KR20110036704A - 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도 - Google Patents

비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20110036704A
KR20110036704A KR1020107027648A KR20107027648A KR20110036704A KR 20110036704 A KR20110036704 A KR 20110036704A KR 1020107027648 A KR1020107027648 A KR 1020107027648A KR 20107027648 A KR20107027648 A KR 20107027648A KR 20110036704 A KR20110036704 A KR 20110036704A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nanoparticles
zein
solution
protein
immunogenic
Prior art date
Application number
KR1020107027648A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101616771B1 (ko
Inventor
오마타누 피. 페루말
사티시 케이. 포다라라
래드헤이 에스. 카우식
Original Assignee
사우스다코타주립대학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사우스다코타주립대학 filed Critical 사우스다코타주립대학
Publication of KR20110036704A publication Critical patent/KR20110036704A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101616771B1 publication Critical patent/KR101616771B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/721—Dextrans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

나노침전 과정에서 pH를 조절하여 단백질 원천의 비면역원성 나노입자의 생성방법이 기술되어 있다. 상기 개시된 방법에 의해 생성된 나노입자는 직경 크기가 약 100 nm 내지 약 400 nm의 범위에 있으며, 바람직하게는 직경 크기가 약 100 nm 내지 약 300 nm의 범위에 있으며, 이에 의하여 비면역원성이 된다. 또한, 본 발명은 치료, 진단 및 기타 다양한 용도에 적합한 나노접합체의 생성방법을 개시한다.

Description

비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도{METHOD OF FORMING NON-IMMUNOGENIC HYDROPHOBIC PROTEIN NANOPARTICLES AND USES THEREFOR}
본 발명은 나노입자의 형성방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 소수성, 수불용성 단백질계 중합체로부터 나노입자를 형성하여 제약, 치료 및 진단 응용에 이용되는 비면역원성 전달 시스템을 생성하는 나노입자의 형성방법에 관한 것이다.
본 명세서에 논의된 참고 문헌은 본 발명에 관한 분야의 설명을 위한 목적으로만 제공된다. 본 명세서의 어떤 부분도 선행 발명에 의해 본 발명자들이 개시물보다 선행한다는 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
제인(Zein)은 옥수수에서 분리된 식물성 단백질이며 프롤린, 글루타민, 아스파라긴과 같은 소수성 아미노산을 다량 함유한 프롤라민류(prolamines)의 계열에 속한다. 제인은 무색, 무취 무독성, 생분해성 및 수불용성이다. 제인은 제약, 의학, 식품, 화장품, 접착제 및 포장재 산업에서 중합체로서 연구되고 이용되어 왔다.
식품 및 제약 산업에서, 제인은 예를 들어 물질을 피막하고 극미립자 또는 나노입자와 같은 미립자 시스템을 형성하는데 사용되어 왔다[1-5]. 제인 입자를 형성하는 다양한 방법들이 제안되었다. 예를 들어, 본 명세서에도 그 내용이 포함된 미국 특허 번호 제 5,330,778 호는 제인을 이용한 극미립자 제조방법을 논의하며 제인 극미립자 형성를 위해 pH 변화를 이용한다[6]. 그러나, 미국 특허 번호 제 5,330,778 호에서 기술된 방법으로는 더 큰 마이크론 크기를 가지며 넓은 입자 크기 분포도를 갖는 제인 입자를 생성하는데, 이는 예를 들어, 생체 내 사용 등에서 큰 약점이 되고 있다.
인간 또는 동물에 사용되는 바이오재료는 안전하고 비면역원성임을 확보하는 것이 중요하다. 일반적으로, 입자를 생체 내에 투여할 때 (예컨대, 인체 내 도입) 면역학적 인지 및 이물질 제거를 담당하는 혈액과 조직의 식세포들은, 입자의 물리화학적 특성에 따라 면역 반응을 시작할 수 있다. 식세포에 의한 섭취는 입자의 크기 및 그 외래 입자의 표면 소수성에 따라 달라진다. 일반적으로, 직경 약 500 nm를 초과하는 크기의 입자들이 식균작용의 대상이 된다. 표면 소수성을 갖는 입자들이 식세포에 용이하게 인식된다[7]. 예를 들어, 로페즈와 무단(Lopez and Murdan) [8]의 최근 보고에 따르면, 직경 1.36±0.036 μm인 제인 마이크로스피어(microsphere)는 면역원성이 있으므로 약물, 백신 또는 기타 치료용 담체로서 부적당하다고 한다.
본 발명은 종래기술의 문제점을 해결한 나노입자의 형성방법을 제공하는 것으로, 구체적으로는 소수성의 수불용성 단백질계 중합체로부터 나노입자를 형성하여 제약, 치료 및 진단 응용에 이용되는 비면역원성 전달 시스템을 생성하는 나노입자의 형성방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 본 발명은 아주 작은 입자 또는 나노입자의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 입자는 예를 들어, 제인 등의 소수성의 수불용성 단백질로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서 예를 들어 소수성의 수불용성 단백질 등에서 형성된 크기가 큰 나노입자 또는 극미립자를 사용할 때 겪는 면역원성을 감소시키거나 실질적으로 극복하는 나노입자를 생성하는 방법이 채용된다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자의 비면역원성 효과는 본 방법에 따라 형성된 입자의 크기 및 입자 크기의 범위를 조절함으로써 달성된다.
본 발명의 실시예들에서, 입자 직경 크기의 범위는 약 400 nm 미만이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 입자 직경 크기의 범위는 약 300 nm 미만이며, 다른 실시예에서, 입자 직경 크기의 범위는 약 100 nm 내지 약 300 nm이다. 본 명세서에서 직경 기준으로 크기를 논의될 때, 나노 입자에서 구형이 달성될 수 있다고 하더라도 나노입자가 만들어질 수 있다고 해도 본 명세서에서 논의된 나노입자가 완벽한 구형을 의미한다고 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 논의된 치수는 단순히 입자의 양단을 측정한 것이거나 양단으로부터 가장 큰 치수를 측정한 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 방법은 다양한 식물, 동물 및 합성 원천에서 유래할 수 있는 수불용성, 소수성 단백질을 이용하여 수행될 수 있다. 다양한 측면에서, 본 발명의 방법이 예를 들어, 프롤린, 글루타민 및 아스파라긴과 같은 소수성 아미노산을 다량 함유한 프롤라민류의 계열을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 소수성 아미노산은 단백질을 수불용성으로 만든다. 프롤라민류는 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수와 같은 다양한 곡물과 다른 식물 및 동물 원천들에서 발견될 수 있다. 프롤라민의 적절한 예는 제인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린(kafirin) 등이 있으나 본 발명의 방법에 따른 적용 시 이 예들에 한정되는 것은 아니다. 본 설명의 목적에 비추어, 그리고 단순히 본 발명의 한 예시 수단으로 제인을 이용한 방법이 본 명세서에 기술된다.
본 발명의 방법에 따른 다양한 실시예에서, 백색 제인이 약 100 nm 내지 약 400 nm의 바람직한 직경 크기를 갖는 나노입자를 제조하는데 이용된다. 황색 제인을 이용하면 직경이 상대적으로 더 큰 입자를 생성할 수 있으며, 입자 직경 크기 분포도가 더 넓은 입자를 생성할 수 있다고 알려져 있다. 황색 제인의 색소가 노란 제인의 용해도 및 황색 제인을 이용한 나노입자 형성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 방법은 달리 가능할 수 있는 것보다 일반적으로 더 작은 크기와 더 좁은 직경 크기 범위의 나노입자를 생성한다. 이들 더 작은 나노입자는 제인과 같은 염기성 단백질의 특정한 하나 이상의 등급을 이용한 pH-조절 나노침전 공정을 수행하고, 나노입자를 비면역원성으로 만드는 나노입자 크기와 직경을 달성하기 위해 선택된 다양한 완충제, 계면활성제 및 인지질의 다양한 조합을 이용함으로써 달성된다.
또한, 본 발명의 방법은 나노입자와 함께 캡슐화, 흡수, 착화 또는 접합된 물질을 형성하기 위하여 다양한 물리화학적 성질을 갖는 다양한 분자, 입자 또는 작용제들과 함께 나노입자를 제조하는데 적절하다. 예를 들어, 상기 방법은 작은 친수성 분자, 작은 소수성 분자 및 거대분자들을 포획하는데 이용될 수 있다. 이 예들의 각각의 경우에서 약 60% 내지 약 80%의 캡슐화 효율이 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 형성된 나노입자는 캡슐화된 분자를 생체 내 환경 및 시험관내 환경에서 1 주일 또는 그 이상 지속적으로 전달할 수 있게 한다.
본 발명의 일 측면에서, 예컨대, 항암제를 함유하는 나노입자 등의 치료 및/또는 진단용 나노입자를 생성하는 방법이 채용된다. 이러한 나노입자들은 소분자 약물, 핵산, 단백질, 백신, 항체, 화학 작용제 또는 기타 제제나 물질 등 많은 경우 치료제로 쓰이는 활성제의 표적 전달 및 일시적 방출 제어를 제공할 수 있다. 상기 기술한 치료 방법 외에 본 발명은 예컨대, 조영제, 프로브 등 진단 모이어티를 갖는 나노입자를 생성하는 수단을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 본 발명의 방법에 따른 나노입자 제조를 위한 키트(kit)를 제공한다. 상기 키트는 선택된 양의 수용성 단백질, 적어도 하나의 완충제 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 또한, 상기 키트는 또 히드로알코올 용매를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 적어도 하나의 인지질을 포함할 수 있는데 그 양은 인지질 대 계면활성제의 선택된 비율을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 따른 블랭크(blank) 제인 나노입자의 일반적인 형성 단계를 순서도로 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 6,7 히드록시 쿠마린 함유(6,7 hydroxy coumarin-loaded) 나노입자의 형성 단계를 순서도로 나타낸다.
도 3은 제인 나노입자의 다양한 전자 현미경 사진들을 도시한다. 도 3 (a)는 빈 제인 나노입자의 주사전자현미경 사진이다. 입자들은 부드러운 표면의 구형으로 보인다. (눈금은 1 mm = 1.76 ㎛을 나타낸다). 도 3(b)는 빈 제인 나노입자의 투과전자현미경 사진이다. (눈금은 1 mm = 8.038 ㎚을 나타낸다.) 도 3(c)는 쿠마린 함유 제인 나노입자의 주사전자현미경 사진이다. (눈금은 1 mm = 0.87 ㎛을 나타낸다.) 도 3(d)는 6, 7 히드록시 쿠마린 함유 제인 나노입자의 투과전자현미경 사진이다. (눈금은 1 mm = 8.04 ㎚를 나타낸다.)
도 4는 본 발명의 대기 중 태핑 모드(tapping mode in air)에서 본 발명의 방법에 따라 생성된 빈 제인 나노입자의 원자간력현미경 (AFM) 사진들을 도시한다. 각각 14.19 nm, 22.2 V, 및 45°의 z-스케일을 갖는 대표 샘플의, 좌에서 우의 순서로 높이, 진폭, 상(phase) 이미지를 나타낸다. 스캔 사이즈는 1.14 x 1.14 ㎛이다. AFM으로 측정한 50개 입자 간 평균 크기는 185 nm이다.
도 5는 완충제가 본 발명의 방법에 따라 제조된 쿠마린 함유 제인 나노입자의 동결건조 전후 크기에 미치는 영향을 타입별로 나타낸 그래프이다. 본 발명의 침전 방법에 인산염 완충제를 사용했을 때 보다 구연산염 완충제를 사용한 경우 동결건조 후 일관되게 더 작은 나노입자를 생성한다. (* p<0.05). 그래프상의 각 점은 평균값±표준편차(n=3)를 나타낸다. 구연산염 완충제는 탈이온수 내 구연산 (0.0153 g/L)과 구연산나트륨(2.91 g/L)으로 구성되었다. 인산염 완충제는 탈이온수 내 제2인산나트륨(1.44 g/L), 제1인산칼륨(0.25 g/L) 및 염화나트륨(10 g/L)으로 구성되었다. 이들 두 완충제는 본 발명에서 pH 7.4에서의 제2 수상(水相)을 유지하기 위해 사용되었다.
도 6은 본 발명의 독소루비신 함유 나노입자의 제조방법의 일반적인 단계를 순서도로 나타낸다.
도 7은 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 중의 6,7 히드록시 쿠마린-로딩된 제인 나노입자의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 쿠마린 함유 제인 나노입자(10 ㎎/㎖)를 투석막(SpectraporTM 분자량 5000 Da) 안에 두고 트립신(trypsin (10 ㎎/㎖)) 비 존재하(비 효소) 또는 존재 하(효소) 조건에서 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 에서 배양하였다. 에탄올(ethanol (20% v/v))을 싱크(sink) 조건 유지를 위해 배지에 첨가하였고 아지드화 나트륨(sodium azide (0.005% w/v))을 항균제로 사용하였다. 상기 용액을 수평 항온 진탕 수조에서 50 rpm , 37℃로 유지하였다. 싱크 조건을 유지하기 위해 투석액의 부분표본(1 ㎖)을 7일간 각기 다른 시점에서 제거하고 새 배지로 교체하였다. 형광분광법(λEX= 490nm; λEm= 520 nm)을 이용하여, 제인 나노입자에서 방출된 쿠마린에 대해 투석액을 분석하였다. 각 데이터 점은 3회의 실험 평균값(±표준편차)이다. 모든 시점(p< 0.05)에서 효소 방출이 비-효소 방출 보다 높았다.
도 8은 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 내에서 제인 나노입자로부터 독소루비신의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 나노침전 방법에 의해 제조된 독소루비신 함유 제인 나노입자(10 ㎎/㎖)를 원심관 내의 1 ㎖ 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 에서 배양하였고 상기 용액을 수평 항온 진탕 수조에서 50 rpm, 37℃로 유지하였다. 상기 표본을 10,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하고, 나노입자에서 방출된 독소루비신에 대해 HPL를 이용하여 상청액을 분석하였다. C- 18 칼럼을 이용하였고 이동상(유속 1 ㎖/min)은 0.1 % TFA:아세토니트릴(Acetonitrile) (아세토니트릴 농도구배 5% 내지 80% 사용)이었다. 독소루비신 검출을 위해 형광검출기(λEX= 505nm; λEm= 550 nm)를 사용하였다. 방출 실험은 최대 4일 동안 실시하였다. 각 데이터 점은 3회의 실험 평균값±표준편차이다.
도 9는 본 발명의 덱스트란-FITC(방법에 따른 덱스트란(dextran)-FITC (플루오로이소티오시아네이트) 함유 나노입자의 제조방법의 일반적인 단계를 순서도로 나타낸다. 덱스트란의 분자량은 4000 Da이다.
도 10은 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 내에서 제인 나노입자로부터 덱스트란-FITC의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 덱스트란-FITC 함유 제인 나노입자(10 ㎎/㎖)를 본 발명의 방법에 의해 제조하고, 원심관 내의 1 ㎖ 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 에서 배양하였으며 상기 용액을 수평 항온 진탕 수조에서 50 rpm, 37℃로 유지하였다. 상기 표본을 10,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하고, 나노입자에서 방출된 덱스트란-FITC에 대해 형광분광법(λEX= 490nm; λEm= 520 nm)을 이용하여 상청액을 분석하였다. 상기 실험은 8일 동안 실시하였다. 각각의 점은 평균값±표준편차(n=3)를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 플라스미드 DNA 함유 나노입자의 제조방법의 일반적인 단계를 순서도로 나타낸다. 덱스트란의 분자량은 4000 Da이다. 본 실험에서 사용된 녹색형광단백질(GFP)을 인코딩하는 플라스미드 DNA(pDNA)는 LB 배지에서 성장한 대장균(E. coli)의 DH5α 균주를 사용하여 증식하였다. 상기 플라스미드는 키아겐(Qiagen)의 '엔도프리 플라스미드 메가 키트(EndoFree Plasmid Mega Kit)'를 사용하여 분리하였다. 정제된 pDNA는 UV-분광광도계를 사용하고, UV 흡수도의 비율을 260/280 nm에서 계산하여 특징화하고, 아가로스겔 전기영동에 의하여 특징화하였다.
도 12는 돼지 다형핵 백혈구에 의한 제인 나노입자의 섭취 시 이에 미치는 입자크기의 영향을 나타낸다. 상기 도면은 제인 입자 및 양성 대조 지모산(zymosan) 존재하에서 루미날 화학발광(luminal chemiluminescence) (90분 초과) 커브 하의 면적 백분율을 보여 준다. 각 실험은 4 회의 실험 평균값±표준편차이다. 섭취는 타 그룹과 비교하여 더 작은 입자 크기(p<0.05)에서 현저하게 낮다.
도 13은 최초 제인 입자를 셋째 주에 주사하고 제인 입자를 추가로 다섯째 주에 주사한 후 측정한 항-제인 항체들(흡광도)을 나타낸다. 각 값은 평균값±SEM (n=4)로 나타난다. 최초 및 추가 역가는 생리식염수군과 비교하여 모두 통계적으로 유의할만한 수준(p>0.05)이 아니었다. 제인 조현탁액(coarse zein suspension) 또는 생리식염수 (100 ㎍/50 ㎕ 상당) 내의 제인 입자를 암컷 Balb/c 마우스에게 피하로 주사하였다. 안와총(orbital plexus)에서 혈액을 채취하고 마우스 엘리사 키트(ELISA kit)를 이용하여 희석한 혈청(1/16)에서 항 제인 항체 농도를 측정하였다.
도 14는 디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide: MTT) 분석을 이용하여 4시간 동안 처리한 후, 미토콘드리아 탈수소 효소의 상대적 활성으로 표현된 돼지 창자 상피세포(IPEC-J2 세포)의 세포 생존율(20,000 세포/웰)에 미치는 황색 제인(Y) 및 백색 제인(W)의 영향을 나타내는 그래프이다. 아무 처리도 하지 않은 플레이트를 대조군으로 사용하였고 100% 생존한 것으로 간주된다. 제인 분말을 55 % v/v 에탄올에 용해시키고 무혈청 배지에서 5 ㎎/㎖ 원액으로부터 추가 희석하였다. 모든 농도에서 황색 제인(Y) 및 백색 제인(W) 모두 무처리(* p<0.05)의 대조군과 현저한 차이가 없었다.
도 15는 본 발명에 따라 제조된 독소루비신 용액 및 독소루비신-제인 나노입자의 OVACAR-3 세포(인간 난소암 세포)에서의 시험관 내 세포 독성 프로파일을 나타낸다. 세포들을 0.0001 μM 내지 10 μM 농도의 독소루비신 용액 및 독소루비신 함유 나노입자에 24시간 노출시켰다. 상기 약물 처리를 24 시간 후 제거하고 블랭크 배지(blank medium) (48시간 마다 배지 교체)에서 세포를 5 일간 배양하며, 5 일째 되는 날 세포 생존율을 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 각 데이터 점은 4 회 실험 평균값이다. 독소루비신 용액 및 독소루비신-제인 나노입자에 대한 IC50는 각각 3.1 nM 및 0.20 nM이었다. (Dox = 독소루비신 용액; Dox-NP = 독소루비신 나노입자.)
도 16은 본 발명에 따라 제조된 독소루비신 용액 및 독소루비신-제인 입자의 항 독소루비신 인간 유방암 세포(NCI/ADR-RES 세포)에서의 시험관 내 세포 독성 프로파일을 나타낸다. 세포들을 0.0001 μM 내지 10 μM 농도의 독소루비신 용액 및 독소루비신 함유 나노입자에 24 시간 노출시켰다. 상기 약물 처리를 24 시간 후 제거하고 상기 세포들을 블랭크 배지(48 시간 마다 배지 교체)에서 5 일간 배양하고 5 일째 되는 날 세포 생존율을 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 각 데이터 점은 4 회의 실험 평균값이다. 독소루비신 용액 및 독소루비신 함유 나노입자에 대한 IC50는 각각 81.73 nM 및 6.41 nM이었다. (Dox = 독소루비신 용액; Dox-NP = 독소루비신 함유 나노입자.)
도 17은 본 발명의 교차 결합된 블랭크 제인 나노입자의 제조방법을 순서도로 나타낸다.
도 18은 제인 나노입자의 교차결합도를 24 시간 동안 교차결합제의 함수로 나타낸 그래프이다. 교차결합도는 TNBS 분석을 이용하여 결정하였다. 사용된 교차결합제는 GTA-글루타르알데히드(25% w/v 원액의 500 ㎕), EDC: 1-에틸-3- [3-디메틸아미노프로필]] 카르보디이미드(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) (0.6% w/v) 및 NHS: N-히드록실 숙신이미드(NHS: N-hydroxyl succinimide) (0.6%w/v) 였다. 사용된 제니핀 농도는 0.05% w/v 였다. "블랭크(blank)"는 임의의 교차결합제가 없는 제인 나노입자를 나타낸다. 데이터는 2 회의 실험 평균값이다.
도 19는 본 발명 로다민-123 함유 교차결합된 제인 나노입자의 제조방법들 순서도로 나타낸다.
도 20은 인산염 완충 식염수(0.1 M) pH 7.4내에서 제인 나노입자로부터 로다민-123의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 결과는 평균값±SEM(n=4) 을 나타낸다. NCS = 비교차결합 입자; CS = 교차결합 입자. 교차결합된 나노입자에서의 약물 방출은 비교차결합된 나노입자에서의 약물 방출 보다 현저하게(p>0.05) 적었다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 로다민-함유 제인 나노입자(20 mg)를 투석막(SpectraporTM 분자량 5000 Da) 안에 두고 5 ㎖ 인산염 완충 식염수(pH 7.4)에서 배양하다. 상기 용액을 수평 항온 진탕 수조에서 100 rpm, 37℃로 유지하였다. 싱크 조건을 유지하기 위해 투석액의 부분표본(1 ㎖)을 48 시간에 걸쳐 각기 다른 시점에서 제거하고 새 배지로 교체하였다. 형광분광법(λEX= 485nm; λEm= 530 nm)을 이용하여, 제인 나노입자에서 방출된 로다민에 대해 투석액을 분석하였다.
도 21은 pH 7.4의 트립신 존재 하에서 제인 나노입자로부터 로다민-123의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 결과는 평균값±SEM(n=4) 을 나타낸다. ENCS = 비교차결합 입자; ECS = 교차결합 입자. 교차결합된 나노입자에서의 약물 방출은 비교차결합된 나노입자에서의 약물 방출 보다 현저하게(p>0.05) 낮았다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 로다민-123-함유 제인 나노입자(20 mg)를 투석막(Spectrapor TM, 분자량 10,000 Da) 안에 두고 205 ㎍/㎖의 트립신을 함유하는 5 ㎍/㎖ 인산염 완충 식염수(0.1 M, pH 7.4)에서 배양하였다. 상기 용액을 수평 항온 진탕 수조에서 100 rpm, 37℃로 유지하였다. 싱크 조건을 유지하기 위해 투석액의 부분표본(1 ㎖)을 48 시간에 걸쳐 각기 다른 시점에서 제거하고 새 배지로 교체하였다. 형광분광법(λEX = 485nm; λEm= 530 nm)을 이용하여, 제인 나노입자에서 방출된 로다민-123에 대해 투석액을 분석하였다.
도 22는 블랭크 페길화(PEGylated) 제인 나노입자의 일반적인 제조방법을 순서도로 나타낸다.
도 23은 페길화 나노입자의 가중 분포의 세기(intensity of weighted size distribution)를 나타내는 그래프이다. 페길화 제인 나노입자의 입자 크기는 131±1 nm, 다분산성지수(PDI)는 0.282±0.01이었다. 또한, 데이터는 페그(PEG)로 제인 나노입자를 표면 변화시키면 입자 크기를 증가시키지 않으며, 나노입자들이 약물 전달 응용에서 요구되는 소기의 크기 범위 안에 든다는 것을 보여 준다.
본 명세서에 사용된 "나노입자"라는 용어는 일반적으로 적어도 한 치수가 1000 nm를 초과하지 않는 입자를 지칭하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 의해 형성된 니노입자는 본 명세서에서 정의하는 특이적인 값의 직경을 가진다. 또한, "나노입자"라는 용어의 사용도 1 분자에 함유되고 본 발명의 방법에 의해 형성된 블랭크 나노입자들과 나노입자들을 지칭하는 것으로 의미한다.
달리 정의되지 않으면(즉, 도 18), 본 명세서에 사용된 "블랭크 나노입자"라는 용어는 선택된 입자, 분자 또는 나노입자와 함께 형성되거나 접합된 물질을 갖지 않는, 본 발명의 방법에 따라 형성된 나노입자를 지칭하고 의미한다.
본 명세서에 사용된 "직경"이라는 용어는, 나노입자의 치수의 문맥에서 사용되는 경우, 입자의 질량 중심을 통과하는 직선들의 입자의 평균 직선 치수를 지칭한다. 구형이 아닌 입자의 직경을 구하는 허용 가능한 근사치는 예를 들어, 좌표계의 세 직교축을 따라 입자의 가장 긴 치수와 정렬된 축들 중 하나와 입자의 두께 평균값을 취하여 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "투여된" 또는 "투여"라는 용어는 나노 입자에 대해 치료 및 진단 용도의 맥락에서 사용되는 경우, 예를 들어, 표적 부위에 치료제를 전달하는 목적을 위해 선택한 양의 나노입자를 생체 내 또는 시험관 내 환경으로 도입하는 것을 지칭하고 포함한다.
본 명세서에 사용된 "생체 내(in vivo)" 는 환자의 신체와 같은 피검자의 신체 또는 신체 내를 의미하며, 구강, 정맥 내, 복강 내, 비 경구적, 피하, 국소, 눈 및 비강 투여 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는 나노입자의 투여를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "시험관 내(in vitro)" 는 피검자 또는 환자의 신체의 외부 환경을 의미하거나 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "피검자" 또는 "환자"라는 용어 양쪽 모두는 예컨대, 인간 또는 인간이 아닌 동물과 같은 개별적인 복합 유기체를 지칭하거나 의미한다.
본 명세서에 사용된 "제인의 등급"은 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 번호 제 5,254,673 호[9]에 개시된 바와 같은 다양한 수단들에 의해 유래된 백색 제인 및 황색 제인을 포함하는 다양한 유형 또는 형태의 제인을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "치료제"라는 용어 및 이와 유사한 치료 또는 약효 기능을 지칭하는 용어들은 참조된 분자, 거대분자, 약물 또는 기타 물질이 피검자의 질병 또는 상태의 시작, 진행 및/또는 하나 이상의 증상들에 긍정적인 영향을 미칠 수 있으며, 질병 또는 기타 상태를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 나노입자와 함께 사용될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "생체적합성"이라는 용어는 본 발명의 개시된 방법에 의해 생성된 나노입자가 피검자에게 생체 내 투여되었을 경우 현저한 부작용을 야기하거나 도출하지 않는 것을 의미한다. 가능한 부작용의 예들은 독성뿐만 아니라 과다 염증 및/또는 과다 또는 부정적인 면역 반응을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된, 예를 들어 "일", "하나", 및 "상기"와 같은 단수형은 문맥이 명백하게 달리 적시하지 않는 한 복수를 포함한다. 예를 들어, "나노입자"에 대한 참조는 그러한 복수개의 나노입자들을 포함하며, "분자"에 대한 참조는 복수개의 분자들 및 그 균등물들에 대한 참조이다.
본 명세서에서 사용된 "약" 또는 "대략"은 언급된 숫자나 금액에 합당하게 가깝거나 약간 더 또는 덜 미치는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "구성된," "포함하는," "갖는, “함유하는” " “특징되는” 및 그 문법적 균등물들은 추가적, 언급하지 않은 요소들이나 방법 상 단계들을 배제하지 않을 뿐 아니라, 더 제한적인 용어인 "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"을 포함하는 포괄적 또는 개방형 용어이다.
본 발명은 나노입자의 입자크기를 약 100 nm 내지 400 nm의 크기 범위 내에서, 가장 바람직하게는 약 100 nm 내지 300 nm 사이의 크기 범위내로 조절함으로써 소수성의 수불용성 단백질로부터 비면역원성 나노입자의 생성방법에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 방법에 의해 비면역원성 나노입자의 일반적인 제조 단계를 순서도로 나타낸다.
본 방법의 최초 단계 또는 국면에 있어서, 수불용성 단백질(0.4 내지1.25 %w/v)을 에탄올과 탈이온수를 함유할 수 있는 히드로알코올 용매에 용해시킨다. 상기 용매의 조성은 예를 들어 90:10 %v/v 또는 92:8 %v/v일 수 있다. 선택한 분자를 나노입자에 캡슐화하는 방법에서는 캡슐화 대상 분자(0.03 내지 0.3%w/v)를 이 제 1 수상의 용액에 첨가한다. 캡슐화 대상 분자는 약 5 내지 50%w/w의 단백질 중합체이다.
상기 용액의 pH는 0.01 NaOH 또는 0.01 N HC를 첨가함으로써 약 pH 6 및 약 pH 7 사이로 상기 용액의 pH를 변경될 수 있다. 만약 물의 pH가 쿠마린과 같은 산성 분자를 첨가하거나 염기성 분자에 의해 변한다면 상기 pH는 pH 6 내지 7로 조절된다. 상기 제 1 상의 용액은 프로브 초음파 분해에 의해 처리될 수 있으며 단백질의 용해물이다.
본 발명에 따른 방법의 다음 단계에 있어서, 최초 단계 또는 상의 수용액은 초음파 전단하에 완충제에 첨가된다. 구연산염 완충제가 특히 바람직하다. 제 2 수상에서 활용되는 완충제의 선택은 나노입자를 형성하는 동안 pH 유지를 위해 중요한 것으로 간주되며, 본 개시물에서 후술하는 바와 같이 형성된 나노입자를 후속 단계에서 동결건조 하는 데에도 중요하다. 완충제를 사용하지 않거나, 또는, 예를 들어 0.1 N 염산을 제 2 수상 용액의 pH 조절하기 위해 사용한다면 생성된 입자는 구연산염 완충제 사용 시 형성된 입자보다 더 커지는 경향이 있으며, 상기 입자는 더 넓은 크기 범위를 보이는 경향이 있다. 구연산염 완충제 사용 시 약 100 nm와 같은 최소 입자 직경 크기를 일부 생성한다. 여타 완충제 사용 시 약 100 nm 내지 약 300 nm의 동일하거나 유사한 직경 크기 범위의 입자를 생성할 수 있으나, 동결건조 단계 후, 기타 완충제 사용 시 형성된 나노입자의 크기는 2-3배 증가하는 경향이 있다.
특히, 제 2 수상 용액의 pH는 소기의 나노입자의 크기를 얻기 위해 약 6.8 및 약 7.4 사이가 바람직하다. 만약 pH가 이 범위를 벗어 나면 입자 크기가 더 커지는 경향이 있으며, 생성된 입자의 다분산성 지수(PDI)도 높아 진다. PDI는 여러 크기의 범위들에서 입자 분포도의 척도이다. 따라서, 상기 방법은 히드로알코올 용액 및 제인의 등전위점에 근접하는 약 6.8 내지 약 7.4의 선택된 pH값을 갖는 수용액에서의 제인과 같은 단백질의 용해도 차이를 이용할 수 있다.
더 나아가, 제 2 수상 용액에 완충제를 첨가하는 것은 고 초음파 전단 또는 고압 균질화 조건, 또는 고 초음파 전단 및 고압 균질화 조건 조합하에서 수행될 수 있다. 초음파 전단의 초음파 에너지와 지속 시간은 소기의 직경 크기의 범위에 들어 가는 입자 형성에 특히 중요할 수 있다. 초음파 전단 에너지는 0.6 kW/h 내지 1.39 kW/h에서, 지속 시간은 2 분 내지 10 분, 이때 펄스 온 타임(pulse on-time)은 5 내지 10 초 및 펄스 오프 타임(pulse off-time)은 1 내지 5 초 조건으로 수행될 수 있다. 상기 초음파 처리는 소기의 크기 범위 내의 입자의 생성에 있어서 중요할 수 있다. 고압 균질화를 적용할 경우, 상기 처리는 0.1 mm 내지 0.25 mm의 오리피스 크기, 5 분 내지 10 분의 기간 및 5000 내지 40,000 psi의 압력에서 수행될 수 있다.
또한, 제 2 상의 완충제는 바람직하게는 계면활성제와 인지질을 선택된 비율로 함유할 수 있다. 계면활성제 대 인지질 비율은 약 2:1 % w/w가 될 수 있는데, 이 비율은 최적의 제조 결과를 가져 온다고 생각된다. 또한, 상기 비율은 1:0.5% w/w 또는 1:1% w/w 또는 1:2% w/w로 할 수도 있다. 특히, 계면활성제와 인지질 조합의 이용은 형성된 입자의 안정화 및 입자들의 응집 방지 보조에 특히 바람직하다. 예시 목적만으로, 계면활성제는 Pluronic® F68과 같은 폴록사머일 수 있으며, 인지질은 레시틴일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 기타 계면활성제는 폴록사머류(Pluronic® F68), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류(Brij), 소르비탄 에스테르류(Span), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르류 (Tween)와 같은 기타 비이온성 계면활성제, 소듐 디옥틸 설포석시네이트(sodium dioctyl sulfosuccinate), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide), n-도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(dodecyl trimethyl ammonium bromide)와 같은 이온성 계면활성제 및 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)과 같은 중합체를 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 기타 인지질은 계란 레시틴, 콩 레시틴, 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 1, 2-디올레오일-3 트리메틸암모늄 프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethyl ammonium propane)과 같은 비이온성 및 대전된 지질 또는 인지질을 포함한다.
폴록사머와 레시틴의 선택된 비율에 의한 조합(예컨대, 0.9% w/w:0.45% w/w)으로 약 100 nm 내지 약 300 nm 범위의 소기의 직경 크기 범위에 있는 나노입자를 생성할 수 있다고 한다. 계면활성제나 인지질 중 어느 하나만을 사용하면 소기의 직경 크기 범위를 벗어 나는 큰 입자가 만들어 진다고 일반적으로 알려져 있다. 그러나, 본 명세서에서 개시된 방법에 따라 계면활성제나 인지질을 사용하면 비면역원성에 대한 소기의 크기를 갖는 나노입자를 제조할 것이다.
제 2 상의 용액에 초음파 전단 및/또는 고압 균질화 적용 이후, 에탄올 또는 기타 용매를 증발시켜 나노입자를 형성하기 위해 상기 혼합물을 교반할 수 있다. 상기 교반은 기계적 교반기를에 의해 수행될 수 있으며, 약 300 rpm 내지 약 500 rpm의 속도로 실온에서 약 3시간 동안 수행될 수 있다.
이후 나노입자를 잔류물질로부터 분리하기 위해 나노입자에 대해 초고속 원심분리 여과(ultracentrifugal filtration)를 실시하는 것이 바람직하다. 초고속 원심분리는 약 5000 Da의 분자량 한계선(또는 5000 Da 초과 또는 미만의 분자량 한계선으로 하는 다른 적당한 필터)의 원심분리 필터 를 사용하여, 캡슐화 된 분자 또는 약물에 따라 또는 페길화와 같은 나노입자의 특정 처리에 따라 2000 g 내지 40,000 g 범위 내에서 수행될 수 있다. 초고속 원심분리 시간은 20 분 내지 50 분 내에서 정할 수 있다.
이후 동해방지제(cryoprotectant)를 나노입자에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 2 % w/v 트레할로오스(trehalose)를 동해방지제로 첨가할 수 있다. 또한, 동결방지제(lyoprotectant)로 사용될 수 있는 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 피콜, 베타인 또는 마니톨(mannitol), 또는 마니톨, 소르비톨 같은 포이올(poyols)을 포함하는 설탕 등 다른 동해 또는 동결방지제를 사용할 수도 있다. 나노입자들은 -80℃에서 보관되어 이후 동결된 상태로 고 진공하에서 상기 나노입자들을 건조하는 것과 같이 동결건조된 고체 케익을 형성할 수 있다. 초음파 에너지의 지속 시간, 계면활성제의 유형, 계면활성제의 농도 및 완충제는 다를 수 있다.
예시를 통해, 약 100 nm 내지 약 400 nm 의 크기 범위 분포도를 갖는 나노입자들을 다음과 같이 제조하였다.
실시예 I
제 1 수상에서, 0.0135 g의 백색 제인을 3 ㎖ 에탄올과 0.25 ㎖ 물 혼합물에 용해시켰다. 제인의 농도 또는 사용된 용매 조합은 최적 조건이었다; 그러나, 소기의 다른 크기 범위 내의 나노입자는 제인의 농도 또는 용매 조성을 변화시켜 생성될 수 있다. 프로브 초음파 분해를 20 초 간 적용하여 상기 제인의 용해를 보조하였다. 제 1 수상의 결과 생성된 용액을, 15 ㎖ 의 pH 7.4인 구연산염 완충제와 레시틴(0.45 % w/v)- 및 Pluronic® F68 (0.9 % w/v)의 조합을, 초음파 에너지(1.39 kW/h, 37% 진폭)를 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서 한방울씩 첨가하였다. 초음파 전단 공정 도중, 분산액(dispersion)을 얼음 수조얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이후 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 에탄올이 완전히 증발된 후, 임의의 잔류 물질 및/또는 표면활성제를 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 탈이온화 된 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 분자량 한계 5000 Da의 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 이로 인한 제인 나노입자의 4 ㎖의 수성 현탁액(aqueous suspension)(pH 7.4의 구연산염 완충제)에 2% w/v 트레할로오스를 동해방지제로 첨가하고, 이후 나노입자를 -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였다. 이후 상기 물질을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다. 이후 상기 나노입자를 데시케이터 내의 냉장고에서 10℃로 보관하였다.
본 발명의 다른 방법에서, 제 2 상 용액의 초음파 전단은, 입자 크기를 줄이기 위해 분산액을 좁은 오리피스를 통해 고압으로 통과시키는 고압 균질기로 보조하거나 대체할 수 있다. 이는 고농도의 제인이 사용되는 경우 작은 입자 크기 범위의 나노입자를 생성하는데 특히 유용하다. 또한, 고압 균질법은 제인 나노입자 제조 시 스케일 업 방법으로 이용될 수 있다. 상기 방법의 실시예는 후술한다.
실시예 II
0.65% w/v 백색 제인 일정량을 6 ㎖ 에탄올과 0.50 ㎖ 물의 혼합물에 용해시켰다. 이로 인한 제 1 수상의 용액 조성을 바람직한 약 pH 6 내지 7의 소기의 pH를 얻기 위해 변경하였다. 상기 제인의 용해를 용이하게 하기 위해 프로브 초음파 분해를 20초 간 가하였다. 이로 인한 상기 제 1 수상의 용액을, 30 ㎖ 의 pH 7.4인 구연산염 완충제 용액과 레시틴(0.45 % w/v) 및 Pluronic® F68 (0.9 % w/v)의 조합에, 초음파 에너지(1.39 kW/h, 37% 진폭)를 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 2 분간 일정하게 가하는 조건 하에서 한방울씩 첨가하였다. 상기 초음파 전단 과정 중, 분산액을 얼음 수조얼음 수조에 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이로 인해 생성된 조 현탁액(coarse suspension)을 0.1 내지 0.25 mm의 오리피스 크기를 갖는 고압 균질기(Nano Debee®, USA)에 20,000 psi로 5 분간 통과시켰다. 고압 균질 과정 동안에 냉각기를 이용하여 고압균질기 내로 물을 순환시켜 온도를 약 100C로 유지하였다. 이어서, 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반시켰다. 완전히 증발된 후, 임의의 잔류 물질 또는 표면활성제를 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계의 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 나노입자의 수성 현탁액(pH 7.4 구연산염 완충제) 4 ㎖를 2 % w/v 트레할로오스 35 mg와 혼합하고, -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였다. 이후 상기 케익을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
실시예 I과 II에서 기술한 본 발명의 방법들은 치료약과 같은 선택된 분자를 나노입자(도 2) 내에 캡슐화하는 나노입자를 형성하에 적합하게 할 수 있다. 본 발명의 분자-캡슐화 나노입자 형성방법의 일 실시예는 다음과 같다:
실시예 III
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3 ㎖와 0.25 ㎖의 0.01 N NaOH 혼합물에 용해시켜 pH를 6 내지 7로 조절하였다. 상기 용액에 0.0066 g 의 6, 7-히드록시 쿠마린을 첨가하고 용해를 용이하게 하기 위해 초음파 분해를 20 초간 가하였다. 상기 결과 용액을, 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 레시틴 0.0675 g과 Pluronic® F68 0.135 g을 함유하는 구연산염 완충제(pH 7.4) 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 에탄올이 완전히 증발된 후, 임의의 과량 약물 및/또는 표면활성제를 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계의 원심분리 필터를 사용하여 50분 간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 4 ㎖의 쿠마린 함유 나노입자의 수성 현탁액(pH 7.4의 구연산염 완충제)를 2 % w/v 트레할로오스 35 mg에 첨가하고, -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였다. 이후 상기 케익을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
백색 제인이 본 발명의 방법에서 염기성 단백질로 적합하게 사용될 수 있음이 밝혀 졌다. 백색 제인은 소기의 좁은 크기 범위인 약 100 nm 내지 약 400 nm의 재현가능한 나노입자를 제공하는 반면에, 황색 제인은 더 큰 크기와 더 넓은 입자 크기 분포도를 갖는 입자를 제공한다. 이 차이는 아래 표 1 및 2에 나타나 있다. 표 1은 노란 제인에서 상기 실시예 I 및 III의 방법으로 제조된 나노입자의 데이터를 제공한다. 블랭크 나노입자 및 쿠마린 함유 나노입자도 나타나 있다. 이들 각각의 입자 크기는 약 460 nm 및 610 nm임을 알 수 있다. 이와 대조적으로, 아래 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 I 및 III의 방법으로 백색 제인에서 제조된 블랭크 나노입자 및 쿠마린 함유 나노입자는 크기가 더 작다. 도 3 및 4는 블랭크 나노입자 및 쿠마린 함유 나노입자의 전자현미경 및 원자간력현미경 이미지를 보여 준다.
모델 화합물 입자크기(nm) 다분산성 지수(PDI) 제타 전위(mV) 캡슐화 효율(%)
블랭크 제인 나노입자 460±63 0.46±0.06 -10.28±2 해당 없음
6, 7 히드록시 쿠마린 610±123 0.62±0.08 -16.28±3 98±1.5
각 값은 3회 실험 평균값±표준편차
모델 화합물 입자크기(nm) 다분산성 지수(PDI) 제타 전위(mV) 캡슐화 효율(%)
블랭크 제인 나노입자 224±20 0.31±0.06 -16±3 해당 없음
6, 7 히드록시 쿠마린 266±30 0.44±0.08 -11.34±1.8 62±17
각 값은 3회 실험 평균값±표준편차
황색 제인의 색소가 제인의 용해도와 소기의 크기 분포도의 나노입자의 형성에 영향을 미치는 것으로 보인다. 종래 기술에 의하면 단백질과 같은 천연 중합체를 이용하여 소기의 크기 범위 내의 입자를 지속적으로 제조하는 것이 특히 어려운 일이었다. 그러나, 본 발명은 백색 제인과 같은 적절한 단백질 등급을 이용하여 소기의 크기 범위 내의 나노입자를 지속적으로 생성할 수 있다.
특히, 본 발명에 의해 80 nm 내지 100 nm의 직경을 갖는 나노입자를 생성할 수 있으며, 지금까지 생성해 왔다. 상기 실시예 II 에서 기술한 바와 같이, 초음파 전단을 고압 균질화로 부분적으로 대체하여도 블랭크 나노입자의 입자 크기는 상기 도 2에 나타난 크기와 유사하게 약 220±15 nm의 크기 및 0.4 ±0.07의 PDI를 갖는다.
본 발명의 나노침전 방법에 의해 생성된, 소기의 크기 범위 내의 나노입자의 수율은 약 60%를 초과하는 것으로 밝혀 졌다. 상기 방법은, 생성된 나노입자가 기본적으로 약 400 nm 미만이며, 신체 내에 투여되었을 경우 면역원성 반응을 피하기 위해 바람직하게는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 상대적으로 좁은 직경 크기 분포도를 가진다는 점에서 의미가 있다. 본 발명 등의 방법에 의해 생성된, 직경 크기 범위가 약 100 nm 내지 약 400 nm인 제인 나노입자는 식세포에 의해 섭취되지 않는 유리한 점이 있는 반면, 돼지 혈액을 이용한 시험관 내에서 실험하는 경우 직경 크기가 약 400 nm를 초과하는 입자의 경우 식세포에 의해 급속히 섭취된다. 이것은 제인 나노입자의 입자 직경 크기를 더 작은 크기 범위 내로 조절함으로써 나노입자 식균작용을 회피한다는 것을 의미한다.
마우스 대상의 면역원성 연구에서, 직경 크기 범위가 약 100 nm 내지 약 400 nm인 제인 나노입자는 비면역원성인 반면에, 직경 크기가 약 400 nm를 초과하는 제인 나노입자는 유의할 만한 면역 반응을 생성하는 것으로 밝혀 졌다. (항 제인 항체는 식염수 대조군에 비하여 2 배 내지 4 배로 높았다). 이러한 결과들에서, 직경 크기가 약 400 nm 미만인 나노입자를 이용하여 제조할 경우 입자의 소수성 단백질에 의한 유의할만한 면역원성을 피할 수 있음을 알 수 있다.
나노입자의 크기를 조절하는 능력은 부분적으로는 본 방법의 제 2 수상의 용액의 pH를 조절함으로써 달성된다. 하기 도 3의 데이터는 더 낮은 PDI를 갖는 나노입자의 더 작은 크기는 pH 6.8 내지 7.4에서 달성됨을 보여 준다.
수상의 pH 입자크기(nm) 다분산성 지수
1.5 362±24 0.392
3 291±15 0.45
6.8 208±10 0.289
7.4 232±7 0.260
10 256±20 0.317
12 368±10 0.438
각 값은 3회 실험 평균값±표준편차
나노입자 형성의 크기 조절에 있어서 다른 중요한 인자는 나노입자를 안정화시키고 입자 응집을 방지하는데 필요한 계면활성제 및 인지질의 조합이다. 2:1 비율(예컨대, 0.9:0.45% w/w)과 같은 폴록사머와 레시틴의 조합으로 소기의 크기 범위를 갖는 나노입자를 생성할 수 있다. 만약 계면활성제나 인지질 중 어느 하나만 사용할 경우 하기 표 4의 데이터에 제시된 바와 같이 더 큰 크기의 입자를 수득한다.
계면활성제(% w/v) 입자크기(nm) PDI
Pluronic® (0.9) 516±75 0.57±0.07
레시틴(0.9) 335±45 0.52±0.05
Pluronic®(0.9) 및 레시틴(0.4) 274±36 0.46±0.02
각 값은 3회 실험 평균값±표준편차
*동결건조로 인하여 점착성 분말로 됨
제 2 수상용의 완충제 선택은 나노입자 형성 과정 중 최적의 pH를 유지하는데 뿐 아니라 후속 동결건조 과정을 위해서도 중요하다. 예를 들어, 제 2 수상 용액에 완충제를 사용하지 않거나 pH 조절을 위해 0.1N 염산을 사용하면 이로 인한 나노입자의 크기가 커지며, 크기 범위 또는 PDI가 더 넓어진다. 도 5에 도시된 바와 같이, 구연산염 완충제를 사용할 경우 최소 입자 크기(109±2 nm)를 얻을 수 있었다. 기타 완충제를 사용하는 경우, 특히 인산염을 사용하는 경우 제인 나노입자의 입자 크기가 동결건조 후 2-3배 증가한다.
도 5의 그래프는, 제 2 수상 용액에서 완충제로 구연산염을 사용하는 방법으로 제조되고 동결건조 후 수득된 제인 나노입자는 제 2 수상에서 완충제로 인산염 완충제를 사용하여 제조된 나노입자에 비하여 훨씬 더 큰 크기의 입자 생성한다는 것을 나타 낸다. 인산염 완충제 사용 시 입자 크기가 커지는 것은 pH 하강에 의해 유발된 동결건조 온도에서 완충제가 결정화 되고 침전되기 때문일 것으로 추측된다[10]. 이 문제는 동결건조 온도에서 pH 변화에 효과적으로 저항하는 구연산염 완충제를 사용하면 해결된다. 제인의 아미노기는 구연산과 교차결합될 수 있고, 또한 이것이 제인 나노입자를 안정화시킨다[11].
제인은 생분해성 단백질이고 합성 중합체 보다 더 생체적합성이라는 것은 주목할 필요가 있다. 제인은 FDA기준에 의해 GRAS (일반적으로 안전한) 중합체로 수록된 중합체이다[12]. 그러므로, 본 발명의 방법은 다른 생리화학적 특성을 가진 캡슐화된 분자 또는 약물과 함께 제인 나노입자를 제조하는데 적합하다. 하기 표 5는, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 나노입자로 캡슐화할 수 있는 일부 분자들의 표본추출을 예를 들어 나타낸다. 나노입자 캡슐화에 사용될 수 있는 분자의 수 및 유형은 본 명세서에서 언급한 이들 예에 국한되지 않는다.
모델 화합물 입자 크기(nm) 제타 전위(mV) 캡슐화 효율(%)
6, 7-히드록시 쿠마린 173±20 -16±3 68±6
독소루비신 171±45 -21±2 61±16
덱스트란 FITC(4000 Da) 89±12 -15±2 79±8
pDNA (GFP) 185±12 -17±0.4 86.2±3
각 값은 3회 실험 평균값±표준편차
6,7 히드록시 쿠마린을 사용하여 형성된 나노입자의 예는 상기 실시예 III에서 기술하였으며 도 2에 도시되어 있다. 치료제를 함유한 나노입자의 또 다른 예는 독소루비신 함유 제인 나노입자인데, 이 것의 일반적인 단계는 도 6에 도시되어 있다. 독소루비신 함유 제인 나노입자의 특이적인 제조방법은 다음과 같다:
실시예 IV
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3 ㎖ 와 물 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 이 제 1 수상 용액에 독소루비신 염산염 0.001 g을 첨가하고 상기 혼합물을 20 초간 프로브 초음파분해 하여 상기 독소루비신 염산염을 용해시켰다. 이로인해 생성된 용액을, 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초 및 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 레시틴 0.0675g과 Pluronic® F68 0.135 g을 함유하는 pH 7.4인 구연산염 완충제(pH 7.4) 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 알코올이 완전히 증발된 후, 잔류 물질을 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 독소루비신 나노입자의 수성 현탁액 (pH 7.4의 구연산염 완충제)에 트레할로오스 35 mg을 첨가하고, 상기 혼합물을 -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였다. 이후 상기 물질을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
본 발명의 방법에 따른 독소루비신 함유 제인 나노입자의 제조에 있어서, 약 171±5 nm의 평균 직경 및 약 0.3의 PDI를 갖는 입자들이 형성되었다. 제인 나노입자에 의한 독소루비신 캡슐화 효율은 약 61±16%였다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자는, 부분적으로 입자들을 일정 기간에 걸쳐 약물 방출을 지속하도록 할 수 있는 제인 나노입자의 수불용성으로 인해, 캡슐화된 분자 또는 약물을 유익하고/또는 유리한 지속 방출을 제공한다. 예를 들어, 도 7은 상기 실시예 II에서 기술한 방법에 따라 제조된 쿠마린 함유 나노입자의 시험관 내 방출 프로파일을 나타낸다. 상기 데이터는 시험관 내에서 최대 7 일간에 걸친 약물의 지속적인 방출을 보여 주며, 효소 존재 하에 더 높은 방출 속도가 관찰되었다. 상기 데이터는, 제인 나노입자의 방출이 나노입자에서 약물이 서서히 확산되고 제인 나노입자가 서서히 효소분해 됨으로써 가능하다는 것을 보여 준다. 도 8은 본 발명의 실시예 IV에 따라 제조된 독소루비신 함유 제인 나노입자로부터 독소루비신의 시험관 내 방출 프로파일을 나타내는데, 최초 폭발(initial burst)이후 약 24 시간 후 지속 방출된 뒤섞인 순서를 보여주고 있다.
본 발명에 따른 나노입자로 형성될 수 있는 치료제 또는 진단제의 다른 예는 덱스트란-FITC(도 9)이다. 덱스트란-FITC 함유 제인 나노입자의 제조 예는 다음과 같다:
실시예 V
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3 ㎖와 물 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 제인 용액에 FITC 라벨을 붙인 덱스트란(분자량 4000 Da) 0.003 g을 첨가하고 상기 덱스트란-FITC를 상기 용액에 용해시켰다. 이로인하여 생성된 용액을 이로인해 생성된 용액초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 레시틴 0.0675 g과 Pluronic® F68 0.135 g을 함유하는 구연산염 완충제(pH 7.4) 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 알코올 용매가 완전히 증발된 후, 잔류 물질을 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da 분자량 한계의 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 덱스트란-FITC-함유 나노입자의 수성 현탁액 (pH 7.4의 구연산염 완충제)에 트레할로오스 35 mg을 첨가하고, 상기 혼합물을 -80℃에서 보관하여 고체 조각을 형성하였다. 이후 상기 물질을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 덱스트란-FITC 나노입자(도 9)는 도 10에 도시된 바와 같이 시험관 내 지속 방출 프로파일을 도시하고 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라, 예를 들어, 플라스미드, DNA, 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 같이 유전자 요법에 적합한 분자들도 치료 및 진단용 목적을 위하여 나노입자에 캡슐화될 수 있다. 도 11은 유전자 베이스의 분자를 함유하는 나노입자의 일반적인 제조방법을 나타낸다. 나노입자에 캡슐화된 pDNA(플라스미드 DNA)를 나노입자를 제조하는 특이적인 예는 다음과 같다:
실시예 VII
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3 ㎖와 물 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 제인 용액에 pDNA GFP (녹색 형광 단백질) 0.187 ㎍을 첨가하고 용해시켰다. 이로인해 생성된 용액을 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 레시틴 0.0675 g, Pluronic® F68 0.135 g 및 CaCl2 7.5 mM을 함유하는 pH 7.4인 구연산염 완충제(pH 7.4) 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조에 두어 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 상기 알코올 용매가 완전히 증발된 후, 여분의 약물과 표면활성제를 제거하기 위해 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계의 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 나노입자를 정제하였다. 초고속원심분리를 2 사이클 실시하고 나노입자를 물로 세척하였다. pDNA 함유 수성 현탁액 (pH 7.4의 구연산염 완충제)에 트레할로오스 35 mg을 첨가하고, 혼합물을 -80℃에서 보관하여 고체 조각을 형성하였다. 이후 상기 물질을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
예를 들어, 도 6, 8 및 10에 도시된 바와 같이, 다양한 캡슐화된 분자에 대한 약물 방출 프로파일은 제인 나노입자가 구강, 협측(buccal), 경피, 비강, 폐 및 안구 전달 경로를 포함한 경구 및 비경구적 경로에 의한 다목적적이고 안전한 약물 전달 운반체로 사용될 수 있음을 나타낸다. 백신 및 화장품 원료(예컨대, 미녹시딜(Minoxidil), 비타민 C 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 여타 분자, 입자 및 약물들도 치료, 진단, 미적(美的) 응용 또는 요법을 위해 캡슐화될 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 방법에 의해 형성된 나노입자는 그 크기가 상대적으로 작으므로, 분자함유 나노입자(예컨대, 약물 함유)는 식세포에게 인지되거나 제거되지 않고 장기간 체내에서 순환할 수 있다. 도 12의 데이터는 100 nm -400 nm 크기 범위의 제인 나노입자가 혈액 식세포에 의해 섭취되지 않는 반면, 400 nm를 초과하는 크기가 더 큰 입자들의 경우 실험관 내 돼지 혈액에서 시험하는 경우 식세포에게 급속도로 섭취되는 것을 나타낸다. 따라서, 제인 나노입자의 크기를 더 작은 크기 범위 내로 조절함으로써 식세포 섭취가 회피된다고 할 것이다. 마우스 대상의 면역원성 연구들에서, 100 nm 내지 400 nm 크기 범위의 나노입자가 비면역원성임이 밝혀 졌다. 한편, 크기가 400 nm를 초과하는 제인 나노입자의 경우 도 13에 도시된 바와 같이 대조군 대비 현저한 면역 반응(2배 내지 4배)을 생성하였다.
나노입자를 만드는데 사용된 제인의 세포 독성 효과를 돼지 창자 상피 세포(IPEC-J2)를 이용한 세포 증식 연구에서 조사하였다. 예시적인 세포 독성 연구의 결과가 도 14에 도시되어 있다. 완충제를 사용한 대조군 처리와 비교하여, 어떠한 농도에서도 백색 제인과 황색 제인 사이에 유의할만한 세포독성 수준이 관찰되지 않았다.
개시된 방법에 따라 제조된 제인 나노입자의 치료 활성은 독소루비신 함유 제인 나노입자를 사용하여 인간 난소암 세포(OVCAR-3)(도 15) 및 독소루비신-내성 인간 유방암 세포(NCI/ADR-RES)(도 16)를 대상으로 시험관 내에서 시험하였다. 세포들을 2000 세포/웰/0.1 ㎖의 접종 밀도로 플레이트하였다. 하루 밤 동안 부착시킨 후, 상기 세포들을 0.07 내지 70 nM(OVCAR-3) 및 0.1 내지 10000 nM(NCI/ADR-RES) 농도의 독소루비신 용액 또는 독소루비신 함유 나노입자로 24 시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 각각의 약물 처리를 제거하였다. 상기 세포들을 얼음 온도로 찬 인산염 완충제로 두 번 세척하고 새 배지로 교체하였다. 배지는 48 시간 마다 교체하였다. MTT 분석을 이용하여, 처리(NCI and OVCAR-3) 후 5 일째 되는 날 세포 독성을 평가하였다. 그 결과, 독소루비신 함유 제인 나노입자가 인간 암세포에서 독소루비신 무함유 용액에 비해 현저히 더 높은 역가를 보였다. 독소루비신 함유 제인 나노입자는 독소루비신 무함유 대비 약 12 내지 16 배 더 많은 역가를 보였다. 역가의 차이는 유리 약물 및 나노입자에 캡슐화 된 약물의 세포 섭취 메커니즘의 차이로 믿어 진다. 유리 독소루비신은 농도 구배의 작용에 의해 수동적 확산으로 섭취되는 반면, 독소루비신 함유 제인 나노입자는 능동적 세포내이입 과정을 통해 흡수된다. 더 나아가, 독소루비신 함유 제인 나노입자의 세포내이입은 내성이 있는 암세포의 약물 방출 펌프를 회피할 수 있고, 결과적으로 더 나은 효능을 가져 온다고 믿어 진다.
본 발명의 또 측면에 있어서, 본 발명의 개시된 방법에 의해 생성된 나노입자의 효소 안정성은 교차결합을 통해 더욱 더 향상될 수 있다. 도 17은 글루타르알데히드를 교차결합제로 사용하여, 교차결합 된 블랭크 나노입자를 제조하는 일반적인 방법을 보여 준다. 상기 제조의 구체적 예는 다음과 같다:
실시예 VIII
개시된 나노침전 방법을 이용하여 블랭크 제인 나노입자를 제조하였다. 제 2 수상의 프로브 초음파 분해에 이어 교차결합제를 첨가하였다. 이후 나노입자를 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 나노입자를 원심분리 여과를 사용하여 정제하고 이후 동결건조하였다.
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3 ㎖ 및 물 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 제 1 상 용액을 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 0.45 % w/v 레시틴과 Pluronic® F68 (0.9 % w/v)의 조합을 함유하는 pH 7.4인 구연산염 완충제(pH 7.4) 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 상기 용액에 25 % w/v 글루타르알데히드 0.5 ㎖를 가하고 상기 용액을 37℃에서 3 내지 24 시간 동안 300 내지 500 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 잔여 글루타르알데히드를 10 % w/v 메타비아황산염(metabisulfite)으로 중화시켰다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 상기 알코올이 완전히 증발된 후, 여분의 물질을 제거하기 위해 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계 원심분리 필터를 사용하여 50분 간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 나노입자의 수성 현탁액에 트레할로오스 35 mg을 첨가하고, 상기 용액을 -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였다. 이후 상기 물질을 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
주목할 것은, EDC/NHS 및 제니핀과 같은 여타 교차결합제를 도 13의 방법으로 사용할 경우, 반응 시간은 24 시간 내지 72시간으로 다양해 질 수 있다는 것이다. 교차결합 시 제인의 표면 아미노기가 관여한다. 트리니트로 벤젠 설폰산(trinitro benzene sulfonic acid)을 사용하여 교차결합 전후 제인의 자유 아미노기를 추정하였다. 440nm 파장에서, 흡수 대비 비 교차결합 및 교차결합 제인의 농도가 증가하는 표준 곡선이 생성되었다. 교차결합 효율은 다음의 공식을 사용하여 계산되었다.
교차결합 효율(%) = [a-b/a] x 100, 여기서 a = 비 교차 제인 대 흡수의 기울기, b= 교차결합 제인 대 흡수의 기울기. 표준 곡선을 작성하는데 사용된 제인의 농도 범위는 0.357 mg/㎖ 내지 12 mg/㎖이고, 상관계수는 0.9994이다.
다른 교차결합제를 사용한 제인 나노입자의 교차결합도는 도 18에 도시되어 있다. 교차결합 효율은 약 70% 내지 약 100%에 걸쳐 있었다. 교차결합도는 교차결합제에 따라 반응시간을 약 3시간에서 3일 사이에서 변경하여 달라질 수 있다. 본 명세서에서 예시한 교차결합제는 예시의 목적으로 사용된 것이며, 본 발명의 방법은 단지 개시한 교차결합제 만을 사용하는데 한정되지 않는다. 폴리카르복시산류(구연산 또는 1,2,3,4-부탄테트라카르복시산(butanetetracarboxylic acid))과 같은 여타 교차결합제도 사용 가능하다.
또한, 상기 방법이 블랭크 제인 나노입자 제조와 관련하여 예시되었지만, 교차결합은 특이적인 분자를 함유하는 나노입자의 제조를 위해서도 제공될 수 있다. 수용성 염료인 로다민(rhodamine)을 나노입자 내에서 제조하는 특정 예는 다음과 같다:
실시예 IX
백색 제인 0.0135 g을 에탄올 3㎖와 물 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 제 1 수상 용액에 로다민-123 0.005 g을 첨가하였다, 이로인해 생성된 용액을 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에서 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10 분간 일정하게 가하는 조건 하에서, 레시틴 0.0675 g과 Pluronic® F68 (0.135 g)의 조합을 함유하는 pH 7.4인 구연산염 완충제 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이후 25 % w/v 글루타르알데히드 0.5 ㎖를 첨가하고 37℃에서 3 시간 동안 300 내지 500 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 잔여 교차결합제를 10 % w/v 메타비아황산나트륨(sodium metabisulfite)으로 중화시켰다. 이어서, 상기 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 상기 알코올이 완전히 증발된 후, 나노입자를 초고속원심분리 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 3950 g에서 5000 Da의 분자량 한계 원심분리 필터를 사용하여 50 분간 초고속 원심분리함으로써 정제를 완료하였다. 로다민 함유 나노입자의 수성 현탁액 (pH 7.4의 구연산염 완충제)에 트레할로오스 35 mg을 첨가하고, 상기 용액을 -80℃에서 보관하여 고체 케익으로 형성하고 이후 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다.
비 교차결합 및 교차결합(글루타르알데히드를 교차결합제로 사용한) 로다민 입자의 입자 크기, 다분산성 지수 및 제타 전위)가 표 6에 나타나 있다.
모델 화합물 입자크기(nm) 다분산성 지수 제타 전위(mV)
로다민 352±20 0.72±0.20 -14±7
로다민(교차결합입자) 130±35 0.72±0.32 -12±2
각 값은 3회 실험 평균값±(표준편차).
pH 7.4에서의 시험관 내 약물 방출은 제인 나노입자가 교차결합(도 20) 되었을 경우 더 느려졌고, 이와 유사하게 효소 방출도 더 느려 졌다(도 21). 제인 나노입자의 표면에 있는 자유 아미노기의 교차결합이 입자 크기를 감소시켰고 용매의 접근을 감소시켰으며 나노입자의 효소분해를 지연 시켰다. 또한, 교차결합은 약물의 폭발 방출(burst release)을 현저하게 감소시켰다. 따라서, 교차결합은 나노입자를 더욱 안정화하고 약물 방출을 지속시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 나노입자의 치료 활성과 효능은 폴리에텔렌 글리콜(PEG)을 나노입자에 부착시킴으로써 더욱 더 향상될 수 있다. 페길화로 얻어지는 다른 이득 가운데 하나는 나노입자의 순환 반감기(circulation half-life)가 증가하는 것이다. PEG의 다른 장점은, 직접적인 접합이 실현 불가능하다면 이것이 표적 리간드, 약물 및 조영제를 제인 나노입자와 연결하는 스페이서(spacer)의 역할을 할 수 있다는 것이다.
도 22는 본 발명의 방법의 다른 측면에 따른 페길화된 제인 나노입자를 제조하는 방법을 나타낸다. 나노입자 제조에 있어서 페길화된 제인의 장점은, 비-페길화된 제인을 제조하기 위해 계면활성제와 인지질의 조합을 사용하는 것과 반대로, Pluronic® F68과 같은 계면활성제만을 사용하여 제조할 수 있다는 점이다. 페길화된 제인 나노입자 형성의 특정 방법은 아래와 같다:
실시예 X
메톡시 PEG-숙신이미딜 숙시네이트(succinimidyl succinate)(분자량 5000 Da) 0.1 g을 90% 에탄올 5 ㎖에 용해된 백색 제인 0.1 g 에 첨가하여 페길화된 제인을 생성하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 3 시간 내지 24 시간 기간 동안 배양하였다. 이후 상기 용액을 실온에서 마그네틱 교반기(100 rpm로 교반된 마그네틱 교반 막대) 안에서 교반하면서 임의의 잔여 물질을 제거하기 위해 물에 대하여 24 시간 동안 투석(10,000 Da의 분자량 한계)하였다. 이로 인해 생성된 생성물을 -80℃에서 동결하고 이후 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 하였다. 다양한 배양 시간에 걸쳐 관찰한 페길화의 효율이, 앞서 기술한 TNBS 분석 절차를 이용하여 효율 백분율이 결정되어 있는 하기 표 7에 나타나 있다. 500 내지 5000 Da과 같은 여타 분자량 PEG들도 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 메톡시(methoxy) PEG-N-히드록실 석시네이트 에스테르(hydroxyl succinate ester)와 같은 PEG 유도체 또는 기타 유도체들도 사용할 수 있다.
배양기간(시간) 제인: mPEG 에스테르 비율 페길화 효율(%)
24 1:1 65
24 1:2 93
3 1:1 52
페길화된 백색 제인 50 mg을 에탄올 3 ㎖와 탈이온수 0.25 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 페길화된 제인 용액을 초음파 에너지를 1.39 kW/h 및 37% 진폭에 펄스 온 타임 10 초, 펄스 오프 타임 1 초로 하여 10분간 일정하게 가하는 조건 하에서, Pluronic® F68(0.9 % w/v)을 함유하는 pH 7.4인 구연산염 완충제 15 ㎖에 한방울씩 첨가하였다. 초음파 분해 과정 중, 상기 용액을 얼음 수조에서 보관하여 온도를 약 10℃로 유지하였다. 이어서, 상기 제인 분산액을 마그네틱 교반기 위에 두고 300 내지 500 rpm으로 실온에서 에탄올이 완전히 증발될 때까지 교반하였다. 증발이 완료된 경우, 나노입자를 정제하였다. 정제 과정 중 pH 7.4의 구연산염 완충제로 반복해서 세척하고, 44,000 g에서 10,000 Da의 분자량 한계의 원심분리 필터를 사용한 초고속 원심분리를 35 분간 실시함으로써 정제를 완료하였다. 나노입자의 수성 현탁액(pH 7.4의 구연산염 완충제)에 2 % w/v 트레할로오스 30 g을 첨가하고, 상기 용액을 -80℃에서 보관하여 고체 케익을 형성하였고, 이후 -47℃, 60 mTorr 진공 조건에서 12 시간 내지 14 시간 동안 동결건조 하였다. 상기 개시한 페길화 과정은 상기 실시예 II에서 개시한 고압 균질화 과정을 이용하여 수행할 수 있다. 페길화된 나노입자의 크기 분포도가 도 23에 나타나 있다.
제인은 단백질이기 때문에, 표적 리간드, 조영제, 약물 및 특정 조직을 표적하는 하는 약물에 대한기타 중합체를 부착하는데 사용할 수 있는 수많은 표면 기능기 및 다른 생체의학적 응용을 갖는다는 점에 있어서 나노입자 형성에 있어서 제인을 사용하는 다른 장점을 실현한다.
본 발명의 개시된 방법을 이용하여 형성된 제인 나노입자는 다른 용도, 특히 체외에서의 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 약물 함유 제인 나노입자는 심혈관 및 기타 생체의학 장치를 위한 코팅 물질로 사용될 수 있다. 본 명세서에서는 약물 전달에 관련하여 기술하였지만, 본 발명의 개시된 방법에 의해 생성된 나노입자는 관심 대상 분자를 캡슐화하여 지속 방출하게 함으로써 화장품 산업뿐 아니라 식품, 낙농 산업에도 사용할 수 있다. 인체용 약물뿐 아니라, 수의학적 약물도 본 발명의 개시된 방법을 이용하여 나노입자에 캡슐화 할 수 있다. 제인 나노입자는 습기, 산화, 빛 등과 같은 유해 환경 요소들로부터 분자를 보호하는 데 사용할 수 있다. 이러한 활용은 제약, 식품, 낙농 및 화장품 산업에서 사용되는 관심 대상 분자들을 포함할 수 있다.
제인은 생체의학, 제약, 식품, 낙농 및 화장품 산업에서의 다양한 응용을 위해 독특한 특성을 갖는 신규한 나노입자를 설계할 때 다양한 천연 및 합성 중합체와 결합할 수 있다. 예를 들어, pH에 민감한 중합체 또는 링커를 제인에 부착함으로써, pH 자극에 대한 반응으로 약물을 방출하도록 상기 제인 나노입자를 제조할 수 있다.
본 명세서에 인용한 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 참고 문헌은 각 참고 문헌이 개별적으로 그리고 특이적으로 참고문헌으로 포함되도록 표시되었으며, 그 전체로서 본 명세서에 설명된 바와 같이 동일한 정도로 참고로 포함되어 있으며, 다음을 포함한다:
1. H. Bernstein, E. Morrel, E. Mathowitz, K. Shwaller, T.R. Beck. Protein microspheres and methods of using them. U.S Patent No. 5,679,377 issued October 21, 1997.
2. X. Liu, Q. Sun, H. Wang, L. Zhang , J.Y. Wang. Microspheres of corn protein, zein, for an ivermectin drug delivery system. Biomaterials 26 (2005) 109-115.
3. P. H. Lopez, S. Murdan. Zein microspheres as drug/antigen carriers: A study of their degradation and erosion, in the presence and absence of enzymes. J. Microencapsulation 23 (2006) 303-314.
4. Q. Zhong, M. Jin, D. Xiao, H. Tian, W. Zhang. Application of supercritical anti-solvent techniques for syntheses of delivery systems of bioactive food components. Food. Biophysics 3 (2008) 186-190.
5. N. Parris, P.H. Cooke, K.B Hicks. Encapsulation of Essential Oils in Zein Nanospherical Particles. J.Agric Food. Chemistry 53 (2005) 4788-4792.
6. L. E. Stark, A.T. Gross. Hydrophobic protein microparticles. U.S Patent No. 5,330.778 issued July 19, 1994.
7. S. Rudt, R.H. Mueller. In vitro phagocytosis assay of nano- and microparticles by chemiluminescence. II. Effect of surface modification by coating of particles with poloxamer on the phagocytic uptake. J. Control. Release. 25 (1993) 51-59.
8. P.H. Lopez, S. Murdan. An investigation into the immunogenicity and adjuvanticity of zein microspheres used as vaccine carriers. J. Pharm. Pharmacol. 58 (2006) 769-774.
9. R. B. Cook, F.M. Mallee, M. L. Shulman. Purification of zein from com gluten meal. U.S Pat. No. 5,245,673 issued October 19, 1993.
10. E. Y. Shalaev, T. D. Johnson-Elton, L. Chang, M. J. Pikal. Thermophysical Properties of Pharmaceutically Compatible Buffers at Sub-Zero Temperatures: Implications for Freeze-Drying. Pharm. Res. 19 (2002) 195-201.
11. N. Reddy, Y. Li, Y. Yang. Alkali-catalyzed low temperature wet crosslinking of plant proteins using carboxylic acids. Biotechnol. Prog. 25 (2009) 139-146.
12. Wheat gluten, corn gluten and zein film: affirmation of GRAS status. Fed.Register 50(1985) 8997-8999.

Claims (22)

  1. 소수성의 수불용성 단백질을 제공하는 단계;
    상기 단백질을 히드로알코올 용매로 용해시켜 제 1 수상 용액을 제공하는 단계;
    계면활성제 및 인지질의 존재하에 상기 제 1 수상 용액에 완충제를 첨가하여 pH 약 6.8 내지 pH 약 7.4의 pH를 갖는 제 2 수상 용액을 생성하는 단계;
    상기 제 2 수상 용액을 처리하여 상기 용액 내 나노입자의 직경 크기를 감소시키는 단계;
    임의의 잔류 용매를 증발시켜 약 400 nm 미만의 직경 크기를 갖는 나노입자를 생성하는 단계; 및
    상기 나노입자를 원심분리하는 단계를 포함하는 비면역원성 나노입자의 생성방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    원심분리 후 상기 나노입자를 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 나노입자를 대기압에 노출시키는 것을 제한하는 조건에서 상기 나노입자를 저장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 염기성 단백질은 제인의 선택된 등급인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제인의 선택된 등급은 백색 제인인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제는 구연산염 완충제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴록사머이고 상기 인지질은 레시틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 계면활성제 대 상기 인지질의 비율은 2:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 수상 용액을 처리하여 상기 용액 내 나노입자의 직경 크기를 감소시키는 단계는 상기 나노입자를 초음파 전단, 고압 균질화 또는 그 조합에 의해 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    나노입자 캡슐화를 위해 선택된 분자를, 상기 제 1 상 용액 형성 시 상기 단백질에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 분자는 피검자에게 투여하기 위해 선택된 치료물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노입자를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 단백질은 페길화된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 따른 방법에 의해 형성된, 치료활성이 있는 비면역원성 나노입자.
  15. 제 1 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 나노입자를 교차결합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 소수성 수불용성 단백질에 치료 분자를 캡슐화하여 형성된 비면역원성 나노입자로서, 약 400 nm 미만의 직경 크기를 가지는 상기 비면역원성 나노입자를 포함하는 치료 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 나노입자의 상기 직경 크기는 약 100 nm 내지 약 300 nm 사이인 것을 특징으로 하는 치료 조성물.
  18. 치료제를 포함하는 비면역원성 나노입자로서, 400 nm 미만의 직경 크기를 갖는 상기 나노입자의 약학적 치료량을 포함하는 물질을 질병 또는 상태로부터 투병 중이거나 투병의 위험이 있는 피검자의 질병이나 상태를 치료하기 위해 사용되는 약제의 제조에 사용하는 용도.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 직경 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 12 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 나노입자의 상기 투여는 구강, 비경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 국소, 비강 또는 안구 투여 경로에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 선택된 양의 수불용성 단백질;
    상기 단백질을 용해하기 위한 히드로알코올 용매;
    적어도 하나의 완충제; 및
    선택된 계면활성제를 포함하는 비면역원성 나노입자의 생성키트.
  22. 제 21 항에 있어서,
    적어도 하나의 선택된 인지질을 상기 선택된 계면활성제와 조합하여 선택된 비율을 제공하는 양으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020107027648A 2008-05-09 2009-05-11 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도 KR101616771B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12713408P 2008-05-09 2008-05-09
US61/127,134 2008-05-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110036704A true KR20110036704A (ko) 2011-04-08
KR101616771B1 KR101616771B1 (ko) 2016-04-29

Family

ID=41264904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107027648A KR101616771B1 (ko) 2008-05-09 2009-05-11 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8669225B2 (ko)
EP (1) EP2285825B1 (ko)
JP (2) JP5546532B2 (ko)
KR (1) KR101616771B1 (ko)
CN (1) CN102066399B (ko)
AU (1) AU2009244742B2 (ko)
BR (1) BRPI0908686B8 (ko)
CA (1) CA2723563C (ko)
HK (1) HK1158221A1 (ko)
IL (1) IL209155A (ko)
RU (1) RU2010146684A (ko)
WO (1) WO2009137112A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140086083A (ko) * 2012-12-28 2014-07-08 엘지디스플레이 주식회사 온도감응형 계면활성제를 이용한 수용성 나노입자의 제조방법

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5658031B2 (ja) 2007-06-22 2015-01-21 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 薄膜凍結による安定したサブミクロンのペプチド又はタンパク質粒子の形成
US20140234420A1 (en) * 2008-05-09 2014-08-21 Omathanu P. Perumal Method of Treating Skin Disorders using Nanoscale Delivery Devices and Transdermal Enhancing Compositions
KR101616771B1 (ko) * 2008-05-09 2016-04-29 사우스다코타주립대학 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도
US8697098B2 (en) 2011-02-25 2014-04-15 South Dakota State University Polymer conjugated protein micelles
JP5711138B2 (ja) 2008-11-16 2015-04-30 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 高濃度の低粘度懸濁液
WO2012000757A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Unilever Nv Particles comprising hydrophobic polymer and hydrophobic phenolic compound
PL2594140T3 (pl) 2010-07-16 2019-09-30 Universidad De Navarra Nanocząstki do kapsułkowania związków, ich wytwarzanie i zastosowanie
CN102120823B (zh) * 2011-01-06 2016-08-03 鲁传华 水溶性玉米朊的合成及在药物制剂中的运用
JP2014515007A (ja) * 2011-02-25 2014-06-26 サウス ダコタ ステート ユニバーシティー 局所送達のためのタンパク質ナノ担体
AU2012222142B2 (en) * 2011-02-25 2017-01-12 South Dakota State University Polymer conjugated protein micelles
JP2014514275A (ja) * 2011-03-10 2014-06-19 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム タンパク質ナノ粒子分散系
CA2883080A1 (en) * 2011-08-26 2013-03-07 Vecoy Nanomedicines Ltd. Pathogen and substance traps
EP2625966A1 (en) 2012-02-13 2013-08-14 Bionanoplus, S.L. Nanoparticles comprising a vegetable hydrophobic protein and a water miscible non-volatile organic solvent and uses thereof
US20150323530A1 (en) * 2012-07-04 2015-11-12 Empire Technology Development Llc Quantum dot-protein complexes, films, and methods of use
BR112015030525B1 (pt) * 2013-06-04 2023-01-24 South Dakota State University Nanopartícula
IL228528A (en) 2013-09-17 2015-01-29 Technion Res & Dev Foundation Potato-based nanoparticles
US20170252446A1 (en) * 2014-10-09 2017-09-07 Andreas Voigt Use of meso- and nanoporous material for surfactant trapping in nanoparticle suspensions
US11484505B2 (en) 2016-10-13 2022-11-01 Thomas Jefferson University Delivery compositions, and methods of making and using same
CN110730656B (zh) * 2017-06-02 2022-09-16 特一华制药株式会社 水难溶性成分增溶胶束及含有该胶束的液体制剂
TWI642685B (zh) * 2017-07-26 2018-12-01 中原大學 新穎胜肽及其應用
CN109432433A (zh) * 2018-10-30 2019-03-08 中国药科大学 一种纳米载体的制备方法和用途
CN109730976B (zh) * 2018-12-24 2020-06-09 华中科技大学 一种基于自由基氧化制备白蛋白纳米粒的方法
CN110251487B (zh) * 2019-08-01 2021-11-02 郑州大学 一种提高多西他赛载药量和口服生物利用度的醇溶蛋白纳米粒的制备方法及其应用
CN112121019B (zh) * 2020-09-23 2022-05-31 合肥工业大学 抗氧化型淀粉基糊精复合纳米颗粒及其制备方法与应用
CN115025054B (zh) * 2022-06-09 2023-12-22 四川普锐特药业有限公司 一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070148251A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Hossainy Syed F A Nanoparticle releasing medical devices

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2236521A (en) 1937-08-12 1941-04-01 Zein Corp Of America Ink
US5330778A (en) 1988-09-19 1994-07-19 Opta Food Ingredients, Inc. Hydrophobic protein microparticles
CA2071867A1 (en) * 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
US5254673A (en) 1991-12-26 1993-10-19 Opta Food Ingredients, Inc. Purification of zein from corn gluten meal
IE80468B1 (en) * 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
MY153295A (en) * 2004-09-29 2015-01-29 Nestec Sa Nanoparticulated whey proteins
WO2007114262A1 (ja) * 2006-03-29 2007-10-11 Fujifilm Corporation カゼインナノ粒子
WO2008013785A2 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Singh-Broemer And Company, Inc. Solid nanoparticle formulation of water insoluble pharmaceutical substances with reduced ostwald ripening
CN101485629B (zh) * 2008-01-16 2013-01-23 沈阳药科大学 一种给药系统及其制备方法
KR101616771B1 (ko) * 2008-05-09 2016-04-29 사우스다코타주립대학 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도
JP2014515007A (ja) * 2011-02-25 2014-06-26 サウス ダコタ ステート ユニバーシティー 局所送達のためのタンパク質ナノ担体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070148251A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Hossainy Syed F A Nanoparticle releasing medical devices

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Controlled Release, August 2006, VoI 114, No 2, Pages 242-250. *
'Lipid vesicles and other colloids as drug carriers on the skin', Advanced Drug Delivery Reviews, March 2004, VoI 56, pages 675-711. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140086083A (ko) * 2012-12-28 2014-07-08 엘지디스플레이 주식회사 온도감응형 계면활성제를 이용한 수용성 나노입자의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP5546532B2 (ja) 2014-07-09
CN102066399A (zh) 2011-05-18
JP2014177474A (ja) 2014-09-25
JP5851550B2 (ja) 2016-02-03
EP2285825A4 (en) 2012-11-28
WO2009137112A1 (en) 2009-11-12
BRPI0908686B1 (pt) 2020-09-29
HK1158221A1 (en) 2012-07-13
IL209155A0 (en) 2011-01-31
EP2285825B1 (en) 2020-07-15
US9616021B2 (en) 2017-04-11
CA2723563C (en) 2017-12-12
CN102066399B (zh) 2014-11-26
BRPI0908686B8 (pt) 2021-05-25
US8669225B2 (en) 2014-03-11
AU2009244742A1 (en) 2009-11-12
IL209155A (en) 2016-07-31
CA2723563A1 (en) 2009-11-12
US20110091565A1 (en) 2011-04-21
US20140308351A1 (en) 2014-10-16
KR101616771B1 (ko) 2016-04-29
RU2010146684A (ru) 2012-06-20
EP2285825A1 (en) 2011-02-23
AU2009244742B2 (en) 2014-11-06
JP2011519932A (ja) 2011-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101616771B1 (ko) 비면역원성의 소수성 단백질 나노입자의 형성방법 및 그 용도
Sailaja et al. Different techniques used for the preparation of nanoparticles using natural polymers and their application
Panos et al. New drug delivery systems based on chitosan
EP2814332B1 (en) Nanoparticles comprising a vegetable hydrophobic protein and a water miscible non-volatile organic solvent and uses thereof
US9233110B2 (en) Protein nanocarriers for topical delivery
US20080102114A1 (en) Microparticles and Nanoparticles for the Transmucosal Delivery of Therapeutic and Diagnostic Agents
KR20130045849A (ko) 화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 그 제조 및 용도
İlhan et al. Aquasomes: a novel platform for drug delivery
Chen et al. Co-encapsulation of curcumin and resveratrol in zein-bovine serum albumin nanoparticles using a pH-driven method
Al-Ani et al. Development of a nanostructured double-layer coated tablet based on polyethylene glycol/gelatin as a platform for hydrophobic molecules delivery
Shakoor et al. Chickpea and soybean protein delivery systems for oral ingestion of hydroxycitric acid
Chaerunisaa et al. Development of cathelicidin in liposome carrier using thin layer hydration method
Peñalva Protein nanoparticles for oral delivery of bioactives
Silva et al. Novel chitosan-based strategies for insulin nanoencapsulation
Zhang et al. Exploring pectin-casein micelles as novel carriers for oral drug delivery of artesunate in the treatment of systemic lupus erythematosus
Basu et al. Nanomaterials in Drug Delivery: Application of Polysaccharides and Protein-Based Nanomaterials in Modern Drug Delivery
Li Surface modifications that benefit protein‐based nanoparticles as vehicles for oral delivery of phenolic phytochemicals
Shah et al. chitosan Nanoparticles
WO2007124618A1 (fr) Nanoproduits obtenus à partir de bois de cervidés enrichis en facteur de croissance insulinomimétique de type 1

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190211

Year of fee payment: 4