tamanho não ultrapassa 1000 nm em pelo menos uma dimensão. Entretanto, as nanopartículas formadas pelos métodos da presente invenção terão um diâmetro de um valor especificado, conforme aqui definido. Ademais, to uso do termo "nanopartícula" também deve se referir a nanopartículas modelo genéricas e nanopartículas carregadas com uma molécula e formadas pelos métodos da presente invenção.

[040]Conforme aqui utilizado, a menos que esteja definido em contrário (isto é, a FIGURA 18), "nanopartícula modelo"refere-se a e significa nanopartículas formadas de acordo com os métodos da invenção que não têm uma partícula, molécula ou material selecionado formado com ou em conjunto com a nanopartícula.

[041]Conforme aqui utilizado, o termo "diâmetro," quando utilizado no contexto de dimensões de nanopartícula, refere-se à dimensão linear da partícula para linhas que passam através do centro da massa da partícula. A aproximação aceitável do diâmetro de partículas não esféricas pode ser fornecida, por exemplo, pegando o meio da espessura da partícula ao longo de três eixos geométricos ortogonais de um sistema coordenado, com um dos eixos geométricos alinhado com a maior dimensão da partícula.

[042]Conforme aqui utilizado, o termo "administrado" ou "administração," quando utilizado no contexto terapêutico e uso diagnóstico de nanopartículas, refere-se a e inclui a introdução de uma quantidade selecionada de nanopartículas em um ambiente in vivo ou in vitro com o propósito de, por exemplo, aplicar um agente terapêutico em um sitio alvo.

[043]Conforme aqui utilizado, "in vivo" significa de ou dentro do corpo de um indivíduo, tal como um paciente, e inclui a administração de nanoparticulas através de uma diversidade de maior incluindo, mas não limitado a, rotas de administração oral, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, subcutânea, tópica, oftalmológica e nasal.

[044]Conforme aqui utilizado, "in vitro"significa ou refere-se a ambientes no exterior do corpo de um indivíduo ou paciente.

[045]Conforme aqui utilizado, os termos "sujeito" ou "paciente"referem-se a ou significam um organismo complexo individual, por exemplo, um animal humano ou não-humano.

[046]Conforme aqui utilizado, "graus de zeina"refere-se a uma variedade de tipos ou formas de zeina, incluindo zeina branco e zeina amarelo, derivados por diversos meios, tal como apresentado na Patente Norte-americana n°. 5.254.673, cujo conteúdo é aqui incorporado [9] .

[047]Conforme aqui utilizado, o termo "agente terapêutico," e termos similares referem-se a um meio de função terapêutica ou medicinal que a molécula, macromolécula, droga ou outras substâncias referidas podem afetar de forma benéfica a iniciação, curso e/ou um ou mais sintomas de uma doença ou condição em um indivíduo, e pode ser utilizada em conjunto com nanoparticulas na produção de medicamentos para o tratamento de uma doença ou outra condição.

[048]Conforme aqui utilizado, o termo "biocompativel" significa que a nanoparticula produzida pelo método apresentado da invenção não ocasiona ou obtém efeitos adversos significativos quando administrado in vivo em um individuo. Os exemplos de efeitos adversos possíveis incluem, mas não se limitam a, inflamação excessiva e/ou uma resposta imuno adversa ou excessiva, assim como toxicidade.

[049]Conforme aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares, por exemplo, "um", "uma" e "o," incluem o plural, a menos que o contexto explicite o contrário. Por exemplo, referência a "uma nanopartícula" inclui uma pluralidade de tais nanopartículas e referência a uma "molécula" é uma referência a uma pluralidade de moléculas e equivalentes das mesmas.

[050]Conforme aqui utilizado, "cerca de" ou "aproximadamente"significa razoavelmente próximo a ou um pouco mais um pouco menos do que o número ou quantidade declarada.

[051]Conforme aqui utilizado, "que compreende", "incluindo", "que tem,""que contém""caracterizado por", e equivalentes gramaticais dos mesmos, são termos inclusivos ou abertos que não excluem elementos ou etapas de métodos adicionais não citados, mas incluem ainda mais termos restritivos "que consiste em" e "que consiste essencialmente de."

[052]A presente invenção refere-se a métodos de produção de nanopartículas não imunogênicas de proteínas insolúveis em água hidrofóbicas através do controle do tamanho da partícula das nanopartículas em uma faixa de tamanho de aproximadamente 100 nm a 4 00 nm, e mais adequadamente em uma faixa de tamanho de entre de aproximadamente 100 nm e 300 nm. A FIGURA 1 ilustra através de um fluxograma as etapas gerais da preparação de nanopartículas não imunogênicas através do método da presente invenção.

[053]Em uma etapa ou fase inicial do método, uma proteína insolúvel em água (0,4 a 1,25 % em peso) é dissolvida em um solvente hidroalcóolico que pode conter etanol e água deionizada. A composição do solvente pode ser 90:10 %v/v ou 92:8%v/v, por exemplo. Para os métodos onde uma molécula selecionada deve ser encapsulada na nanoparticula, a molécula (0,03 a 0,3%w/v) a ser encapsulada é adicionada à solução desta primeira fase aquosa. A molécula a ser encapsulada tem aproximadamente 5 a 50% em peso/peso do polímero de proteina.

[054] O pH da solução pode ser alterado para colocar o pH da solução entre cerca de 6 de pH e cerca de 7 de pH através da adição de 0,01 NaOH ou 0,01N HC. Se o pH da água muda após a adição de uma molécula ácida, tal como a cumarina, ou através de uma molécula básica, o pH deve ser ajustado para 6 a 7 de pH. A solução da primeira fase pode ser processada pela sonicação de prova para auxiliar a dissolução da proteina.

[055]Em uma etapa subsequente do método, a solução aquosa da etapa ou fase inicial é adicionada a um agente tampão sob cisalhamento ultra-sônico. O tampão de citrato é particularmente preferencial. A escolha do agente tampão utilizado na segunda fase aquosa é considerada significante para manter o pH durante a formação da nanoparticula, e também é significante para a liofilização subsequente das nanoparticulas formadas, conforme descrito posteriormente nesta apresentação. Se nenhum tampão for utilizado, ou se, por exemplo, HC1 0,lN for utilizado para ajustar o pH da segunda solução de fase aquosa, as partículas produzidas tendem a ser maiores do que as produzidas com o tampão de citrato, e as partículas tendem a demonstrar faixa de tamanho maior. O uso de um tampão de citrato produz alguns do tamanho de diâmetro de partícula menores, como aproximadamente 100. O uso de outros tampões pode produzir partículas com a faixa de tamanho de diâmetro igual ou similar de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, mas após a etapa de liofilização, o tamanho das nanoparticulas formadas com o uso de outros agentes tampão tendem a aumentar duas ou três vezes.

[056]Significativamente, o pH da segunda solução de fase aquosa situa-se preferencialmente entre aproximadamente pH 6,8 e aproximadamente pH 7,4 para a obtenção do tamanho desejado de nanoparticulas. Se o pH estiver situado fora dessa faixa, o tamanho de partícula tenderá a se tornar maior, e o indice de polidispersidade (PDI) das partículas produzidas será mais alto. O PDI é uma medida da distribuição das partículas em faixas de tamanho diferentes. O método, dessa forma, pode utilizar a diferença de solubilidade de uma proteína, como zeina, na solução hidroalcoólica e em uma solução aquosa com um pH selecionado de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4 próximo do ponto isoelétrico de zeina.

[057]Além disso, a adição de um agente de tamponamento à segunda solução de fase aquosa pode ser realizada com um alto cisalhamento ultrassónico ou com uma alta homogeneização por pressão, ou com uma combinação tanto do cisalhamento ultrassónico quanto da alta homogeneização por pressão. A energia ultrassónica e a duração do cisalhamento ultrassónico podem ser particularmente significativas para a formação de partículas nas faixas de tamanho de diâmetro desejadas. A energia de cisalhamento ultrassónico pode ser efetuada de 0, 6 kW/h a 1,39 kW/h, com uma duração de aproximadamente dois a dez minutos com um pulso pontual de cinco a dez segundos e um tempo de interrupção de um a cinco segundos. O processamento ultrassónico pode ser significativo para a produção de partículas com o tamanho na faixa desejada. Quando se emprega uma homogeneização de alta pressão, o processo pode ser realizado com o uso de um tamanho de orifício entre 0,1 mm e 0,25 mm, e por um período de tempo entre cinco e dez minutos com uma pressão de 5000 a 40.000 psi.

[058]O agente de tamponamento da segunda fase também pode conter preferencialmente um tensoativo e um fosfolipídeo com uma razão selecionada. A razão do tensoativo em relação ao fosfolipídeo pode ser de aproximadamente 2:1% em peso/peso, a qual se acredita que produza os resultados mais desejáveis. A razão também pode ser de 1:0,5% em peso/peso ou de 1:1% em peso/peso ou 1:2% em peso/peso. Significativamente, a utilização da combinação de um tensoativo e de um fosfolipídeo é altamente desejável para estabilizar as partículas produzidas e para ajudar a evitar agregações das partículas. Apenas a título de exemplo, o tensoativo pode ser um poloxâmero, tal como Pluronic® F68, e o fosfolipídeo pode ser a lecitina. Outros tensoativos que podem ser utilizados no método incluem outros tensoativos não-iônicos tais como poloxâmeros (Pluronic®), ésteres de alquil polióxietileno (Brij), ésteres de sorbitano (Span), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitan (Tween), e tensoativos iônicos como dioctil sulfosucinato de sódio, lauril sulfato de sódio, cloreto de benzalcônio, brometo de cetil trimetil amónio, brometo de n-dodecil trimetil amónio, e um polímero tal como álcool polivinílico, polivinil pirrolidona. Outros fosfolipídeos que podem ser utilizados no método incluem lipídeos carregados e não-iônicos ou fosfolipídeos tais como lecitina de ovo, lecitina de soja, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, 1,2-dioleoíla-3-trimetil amónio propano.

[059]Foi verificado que uma cominação de poloxâmero e lecitina (por exemplo, 0,9% em peso/peso:0,45% em peso/peso) com a razão selecionada produz nanoparticulas com o tamanho na faixa de diâmetro desejada de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm. Foi verificado que o uso de tensoativo ou fosfolipideo sozinho resulta, em geral, em tamanhos de partícula maiores fora do tamanho da faixa de diâmetro desejada. Entretanto, o uso de um tensoativo ou de um fosfolipideo, de acordo com os métodos descritos na presente invenção, resultará em nanoparticulas com um tamanho desejado para uma não-imunogenicidade.

[060]Após a aplicação de cisalhamento ultrassónico ou/ou homogeneização de alta pressão à solução da segunda fase, a mistura pode ser agitada para evaporar o etanol ou outro solvente para formar as nanoparticulas. A agitação pode ser realizada através de um agitador mecânico, e pode ser realizada com uma taxa de aproximadamente 300 rpm a aproximadamente 500 rpm com umà temperatura ambiente durante aproximadamente três horas.

[061]Preferencialmente, as nanoparticulas podem, então, ser submetidas à filtragem ultracentrifuga com o propósito de separar as nanoparticulas do material residual. A ultracentifugação pode ser executada com o uso de filtros centrífugos com um valor de corte de peso molecular de cerca de 5000 Da (ou outros filtros adequados com um valor de corte de Mwt maior ou menor que 5000 Da), e entre 2000 g e 40.000 g, dependendo da molécula ou droga encapsulada, ou com o tratamento em particular das nanoparticulas, como a Pegilação. 0 tempo da ultracentrifugação pode variar entre 20 e 50 minutos.

[062]Um crioprotetor pode, então, ser adicionado às nanoparticulas. Por exemplo, 2% em peso/volume de trehalose podem ser adicionados como um crioprotetor. Outros crio- ou lio- protetores também podem ser utilizados, tais como açúcares, incluindo glicose, sacarose, lactose, ficol, betaina ou manitol, ou poióis como manitol, sorbitol, que podem ser utilizados como lioprotetores. As nanoparticulas podem ser mantidas a -80°C para formar uma barra sólida, que é, então, liofilizada, tal como pela secagem das nanoparticulas em um estado congelado sob alto vácuo. A duração da energia ultrassónica, do tipo de tensoativo, da concentração de tensoativos, e do tampão pode ser variada.

[063]A titulo de exemplo, as nanoparticulas que têm uma distribuição de tamanho na faixa entre aproximadamente 100 nm e aproximadamente 400 nm foram preparadas da seguinte maneira:

Exemplo I

[064]Em uma primeira fase aquosa, 0,0135 g de zeina branca foi dissolvido em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água. A concentração de zeina ou a combinação de solvente utilizada era ideal; entretanto, as nanoparticulas com a faixa de tamanho diferente desejada podem ser produzidas com a modificação da concentração de zeina ou da composição de solvente. A dissolução da zeina foi auxiliada pela aplicação de uma sonicação com sonda durante cerca de vinte segundos. A solução resultante da primeira fase aquosa foi, então, adicionada em gotas em uma solução de 15 ml de tampão citrato, com um pH de 7,4, e uma combinação de lecitina (0,45% em peso/volume) e Pluronic® F68 (0,9% em peso/volume) sob aplicação constante de energia ultrassónica (1,39 kW/h, 37% de amplitude) durante dez minutos com um pulso pontual de 10 segundos e um tempo de interrupção de um segundo. Durante o processo de cisalhamento ultrassónico, a dispersão foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura em cerca de 10°C. A dispersão foi, então, colocada em um agitador magnético entre 300 e 500 rpm, à temperatura ambiente, até o etanol ficar completamente evaporado. Após a evaporação completa do etanol, as nanopartículas foram purificadas para a remoção de quaisquer materiais residuais e/ou agentes ativos de superfície. A purificação foi consumada mediante a lavagem repetida com um tampão citrato com 7,4 de pH deionizado e ultracentrifugação com o uso de filtros centrífugos com um valor de corte de MWt de 5000 Da, com 3950 g durante 50 minutos. Em 4 ml da suspensão aquosa resultante (tampão citrato com pH de 7,4) de nanopartículas de zeina, adicionou-se 2% em peso/volume de trehalose como um crioprotetor, e as nanopartículas foram, então, mantidas a -80°C para formar uma barra sólida. O material foi, então, liofilizado a -47°C e com um vácuo de 60 mTorr por doze a catorze horas. As nanopartículas foram, então, armazenadas em um refrigerador a 10°C em um dessecador.

[065]Em um método alternativo da invenção, o cisalhamento ultrassónico da segunda solução de fase pode ser suplementado ou substituído por um homogeneizador de alta pressão com a passagem da dispersão sob uma alta pressão através de um orifício estreito para reduzir o tamanho de partícula. Isto é especialmente útil para a produção de nanopartículas na menor faixa de tamanho quando uma alta concentração de zeina for utilizada. Além disso, a homogeneização por alta pressão pode ser utilizada como um método em escala aumentada para preparar as nanopartículas de zeina. Um exemplo do método está descrito abaixo.

Exemplo II

[066]Uma quantidade de 0,65% em peso/volume de zeina branca foi dissolvida em uma mistura de 6 ml de etanol e 0,50 ml de água. A composição da solução resultante da primeira fase aquosa foi alterada para a obtenção de um pH desejado de cerca de pH 6 a cerca de pH 7. A dissolução da zeina foi auxiliada pela aplicação da sonicação com sonda durante cerca de 20 segundos. A solução resultante da primeira fase aquosa foi, então, adicionada em gotas a uma solução de 30 ml de tampão citrato, tendo um pH de 7,4, e uma combinação de lecitina (0,45 % em peso/volume) e Pluronic® F68 (0,9 % em peso/volume) sob a aplicação constante de energia ultrassónica (1,39 kW/h, 37% de amplitude) por dois minutos com um pulso pontual de dez segundos e com um tempo de interrupção de um segundo. Durante o processo de cisalhamento ultrassónico, a dispersão foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. A suspensão grossa resultante foi, então, passada através de um homogeneizador de alta pressão (Nano Debee®, USA) contendo um tamanho de orificio entre 0,1 e 0,25 mm durante cinco minutos a 20.000 psi. Durante o processo de homogeneização por alta pressão, a temperatura é mantida a aproximadamente 10°C mediante a circulação de água no homogeneizador de alta pressão com o uso de um resfriador. Subsequentemente, a dispersão foi mantida em um agitador magnético com 300 a 500 rpm e à temperatura ambiente até o etanol ficar completamente evaporado. Após a evaporação completa, as nanoparticulas foram purificadas para remover quaisquer materiais residuais ou agentes ativos de superfície. A purificação foi realizada mediante a lavagem repetida com um tampão citrato com um pH de 7,4 e ultracentrifugação com o uso de filtros centrífugos com um valor de corte de MWt de 5000 Da, em 3950 g durante 50 minutos. Quatro mililitros da suspensão aquosa (tampão citrato com pH de 7,4) de nanoparticulas foram misturados com 35 mg de 2 % em peso/volume de trehalose, e foram mantidos a -80°C para formar uma barra sólida. A barra foi, então, liofilizada a -47°C e com um vácuo de 60 mTorr por doze a catorze horas.

[067]Os métodos da invenção descritos nos Exemplos I e II podem ser adaptados para a formação de nanoparticulas em que uma molécula selecionada, como uma droga terapêutica, é encapsulada dentro de uma nanoparticula (Figura. 2). Um exemplo de um método da invenção para formar uma molécula encapsulada por nanoparticula é tal como segue.

Exemplo III

[068]A zeina branca, na quantidade de 0,0135 g, foi dissolvido em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de NaOH a 0,01 N para ajustar o pH entre 6 e 7. À solução, foi adicionado 0,0066 g de 6,7-hidroxi cumarina e a mistura foi submetida à sonificação por sonda por vinte segundos a fim de assegurar a dissolução. A solução resultante foi adicionada por gotejamento em 15 ml de tampão de citrato (pH 7,4) contendo 0, 0675g de lecitina e 0,135 g de Pluronic® F68 sob energia ultrassónica constante a 1,39 kW/h e 37% de amplitude por dez minutos, com um pulso de atividade de dez segundos e um de inatividade de um segundo. Durante o processo de sonificação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura em cerca de 10°C. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético a 300 a 500 rpm e à temperatura ambiente até que o etanol fosse completamente evaporado. Após a evaporação completa do álcool, as nanoparticulas foram purificadas para remover qualquer excesso de agentes ativos de superfície e/ou droga. A purificação foi realizada através da lavagem repetida com tampão de citrato de pH 7,4 e a ultracentrifugação, utilizando filtros centrífugos de corte de MWt de 5.000 Da, a 3.950 g por 50 minutos. Quatro mililitros da suspensão aquosa (tampão de citrato de pH 7,4) de nanoparticulas carregadas com cumarina foram adicionados com 35 mg de trealose e mantida a -80° C a fim de formar um bolo sólido. 0 bolo sólido foi, então, liofilizado a -47° C e vácuo a 60 mlorr por doze a catorze horas.

[069]Foi mostrado que a zeina branca pode ser adequadamente utilizada nos métodos da presente invenção como a proteína base. A zeina branca fornece nanopartículas reproduzíveis em um tamanho estreito desejado na faixa de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 400 nm, enquanto a zeina amarela fornece partículas maiores com distribuição de tamanho de partícula mais ampla. Esta diferença está ilustrada na Tabela 1 e na Tabela 2, abaixo. A Tabela 1 apresenta dados de nanopartículas produzidas a partir de zeina amarela através do método do Exemplo I e do Exemplo ITT, acima. São mostradas as nanopartículas modelo e carregadas com cumarina. Pode-se observar que o tamanho de partícula de cada uma dentre as mesmas é de aproximadamente 460 nm e 610 nm, respectivamente. A titulo de comparação, conforme mostrado na Tabela 2, abaixo, as nanopartículas modelo e carregadas com cumarina produzidas a partir de zeina branca através do método do Exemplo I e do Exemplo III são menores. As Figuras 3 e 4 mostram imagem de força atômica e microscopia de eletrônica das nanopartículas de zeina modelo ou carregadas com cumarina. Tabela 1.

Cada valor é uma média de três experimentos com ± SD. Tabela 2.

Cada valor é uma média de três experimentos com ± SD

[070]Os pigmentos na zeina amarela parecem afetar a solubilidade da zeina e a formação de nanoparticulas da distribuição de tamanho desejada. Foi verificado na técnica anterior que é particularmente dificil preparar partículas com o uso de polímeros naturais, como proteínas, que se situam consistentemente na faixa de tamanho desejada. No entanto, a presente invenção pode produzir nanoparticulas consistentemente na faixa de tamanho desejada com o uso de um grau adequado de proteina, como zeina branca.

[071]Significantemente, os métodos da invenção podem produzir e têm produzido, nanoparticulas com um tamanho de diâmetro menor que 80 nm a 100 nm. Se parte do cisalhamento ultrassónico for substituída por homogeneização de alta pressão, conforme descrito no Exemplo II, acima, o tamanho de partícula resultante das nanoparticulas modelo também é similar aos tamanhos de partícula mostrados na Tabela 2, acima, ou seja, tendo um tamanho de partícula de aproximadamente 220+-15 nm e um PDI de 0,4+-0,07.

[072]Foi verificado que o rendimento de nanoparticulas produzida através dos métodos de nanoprecipitação da presente invenção que estão na faixa de tamanho desejada é maior que aproximadamente 60%. Os métodos são significantes na medida em que as particulas produzidas têm diâmetros primariamente em uma faixa de menos que aproximadamente 400 nm e, de preferência, com uma distribuição de tamanho de diâmetro relativamente estreito de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm a fim de evitar uma reação imunogênica quando administrados no corpo. De maneira vantajosa, as nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho de diâmetro de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 nm, como são produzidas através dos métodos da invenção, não são absorvidas pelas células fagociticas, enquanto particulas maiores de um tamanho de diâmetro maior que aproximadamente 400 nm são rapidamente absorvidas pelas células fagociticas quando testadas in vitrocom o uso de sangue de porco. Isto sugere que a fagocitose de nanoparticula é evitada ao controlar o tamanho de diâmetro da partícula de nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho menor.

[073]Os estudos de imunogenicidade em camundongos mostraram que as nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho de diâmetro de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 nm são não imunogênicas, enquanto as nanoparticulas de zeina que têm um tamanho de diâmetro maior que aproximadamente 400 nm produziram uma imunoresposta significante (anticorpos anti-zeina foram duas a quatro vezes dobradas mais elevadas quando comparado ao controle salino) . Estes resultados mostraram que preparar e usar nanoparticulas que têm tamanhos de diâmetro menores que aproximadamente 400 nm ajuda a evitar qualquer imunogenicidade significante causada pelas proteínas hidrofóbicas das particulas.

[074]A capacidade para controlar o tamanho das nanopartículas é alcançada, em parte, através do controle do pH da solução na segunda fase aquosa do método. Os dados na Tabela 3, abaixo, ilustram que tamanhos menores de nanopartículas, com um PDI menor, são alcançados a um pH entre 6,8 e 7,4. Tabela 3

Cada valor é uma média de três experimentos com ± SD.

[075]Um fator crítico adicional no controle do tamanho da formação de nanopartícula é a combinação de tensoativo e fosfolipídios que é necessária para estabilizar as nanopartículas e impedir agregação de partícula. Uma combinação de um poloxâmero e lecitina, como em uma razão de 2:1 (por exemplo, 0,9:0,45%, em peso), produz nanopartículas na faixa de tamanho desejada. Se ou o tensoativo ou o fosfolipídio for utilizado sozinho, são obtidas partículas maiores, conforme sugerido pelos dados na Tabela 4, abaixo. Tabela 4

Cada valor é uma média de três experimentos com ± SD. *A liofilização resultou em um pó pegajoso.

[076]A escolha do agente de tamponamento para a segunda fase aquosa não é apenas critica para manter o pH ideal durante a formação de nanoparticula, mas também é critica para liofilização subsequente. Por exemplo, se não for utilizado nenhum agente de tamponamento na segunda solução de fase aquosa, ou se HC1 0,IN é utilizado para ajustar o pH, as nanoparticulas resultante são maiores em tamanho, com um PDI ou faixa de tamanho mais ampla. Conforme mostrado na Figura 5, o uso de tampão de citrato fornece o menor tamanho de partícula (109+-12 nm). O uso de outros agentes de tamponamento, particularmente fosfato, resulta no tamanho de partícula de nanoparticulas de zeina sendo aumentados em duas ou três vezes após liofilização.

[077]O gráfico da Figura 5 ilustra que as nanoparticulas de zeina preparadas através do método com o uso de fosfato como o agente de tamponamento na solução da segunda fase aquosa e obtidas após liofilização produziram partículas muito maiores quando comparadas às nanoparticulas preparadas através do uso de tampão de citrato como o agente de tamponamento na segunda fase aquosa. O aumento no tamanho de partícula no tampão de fosfato se dá, provavelmente, devido à cristalização e precipitação do tampão em temperaturas de secagem por congelamento causadas pela queda de pH [10]. Este problema é resolvido através do uso de também de citrato, que resiste de forma eficaz às mudanças no pH durante as temperaturas de secagem por congelamento. Os grupos amino em zeina podem ser reticulados através de ácido citrico e isto também estabiliza as nanoparticulas de zeina [11],

[078]É notável o fato que a zeina é uma proteína biodegradável e também é mais biocompatível que os polímeros sintéticos. A zeina é um polímero que está listado como um polímero GRAS (Geralmente Considerado Como Seguro) pelos padrões da FDA [12] . O método da invenção é, portanto, adequado para preparar nanoparticulas de zeina com drogas ou moléculas encapsuladas de diferentes propriedades fisioquímicas. A Tabela 5, abaixo, ilustra a título de exemplo uma amostra de algumas moléculas que podem ser encapsuladas por nanoparticulas com o uso dos métodos de acordo com a presente invenção. O número ou tipo de moléculas que podem ser utilizadas na encapsulação de nanoparticula não se limita a estes registrados no presente documento. Tabela 5

Cada valor é uma média de três experimentos com ± SD.

[079]Um exemplo de uma nanoparticula formada com 6,7- hidroxicumarina é descrito no Exemplo III acima e é mostrado na Figura 2. Outro exemplo de uma nanopartícula que contém um agente terapêutico são nanopartículas de zeina carregadas com doxorrubicinas, sendo que as etapas gerais disto estão ilustradas na Figura 6. Um método especifico para preparar nanopartículas de zeina carregadas com doxorrubicinas é tal como segue

Exemplo IV

[080]Zeina branca na quantidade de 0,0135 g foi dissolvida em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água. Para essa solução da primeira fase aquosa foi adicionado 0,001 g de cloridrato de doxorrubicina e a mistura foi submetida a sonicação por sonda por 20 segundos para dissolver o cloridrato de doxorrubicina. A solução resultante foi adicionada gota a gota em 15 ml de tampão de citrato (pH 7,4) contendo 0, 0675 g de lecitina e 0,135 g de Pluronic® F68 sob energia ultra-sônica constante a 1,39 kW/h e 37% de amplitude para dez minutos com um pulso em periodo de atividade de dez segundos e periodo de inatividade de um segundo. Durante o processo de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético de 300 a 500 rpm à temperatura ambiente até que o etanol fosse completamente evaporado. Após a evaporação completa do álcool, as nanopartículas foram purificadas para a remoção do material residual. A purificação foi obtida por meio de lavagem repetida com tampão de citrato de pH 7,4 e submetida a ultracentrifugação, utilizando filtros centrífugos de corte de MWt de 5.000 Da, em 3.950 g por 50 minutos. Para a suspensão aquosa (tampão de citrato de pH 7,4) de nanopartículas de doxorrubicina foram adicionados 35 mg de trehalose e a mistura foi mantida a -80°C para formar uma massa sólida. 0 material foi liofilizado, então, a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas.

[081]Na preparação das nanoparticulas de zeina carregadas de doxorrubicina de acordo com o método (FIGURA 6) , as partículas foram formadas tendo um diâmetro médio de aproximadamente 171145 nm e um PDI de aproximadamente 0,3. A eficiência de encapsulação de doxorrubicina por meio das nanoparticulas de zeina foi aproximadamente de 61116%.

[082]As nanoparticulas de zeina produzidas de acordo com a presente invenção apresentam uma liberação sustentada vantajosa e/ou benéfica da droga ou da molécula encapsulada devido, em parte, à insolubilidade a água de nanoparticulas de zeina que permite que as partículas sustentem a liberação de droga por um periodo de tempo. Por exemplo, a FIGURA 7 descreve os perfis de liberação in vitropara nanoparticulas carregadas de cumarina produzidas de acordo com o método descrito no Exemplo II, acima. Os dados indicam que in vitro,existe uma liberação sustentada da droga por um periodo de até sete dias, com uma taxa de liberação mais alta sendo observada na presença de enzimas. Os dados mostram que a liberação de nanoparticula de zeina é mediada por meio de difusão lenta de droga fora da nanoparticula e decomposição quimica enzimática lenta de nanoparticulas de zeina. A FIGURA 8 descreve o perfil de liberação in vitro de doxorrubicina a partir das nanoparticulas de zeina carregadas de doxorrubicina produzidas de acordo com o Exemplo IV, apresentando uma ordem misturada com uma ruptura inicial seguida por uma liberação sustentada após aproximadamente 24 horas.

[083]Um exemplo adicional de um agente diagnóstico ou terapêutico que pode ser formado como uma nanoparticula de acordo com a invenção é Dextrano-FITC (FIGURA 9) . Um exemplo de preparação de Nanoparticulas de zeina carregadas de Dextrano- FITC é tal como segue.

Exemplo V

[084]Uma quantidade de 0,0135 g de zeina branca foi dissolvida em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água. Para a solução de zeina foi adicionado 0,003 g de dextrano (Mwt de 4.000 Da) marcado com FITC e o dextrano-FITC foi dissolvido na solução acima. A solução resultante foi adicionada gota a gota em 15 ml de tampão de citrato (pH 7,4) contendo 0,0675 g de lecitina e 0,135 g de Pluronic® F68 sob energia ultra-sônica constante a 1,39 kW/h e 37% de amplitude por dez minutos com um pulso em periodo de atividade de dez segundos e periodo de inatividade de um segundo. Durante o processo de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético de 300 a 500 rpm à temperatura ambiente até que o etanol fosse completamente evaporado. Após a evaporação completa do solvente de álcool, as nanoparticulas foram purificadas para a remoção dos materiais residuais. A purificação foi obtida por meio de lavagem repetida com tampão de citrato de pH 7,4 e ultracentrifugação, utilizando filtro centrifugo de corte de MWt de 5.000 Da, em 3.950 g por 50 minutos. Para a suspensão aquosa (tampão de citrato de pH 7,4) de nanoparticulas carregadas de dextrano-FITC foram adicionados 35 mg de trehalose e a mistura foi mantida a -80°C para formar uma massa sólida. O material foi liofilizado, então, a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas.

[085]Nanoparticulas de dextrano-FITC preparadas de acordo com a invenção (FIGURA 9) apresentam um perfil de liberação sustentada in vitro,conforme mostrado na FIGURA 10.

[086]Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, moléculas que são adequadas para as terapias gênicas também podem ser encapsuladas em nanopartículas para uso diagnóstico e terapêutico, como, por exemplo, plasmideos, DNA, oligonucleotideos e siRNA. A FIGURA 11 ilustra o método geral para a preparação de uma nanopartícula contendo uma molécula baseada em gene. Um exemplo especifico para a produção de uma nanopartícula compreendendo pDNA (DNA de plasmideo) encapsulado em uma nanopartícula é tal como segue.

Exemplo VII

[087]Uma quantidade de 0,0135 g de zeina branca foi dissolvida em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água. Para a solução de zeina foi adicionado 0.187 pg de GFP de pDNA (proteína verde fluorescente) que foi dissolvida na solução de zeina acima. A solução resultante foi adicionada gota a gota em 15 ml de tampão de citrato (pH 7,4) contendo 0, 0675 g de lecitina, 0,135 g de Pluronic® F68 e 7,5 mM de CaC12 sob energia ultra-sônica constante a 1,39 kW/h e 37% de amplitude por dez minutos com um pulso em periodo de atividade de dez segundos e periodo de inatividade de um segundo. Durante o processo de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético de 300 a 500 rpm à temperatura ambiente até que o etanol fosse completamente evaporado. Após a evaporação completa do solvente de álcool, as nanopartículas foram purificadas por meio de ultracentrifugação utilizando um filtro centrifugo com um corte de Mwt de 5.000 Da e processando em 3.950 g por 50 minutos para a remoção de droga em excesso, e agentes ativos de superfície. Dois ciclos de ultracentrifugação foram conduzidos e as nanoparticulas foram lavadas com água. Para a suspensão aquosa de nanoparticulas carregadas de pDNA foram adicionados 35 mg de trehalose e a mistura foi mantida a -80°C para formar uma massa sólida. 0 material foi liofilizado, então, a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas.

[088]Os perfis de liberação de droga para as diversas moléculas encapsuladas, conforme mostrado nas FIGURAS 6, 8 e 10, por exemplo, indicam que as nanoparticulas de zeina podem ser utilizadas como um veiculo seguro e versátil de fornecimento de droga por meio de rotas parenterais e não-parenterais de administração incluindo rotas oral, bucal, transdérmica, nasal, pulmonar e ocular de fornecimento. Muitas outras moléculas, partículas e muitos outros drogas também podem ser encapsulados, incluindo, mas não limitados a, vacinas e substâncias cosméticas (por exemplo, Minoxidil, Vitamina C, etc.) para aplicações e terapias terapêuticas, diagnósticas e estéticas.

[089]Além disso, devido ao tamanho relativamente menor das nanoparticulas formadas por meio dos métodos da presente invenção, nanoparticulas de zeina carregadas de molécula (por exemplo, carregas de droga) podem circular no corpo por períodos prolongados sem serem reconhecidas e eliminadas por células fagociticas. Os dados da FIGURA 12 ilustram que nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho de 100 a 400 nm não são absorvidas por meio das células fagociticas sanguíneas, ao mesmo tempo em que partículas maiores no tamanho de >400 nm são absorvidas rapidamente por meio de células fagociticas quando testadas in vitroutilizando sangue porcino. Desse modo, pode ser mostrado que a absorção fagocitica é evitada controlando o tamanho de partícula de nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho menor. Estudos de imunogenicidade em camundongos mostraram que nanoparticulas de zeina na faixa de tamanho de 100 nm a 400 nm são não-imunogênicas. Por outro lado, nanoparticulas de zeina tendo um tamanho >400 nm produziram uma resposta imunológica significativa (duas a quatro vezes) comparada ao controle, conforme mostrado na FIGURA 13.

[090]Os efeitos citotóxicos da zeina utilizada para produzir as nanoparticulas foram investigados em estudos de proliferação celular utilizando células epiteliais intestinais porcinas (IPEC-J2). Os resultados de um estudo de citotoxicidade exemplificador são mostrados na FIGURA 14. Nenhum grau significativo de citotoxicidade foi observado entre zeina branca e zeina amarela, conforme comparado ao tratamento de controle com tampão em qualquer concentração.

[091]A atividade terapêutica de nanoparticulas de zeina produzidas de acordo com os métodos descritos foi testada in vitroutilizando nanoparticulas de zeina carregadas de doxorrubicina com células de câncer de ovário humanas (OVCAR-3) (FIGURA 15) e células de câncer de mama humanas resistentes a doxorrubicina (NCI/ADR-RES) (FIGURA 16). As células foram plaqueadas em uma densidade de semeadura de 2.000 células/cavidade/0,1 ml. Seguindo a fixação de um dia para o outro, as células foram tratadas com 0,07 a 70 nM (OVCAR-3) e 0,1 a 10.000 nM (NCI/ADR-RES) de concentrações de solução de doxorrubicina ou doxorrubicina-nanoparticulas por 24 horas. Após 24 horas, os tratamentos por droga respectivos foram removidos. As células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato resfriado em gelo e substituídas por meio fresco. O meio foi substituído todas as 48 horas. Um ensaio de MTT foi utilizado para apurar a citotoxicidade no quinto dia seguindo o tratamento (NCI e OVCAR- 3) . Os resultados mostram que a carga de doxorrubicina em nanopartículas de zeina teve uma potência significativamente mais alta do que a solução de doxorrubicina livre em células de câncer humanas. Nanopartículas carregadas de doxorrubicina foram aproximadamente 12 a 16 vezes mais potentes do que a doxorrubicina livre. Acredita-se que a diferença em potência ocorra devido à diferença no mecanismo de absorção de célula de droga livre e droga encapsulada em nanopartículas. A doxorrubicina livre é absorvida por meio de difusão passiva determinada por meio do gradiente de concentração, ao mesmo tempo em que as nanopartículas carregadas de doxorrubicina são absorvidas em um processo de endocitose ativa. Adicionalmente, acredita-se que a endocitose de nanopartículas carregadas de doxorrubicina possa evitar bombas de efluxo de droga em células de câncer resistentes, resultando, assim, em melhor eficácia.

[092]Em um aspecto adicional da presente invenção, a estabilidade enzimática das nanopartículas produzidas por meio dos métodos descritos da invenção pode ser intensificada adicionalmente por meio de reticulação. A FIGURA 17 ilustra o método geral para a preparação de nanopartículas limpas reticuladas de zeina utilizando glutaraldeído conforme o agente de reticulação. Um exemplo específico de tal preparação é tal como segue.

Exemplo VIII

[093]As nanopartículas de zeina modelo foram preparadas com o uso do método de nanoprecipitação descrito. Um agente de reticulação foi adicionado seguindo a sonicação de sonda da segunda fase aquosa. As nanopartículas foram adicionalmente incubadas por 24 horas. No final do tempo de incubação, as nanopartículas foram purificadas com o uso de filtração centrífuga e foram, então, liofilizadas.

[094]A zeina, em uma quantidade de 0,0135 g, foi dissolvida em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água. À primeira fase de solução foi, então, adicionada em gotas uma quantidade de 15 ml de tampão de citrato que tem um pH 7,4 e que contém uma combinação de 0,45% em peso/volume de lecitina e Pluronic® F68 (0,9% em peso/volume) mediante aplicação constante de energia ultrassónica a 1,39 kW/h e 37% de amplitude por dez minutos com um periodo de ativação de pulso de dez segundos e periodo de inatividade de um segundo. Durante o processo de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. À solução foi adicionada uma quantidade de 0,5 ml de glutaraldeido de 25% em peso/volume e a solução foi incubada por 3 a 24 horas a 37°C enquanto era agitada a 300 a 500 rpm. O glutaraldeido residual foi neutralizado com 10% em peso/volume de metabisulfito. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético a 300 a 500 rpm e à temperatura ambiente até que o etanol seja completamente evaporado. Após a evaporação completa do álcool, as nanoparticulas foram purificadas para remover o material residual. A purificação foi realizada através de lavagem repetida com tampão de citrato com pH 7,4 e ultracentrifugação, com o uso de filtro centrifugo de MWt de corte (massa molecular de corte) de 5000 Da, a 3950g por 50 minutos. À suspensão aquosa de nanoparticulas foi adicionada uma quantidade de 35 mg de trehalose e a solução foi mantida a -80 °C para formar uma torta sólida. O material foi, então, liofilizado a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas.

[095]Notavelmente, para os outros agentes de reticulação, como EDC/NHS e genipina, quando utilizados no método de Figura 13, o tempo de reação pode variar de 24 a 72 horas. Os grupos amino de superfície em zeina são envolvidos em reticulação. O ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) foi utilizado para estimar os grupos amino livres em zeina antes e depois da reticulação. Uma curva padrão foi gerada com concentração crescente de zeina não-reticulada e reticulada versus absorbância a 440nm de comprimento de onda. A eficiência da reticulação foi calculada com o uso da fórmula: % de eficiência de reticulação = [a-b/a] x 100, na qual a = coeficiente angular de zeina não- reticulada versus absorbância, e b= coeficiente angular de zeina reticulada versus absorbância. A faixa de concentração de zeina utilizada para construir a curva padrão é 0,357 mg/ml a 12 mg/ml, e o coeficiente de correlação é 0,9994.

[096]A extensão de reticulação em nanoparticulas de zeina com o uso de diferentes agentes de reticulação é mostrada na Figura 18. A eficiência de reticulação variou de aproximadamente 70% a aproximadamente 100%. A extensão de reticulação pode ser variada através da alteração do tempo de reação para a faixa de aproximadamente três horas a três dias dependendo do agente de reticulação. O agente de reticulação mostrado aqui representa apenas exemplos e os métodos da invenção não são limitados ao uso de apenas os agentes de reticulação descritos. Outros agentes de reticulação podem ser utilizados, tais como ácidos policarboxilicos (ácido citrico ou ácido 1,2,3,4- butanotetracarboxilico).

[097]Adicionalmente, embora o método seja ilustrado em relação ao preparo de nanoparticulas de zeina modelo, a reticulação pode ser provida na formação de nanoparticulas que contêm moléculas especificas. Um exemplo especifico de preparo de rodamina, um corante solúvel em água, em uma nanoparticula ocorre tal como segue.

Exemplo IX

[098]A zeina branca na quantidade de 0,0135 g foi dissolvida em uma mistura de 3 de etanol e 0,25 ml de água (0,25 ml). À primeira solução aquosa foi adicionada uma quantidade de 0,005 g de rodamina-123. A solução resultante foi adicionada em gotas em 15 ml de tampão de citrato que tem um pH 7,4 e que contém uma combinação de 0,0675 g de lecitina e (0,135 g) de Pluronic® F68 mediante a aplicação constante de energia ultrassónica a 39 kW/h e 37% de amplitude por dez minutos com um periodo de ativação de pulso de dez segundos e um periodo de inatividade de um segundo. Durante os processos de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. Então, uma quantidade de 0,5 ml de glutaraldeído de 25% em peso/volume foi adicionada e incubada por três horas a 37 °C enquanto era agitada a 300 a 500 rpm. O agente de reticulação residual foi neutralizado com 10% em peso/volume de metabisulfite de sódio. Subsequentemente, a dispersão foi colocada em um agitador magnético a 300 a 500 rpm e à temperatura ambiente até que o etanol foi completamente evaporado. Após a evaporação completa do álcool, as nanopartículas foram purificadas por ultracentrifugação. A purificação foi realizada através de lavagem repetida com tampão de citrato com pH 7,4 e ultracentrifugação, com o uso de filtro centrifugo de MWt de corte (massa molecular de corte) de 5000 Da, a 3950g por 50 minutos. À suspensão aquosa (tampão de citrato de pH 7,4) de nanopartículas carregadas por rodamina foi adicionada uma quantidade de 35 mg de trehalose e a solução foi mantida a -80°C para formar uma torta sólida, a qual foi, então, liofilizada a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas).

[099]O tamanho de partícula, o indice de polidispersidade e o potencial zeta de partículas de rodamina não-reticuladas e reticuladas (com o uso de glutaraldeido como agente de reticulação) são mostrados na Tabela 6. Tabela 6

Cada valor é um meio de três experimentos (±SD).

[0100]A liberação de droga in-vitro a pH 7,4 é mais vagarosa quando as nanoparticulas de zeina são reticuladas (Figura 20) e, similarmente, a liberação enzimática também foi mais vagarosa (Figura 21). A reticulação dos grupos amino livres na superfície de nanoparticulas de zeina reduziu o tamanho de partícula, e também reduziu o acesso de solvente e atrasou a degradação enzimática das nanoparticulas. A reticulação também reduz significantemente a liberação de ruptura. Então, a reticulação pode estabilizar adicionalmente as nanoparticulas e sustentar a liberação de droga.

[0101]A atividade terapêutica e a eficácia das nanoparticulas produzidas pelo método da invenção podem ser adicionalmente melhoras através da fixação de polietilenoglicol (PEG) às nanoparticulas. Entre os benefícios adicionados de pegilação está o aumento na meia-vida de circulação das nanoparticulas. Uma vantagem adicional de PEG é que funciona como um espaçador para ligar os ligandos alvo, drogas e agentes de imageamento às nanoparticulas de zeina, se a conjugação direta não for possível.

[0102]A Figura 22 ilustra um método de preparo de nanoparticulas de zeina pegiladas de acordo com outro aspecto do método da invenção. Uma vantagem da zeina pegilada para produzir nanoparticulas é que pode ser produzida com o uso de apenas um tensoativo, como Pluronic® F68, em oposição ao uso de uma combinação de um tensoativo e fosfolipídios para a zeina não-pegilada. Um método específico de formação de nanoparticulas de zeina pegiladas ocorre tal como segue.

Exemplo X

[0103]A zeina pegilada foi produzida através da adição de 0,1 g de metóxi PEG-succinimidil succinato (Mwt de 5000 Da) a 0,lg de zeina branca em 5 ml de 90% de etanol. A mistura foi incubada por um período de três horas e 24 horas a 37°C. A solução foi, então, dializada (Mwt de corte de 10.000 Da) contra água em um agitador magnético (barra de agitação magnética agitada a 100 rpm) à temperatura ambiente por 24 horas para remover quaisquer materiais residuais. O produto resultante foi, então, congelado a -80°C sucedido por secagem por congelamento a -47°C a 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas. A eficiência da pegilação observada ao longo de diversos períodos de incubação é mostrada na Tabela 7, abaixo, em que as porcentagens de eficiência foram determinadas com o uso de um procedimento de ensaio de TNBS conforme descrito mais acima. PEGs com outros peso molecular, tais como 500 a 5.000 Da, podem ser utilizados. Similarmente, os derivados de PEG, como metóxi PEG-N-hidroxil succinato éster, ou outros derivados podem ser utilizado. Tabela 7

[0104]Uma quantidade de cinquenta miligramas de zeina branca pegilada foi dissolvida em uma mistura de 3 ml de etanol e 0,25 ml de água desionizada. A solução de zeina pegilada foi então adicionada em gotas em uma quantidade de 15 ml de tampão de citrato que tem um pH 7,4 e que contém Pluronic® F68 (0,9% em peso/volume) mediante a aplicação constante de energia ultrassónica a l,39kW/h e 37% de amplitude por dez minutos com um periodo de ativação de pulso de dez segundos e um periodo de inatividade de um segundo. Durante os processos de sonicação, a solução foi mantida em um banho de gelo para manter a temperatura a cerca de 10°C. Subsequentemente, a suspensão de zeina foi colocada em um agitador magnético a 300 a 500 rpm à temperatura ambiente até que o etanol fosse completamente evaporado. Quando a evaporação estava completa, as nanopartículas foram purificadas. A purificação foi realizada através de lavagem repetida com tampão de citrato com pH 7,4 e ultracentrifugação, com o uso de filtro centrifugo de MWt de corte (massa molecular de corte) de 10000 Da, a 44.000g por 35 minutos. À suspensão aquosa (tampão de citrato de pH 7,4) de nanopartículas de zeina foi adicionada uma quantidade de 30g de 2% em peso/volume de trehalose e a solução foi mantida a -80°C para formar uma torta sólida, a qual foi, então, liofilizada a -47°C e 60 mTorr de vácuo por doze a catorze horas) . O processo de pegilação apresentado acima pode ser realizado com o uso de homogeneização de alta pressão, conforme apresentado no Exemplo II, acima. A distribuição de tamanho das nanopartículas pegiladas é mostrada na Figura 23.

[0105] Devido ao fato de que a zeina é uma proteina, uma vantagem adicional do uso de zeina na formação de nanoparticulas se deve ao fato de que a zeina tem um grande número de grupos funcionais de superfície que podem ser utilizados para fixar ligandos alvo, agentes de imageamento, drogas e outros polímeros para alvo de droga para tecidos específicos e outras aplicações biomédicas.

[0106]As nanoparticulas de zeina formadas com o uso do método apresentado podem ter outros usos, particularmente, fora do corpo. Por exemplo, as nanoparticulas de zeina carregadas com droga podem ser utilizadas como um material de revestimento para dispositivos cardiovasculares e outros dispositivos biomédicos. Embora descritas no presente documento em relação à distribuição de droga, as nanoparticulas produzidas pelo método apresentado podem ser utilizadas para encapsular e sustentar a liberação de moléculas de interesse para as indústrias alimentícias, de laticínios e de cosméticos. Além das drogas humanas, drogas veterinárias também podem ser encapsuladas em nanoparticulas que utilizam os métodos apresentados. As nanoparticulas de zeina podem ser utilizadas para proteger moléculas de agentes ambientais adversos tais como umidade, oxidação, luz, etc. Esta utilização pode inclui moléculas de interesse para indústrias farmacêuticas, alimentícias, de laticínios e de cosméticos.

[0107]A zeina pode ser combinada com outros polímeros sintéticos ou naturais para projetar nanoparticulas inovados com propriedades exclusivas para várias aplicações nas indústrias biomédicas, farmacêuticas, alimentícias, de laticínios e de cosméticos. Por exemplo, através da fixação de um polímero ou ligante sensível a pH, as nanoparticulas de zeina podem ser produzidas para liberar o droga em resposta a um estimulo de pH.

[0108]Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, mencionados no presente documento são incorporadas no presente documento a titulo de referência ao ponto em que cada referência é individual e especificamente indicada como sendo incorporada por referência e apresentada em sua totalidade no presente documento, incluindo: 1. H. Bernstein, E. Morrei, E. Mathowitz, K. Shwaller, T.R. Beck. Protein microspheres and methods of using them. Patente nP. US5.679.377 cedida em 21 de outubro de 1997. 2. X. Liu, Q. Sun, H. Wang, L. Zhang , J.Y. Wang. Microspheres of corn protein, zein, for an ivermectin drug delivery system. Biomaterials 26 (2005) 109-115. 3. P. H. Lopez, S. Murdan. Zein microspheres as drug/antigen carriers: A study of their degradation and erosion, in the presence and absence of enzymes. J. Microencapsulation 23 (2006) 303-314. 4. Q. Zhong, M. Jin, D. Xiao, H. Tian, W. Zhang. Application of supercritical anti-solvent techniques for syntheses of delivery systems of bioactive food components. Food. Biophysics 3 (2008) 186-190. 5. N. Parris, P.H. Cooke, K.B Hicks. Encapsulation of Essential Oils in Zein Nanospherical Particles. J.Agric Food. Chemistry 53 (2005) 4788-4792. 6. L. E. Stark, A.T. Gross. Hydrophobic protein microparticles. . Patente nP. US5.330.778 cedida em 19 de julho de 1994 . 7. S. Rudt, R.H. Muller, hi vitro phagocytosis assay of nano- and microparticles by chemiluminescence. II. Effect of surface modification by coating of particles with poloxamer on the phagocytic uptake. J. Control. Release. 25 (1993) 51-59. 8. P.H. Lopez, S. Murdan. An investigation into the immunogenicity and adjuvanticity of zein microspheres used as vaccine carriers. J. Pharm. Pharmacol. 58 (2006) 769-774. 9. R. B. Cook, F.M. Mallee, M. L. Shulman. Purification of zein from corn gluten meal. . Patente nr. US5.245.673 cedida em 19 de outubro de 1993. 10. E. Y. Shalaev, T. D. Johnson-Elton, L. Chang, M. J. Pikal. Thermophysical Properties of Pharmaceutically Compatible Buffers at Sub-Zero Temperatures: Implications for Freeze-Drying. Pharm. Res. 19 (2002) 195-201. 11. N. Reddy, Y. Li, Y. Yang. Alkali-catalyzed low temperature wet crosslinking of plant proteins using carboxylic acids. Biotechnol. Prog. 25 (2009) 139-146. 12. Wheat gluten, corn gluten and zein film: affirmation of GRAS status. Fed.Register 50(1985) 8997-8999.

Claims (18)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS NÃO- IMUNOGÊNICAS, caracterizado pelo fato de compreender: a provisão de uma proteina hidrofóbica insolúvel em água; em que a dita proteina tem um grau selecionado da zeina; a dissolução da dita proteina com um solvente hidroalcoólico para formar uma primeira solução de fase aquosa; a adição de um agente tampão à primeira solução de fase aquosa na presença de um tensoativo e um fosfolipidio para produzir uma segunda solução de fase aquosa que tem um pH entre pH 6,8 e pH 7,4; em que o dito agente tampão é tampão de citrato; o dito tensoativo é um poloxâmero; e o dito fosfolipidio é lecitina; o processamento da dita segunda solução de fase aquosa para efetuar uma redução no tamanho do diâmetro das partículas dentro da solução; a evaporação de todo solvente residual para produzir nanoparticulas com um tamanho de diâmetro menor do que 400 nm; e a centrifugação das ditas nanoparticulas.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a liofilização das nanoparticulas depois da centrifugação.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente a armazenagem das nanoparticulas sob condições que restringem a exposição das nanoparticulas à pressão atmosférica.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito grau selecionada da zeina ser zeina branca.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela relação entre o dito tensoativo e o dito fosfolipidio ser de 2:1.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito processamento da dita segunda solução de fase aquosa para efetuar uma redução no tamanho do diâmetro das particulas compreende adicionalmente a sujeição das nanoparticulas ao cisalhamento ultra-sônico, à homogeneização a alta pressão, ou a uma combinação destes.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a adição à dita proteina, na formação da primeira solução de fase aquosa, de uma molécula que é selecionada para a encapsulação da nanoparticula.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela dita molécula ser uma substância terapêutica selecionada para a administração a um indivíduo.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita proteina é pegilada.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a reticulação das ditas nanoparticulas.

11. NANOPARTÍCULA NÃO-IMUNOGÊNICA TERAPEUTICAMENTE ATIVA, caracterizada por ser formada pelo método, tal como definido nas reivindicações 1 a 10.

12. COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA, caracterizada por compreender uma nanoparticula não-imunogênica, conforme definida na reivindicação 11, formada pelo encapsulamento de uma molécula terapêutica em uma proteina insolúvel em água hidrofóbica, em que a dita nanopartícula tem um tamanho de diâmetro menor do que 400 nm.

13. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo dito tamanho de diâmetro da dita nanopartícula estar compreendido entre 100 nm e 300 nm.

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizada pela dita composição ser uma formulação oral, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, tópica, nasal ou oftalmológica.

15. USO DE UMA NANOPARTÍCULA NÃO-IMUNOGÊNICA, conforme definida na reivindicação 11, em que a dita nanopartícula tem um tamanho de diâmetro menor do que 400 nm, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para ser utilizado no tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo sofrendo, ou com o risco de sofrer, a doença ou condição.

16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela dita nanopartícula ter um tamanho de diâmetro de 100 nm a 300 nm.

17. KIT PARA A PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS NÃO- IMUNOGÊNICAS, conforme definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender: uma quantidade selecionada de uma proteína insolúvel em água; em que a dita proteína tem um grau selecionado da zeina; um solvente hidroalcoólico para dissolver a dita proteína; pelo menos um agente tampão; em que o dito agente tampão é tampão de citrato; um tensoativo selecionado; em que o dito tensoativo é um poloxâmero; e um fosfolipidio, em que o dito fosfolipidio é lecitina.

18. KIT, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente pelo menos um fosfolipidio selecionado em uma quantidade para obter uma relação selecionada em combinação com o dito tensoativo selecionado.

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