BR112015030525B1 - Nanopartícula - Google Patents

Abstract

NANOPARTÍCULA, KIT, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA NANOPARTÍCULA, E USO DA NANOPARTÍCULA. A invenção se refere a um sistema de liberação de droga de nanopartícula oral, incluindo métodos para preparação desse sistema utilizando uma proteína insolúvel em água hidrofóbica, essas nanopartículas podem incluir prolamina para gerar o dito sistema de liberação de droga oral.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere, de modo geral, a tecnologias de liberação da droga e, mais especificamente, a um sistema de liberação de droga de nanopartícula oral, incluindo métodos para a preparação desse sistema utilizando uma proteína insolúvel em água hidrofóbica, essas nanopartículas podem incluir prolamina para gerar um sistema de liberação de droga oral.

INFORMAÇÕES DE HISTÓRICO

[002] Apesar das estimativas de um mercado farmacêutico para a prescrição de drogas pediátricas de $43 bilhões por ano, a falta de formulações favoráveis pediátricas resulta em 40% da população mundial em risco elevado de dosagem inadequada, não aderência, toxicidade e dificuldade de acesso à maioria das drogas. Por exemplo, todos ácidos retinoicos trans (ATRA) é utilizado no tratamento de leucemia promielocítica aguda em crianças; entretanto, as formulações atuais sofrem da má estabilidade química, má solubilidade em água e má biodisponibilidade oral.

[003] Dado que mais de 3,3 milhões de pacientes com HIV são crianças, a maioria de pacientes pediátricos com HIV não tem acesso à medicação adequada. HIV pediátrico é muito difícil de eliminar, devido à transmissão materno-fetal e à amamentação, principalmente, em países desenvolvidos. A mais recente Assembleia Mundial de Saúde (AMS) reconheceu o direito de pacientes pediátricos ao promover a necessidade por medicamentos seguros e eficazes sob a abrangência global 'Faça medicamentos sob medida para crianças'.

[004] Saquinavir é um inibidor de protease altamente lipofílico utilizado no tratamento de HIV e classificado na classe IV do Biopharmaceutic Classification System (BCS). Entretanto, saquinavir sofre de problemas de sabor amargo a má solubilidade, e permeabilidade levando à baixa biodisponibilidade de aproximadamente (0,7- 4%).

[005] Zeína, uma proteína vegetal que pode ser isolada de milho ou cereais, pertence a uma família de prolaminas que são compostas de altas quantidades de aminoácidos não polares, como prolina, glutamina e asparagina. Zeína é inodor, não tóxico, biodegradável e insolúvel em água e é, portanto, um componente atrativo para muitas aplicações, incluindo o uso nas indústrias farmacêuticas e médicas. Nas indústrias farmacêuticas, zeína tem sido utilizado, por exemplo, para materiais revestidos com filme e para formar sistemas particulados, como micropartículas ou nanopartículas (Patente Norte-Americana No 5.679,377 (Bernstein et al.), aqui incorporada por referência em sua integridade; Liu et al., Biomaterials 26 (2005) 109115; Lopez e Murdan, J Microencapsulation 23 (2006) 303-314; Zhong et al., Food Biophysics 3 (2008) 186-190; Parris et al., J Agric Alimento Chemistry 53 (2005) 4788-4792).

[006] Sistemas de liberação de droga particulados podem ser utilizados para mascaramento de sabor, melhorando a estabilidade da droga e a solubilidade da droga. A facilidade da administração de medicação, segurança e palatabilidade dos excipientes da formulação são os mais importantes determinantes para formas de dosagem, especialmente, para uso pediátrico.

[007] Em geral, para drogas pediátricas, permanecem desafios em relação à segurança e palatabilidade de excipientes utilizados em formulações pediátricas, de fácil administração e aderência de paciente, condições de armazenamento especiais, compatibilidade com alimentos e bebidas, e engenharia de formulações de droga pediátrica com a consideração de fisiologia GI pediátrica.

[008] Da mesma forma, novos métodos são necessários para preparar partículas de zeína para tornar as partículas úteis para administração oral. Também são necessários novos carregadores terapêuticos para a liberação de compostos terapêuticos importantes de maneira segura e eficaz, de modo a superar os desafios associados à administração oral pediátrica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Os requerentes desenvolveram um sistema de liberação de droga de nanopartícula oral para pacientes pediátricos utilizando polímeros de grau alimentício. Para este fim, foram desenvolvidas nanopartículas utilizando, por exemplo, zeína, uma proteína do milho, como o núcleo hidrofóbico e caseína, uma proteína do leite ou uma glicoproteína globular, como lactoferrina, como o invólucro.

[010] Nas realizações, uma nanopartícula é revelada, incluindo pelo menos duas proteínas, em que uma primeira proteína é uma prolamina e a segunda proteína é β- caseína ou lactoferrina, e em que a nanopartícula apresenta uma estrutura de invólucro de núcleo.

[011] Em um aspecto, a proteína prolamina compreende zeína branca, zeína amarela, gliadina, hordeína, ou kafirina.

[012] Em outro aspecto, a nanopartícula ainda pode incluir uma molécula de carga, em que a molécula de carga é uma droga classe II ou classe IV. Em um aspecto relacionado, a molécula de carga inclui um material farmacêutico, um material terapêutico, um agente diagnóstico, material agrícola, um agente imuno-potencializador, um agente bioativo e combinações destes.

[013] Em um aspecto, a molécula de carga inclui retinol, 13-trans-ácido retinoico (tretinoína) ou todos ácidos retinoicos trans (ATRA), 13-cis-ácido retinoico (isotretinoína), 9-cis-ácido retinoico (alitretinoína), retinaldeído, etretinato, acitretina, α-caroteno, β-caroteno, Y-caroteno, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina, e combinações destes.

[014] Em outro, a molécula de carga é saquinavir.

[015] Em um aspecto, a nanopartícula é formada por secagem por pulverização ou separação de fase.

[016] Em outro aspecto, a nanopartícula ainda inclui carga, em que a carga é uma célula, proteína, ácido nucléico, anticorpo, fator de crescimento, ou uma combinação destes. Em um aspecto relacionado, a carga é adsorvida à superfície da nanopartícula.

[017] Em um aspecto, a nanopartícula é de ligação cruzada, em que um agente de ligação cruzada inclui genipina.

[018] Em outro aspecto, a proteína prolamina da nanopartícula é de PEGuilato.

[019] Em um aspecto, a nanopartícula está na forma de um pó seco, fluidizante, incolor ou branco, não higroscópico. Em outro aspecto, a nanopartícula inclui um diluente, um excipiente, ou condutor para formar uma composição farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a composição é uma formulação oral e é, opcionalmente, contida em um alimento ou a bebida.

[020] Em uma realização, é revelado um kit incluindo um pó liofilizado ou dispersão contendo as nanopartículas, conforme aqui reveladas; um ou mais tampões; uma ou mais etiquetas; um ou mais recipientes; e um manual de instruções, em que o manual de instruções revela como utilizar o pó liofilizado.

[021] Em outra realização, um método de preparação de uma nanopartícula é revelado, incluindo dissolução de uma proteína prolamina em um solvente hidroalcoólico para formar uma fase orgânica; adição da fase orgânica a um tampão, em que o tampão inclui um ânion de citrato, uma proteína separada, opcionalmente, pelo menos uma molécula de carga ou, opcionalmente, uma molécula de estabilização incluindo uma goma, um polissacarídeo ou uma pectina, ou uma combinação destes, para formar um precipitado; sonicação do precipitado; centrifugação da fase aquosa restante para formar um pélete; lavagem do pélete, opcionalmente, adicionando um crioprotetor; e liofilização do pélete, em que a nanopartícula resultante tem um tamanho de partícula entre cerca de 90 nm a cerca de 300 nm.

[022] Em um aspecto, a proteína separada é β- caseína ou lactoferrina e o polissacarídeo é dextrano ou goma arábica.

[023] Em uma realização, um método de preparação de uma nanopartícula é revelado, incluindo dissolução de uma proteína prolamina e uma segunda proteína em um solvente hidroalcoólico incluindo um tampão para formar um precipitado, em que o tampão inclui um ânion de citrato; sonicação do precipitado para formar um sonicado; opcionalmente, adição de uma ou mais moléculas de carga ao sonicado para formar uma mistura; carregamento do sonicado ou mistura em um secador por pulverização, secagem por pulverização do sonicado ou mistura em um tambor de coleta para formar um material seco por pulverização; e coleta do material seco por pulverização do tambor de coleta, em que a nanopartícula resultante tem um tamanho de partícula entre menos que cerca de 90 nm a cerca de 300 nm.

[024] Em um aspecto relacionado, em que a proteína separada é β-caseína ou lactoferrina.

[025] Em uma realização, o uso da nanopartícula, conforme descrito, é revelado para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio em um indivíduo que precisa dele, em que o distúrbio inclui leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica, neuroblastoma e HIV pediátrico.

[026] Em outra realização, um método de tratamento de um distúrbio é revelado, incluindo administração via oral da nanopartícula, conforme aqui descrita, a um indivíduo que precisa dela, em que o distúrbio inclui leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica, neuroblastoma e HIV pediátrico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[027] Os desenhos a seguir formam parte da especificação e são incluídos para demonstrar mais determinadas realizações ou diversos aspectos da invenção. Em alguns casos, as realizações da invenção podem ser melhor entendidas ao se referir aos desenhos anexos em combinação com a descrição detalhada aqui apresentada. A descrição e desenhos anexos podem destacar um determinado exemplo específico, ou um determinado aspecto da invenção, entretanto, um técnico no assunto entenderá que partes do exemplo ou aspecto podem ser utilizadas em combinação com outros exemplos ou aspectos da invenção.

[028] A FIGURA 1 ilustra as etapas para a preparação de nanopartículas de zeína estabilizadas por lactoferrina.

[029] A FIGURA 2 ilustra, por meio de um fluxograma, as etapas gerais para a preparação de nanopartículas de genipina de ligação cruzada zeína-caseína, de acordo com uma realização.

[030] A FIGURA 3 ilustra um fluxograma para secagem por pulverização.

[031] A FIGURA 4 apresenta um gráfico da data de liberação in vitro release de [3H]-ATRA de nanopartículas ZLF.

[032] A FIGURA 5 apresenta um gráfico de liberação de SQ em matrizes de alimento, seguidas por SGF e SIF. (A) pré-administração de leite e (B) pré-administração de suco de maçã.

[033] A FIGURA 6 apresenta um gráfico ilustrando valores Papp ao longo do tempo para SQ (saquinavir), ZC (zeína-caseína), ZLF (zeína-lactoferrina), e PZ (polietileno glicol).

[034] A FIGURA 7 apresenta um gráfico ilustrando valores Papp ao longo do tempo para ZC (zeína- caseína), ZLF (zeína-lactoferrina) e PZ (polietileno glicol).

[035] A FIGURA 8 apresenta o efeito de nanopartículas em TEER.

[036] A FIGURA 9 apresenta gráficos para a absorção celular como uma função do tempo (A) e temperatura (B).

[037] A FIGURA 10 apresenta dados de um ensaio de inibição competitivo.

[038] A FIGURA 11 apresenta a inibição de P-gp em células CaCo-2.

[039] A FIGURA 12 apresenta perfil de concentração de plasma de saquinavir em ratos, após a administração oral de nanopartículas de saquinavir carregadas em zeína-caseína (ZC); nanopartículas de zeína lactoferina (ZLF) e nanopartículas de PEG-zeína (PZ). A biodisponibilidade de saquinavir foi aprimorada de nanocarregadores com base em zeína. Como pode ser visto do perfil, a droga foi liberada lentamente e a concentração de plasma foi mantida por 48h no plasma.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[040] A via oral é o meio mais prevalente de liberação de medicações à população pediátrica. Entretanto, a falta de formulações favoráveis a crianças resulta em 40% da população mundial em risco elevado de dosagem inadequada e dificultada em acessar a maioria dos APIs (Ingrediente Farmacêutico Ativo). Para este fim, os polímeros de grau alimentício naturais (por exemplo, proteínas) são carregadores de liberação de droga promissores. Dos biopolímeros, zeína, uma proteína hidrofóbica globular de milho, e β-caseina, uma proteína anfipática linear do leite, são amplamente utilizadas como ingredientes em aplicações alimentícias e farmacêuticas. Esse polímeros são biodegradáveis, amplamente disponíveis e aprovados pela Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos [US-FDA], como um material GRAS. Nas realizações, nanopartículas de invólucro de núcleo que utilizam zeína e caseína para aplicações de liberação de droga oral pediátrica são reveladas.

[041] Nas realizações, as nanopartículas com base em proteína da presente revelação podem carregar de maneira eficiente drogas classe II/IV do BCS e alcançam liberação oral de sucesso dessas drogas em indivíduos que precisam dela. Conforme é bem conhecido na técnica, drogas de classe II do BCS são as que têm alta permeabilidade, baixa solubilidade; drogas classe IV do BCS são as que têm baixa permeabilidade e baixa solubilidade.

[042] Drogas classe II do BCS incluem, entre outros, amiodarona, atorvastatina, azitromicina, carbamazepina, carvedilol, clorpromazina, cisaprida, ciprofloxacina, ciclosporina, danazol, dapsona, diclofenaco, diflunisal, digoxina, eritromicina, flurbiprofeno, glipizida, gliburida, griseofulvina, ibuprofeno, indinavir, indometacina, itraconazol, cetoconazol, lansoprazol I, lovastatina, mebendazol, naproxeno, nelfinavir, ofloxacina, oxaprozina, fenazopiridina, fenitoína, piroxicam, raloxifeno, ritonavir, saquinavir, sirolimus, espironolactona, tacrolimus, talinolol, tamoxifeno e terfenadina.

[043] Drogas classe IV do BCS incluem, entre outros, amfotericina, clortalidona, clorotiazida, colistina, ciprofloxacina, furosemida, hidroclorothiazida, mebendazol, metotrexato, neomicina.

[044] Nas realizações, todos ácidos retionicos trans (ATRA), uma droga utilizada para neuroblastoma em pediatria pode ser combinada com as ditas nanopartículas, essa combinação supera os problemas associados à má estabilidade química, solubilidade e biodisponibilidade oral.

[045] Nas realizações, as nanopartículas à base de proteína da presente revelação têm uma estrutura de invólucro de núcleo. Em um aspecto, as ditas nanopartículas à base de proteína podem ser formadas por separação de fase. Em um aspecto relacionado, as partículas com invólucro de núcleo são formadas devido a diferenças em hidrofobicidade entre as proteínas compreendendo as nanopartículas.

[046] Nas realizações, as nanopartículas à base de proteína da presente revelação podem ser feitas por secagem por pulverização. Em um aspecto relacionado, o secador por pulverização que pode ser utilizado é um Nano Spray Dryer B-90, BÜCHI (BUCHI Labortechnik AG, Switzerland).

[047] Nas realizações, a taxa de pulverização pode ser 100%, cerca de 50%, ou cerca de 20%. Em um aspecto relacionado, a vazão de nitrogênio pode ser cerca de 90 L/min, cerca de 120 L/min ou cerca de 150L/min. Em outro aspecto, a temperatura de entrada pode ser de cerca de 70°C, cerca de 90°C ou cerca de 120°C.

[048] Nas realizações, o processo de secagem por pulverização compreende uma temperatura de entrada de cerca de 155°C, uma vazão de nitrogênio de cerca de 90L/min, e tamanho de malha de pulverização de cerca de 4 μm e uma taxa de pulverização de cerca de 100% de Nanopartículas é aqui revelada utilizando zeína, uma proteína do milho como o núcleo hidrofóbico e caseína, uma proteína do leite como o invólucro.

[049] Em outro aspecto, o componente de proteína compreende uma prolamina selecionada do grupo que consiste em zeína, gliadina, hordeína, ou kafirina. Em um aspecto relacionado, a prolamina é zeína. Em outro aspecto relacionado, a proteína zeína é combinada com beta caseína ou lactoferrina ou polietileno glicol (PEG), em que PEG é de cerca de 3 a cerca de 20 kDa.

[050] Nas realizações, a zeína/beta caseína ou zeína/lactoferrina está presente em uma proporção de cerca de 1:1 ou cerca de 1:2 ou cerca de 1:3 ou cerca de 1:4 ou cerca de 1:5. Em um aspecto, as nanopartículas são feitas em uma solução compreendendo um tampão de citrato, tendo um pH de cerca de 6,8 a cerca de 7,4. Em um aspecto relacionado, a solução pode compreender uma fase hidroalcoólica, onde a fase alcoólica é entre cerca de 70% a cerca de 90% de álcool.

[051] Nas realizações, as partículas têm um tamanho na variação de nanômetro, com uma polidispersão estreita. Em um aspecto, o tamanho médio das ditas nanopartículas é entre cerca de 50 a cerca de 70 nm, cerca de 70 a cerca de 90 nm, cerca de 90 a cerca de 115 nm, cerca de 115 a cerca de 150 nm, cerca de 150 a cerca de 200 nm, cerca de 200 a cerca de 300 nm, cerca de 300 a cerca de 350 nm, cerca de 300 a cerca de 500 nm, ou cerca de 500 a cerca de 900 nm.

[052] Em outro aspecto, as nanopartículas apresentam uma eficiência de encapsulamento de cerca de 71,06% a cerca de 90%, e uma eficiência de carregamento de cerca de 1,17% a cerca de 9%. Em um aspecto relacionado, as partículas apresentam uma superfície lisa e esférica.

[053] Em outro aspecto, as nanopartículas à base de proteína compreendem estabilizadores, esses estabilizadores incluem, entre outros, PEG, gomas e pectinas, em que esses estabilizadores são combinados com a proteína em secagem por pulverização ou separação de fase.

[054] Nas realizações, os processos, conforme aqui revelados, podem ser otimizados para alcançar o tamanho de partícula desejado, PDI e alta eficiência de encapsulamento. Em um aspecto relacionado, a otimização pode envolver o uso de desenho 33 Box-Behken. Em um aspecto relacionado, desenho de nanopartícula otimizado utilizando um modelo compreendendo equações quadráticas, resultou em uma formulação que foi otimizada com base nos valores observados e previstos. Por exemplo, um desenho otimizado desse para zeina-β caseína compreende zeina-β caseína em uma proporção de 1:2; onde o pH da fase aquosa foi 7,4 utilizando tampão de citrato, e a % da fase hidroalcoólica foi 70%.

[055] Nas realizações, as formulações de nanopartícula podem ser utilizadas como um sistema de liberação de droga oral controlado para ATRA. Em um aspecto relacionado, a estabilidade de ATRA é aumentada em nanopartículas carregadas de ATRA da presente revelação. Em outro aspecto, a absorção das nanopartículas pode ser realizada com células in vitro, incluindo, entre outras células polarizadas de Caco-2. Ainda, resultados desses estudos podem ser confirmados utilizando análise de perfusão in-situ e absorção intestinal de segmento em modelos de animal adequados, incluindo ratos. Ademais, análise farmacocinética pode ser realizada utilizando os ditos animais.

[056] Nas realizações, as formulações de nanopartícula podem ser utilizadas como um sistema de liberação de droga oral controlado para saquinavir.

[057] Os requerentes se direcionaram com sucesso às questões de liberação oral de retinol pelo encapsulamento de retinol em nanocarregadores à base de proteína inovadores para aplicações de dosagem oral, incluindo uso pediátrico.

[058] Nanocarregadores inovadores foram desenvolvidos de uma combinação da proteína do milho zeína e β-caseina, uma proteína anfipática linear do leite, conforme aqui descrito. Devido à zeína ser hidrofóbica, pode ser utilizada para encapsular retinoides hidrofóbicos dentro das nanopartículas, conforme aqui descrito, e nanopartículas de zeina-β-caseina, conforme aqui descritas, podem ser utilizadas para encapsular retinoides hidrofóbicos para prover uma formulação removível com água de um retinoide.

[059] As nanopartículas proveem flexibilidade na escolha de formulações de retinol para diversas aplicações. Os requerentes prepararam nanopartículas de zeína-caseína carregadas de retinol na variação de tamanho de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm com uma eficiência de encapsulamento de 76-100%. Nanopartículas carregadas de retinol estão na variação de tamanho de 180-220 nm com uma eficiência de encapsulamento de 79-91%. Encapsulamento de retinol nos nanocarregadores resultou em formulações dispersíveis em água necessárias para liberação oral.

[060] Nanopartículas de zeina-β-caseina melhoraram significativamente a estabilidade em estado sólido e estado líquido de retinol em relação à umidade e degradação induzida por luz. A liberação de retinol foi sustentada até uma semana das nanopartículas de zeína-β-caseina.

[061] Um aspecto exclusivo dos nanocarregadores é a capacidade de as nanopartículas se direcionarem aos múltiplos desafios do mercado para liberação oral de retinol, incluindo a provisão da facilidade de administração e aderência do paciente, evitando condições de armazenamento especiais, provisão de compatibilidade com alimentos e bebidas, e provisão de formulações medicamentosas pediátricas com a consideração de fisiologia GI pediátrica.

[062] A capacidade de dispersão em água de retinol é aumentada significativamente após encapsulamento em nanopartículas. A liberação de retinol pode ser sustentada de nanopartículas de zeína-β-caseina levando a menor dose e frequência reduzida de aplicação. O encapsulamento de retinol em nanopartículas de zeína-β-caseina aumenta significativamente o tempo de prateleira de formulações de retinol. Nanopartículas de zeína-β-caseína aumentam a fluidez e a capacidade de dispersão do retinol em formulações sólidas e semi-sólidas. Devido ao retinol ser um pó pegajoso higroscópico, o encapsulamento de retinol em nanopartículas pode superar as questões de manipulação e processamento difíceis associadas ao retinol.

[063] A administração de droga oral é a via mais favorável para liberar medicações mais importantes a pacientes pediátricos. Dado que mais de 3,3 milhões de pacientes com HIV são crianças, a maioria dos pacientes pediátricos com HIV não têm acesso à mediação adequada.1 HIV pediátrico é bastante difícil de eliminar devido à transmissão maternal ao feto e amamentação, principalmente, em países desenvolvidos. A mais recente Assembleia Mundial de Saúde (AMS) reconheceu o direito de pacientes pediátricos ao promover a necessidade por medicamentos seguros e eficazes sob a abrangência global 'Faça medicamentos sob medida para crianças'. Saquinavir, é um inibidor de protease altamente lipofílico utilizado no tratamento de HIV e classificado na classe II do Biopharmaceutic Classification System (BCS). Entretanto, saquinavir sofre de problemas de sabor amargo a má solubilidade, e permeabilidade levando à baixa biodisponibilidade de aproximadamente (0,7 - 4%). Avanços recentes em nanotecnologia resultaram no desenvolvimento de formulação oral à base de nanopartícula para fins diagnósticos e terapêuticos.

[064] Lactoferrina (Lf), uma glicoproteína de ligação de ferro catiônica de mamífero pertencente à família transferrina (Tf), tem sido amplamente utilizada em uma variedade de campos que variam do tratamento de diarreia em bebês e suportando o crescimento de recém-nascidos para alimento e outras aplicações. Auxilia no transporte de ferro e aumenta a biodisponibilidade de ferro.

[065] Em relação à arquitetura de invólucro de núcleo das nanopartículas orais de proteína-proteína, a β caseína e lactoferrina são proteínas hidrofílicas que estabilizam o núcleo de zeína resultando em nanopartículas de tamanho menor. Ainda, a arquitetura de invólucro de núcleo provê melhor estabilidade proteolítica, conforme demonstrado por estudos de estabilidade in vitro aqui revelados. A carga catiônica de lactoferrina ajuda a estabilizar mais as nanopartículas de zeína-lactoferrina. Ainda, a carga catiônica na superfície pode ser utilizada para adsorver outros compostos aniônicos incluindo drogas, gene ou proteínas carregadas negativamente.

[066] No caso de PEG-zeína, as nanopartículas preparadas por secagem por pulverização, diferentes pesos moleculares de PEG incluindo 3000, 10,000 e 20,000 Da foram aqui apresentadas por serem úteis.

[067] As vantagens da formulação de nanopartículas sobre uma convencional são notáveis, incluindo solubilidade da droga aumentada, liberação sustentada, proteção da carga de ambiente acídico ou enzimático duro e liberação específica, enquanto minimiza os efeitos tóxicos da droga. Polímeros utilizados extensivamente para a produção das nanopartículas são Eudragit, gelatina e PLGA.

[068] Proteínas utilizadas como uma plataforma para nanopartículas têm muitas vantagens, elas são biodegradáveis, acessíveis, naturalmente em abundância, quimicamente modificáveis, eficientes em termos de custo, e favoráveis ecologicamente comparadas a excipientes sintéticos atualmente no mercado. Por outro lado, polímeros catiônicos, como quitosana, lisozima e poli-lisina demonstraram possíveis propriedades mucoadesivas assim como eficácia de internalização celular. Essas propriedades foram atribuídas a uma interação eletrostática com o muco e glicoproteínas aniônicas que foram abundantes na superfície do trato GI. Zeína é uma proteína insolúvel em água hidrofóbica de milho. É comestível, o mascaramento de sabor e característica hidrofóbica a torna um bom candidato para o sistema de liberação oral. Nas realizações, para desenvolver um sistema de liberação completamente natural e biodegradável, nanopartículas de zeína estabilizadas utilizando proteína do leite foram utilizadas. Por exemplo, lactoferrina é uma proteína de ligação ao ferro no leite. Tem propriedades nutricionais e biológicas, particularmente importantes para bebês que se alimentam de fórmula. Nas realizações; nanopartículas com estrutura de invólucro de núcleo são descritas, incluindo suas características fisicoquímicas e de conformação. Em um aspecto relacionado, nanopartículas à base de zeína são reveladas, que melhoram a solubilidade e permeabilidade de drogas classe II/IV de BCS, incluindo, entre outras, saquinavir.

DEFINIÇÕES

[069] Conforme aqui utilizados, os termos mencionados têm os seguintes significados. Todos os outros termos e frases utilizados nessa especificação têm seus significados comuns, conforme um técnico no assunto entenderia. Esses significados comuns podem ser obtidos por referência aos dicionários técnicos, como Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001.

[070] Referências na especificação a “uma realização”, “a realização” etc., indicam que a realização descrita pode incluir um aspecto, caráter, estrutura, parte ou característica particular, mas nem toda realização necessariamente inclui esse aspecto, caráter, estrutura, parte ou característica. Ademais, essas frases podem, mas não necessariamente, referem-se à mesma realização mencionada em outras partes da especificação. Ainda, quando um aspecto, caráter, estrutura, parte ou característica particular for descrito em conexão com uma realização, ele está dentro do conhecimento de um técnico no assunto para afetar ou conectar esse aspecto, caráter, estrutura, parte ou característica com outras realizações, seja descrito explicitamente ou não.

[071] Os termos “compreendendo”, “incluindo”, “tendo”, “contendo”, “caracterizado por” e seus equivalentes gramaticais, são termos inclusivos ou de interpretação livre que não excluem elementos ou etapas de método não mencionados adicionais, mas também incluem os termos mais restritivos “consistindo em” e “consistindo essencialmente em”.

[072] As formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referência em plural, a menos que o contexto mencione claramente de outra forma. Assim, por exemplo, uma referência a “um composto” (por exemplo, uma droga) inclui uma pluralidade desses compostos, de modo que um composto X inclui uma pluralidade de compostos X. Como um exemplo adicional, referência a “uma nanopartícula” pode incluir uma pluralidade dessas nanopartículas, e referência a uma “molécula” é uma referência a uma pluralidade de moléculas, e seus equivalentes. Ainda, é observado que as reivindicações podem ser propostas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, essa declaração é destinada a servir como uma base antecedente para o uso de terminologia exclusiva, como “somente”, “só”, e similares, em conexão com a menção de elementos ou uso de acordo com a reivindicação de uma limitação “negativa”.

[073] O termo “e/ou” significa que qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais esse termo é associado. A frase “um ou mais” é prontamente entendida por um técnico no assunto, particularmente, quando lida no contexto de seu uso. Por exemplo, um ou mais substituintes em um anel de fenil se refere de um a cinco, ou um a quatro, por exemplo, se o anel de fenil for disubstituído.

[074] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” significa razoavelmente próximo a ou um pouco mais ou menos que, um número ou quantidade mencionado. Assim, o termo “cerca de” pode se referir a uma variação de ± 5%, ± 10%, ± 20%, ou ± 25% do valor especificado. Por exemplo, “cerca de 50” por cento pode, em algumas realizações, carregar uma variação de 45 a 55 por cento. Para variações de número inteiro, o termo “cerca de” pode incluir um ou mais números inteiros maior que e/ou menor que o número inteiro mencionado. A menos que indicado de outra forma aqui, o termo “cerca de” é destinado a incluir valores, por exemplo, porcentagens em peso, próximas à variação mencionada, que são equivalentes em termos da funcionalidade do ingrediente individual, a composição, ou a realização. Além disso, a menos que indicado de outra forma aqui, uma variação mencionada (por exemplo, porcentagens em peso ou grupos de carbono) inclui cada valor ou identidade específicos dentro da variação.

[075] Conforme será entendido pelo técnico no assunto, todos os números, incluindo os que expressam quantidades de ingredientes, propriedades, como peso molecular, condições de reação e assim por diante, são aproximações e são entendidos como sendo opcionalmente modificadas em todos os casos pelo termo “cerca de”. Esses valores podem variar dependendo das propriedades desejadas procuradas para serem obtidas pelos técnicos no assunto, utilizando os ensinamentos das descrições aqui. Também deve ser entendido que esses valores inerentemente contêm variabilidade resultando necessariamente dos desvios padrão encontrados em suas respectivas medições de teste.

[076] Conforme será entendido por um técnico no assunto, para todo e qualquer objetivo, particularmente, em termos de provisão de uma descrição escrita, todas as variações mencionadas aqui englobam toda e qualquer subvariação e combinações possíveis de suas subvariações, assim como os valores individuais que constituem a variação, particularmente, valores inteiros. Uma variação mencionada (por exemplo, porcentagens em peso ou grupos de carbono) inclui cada valor específico, número inteiro, decimal, ou identidade dentro da variação. Qualquer variação listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo de maneira suficiente e permitindo que a mesma variação seja quebrada em pelo menos metades, terços, quartos, quintos ou dezenas iguais. Como um exemplo não limitante, cada variação discutida aqui pode ser prontamente quebrada em um terço menor, terço médio ou terço superior etc.

[077] Conforme também será entendido por um técnico no assunto, toda linguagem como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que”, “mais que”, “ou mais” e similares, incluem o número mencionado e esses termos se referem a variações que podem ser subsequentemente quebradas em subvariações, conforme discutido acima. Da mesma forma, todas as proporções mencionadas aqui também incluem todas as sub- proporções que estejam dentro da proporção mais ampla. Da mesma forma, valores específicos mencionados para radicais, substituintes e variações, são somente para ilustração; eles não excluem outros valores definidos ou outros valores dentro das variações definidas para radicais e substituintes.

[078] Um técnico no assunto também reconhecerá prontamente que quando membros forem agrupados juntamente de maneira comum, como em um grupo Markush, a invenção engloba não somente todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal. Adicionalmente, para todos os fins, a invenção engloba não somente o grupo principal, mas também o grupo principal que não tem um ou mais dos membros do grupo. A invenção, portanto, visa à exclusão explícita de qualquer um ou mais dos membros de um grupo mencionado. Da mesma forma, ressalvas podem se aplicar a qualquer uma das categorias ou realizações reveladas, pelas quais qualquer um ou mais dos elementos, espécies ou realizações mencionadas, podem ser excluídos dessas categorias ou realizações, por exemplo, conforme utilizado em uma limitação negativa explícita.

[079] O termo “zeína” se refere a um membro da classe de proteínas prolaminas. Prolaminas são encontradas em diversos grãos, como milho, trigo, cevada, arroz e sorgo, assim como em outras plantas e animais. Outros exemplos de prolaminas incluem gliadina, hordeína e kafirina. Essas prolaminas podem ser trocadas para zeína nas diversas realizações descritas aqui. Zeína é composta de uma alta proporção de aminoácidos não polares, como prolina, glutamina e asparagina, e tem um peso molecular de cerca de 22-27 kDa (Shukla, Zein: the industrial protein from corn, Ind Crops Prod 13, 171-92 ; 2001), e pode ser uma mistura de três proteínas distintas com pesos moleculares variantes. Uma amostra típica de zeína pode ter aproximadamente 20% de leucina, 10% de prolina, 21-26% de glutamina, 5% de asparagina, e 10% alanina, portanto, pelo menos cerca de 61% de sua composição de aminoácido é de aminoácidos hidrofóbicos. Esses aminoácidos hidrofóbicos tornam a proteína insolúvel em água. Zeína é um polímero de GRAS aprovado pela US-FDA biodegradável (Fed Register (1985) 50:8997-8999).

[080] Zeína pode ser fabricada como um pó de farinha de glúten de milho. A zeína pura é inodora, sem sabor, insolúvel em água, e comestível, propriedades que a tornaram um componente importante para alimentos e produtos farmacêuticos processados. Métodos para isolar, processar e utilizar zeína são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Lawton, Cereal Chem 2002, 79(1): 1-18, e WO2009/137112 (Perumal et al.), que são aqui incorporados por referência em suas integridades. Um “grau” de zeína se refere a uma variedade de tipos ou formas de zeína, incluindo zeína branca e zeína amarela, derivada por diversos meios, conforme é revelado na Patente Norte-Americana No 5.254.673 (Cook et al.), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua integridade.

[081] Caseína é o nome para uma família de fosfoproteínas relacionadas (αS1, αS2, β, K). Essas proteínas são comumente encontradas em leite de mamífero, constituindo 80% das proteínas em leite de vaca e entre 20% e 45% das proteínas em leite humano. Caseína tem uma ampla variedade de usos, de ser um componente importante do queijo, para utilizar como um aditivo alimentar, a um aglutinante para combinações de segurança. Como uma fonte de alimento, caseína fornece aminoácidos; carboidratos; e dois elementos inorgânicos, cálcio e fósforo.

[082] β-caseina é uma proteína importante encontrada no leite. A proteína se liga ao cálcio em suas regiões fosforiladas, que, por sua vez, são altamente conservadas. O cálcio, então, liga as caseínas juntamente e forma micelas, que permitem melhor que elas sejam ingeridas por bebês. Também tem efeitos do tipo opioide em padrões de sono de recém-nascido em humanos. A proteína, como um todo, é desordenada e é caracterizada como uma proteína de zona desordenada. Beta-caseína pode estar presente como uma das duas variantes genéticas importantes: A1 e A2. A principal diferença entre as proteínas beta-caseína A1 e A2 é um único aminoácido na posição 67 em um filamento de 209 aminoácidos. Beta-caseína A1 tem o aminoácido histidina na posição 67, enquanto beta-caseína A2 tem um aminoácido prolina na mesma posição. Beta-caseína A1 em leite de vaca é diferente de outras beta-caseínas de mamífero, devido à sua histidina na posição 67. Leite humano, leite de cabra, leite de ovelha e leite de outras espécies contêm beta-caseína que é 'semelhante a A2', devido a terem uma prolina na posição equivalente em suas cadeias de beta-caseína.

[083] Lactoferrina, também conhecida como lactotransferrina (LTF), é uma proteína multifuncional da família transferrina. Lactoferrina é uma glicoproteína globular com uma massa molecular de cerca de 80 kDa que é amplamente representada em diversos fluidos secretores, como leite, saliva, lágrimas e secreções nasais. Lactoferrina também está presente em grânulos secundários de PMN e é secretado por algumas células acinar. Lactoferrina pode ser purificada do leite ou produzida de maneira recombinante. Colostro humano (“primeiro leite”) tem a mais alta concentração, seguido por leite humano, então, leite de vaca (150 mg/L).

[084] Lactoferrina é um dos componentes do sistema imune do corpo; tem atividade antimicrobiana (bactericida, fungicida) e é parte da defesa inata, principalmente, nas mucosas. Em particular, lactoferrina provê atividade antibacteriana em crianças humanas.

[085] Lactoferrina interage com DNA e RNA, polissacarídeos e heparina, e apresenta algumas de suas funções biológicas em complexos com esses ligantes.

[086] O termo “biocompatível” significa que o polímero ou conjugado mencionado não causa ou evoca efeitos adversos significativos quando administrado in vivo a um indivíduo. Exemplos de possíveis efeitos adversos incluem, entre outros, inflamação excessiva e/ou uma resposta imune excessiva ou adversa, assim como toxicidade. Por exemplo, zeína e beta-caseína são componentes biocompatíveis.

[087] O termo “nanopartícula” é geralmente conhecido por se referir a uma partícula que é não mais que 1000 nm em pelo menos uma dimensão. Entretanto, as nanopartículas formadas pelos métodos da presente invenção terão um diâmetro de um valor específico conforme aqui definido. Ainda, o uso do termo “nanopartícula” também deve significar para se referir de maneira genérica a nanopartículas brancas e nanopartículas carregadas com uma molécula e formadas pelos métodos da presente invenção. Conforme aqui utilizado, a menos que definido de outra forma, “nanopartícula branca” se refere a nanopartículas que não têm uma partícula, molécula ou material selecionado, formado com ou em conjunto com a nanopartícula.

[088] O termo “diâmetro”, quando utilizado no contexto de dimensões de nanopartícula, refere-se a uma dimensão linear média da partícula para linhas que passam através do centro da massa da partícula. Aproximação aceitável do diâmetro de partículas não esféricas pode ser provida, por exemplo, ao considerar a média da espessura da partícula ao longo de três eixos ortogonais de um sistema de coordenada, com um dos eixos alinhado com a dimensão maior da partícula.

[089] O termo “solvente hidroalcoólico” se refere a um sistema de solvente que inclui água e um solvente alcoólico, como metanol, etanol, n-propanol, iso-propanol, ou butanol (incluindo 1-butanol, 2-butanol (sec-butanol), isobutanol, e terc-butanol). Sistemas de solvente hidroalcoólico comuns incluem 50%, 70%, 90% e 92% de etanol em água.

[090] O termo “contato” se refere à ação de toque, fazer contato, ou de trazer à proximidade imediata ou estrita, incluindo no nível celular ou molecular, por exemplo, para trazer cerca de uma reação fisiológica, uma reação química, ou uma alteração física, por exemplo, em uma solução, em uma mistura de reação, in vitro ou in vivo.

[091] O termo “in vivo” significa do ou dentro do corpo de um indivíduo, como o de um paciente e inclui a administração de nanopartículas por uma variedade de meios, incluindo, entre outros, vias de administração oral, intravenosa, intratumoral, peritumoral, intraperitoneal, parenteral, subcutânea, tópica, ocular, pulmonar e nasal.

[092] O termo “in vitro” se refere a ambientes fora do corpo de um indivíduo ou paciente.

[093] O termo “in situ” se refere à posição original; não tendo sido movimentada ou transferida a outra localização.

[094] O termo “associação” se refere à formação de complexos de carga ou moléculas de carga para as nanopartículas da revelação do momento, e incluem, entre outros, conjugação (covalente ou não covalente) à superfície ou regiões internas da partícula, adsorção e encapsulamento.

[095] O termo “formação de complexo”, incluindo suas variações gramaticais, refere-se à combinação de diversas entidades celulares ou moleculares com as nanopartículas da presente revelação.

[096] O termo “administrado/a” ou “administração”, quando utilizado no contexto de usos terapêuticos e diagnósticos para nanopartículas, refere-se a e inclui a introdução de uma quantidade selecionada de nanopartículas em um ambiente in vivo ou in vitro para o objetivo de, por exemplo, liberação de um agente terapêutico a um local alvo.

[097] Uma “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade eficaz para tratar uma doença, distúrbio, e/ou condição, ou para trazer aproximadamente um efeito mencionado. Por exemplo, uma quantidade eficaz pode ser uma quantidade eficaz para reduzir a progressão ou gravidade da condição ou sintomas sendo tratados. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz é bem dentro da capacidade de técnicos no assunto. O termo “quantidade eficaz” é destinado a incluir uma quantidade de um nanocarregador branco ou carregado de droga (isto é, nanopartícula) aqui descrito, por exemplo, que é eficaz para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio, ou para tratar os sintomas da doença ou distúrbio, em um hospedeiro. Assim, uma “quantidade eficaz” geralmente significa uma quantidade que provê o efeito desejado.

[098] Os termos “tratando”, “tratar” e “tratamento” podem incluir (i) a prevenção de uma doença, condição patológica ou clínica de ocorrer (por exemplo, profilaxia); (ii) inibição da doença, condição patológica ou clínica ou detenção de seu desenvolvimento; (iii) alívio da doença, condição patológica ou clínica; e/ou (iv) diminuição de sintomas associados à doença, condição patológica ou clínica. Assim, os termos “tratar”, “tratamento”, e “tratando” podem se estender a profilaxia e podem incluir prevenir, prevenção, prevenindo, redução, interrupção ou reversão da progressão ou gravidade da condição ou sintomas sendo tratados. Como tal, o termo “tratamento” pode incluir administração clínica, terapêutica e/ou profilática, conforme adequado.

[099] Nas realizações, as nanopartículas da presente revelação podem ser utilizadas para tratar uma variedade de doenças incluindo, entre outros, asma, DPOC, doença pulmonar fibrótica, HIV, câncer, tumores cerebrais, tumores pulmonares, neoplasias do sangue (por exemplo, leucemia, mielomas), doenças inflamatórias, epilepsia, diabetes, demência, distúrbios neurodegenerativos, distúrbios de articulação, doença cardíaca, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças hepáticas, e doenças auto-imunes.

[0100] Os termos “indivíduo” ou “paciente”, ambos, referem-se a ou significam um organismo complexo individual, por exemplo, um humano ou animal não humano.

[0101] Os termos “inibir”, “inibindo”, e “inibição” se referem ao retardamento, interrupção, ou reversão do crescimento ou progressão de uma doença, infecção, condição, ou grupo de células. A inibição pode ser maior que cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, ou 99%, por exemplo, comparado ao crescimento ou progressão que ocorre na ausência do tratamento ou contato.

[0102] O termo “agente terapêutico” e termos semelhantes referindo a uma função terapêutica ou medicinal, significam que uma molécula, macromolécula, droga ou outra substância mencionada pode afetar de maneira benéfica o início, evolução e/ou um ou mais sintomas de uma doença ou condição em um indivíduo, e pode ser utilizado em conjunto com nanopartículas na fabricação de medicamentos para tratar uma doença ou outra condição. Agentes terapêuticos adequados para encapsulamento ou absorção nas nanopartículas aqui descritas incluem agentes terapêuticos hidrofóbicos, como, entre outros, retinoides, como retinol e seus ésteres, e derivados de retinol, como todos ácidos retinoicos trans (ATRA) e retinol, moléculas pequenas, anticorpos, ácido nucléicos, proteínas, hormônios, receptores, ligantes, células (por exemplo, plasma rico em plaqueta (PRP)), fatores de crescimento, extratos de célula e similares.

[0103] O termo “agente terapêutico” e termos similares referindo-se a uma função terapêutica ou medicinal significa que a molécula, macromolécula, droga ou outra substância mencionada pode afetar de maneira benéfica o início, evolução e/ou um ou mais sintomas de uma doença ou condição em um indivíduo, e pode ser utilizado em conjunto com nanopartículas na fabricação de medicamentos para tratar uma doença ou outra condição.

[0104] Retinol (C20H30O; 286,45 g/mol) é um álcool diterpenoide que tem uma atividade biológica importante. Retinol tem um ponto de fusão de 61-63 °C, uma atividade de 3100 unidades/mg, e um Log P de 6,2. Retinol é praticamente insolúvel em água, é solúvel ou parcialmente solúvel em etanol, e é miscível com clorofórmio, éter e espíritos de petróleo. Retinol é um agente cosmético/terapêutico utilizado para diversas condições cutâneas incluindo fotoenvelhecimento, acne, cicatrização de ferida, psoríase melasma, câncer de pele, melanoma e outras condições cutâneas (Orfanos et al., Drug 53:358-388, 1997). Retinol tem má solubilidade em água e má fotoestabilidade (Melo et al., J Control Release 138:32-39, 2009; Patente Norte-Americana No 5.851.538 (Froix et al.), aqui incorporada por referência em sua integrdade). Tretinoína é a forma de ácido carboxílico da vitamina A e também é conhecida como todos ácidos retinoicos trans ou ATRA.

NANOPARTÍCULAS E MÉTODOS PREPARATÓRIOS

[0105] A revelação provê nanopartículas que podem ser formadas de uma proteína insolúvel em água hidrofóbica, como prolamina, por exemplo, zeína e e-caseína ou zeína e lactoferrina.

[0106] A FIGURA 1 ilustra, por meio de um fluxograma, etapas gerais para a preparação de nanopartículas de zeína estabilizadas por e-caseína, de acordo com uma realização. As quantidades específicas utilizadas são para ilustração, e muitas variações podem ser aplicadas aos procedimentos aqui descritos, conforme será prontamente reconhecido por um técnico no assunto. Em uma etapa ou fase inicial do método, uma proteína insolúvel em água (0,4 a 1,25% p/v) é dissolvida em um solvente hidroalcoólico (por exemplo, uma combinação de etanol e água deionizada). A composição do solvente pode ser, por exemplo, 90%:10% v/v ou 92%:8% v/v, álcool para água. Para métodos nos quais uma molécula selecionada deve ser encapsulada na nanopartícula (por exemplo, ATRA), a molécula (0,03 a 0,3% p/v) a ser encapsulada é adicionada à solução dessa primeira fase aquosa. A molécula a ser encapsulada pode ser aproximadamente a 50% p/p do polímero de proteína.

[0107] O pH da solução pode ser alterado, por exemplo, para trazer o pH da solução para entre cerca de pH 6 e cerca de pH 7 pela adição de 0,01N de NaOH ou 0,01N de HCl. Se o pH da água mudar após a adição de uma molécula acídica, como ácido retinoico, ou por uma molécula básica, o pH pode ser reajustado ao pH 6-7. A solução da primeira fase pode ser processada, por exemplo, por sonicação de sonda, para ajudar é a dissolução da proteína.

[0108] Em uma etapa subsequente do método, a solução aquosa da etapa ou fase inicial pode ser adicionada a uma solução de β-caseína contendo um agente de tamponamento e gomas ou polissacarídeos naturais opcionais (por exemplo, goma arábica). Tampão de citrato é o tampão adequado. A escolha do agente de tamponamento utilizado para a segunda fase aquosa é significativa para manter o pH durante a formação de nanopartícula e para liofilização subsequente das nanopartículas formadas, conforme descrito posteriormente nessa revelação. Se não for utilizado tampão, ou se, por exemplo, 0,1N de HCl for utilizado para ajustar o pH da segunda solução em fase aquosa, as partículas produzidas tendem a ser maiores que as produzidas com o tampão de citrato, e as partículas tendem a demonstrar uma variação de tamanho mais larga. O uso de um tampão de citrato produz alguns dos menores tamanhos de diâmetro de partícula, como aproximadamente 100 nm. O uso de outros tampões pode produzir partículas na mesma variação de tamanho de diâmetro ou semelhante de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, mas após a etapa de liofilização, o tamanho médio das nanopartículas formadas utilizando outros agentes de tamponamento foi conhecido por aumentar em duas ou três vezes.

[0109] O pH da segunda solução em fase aquosa pode ser ajustado para ser entre cerca de pH 6,8 e cerca de pH 7,4 para obter o tamanho desejado de nanopartículas. Se o pH estiver fora dessa variação, o tamanho de partícula tende a se tornar maior, e o índice de polidispersão (PDI) das partículas produzidas se torna maior. O PDI é uma medida da distribuição das partículas em diferentes variações de tamanho. O método, portanto, pode utilizar a diferença de solubilidade de uma proteína, como zeína, na solução hidroalcoólica e uma solução aquosa com um pH selecionado de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, próximo ao ponto isoelétrico da zeína (isto é, pI 5 a 9).

[0110] A adição de um agente de tamponamento à segunda solução em fase aquosa pode ser realizada sob alto cisalhamento ultrassônico ou sob homogeneização de alta pressão, ou uma combinação de cisalhamento ultrassônico e alta homogeneização de pressão. A energia ultrassônica e duração do cisalhamento ultrassônico podem ser particularmente significativas para a formação de partículas nas variações de tamanho de diâmetro desejadas. A energia de cisalhamento ultrassônico pode ser realizada, por exemplo, de 0,6 kW/h a 1,39 kW/h, por uma duração de aproximadamente 2 a 10 minutos com um pulso pontual de 5 a 10 segundos e um tempo de descanso de 1 a 5 segundos. O processamento ultrassônico pode ser significativo para a produção de partículas na variação de tamanho desejado. Ao empregar homogeneização de alta pressão, o processo pode ser realizado utilizando um tamanho de orifício entre 0,1 mm e 0,25 mm, e por um período de tempo entre cinco a dez minutos em uma pressão entre 5000 a 40.000 psi.

[0111] Após a aplicação de cisalhamento ultrassônico ou/ou homogeneização de alta pressão à solução da segunda fase, a mistura pode ser agitada para evaporar o etanol ou outro solvente para formar as nanopartículas. Em uma realização, a agitação pode ser realizada, por exemplo, por um agitador mecânico, em uma taxa de aproximadamente 300 rpm a aproximadamente 500 rpm em temperatura ambiente (-23 °C) por aproximadamente uma a seis horas, ou cerca de horas [SIC].

[0112] As nanopartículas podem ser, então, sujeitas à filtração ultracentrífuga para o objetivo de separação das nanopartículas de qualquer material residual. Ultracentifugação pode ser realizada utilizando filtros centrífugos de limite de peso molecular de cerca de 5 kDa (ou outros filtros adequados com um limite Mwt maior ou menor que 5 kDa), e entre 2 kDa e 40 kDa, dependendo da molécula ou droga encapsulada, ou no tratamento particular das nanopartículas, como PEGlação. O tempo da ultracentrifugação pode variar, por exemplo, de cerca de 20 a cerca de 50 minutos. Um crioprotetor pode ser, então, adicionado às nanopartículas. Por exemplo, 2% p/v de trehalose pode ser adicionado como crioprotetor. Outros crio ou lioprotetores também podem ser utilizados, como açúcares, incluindo glucose, sucrose, lactose, ficoll, betaína, ou polióis, como manitol ou sorbitol. As nanopartículas podem ser mantidas em, por exemplo, -80 °C para formar um bolo sólido, que pode ser, então, liofilizado, como ao secar as nanopartículas em um estado congelado sob alto vácuo. A duração de energia ultrassônica e tampão pode ser variada de acordo com os parâmetros desejados, conforme seria prontamente reconhecido por um técnico no assunto.

[0113] Da mesma forma, a variação de tamanhos de diâmetro de partícula das nanopartículas aqui descritas pode ser menor que aproximadamente 400 nm, ou menor que aproximadamente 300 nm. Em algumas realizações, a variação de tamanhos de diâmetro de partícula é de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, ou aproximadamente 75 nm a aproximadamente 300 nm. Embora o tamanho seja discutido em termos de um diâmetro, as nanopartículas não são necessariamente perfeitamente esféricas em forma, apesar de formas esféricas nas nanopartículas poderem ser alcançadas e poderem ser típicas em algumas realizações. As dimensões podem ser medidas entre lados opostos da partícula, por exemplo, a maior dimensão através da partícula de lados opostos, ou a média da maior dimensão através da partícula de lados opostos e a menor dimensão através da partícula de lados opostos.

[0114] Proteínas hidrofóbicas insolúveis em água utilizadas para as nanopartículas podem ser derivadas de uma variedade de fontes, incluindo fontes vegetais, animais e sintéticas. Em algumas realizações, a proteína pode ser da família de prolaminas, que são compostas de altas quantidades de aminoácidos hidrofóbicos como, por exemplo, prolina, glutamina e asparagina. Esses aminoácidos hidrofóbicos tornam a proteína insolúvel em água. Prolaminas podem ser encontradas em diversos grãos, como milho, trigo, cevada, arroz e sorgo, e em outras fontes vegetais e animais. Alguns exemplos de prolaminas adequadas incluem, entre outras, zeína, gliadina, hordeína e kafirina.

[0115] Em algumas realizações, zeína branca pode ser utilizada para produzir nanopartículas adequadas, como as tendo um diâmetro de cerca de 100 nm a cerca de 400 nm. Zeína amarela pode produzir partículas com tamanhos de diâmetro relativamente maiores e também pode produzir partículas com distribuição de tamanho de diâmetro de partícula mais ampla. Os pigmentos em zeína amarela podem afetar a solubilidade da zeína amarela e a formação de nanopartícula utilizando zeína amarela.

[0116] Métodos de preparação de nanopartículas de um tamanho de diâmetro geralmente menor e variação de tamanho de diâmetro mais estreita do que seriam de outra forma possíveis são aqui descritos. Essas nanopartículas menores podem ser preparadas ao implementar um processo de nanoprecipitação controlado por pH utilizando um ou mais graus particulares de uma proteína de base, como zeína, e ao utilizar diversas combinações de tampões que são selecionados para alcançar tamanhos e diâmetros de nanopartícula que tornam as nanopartículas não imunogênicas.

[0117] A FIGURA 2 ilustra, por meio de um fluxograma, etapas gerais para a preparação de nanopartículas de zeína-caseína e genipina de ligação cruzada, de acordo com uma realização.

[0118] Nanopartículas de zeína-caseína podem ser de ligação cruzada ao adicionar genipina (1,0mg/mL) como agente de ligação cruzada à fase orgânica e seguindo as etapas anteriores, conforme delineadas acima (vide, por exemplo, FIGURA 1). Subsequentemente, as nanopartículas resultantes podem ser purificadas, lavadas e liofilizadas.

[0119] Conforme apresentado na FIGURA 3, nas realizações, as nanopartículas podem ser preparadas por secagem por pulverização. Nas realizações, o processo de secagem por pulverização pode ser realizado ao dissolver zeína e caseína em solução etanólica binária (55% de Etanol/CB), de modo que a concentração total de proteínas seja de cerca de 1% em peso.

[0120] Uma molécula de carga (por exemplo, uma droga classe II/IV de BCS) pode ser adicionada de uma solução-mãe etanólica em uma concentração de cerca de 10% (p/v) para a suspensão antes da secagem por pulverização. A secagem por pulverização pode ser realizada utilizando secadores por pulverização de nova geração, por exemplo, Nano Spray Dryer B-90, BÜCHI, em temperatura ambiente por cerca de 6 horas. Os parâmetros operacionais podem ser ajustados como segue: secagem por pulverização através de uma malha de pulverização de 4 μm, taxa de pulverização de cerca de 100%, a temperatura de entrada foi ajustada a cerca de 100 °C e vazão de nitrogênio de cerca de 150 L/min.

[0121] Para PEG-zeína, a solução pode ser banho sonicado e examinado visualmente antes da pulverização para garantir a solubilidade completa. As partículas secas podem ser coletadas de um tambor de coleta utilizando um raspador adequado e armazenadas em um dissecador até utilizadas.

[0122] Nas realizações, após a secagem por pulverização, as nanopartículas de zeína-caseína podem ser de ligação cruzada com genipina. Por exemplo, após a secagem por pulverização as nanopartículas de zeína-caseína resultantes podem ser incubadas em uma solução de tampão adequada (por exemplo, tampão de citrato) em um pH de cerca de 7, contendo genipina (1,0mg/mL) por cerca de 4 horas em temperatura ambiente. As nanopartículas resultantes podem ser purificadas utilizando filtros de centrífuga Millipore (10k MWCO) e lavadas com H2O deionizada. Por fim, um crioprotetor (por exemplo, trehalose) pode ser adicionado e, então, as partículas podem ser resfriadas a cerca de -80 °C, seguido por liofilização por cerca de 48 horas a cerca de -105 °C/100 mTorr de vácuo. As partículas liofilizadas podem ser então armazenadas em um dissecador.

[0123] As nanopartículas podem ser preparadas com uma ampla variedade de “cargas” ou “moléculas de carga”. Por exemplo, partículas ou agentes, tendo propriedades fisicoquímicas variantes, podem ser adicionadas na preparação das nanopartículas de proteína para prover materiais encapsulados, adsorvidos, complexados e/ou conjugados com as nanopartículas. As partículas podem apanhar pequenas moléculas hidrofílicas, pequenas moléculas hidrofóbicas, e/ou macromoléculas. Uma eficiência de encapsulamento de aproximadamente 60% a aproximadamente 80% ou maior pode ser alcançada. As nanopartículas podem prover liberação sustentada da molécula encapsulada de um a sete dias, ou uma ou duas semanas, em um ambiente in vitro ou in vivo. Em algumas realizações (por exemplo, proteínas/anticorpos e similares), a carga pode ser adsorvida/complexada/conjugada à superfície da nanopartícula.

[0124] Nas realizações, a carga ou moléculas de carga são materiais farmacêuticos. Esses materiais que são adequados para uso com as presentes nanopartículas como carga ou moléculas de carga encapsuladas, moléculas de carga complexadas ou conjugadas ou moléculas de carga adsorvidas incluem quaisquer materiais para uso in vivo ou in vitro para tratamento diagnóstico ou terapêutico de um indivíduo que pode ser associado à nanopartícula sem deturpar de maneira apreciável integridade física da nanopartícula.

[0125] Em outras realizações, a carga ou moléculas de carga são materiais agrícolas. Esses materiais que são adequados para uso com as nanopartículas, conforme aqui descritas, incluem quaisquer materiais para tratamento in vivo ou in vitro, diagnóstico ou aplicação em plantas ou não mamíferos (incluindo micro-organismos) que podem ser associados (isto é, encapsulados, conjugados ou adsorvidos) às nanopartículas sem deturpar de maneira apreciável a integridade física das nanopartículas.

[0126] Em outra realização, a carga ou moléculas de carga são agentes imuno-potencializadores. Esses materiais que são adequados para uso com as nanopartículas, conforme descritas, incluem qualquer antígeno, hapteno, parcela orgânica ou compostos orgânicos ou inorgânicos que darão origem a uma resposta imune que pode ser associada (isto é, encapsulada, conjugada ou adsorvida) às nanopartículas sem deturpar de maneira apreciável a integridade física das nanopartículas. As nanopartículas podem ser úteis para a produção de antivirais para o tratamento de doenças, como AIDS.

[0127] Essas nanopartículas podem ser utilizadas em uma variedade de aplicações diagnósticas ou terapêuticas in vivo, ex vivo ou in vitro. Alguns exemplos são o tratamento de doenças, como câncer, doença autoimune, defeitos genéticos, distúrbios de sistema nervoso central, doenças infecciosas e distúrbios cardíacos, usos diagnósticos, como radio-imunoensaios, microscopia de elétron, PCR, ensaios imunoadsorventes ligados de enzima, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, formação de imagem com contraste, imunoscintografia, e pesticidas de liberação, como herbicidas, fungicidas, repelentes, atrativos, antimicrobianos ou outras toxinas. Materiais não genéticos também são incluídos, como fatores de crescimento, hormônios, quimiocinas, citocinas, interleuquinas, interferons, fator de necrose tumoral, fator estimulante de colônia de granilócitos, e outra proteína ou fragmentos de qualquer um desses agentes antivirais.

[0128] A invenção também provê nanopartículas como dispositivos de liberação oral, como nanopartículas contendo um agente ativo (droga). As nanopartículas podem prover liberação focalizada e controle temporal da liberação do agente. O agente pode ser, por exemplo, um agente eficaz para tratar doenças da infância, por exemplo, retinol ou ácido retinoico, e similares dentre outros agentes descritos aqui.

[0129] A invenção também provê um kit para a preparação de nanopartículas aqui descritas. O kit pode conter uma quantidade selecionada de uma proteína solúvel em água, beta-caseína, um ou mais agentes de tamponamento, uma ou mais gomas naturais ou polissacarídeos, e agentes de ligação cruzada, ou combinações destes.

[0130] A invenção, portanto, provê nanopartículas de encapsulamento de diversos agentes e métodos de preparação delas. Em uma realização, o método pode ser para a produção de nanopartículas não imunogênicas. O método pode incluir a provisão de uma proteína insolúvel em água hidrofóbica; dissolução da proteína com um solvente hidroalcoólico e uma molécula de carga para prover uma primeira solução em fase aquosa; adição da solução hidroalcoólica ao agente de tamponamento contendo beta- caseína (e uma goma natural ou polissacarídeo opcional) para produzir uma segunda solução em fase aquosa tendo um pH entre aproximadamente pH 6,8 e aproximadamente pH 7,4; processamento da segunda solução em fase aquosa para efetuar uma redução no tamanho de diâmetro de partículas dentro da dispersão; evaporação de qualquer solvente residual para produzir nanopartículas tendo um tamanho de diâmetro menor que aproximadamente 400 nm. As nanopartículas podem ser, então, centrifugadas para isolamento e coleta. Alternativamente, nas realizações, as nanopartículas podem ser de ligação cruzada ou secas por pulverização.

[0131] Nas realizações, a seleção do solvente orgânico ou misturas de solventes orgânicos para a solubilização de Zeína antes da secagem por pulverização pode incluir um ou mais dos seguintes: água; EtOH/água; EtOH/tampão de citrato, pH cerca de 7,4; EtOH/solução fisiológica tamponada de fosfato, pH cerca de 7,4; IPA/água; MeOH/água; Acetona/água e DCM/Etanol (1:1). Nas realizações, diversas misturas orgânicas podem ser utilizadas para conduzir o processo de pulverização. Em uma realização, a proporção de solvente/aquoso orgânico final é de cerca de 3:2 em volume final de 40 ml.

[0132] Nas realizações, zeína seca por pulverização pode ser estabilizada com uma ou mais moléculas incluindo ácido cítrico, SLS, Tween 80, Pluronic F68, Lecitina, Lecitina-Pluronic F68, PVP (polivinilpirrolidona), PEG (polietileno glicol) 20 kDa, TPGS 1000, Goma arábica, Caseína, sal de sódio, β-Caseina, Dextrano, PSA (ácido polisiálico).

[0133] Nas realizações, pectinas e gomas podem ser adicionadas à matriz de material (zeína e caseína), onde a concentração total na solução de pulverização é de cerca de 1% em peso.

[0134] O método, conforme aqui revelado, pode incluir liofilização das nanopartículas após centrifugação. O método ainda pode incluir armazenamento das nanopartículas sob condições que restringem a exposição das nanopartículas à pressão atmosférica. A proteína de base pode ser, por exemplo, um grau selecionado de zeína, como zeína branca.

[0135] O agente de tamponamento pode ser um tampão de citrato. O processamento da segunda solução em fase aquosa para efetuar uma redução em tamanho de diâmetro de partículas ainda pode incluir a sujeição das nanopartículas a cisalhamento ultrassônico, homogeneização de alta pressão, ou uma combinação destes. Para outras preparações de nanopartícula, por exemplo, surfactantes podem estar ausentes (por exemplo, nanopartículas de e-caseína-dextrano ou nanopartículas de zeina-β-caseína-goma arábica) ou outros surfactantes podem ser utilizados (por exemplo, quando for utilizado lauril sulfato de sódio além de surfactantes não iônicos para preparar nanopartículas de zeína).

[0136] O método pode incluir a adição à proteína na formação da solução de primeira fase de uma molécula para encapsulamento de nanopartícula. A molécula pode ser uma substância terapêutica selecionada para administração a um indivíduo, para prover uma nanopartícula não imunogênica, terapeuticamente ativa. A proteína também pode ser de PEGuilato e/ou de ligação cruzada.

[0137] A invenção ainda provê uma composição terapêutica compreendendo uma nanopartícula não imunogênica formada pelo encapsulamento de uma molécula terapêutica em uma proteína insolúvel em água, hidrofóbica, a nanopartícula tendo um diâmetro de menos que cerca de 400 nm. Em algumas realizações, o diâmetro das partículas é cerca de 100 nm a cerca de 400 nm, ou cerca de 100 nm a cerca de 300 nm. A invenção também provê uma quantidade farmacologicamente terapêutica de nanopartículas não imunogênicas compreendendo um agente terapêutico, as nanopartículas tendo diâmetros médios de menos que cerca de 400 nm. As nanopartículas podem ser utilizadas para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo que sofre de ou em risco de sofrer da doença ou condição que pode ser tratada pelo agente terapêutico (isto é, que precisa dele).

VARIAÇÕES DE PROTEÍNA, POLÍMERO, E COMPONENTES DE NANOPARTÍCULA

[0138] Variações das nanopartículas de zeína descritas aqui também podem ser preparadas. Por exemplo, no lugar de zeína, outras proteínas prolamina hidrofóbicas, como gliadina, hordeína e kafirina podem ser utilizadas como a proteína para formação de nanopartícula. Da mesma forma, nanopartículas de gliadina, nanopartículas de hordeína e nanopartículas de kafirina podem ser preparadas e utilizadas semelhantes às nanopartículas de zeína aqui descritas.

[0139] Adicionalmente, a proteína das nanopartículas pode ser conjugada em parcelas, como PEG, para modificar a superfície das nanopartículas. A parcela de modificação de superfície pode ser parcelas de PEG ou outros polímeros solúveis em água, como polivinilpirrolidona (PVP), ácido poliglicólico (PGA), álcool polivinílico (PVA), quitosana, dextrano, polietilenoimina (PEI), ácido polisiálico (PSA), ácido poliacrílico (PAA), e similares. Esses polímeros solúveis em água podem ser conjugados a qualquer uma das proteínas prolamina hidrofóbicas, como zeína, gliadina, hordeína e kafirina, para formar modificações de superfície das nanopartículas.

[0140] De maneira semelhante, polímeros hidrofóbicos podem ser complexados, misturados ou conjugados a uma nanopartícula de prolamina. Esses polímeros podem incluir, por exemplo, policaprolactona, poli ácido láctico-co ácido glicólico, óxido de polipropileno, poliaspartato, poliglutamato, espermina, polilisina, polietileno imina ou poliacrilatos (por exemplo, polimetacrilato, acrilato de etila poli-dimetilamino, e similares). Polímeros naturais também podem ser complexados, misturados ou conjugados em nanopartícula de prolamina, como outros polímeros de proteína (albumina, caseína, gelatina, e similares), e polímeros de carboidrato como quitosana, dextrano, goma arábica, caseína enxertada de dextrano, alginatos ou combinações destes. Da mesma forma, ácidos graxos também podem ser misturados, complexados ou conjugados em uma superfície de nanopartículas de prolamina. Exemplos desses ácidos graxos podem incluir ácido esteárico, ácido palmítico, fosfatidil etanolamina, e/ou ácido oléico. Esses polímeros e/ou ácidos graxos podem ser conjugados a qualquer uma das proteínas prolamina hidrofóbicas, como zeína, gliadina, hordeína e kafirina, para formar nanopartículas modificadas de superfície.

[0141] Devido à zeína e beta-caseína serem proteínas, uma vantagem adicional da utilização dessas moléculas na formação de nanopartículas é realizada, em que as proteínas têm um número grande de grupos funcionais de superfície que podem ser utilizados para afixar ligantes de focalização, agentes de formação de imagem, drogas e outros polímeros para focalização da droga a tecidos específicos e outras aplicações biomédicas. Outras ou adicionais modificações podem ser feitas ao núcleo hidrofóbico de prolamina ou às superfícies de nanopartícula. Elas podem incluir a conjugação de elementos responsivos por estímulos, como polihidroxietilmetacrilato, às nanopartículas para preparar nanopartículas sensíveis a pH ou poli (N- isopropilacrilamida) para preparar nanopartículas termosensíveis. Além disso, as nanopartículas de prolamina podem ser de ligação cruzada, por exemplo, utilizando agentes de ligação cruzada, como glutaraldeído, genipina, ácido cítrico, ácido polisiálico (PSA), e similares, para controlar a liberação da droga e aumentar a produção e eficiência de encapsulamento da droga.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS DE NANOPARTÍCULAS

[0142] As nanopartículas aqui descritas podem ser utilizadas para preparar composições farmacêuticas terapêuticas. As nanopartículas podem ser adicionadas às composições na forma de uma dispersão aquosa ou como um pó seco de nanopartículas liofilizadas. As nanopartículas podem ser formuladas como composições farmacêuticas e administradas a um hospedeiro mamífero, como um paciente humano, em uma variedade de formas. As formas podem ser adaptadas especificamente a uma via escolhida de administração, como administração oral.

[0143] As nanopartículas aqui descritas podem ser administradas via oral em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, como um diluente inerte. A porcentagem em peso do agente nas composições e preparações pode variar e também pode ser, de maneira conveniente, de cerca de 2% a cerca de 60% do peso de uma determinada forma de dosagem unitária. A quantidade de composto ativo nessas composições terapeuticamente úteis contendo nanopartículas é de modo que um nível de dosagem eficaz possa ser obtido. Dispersões, formulações em aerossol, géis e similares também podem conter um ou mais dos seguintes: aglutinantes, como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina. Uma forma de dosagem unitária, além de materiais do tipo acima, podem incluir um condutor líquido, como um óleo vegetal ou um polietileno glicol. Diversos outros materiais podem estar presentes para modificar a forma física de uma forma de dosagem unitária. Uma formulação tópica pode conter as nanopartículas, além de metil e propil parabenos como preservativos e, opcionalmente, um corante para adicionar cor. Qualquer material utilizado na preparação de uma forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não tóxica nas quantidades empregadas. Além disso, a dispersão de nanopartículas ou nanopartículas liofilizadas podem ser incorporadas em preparações e dispositivos de liberação sustentada adicional.

[0144] Dispersões das nanopartículas podem ser preparadas em água, opcionalmente, misturadas com um tampão, ou em outros solventes farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas destes. Sob condições comuns de armazenamento e uso, preparações podem conter um preservativo para impedir o crescimento de micro-organismos. A forma de dosagem fundamental deve ser estéril, fluida e estável sob condições de fabricação e armazenamento. O condutor ou veículo líquido pode ser um meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, a poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietilenos glicóis líquidos e similares), óleos vegetais, gliceril ésteres não tóxicos, e misturas adequadas destes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser ocasionada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal, e similares. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões, ou cloreto de sódio em algumas formulações.

[0145] Soluções estéreis podem ser preparadas ao incorporar as nanopartículas na quantidade necessária em um solvente apropriado com diversos dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis, métodos de preparação podem incluir técnicas de secagem à vácuo e secagem de congelamento, que produzem um pó das nanopartículas mais qualquer ingrediente adicional desejado presente no material filtrado, estéril previamente.

[0146] Nas realizações, compostos descritos aqui podem ser formulados para administração oral. Compostos descritos aqui podem ser formulados ao combinar os compostos ativos com, por exemplo, carregadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em diversas realizações, os compostos descritos aqui podem ser formulados em formas de dosagem oral que incluem, somente a título de exemplo, comprimidos, pós, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, elixires, pastas, suspensões e similares.

[0147] Nas realizações, preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas ao misturar um ou mais excipientes sólidos com um ou mais dos compostos aqui descritos, opcionalmente, esmerilhamento da mistura resultante, e processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são, em particular, excipientes, como açúcares, incluindo lactose, sucrose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, celulose microcristalina, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio; ou outros, como: polivinilpirrolidona (PVP ou povidona) ou fosfato de cálcio. Nas realizações, agentes de desintegração são opcionalmente adicionados. Agentes de desintegração incluem, somente a título de exemplo, croscarmelose de sódio de ligação cruzada, polivinilpirrolidona, agar-agar, ou ácido algínico ou um sal destes, como alginato de sódio.

[0148] Nas realizações, formas de dosagem, como núcleos de drágeas e comprimidos, são providas de uma ou mais revestimentos adequados. Nas realizações, soluções de açúcar concentradas são utilizadas para revestimento da forma de dosagem. As soluções de açúcar, opcionalmente, contêm componentes adicionais, como, somente a título de exemplo, goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. Corantes e/ou pigmentos também são opcionalmente adicionados aos revestimentos para fins de identificação. Adicionalmente, os corantes e/ou pigmentos são opcionalmente utilizados para caracterizar diferentes combinações de doses de composto ativo.

[0149] Nas realizações, quantidades terapeuticamente eficazes de pelo menos um dos compostos aqui descritos podem ser formuladas em outras formas de dosagem oral. Formas de dosagem oral incluem cápsulas de ajuste por pressão feitas de gelatina, assim como cápsulas macias, seladas feitas de gelatina e um plastificante, como glicerol ou sorbitol. Nas realizações, cápsulas de ajuste por pressão contêm os ingredientes ativos em mistura com um ou mais excipiente. Excipientes incluem, somente a título de exemplo, lactose, retardadores, como amidos, e/ou lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas realizações, cápsulas macias contêm um ou mais compostos ativos que são dissolvidos ou suspensos em um líquido adequado. Líquidos adequados incluem, somente a título de exemplo, um ou mais óleo graxo, parafina líquida, ou polietileno glicol líquido. Além disso, estabilizadores podem ser opcionalmente adicionados.

[0150] Nas realizações, quantidades terapeuticamente eficazes de pelo menos um dos compostos aqui descritos são formuladas para administração bucal ou sublingual. Formulações adequadas para administração bucal ou sublingual incluem, somente a título de exemplo, comprimidos, lozenges, ou géis.

[0151] Dosagens úteis de nanopartículas carregadas de droga aqui descritas podem ser determinadas ao comparar sua atividade in vitro, e atividade in vivo em modelos de animais mamíferos. Um mamífero inclui um primata, humano, roedor, canino, felino, bovino, ovino, equino, suíno, caprino, bovino e similares.

[0152] Métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em camundongos, e outros animais, a humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, vide Patente Norte- Americana No 4.938.949 (Borch et al.), incorporada por referência em sua integridade. A quantidade de um composto, ou um sal ativo, pró-droga, ou derivados destes, carregada em uma nanopartícula necessária para uso no tratamento pode variar não somente com o composto particular ou sal selecionado, mas também a via de administração, a natureza da condição sendo tratada e a idade e condição do paciente, e será, por fim, a critério do médico assistente ou clínico.

[0153] A nanopartícula carregada de agente terapêutico pode ser administrada de maneira conveniente em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, contendo 5 a 1000 mg/m2, de maneira conveniente 10 a 750 mg/m2, de maneira mais conveniente, 50 a 500 mg/m2 de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. A dose desejada pode ser apresentada de maneira conveniente em uma única dose ou como doses divididas administradas em intervalos adequados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A sub-dose em si pode ser ainda dividida, por exemplo, em diversas administrações diferentes espaçadas folgadamente.

[0154] Os seguintes Exemplos são destinados a ilustrar a invenção acima e não devem ser construídos como estritos em seu escopo. Um técnico no assunto reconhecerá prontamente que os Exemplos sugerem muitas outras maneiras nas quais a invenção poderia ser praticada. Deve ser entendido que as diversas variações e modificações podem ser feitas enquanto permanecem dentro do escopo da invenção.

EXEMPLOS

[0155] Exemplo 1. Materiais e Métodos para Nanopartículas de zeína-caseína.

[0156] Método de separação de fase.

[0157] 15 mg de zeína branca de milho (Grau F6000) foi dissolvido em 2 ml de 90% EtOH, de modo que a concentração total fosse 0,5% (p/v). A essa solução etanólica, todos ácidos retinoicos trans (ATRA) foi adicionado de uma solução-mãe em uma concentração ideal de 1 mg. A fase orgânica foi adicionada em gotas a 0,1 M de solução de tampão de citrato contendo 0,15% (p/v) de beta- caseína (Cat. Sigma no C6905) sob sonicação de sonda. Opcionalmente, um estabilizador (por exemplo, goma arábica a 0,1% p/v) pode ser adicionado durante essa etapa ou adicionado a 0,1 M de tampão de citrato antes da adição em gotas da fase orgânica. A sonicação de sonda foi ajustada a 38% de amplitude por 10 min (ciclo de 10 seg. em e 1 seg. fora). A dispersão de zeína-caseína foi deixada sob um agitador magnético (300 rpm) por 4 horas para evaporar o EtOH. Ainda, as nanopartículas foram separadas utilizando filtros centrífugos Millipore (MWCO 5-10kDa; 40.000 rpm por 60 minutos) e lavadas diversas vezes com H2O DI utilizando uma pipeta e/ou PBS, pH 7,0. Por fim, um crioprotetor (trehalose) foi adicionado e, então, colocado em -80 °C, seguido por liofilização por 48 horas em vácuo -105 °C/100 mTorr. A formulação foi, então, armazenada em frascos fechados em um dissecador (a 2-8 °C) até uso adicional.

[0158] Para nanopartículas de zeína-caseína ligadas de maneira cruzada de genipina, genipina foi adicionada (1,0 mg/ml) à fase orgânica e as etapas restantes foram seguidas como acima. Subsequentemente, as nanopartículas resultantes foram purificadas, lavadas e liofilizadas.

[0159] Método de secagem por pulverização para nanopartículas de ZC.

[0160] O processo de secagem por pulverização foi realizado ao dissolver zeína e caseína em solução etanólica binária (55% de EtOH/tampão de citrato), de modo que a concentração total de proteínas fosse 1%. Para PEG- zeína, a solução foi sonicada em banho e examinada visualmente antes da pulverização para garantir a solubilidade completa. ATRA foi adicionado da solução-mãe etanólica em uma concentração de 10% à suspensão antes da secagem por pulverização. A secagem por pulverização foi realizada utilizando um Nano Spray Dryer B-90 BÜCHI em temperatura ambiente por 6 horas. Os parâmetros operacionais foram ajustados como segue:

[0161] Secagem por pulverização através de uma malha de pulverização de 4 μm, taxa de pulverização de 100%, a temperatura de entrada foi ajustada a 100 °C e vazão de nitrogênio de 150L/min.

[0162] As partículas secas foram coletadas do tambor de coleta utilizando um raspador adequado e armazenadas em um dissecador até o uso.

[0163] Para nanopartículas de ZC ligadas de maneira cruzada de genipina, após secagem por pulverização, as nanopartículas de ZC foram ligadas de maneira cruzada por incubação em uma solução de tampão de citrato (pH 7) contendo genipina (1,0 mg/ml) por 4 horas em temperatura ambiente. As nanopartículas resultantes foram purificadas utilizando filtros de centrífuga Millipore (10 kDa MWCO) e lavadas com água DI. Por fim, crioprotetor (trehalose) foi adicionado e, então, as nanopartículas foram colocadas em -80 °C seguido por liofilização por 48 horas de vácuo -105 °C/100 mTorr. As nanopartículas liofilizadas foram armazenadas em um dissecador até o uso.

[0164] Análise de tamanho de partícula e potencial zeta foi medido utilizando Dispersão em Luz Dinâmica (DLS). O tamanho médio assim como o potencial zeta das partículas foram medidos utilizando um Malvern ZetasizerS 3600 (Malvern Instruments Inc., South Borough, MA). Para microscopia de força atômica, 100 μl da dispersão foi colocado em uma lamínula de vidro revestida de amina de polietileno e seco ao ar. Imagens AFM de nanopartículas de ZC foram caracterizadas utilizando microscópio Agilent 5500 AFM/SPM. imagens AFM foram coletadas utilizando a área de escaneamento de 1 μm. Para microscopia de elétron de escaneamento (SEM), nanopartículas de ZC foram dispersas em água em uma concentração de 20 μg/ml e aplicadas em uma rede de amostra polida. As amostras foram secas a vácuo e metalizadas com uma camada de ouro de 3 nm.

[0165] A quantidade de ATRA foi determinada por HPLC de fase reversa. Resumidamente, 2 mg de nanopartículas de ZC carregadas de ATRA foram dispersas em água DI, então, centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o pélete restante foi dissolvido em 50% de solução hidroalcoólica/tampão de citrato, sonicado em sonda por 5 min., seguido por sonicação em banho por 5 min. A concentração da droga foi determinada da curva de calibração. O carregamento e eficiência de encapsulamento foram calculados como segue:

[0166] % de DL = (peso de ATRA em nanopartículas de ZC/peso de nanopartículas de ZC) * 100

[0167] % de EE = (peso de ATRA em nanopartículas de ZC/peso do ATRA de alimentação) * 100

[0168] Coluna: C18 coluna, 100Â, 5 μm, 4,6 mm x 150 mm; Fase móvel: acetonitrila (1,13 ml/min)-1% p/v de tampão de acetato de amônia (0,12 ml/min); Comprimento de onda de detecção: 340 nm; Volume de injeção: 50 μl; Tempo de execução: 10 min.

[0169] Eficiência de carregamento (ATRA) = 1,174,1%

[0170] Eficiência de encapsulamento (ATRA) = 6188,56%

[0171] Para nanopartículas de ZC Vermelho Nilo:

[0172] Eficiência de carregamento = 2,9%

[0173] Eficiência de encapsulamento = 71,06%

[0174] Para nanopartículas de ZC de curcumina:

[0175] Eficiência de carregamento = 0,98%

[0176] Eficiência de encapsulamento = 73,5%

[0177] Otimização

[0178] Para otimizar a parâmetros de formulação, um projeto Box-Behnken de três níveis foi utilizado. Um total de 15 experimentos com três variáveis de formulação foram utilizados. Os três parâmetros foram estudados em três níveis (baixo, médio e alto). As variáveis dependentes que foram selecionadas para estudo: tamanho de partícula (Y1), PDI (Y2) e % de EE (Y3). Vide Tabela 1. TABELA 1. OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS DE FORMULAÇÃO.

X1, proporção de zeína/caseína; X2, pH da fase aquosa; X3 % de fase hidroalcoólica

[0179] Análise estatística

[0180] O efeito de diversos parâmetros foi analisado utilizando análise regressão linear múltipla e ANOVA em um nível de significância de p<005 (software MINITAB™).

[0181] O estado físico de ATRA na formulação foi determinado por calorímetro de escaneamento diferencial DSC Q200 (TA Instruments, Inc. USA). Amostras pesadas precisamente (5 mg) foram seladas em tabuleiros de selagem de alumínio (T Zero Lid no T100819) e aquecidas em uma taxa de 10 °C/min de 23 a 300 °C sob atmosfera de nitrogênio (vazão de 20 ml/min). Uma célula de alumínio branca foi utilizada como uma referência. Os termogramas foram processados utilizando software de Análise Universal da TA (TA Instruments Inc, USA).

[0182] Degradação e liberação in vitro de ATRA das nanopartículas de ZC

[0183] O perfil de degradação de nanopartículas de ZC foi determinado por incubação das nanopartículas de zeína-caseína em fluido gástrico e fluido intestinal simulados por até 4 horas. As amostras foram analisadas por eletroforese em gel. Ainda, a liberação de ATRA em fluido gástrico simulado foi quantificada por HPLC. Resumidamente, 10 mg e nanopartículas de ZC carregadas de ATRA foi suspenso em tubos Eppendorf de 1,5 ml contendo meio de liberação. Os tubos foram colocados em um agitador a 37 °C. Em diferentes pontos no tempo, as amostras foram removidas e centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min., o sobrenadante foi removido cuidadosamente utilizando uma pipeta de 1 ml e o pélete restante foi dissolvido em 50% de EtOH. A concentração de ATRA foi determinada utilizando HPLC, conforme descrito.

[0184] Estudos de estabilidade

[0185] Para estabilidade de estado sólido de nanopartículas de zeína-caseína carregadas de ATRA, 40 mg de nanopartículas carregadas de ATRA foi mantido em seis frascos de vidros vedados e mantido no escuro em temperatura ambiente (isto é, 25 °C) assim como a 4 °C em um refrigerador. Em diferentes pontos no tempo, tamanho de partícula, PDI, eficiência de encapsulamento e porcentagem da droga restante nas nanopartículas foram determinados.

[0186] Partículas com invólucro de núcleo híbridas foram formadas durante o processo de separação de fase. As partículas foram uniformes e com um tamanho de partícula médio de 90-150 nm, tendo uma polidispersão estreita (PD). As nanopartículas tiveram um potencial zeta alto negativo, indicando boa estabilidade coloidal. (Vide Tabelas 2 e 3.) TABELA 2. MÉTODO DE NANOPRECIPITAÇÃO (SEPARAÇÃO DE FASE) (DE TERCEIRO PDF)

ZC, nanopartículas de zeína-caseína; ZCG, nanopartículas de zeína-caseína goma arábica; ATRA, todos ácidos retinoicos trans. TABELA 3. CARACTERÍSTICAS DE PARTÍCULA E EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAMENTO DE PARTÍCULAS DE ZC BRANCAS E CARREGADAS DE ATRA.

[0187] Com base no modelo Box-Behnken, a formulação foi otimizada com base em valores observados e previstos. Os fatores ideais foram determinados como proporção de zeína/caseína (1:2), pH da fase aquosa (7,4) e % de fase hidroalcoólica (70%).

[0188] O ATRA foi encapsulado em nanopartículas de zeína-caseína com alta eficiência de encapsulamento (Vide Tabela 3). Estudos de estabilidade química indicaram que nanopartículas de ZC carregadas de ATRA são estáveis em condições de armazenamento e que não houve alteração digna de nota no tamanho de partícula nem conteúdo de ATRA por até 60 dias. Estudo de liberação e degradação in vitro apresentou que a formulação de nanopartícula apresentou um perfil de liberação sustentada. Ainda, as nanopartículas de ZC foram estáveis no fluido gástrico simulado. (Pode ter de utilizar flix).

[0189] Calorimetria de Escaneamento Diferencial (DSC).

[0190] O estado físico da droga na formulação foi determinado por DSC em um DSC Q200 (TA Instruments Inc., USA). Termogramas de DSC (não apresentados) foram obtidos para zeína branca, partículas carregadas de ATRA e ATRA puro. Amostras pesadas precisamente (5 mg) foram seladas em tabuleiros de selagem de alumínio (T Zero Lid no T100819) e aquecidas em uma taxa de 10 °C/min de 23 a 300 °C sob uma atmosfera de nitrogênio (vazão de 20 ml/min). Uma célula de alumínio branca foi utilizada como uma referência. Os termogramas (não apresentados) foram processados utilizando software de Análise Universal da TA (TA Instruments, Inc. USA). Os termogramas obtidos das formulações brancas, droga pura e formulações carregadas de droga foram comparados entre si para determinar o estado físico de ATRA na formulação.

[0191] Exemplo 2. Influência de solventes.

[0192] Para identificar solventes adequados e para estabilizar as nanopartículas utilizando um secador de nanopulverização, um composto hidrofóbico modelo foi utilizado (curcumina) como um agente de encapsulamento em nanopartículas de zeína.

[0193] Conforme apresentado na Tabela 4, diversos solventes de secagem por pulverização tiveram diferentes efeitos nas nanopartículas de zeína, incluindo efeitos no tamanho, PDI e potencial zeta. TABELA 4 . INFLUÊNCIAS DE DIVERSOS SOLVENTES NAS CARACTERÍSTICAS DE NANOPARTÍCULA

[0194] A seleção do solvente orgânico ou misturas de solventes orgânicos foi considerada inicialmente para a solubilização de zeína antes da secagem por pulverização. Diversas misturas orgânicas foram utilizadas para conduzir o processo de pulverização. A proporção de solvente orgânico/aquoso final foi de 3:2 para um volume final de 40 ml.

[0195] Exemplo 3. Influência de estabilizadores

[0196] Conforme apresentado na Tabela 5, diversos estabilizadores utilizados em secagem por pulverização tiveram diferentes efeitos nas nanopartículas de zeína, incluindo efeitos no tamanho, PDI, potencial zeta e características de agregação. TABELA 5. INFLUÊNCIAS DE ESTABILIZADORES NAS CARACTERÍSTICAS DE NANOPARTÍCULA

polivinilpirrolidina; PSA, ácido polisiálico.

[0197] Zeína e estabilizador em uma proporção de 1:1 foram adicionados em um volume aproximado de 60% de EtOH (isto é, a concentração total da matriz de material na solução orgânica foi mantida constante em 1%) e, então, sonicados em banho em temperatura ambiente, até todos os componentes serem completamente dissolvidos.

[0198] Exemplo 4. Caracterização fisicoquímicas de partículas secas por pulverização.

[0199] A caracterização do tamanho de partícula, distribuição e potencial zeta foram determinados por dispersão de luz de laser dinâmica utilizando Malvern Zetasizer S3600 (Malvern Instruments Inc., Southborough, MA). Vide, por exemplo, Tabela 6 e FIGURA .

[0200] Para nanopartículas de beta caseína secas por pulverização, os seguintes dados foram gerados:

TABELA 6 . PROPRIEDADES PARA NANOPARTÍCULAS DE ZC SECAS POR PULVERIZAÇÃO

ZC, nanopartículas de zeína caseína; ATRA, todos ácidos retinoicos trans.

[0201] Exemplo 5. Nanopartículas de zeína- caseína (ZC) secas por pulverização com gomas naturais ou polissacarídeos.

[0202] Pectina e gomas foram adicionadas à matriz do material (zeína e caseína), assim a concentração total na solução de pulverização foi cerca de 1% em peso. O processo de secagem por pulverização foi realizado conforme mencionado acima. Para investigar a estabilidade de nanopartículas de ZC com pectina e gomas, o tamanho, PDI, e potencial zeta foram medidos em pH acídico (1,5) assim como em água (pH neutro). Vide Tabelas 7, 8, e 9. TABELA 7. NANOPARTÍCULAS DE ZC SECAS POR PULVERIZAÇÃO COM GOMA ARÁBICA (ZCG)

[0203] Exemplo 6. Caracterização de Nanopartículas de PEG-zeína secas por pulverização, incluindo comparações com nanopartículas de zeína-caseína.

[0204] A Tabela 10 apresenta tamanho, PDI, e dados de potencial zeta para diversas combinações de Zeína PEGuilada, com PEGs de diversos pesos moleculares (5-20 kDa) entre processos de secagem por pulverização e sem pulverização. TABELA 10. INFLUÊNCIAS DE PESO MOLECULAR DE PEG EM CARACTERÍSTICAS DE NANOPARTÍCULA

[0205] Misturas físicas também foram examinadas (Vide Tabela 11). TABELA 11. MISTURAS FÍSICAS DE PEG E ZEÍNA SOB CONDIÇÕES DE SECAGEM POR PULVERIZAÇÃO

[0206] Conforme pode ser visto entre as Tabelas 10 e 11, zeína de PEGuilato teve propriedades bastante diferentes de misturas de PEG + zeína simples.

[0207] A Tabela 12 demonstra a estabilidade de diversas composições de nanopartícula de zeína em fluido gástrico simulado (SGF, pH 1,3). TABELA 12 . INFLUÊNCIAS DE SGF NA ESTABILIDADE DE DIVERSAS CARACTERÍSTICAS DA NANOPARTÍCULA

ZCG, nanopartículas de zeína-caseína goma arábica.

[0208] Características de nanopartículas de zeína caseína carregadas de ATRA podem ser vistas nas Tabelas 13 (preparadas por separação de fase) e 14 (preparadas por secagem por pulverização). TABELA 13. PREPARAÇÕES DE SEPARAÇÃO DE FASE

[0209] A Tabela 15 apresenta que o efeito de secagem por pulverização em nanopartículas de zeína-PEG carregadas de ATRA utilizando diversas concentrações de ATRA. TABELA 15. INFLUÊNCIAS DE CONCENTRAÇÃO DE ATRA EM CARACTERÍSTICAS DE NANOPARTÍCULA

[0210] Conforme poderia ser esperado, tendências sugerem que conforme a concentração de ATRA aumenta, o tamanho e PDI aumentam, enquanto o potencial zeta diminui, sugerindo que para zeína-PEG, pelo menos, pode haver uma minimização previsível da agregação conforme a concentração de ATRA aumenta.

[0211] Carregamento de ATRA e eficiência de encapsulamento como uma função de zeína-caseína separada em fase e PEG zeína seca por pulverização é apresentado na Tabela 16 (análise realizada utilizando HPLC). TABELA 16. EFICIÊNCIA DE CARREGAMENTO E ENCAPSULAMENTO UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DE ATRA E ZC E ZEÍNA-PEG

[0212] Os resultados indicam que as nanopartículas de zeína-caseína carregadas de ATRA são estáveis em condições de armazenamento e que não houve alterações dignas de nota no tamanho de partícula ou conteúdo de ATRA por até 60 dias. Ainda, parece que as nanopartículas de ZC apresentam carregamento e eficiência de encapsulamento maiores que zeína-PEG. Dados de liberação in vitro para essas formulações são apresentados na FIGURA 4.

Exemplo 7. Combinações de nanopartículas de ZC e saquinavir (SQ).

[0213] A Tabela 17 apresenta as características de nanopartículas de zeína caseína carregadas de saquinavir (SQ) preparadas por separação de fase. TABELA 17. CARACTERÍSTICAS DE NANOPARTÍCULA CONTENDO SQ PREPARADA POR SEPARAÇÃO DE FASE

[0214] A Tabela 18 apresenta o conteúdo de SQ e a eficiência de encapsulamento de nanopartículas de ZC por HPLC. TABELA 18. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAMENTO E CARREGAMENTO DE SQ

[0215] Exemplo 8. Materiais e Métodos para Nanopartículas de zeína-lactoferrina.

[0216] Método de separação de fase

[0217] 0,2% (p/v) de lactoferrina bovina (Fonterra Cooperative Group, Auckland, New Zealand) foi dissolvida em 0,1 M de tampão de citrato solução. 15 mg de zeína branca de milho (Grau F6000) foi dissolvido em 2 ml de 90% de EtOH. A essa solução etanólica, saquinavir foi adicionado da solução-mãe em variação de concentração de cerca de 0,1 a 1 mg. A fase orgânica foi adicionada em gotas a 0,1 M de solução de tampão de citrato contendo lactoferrina sob sonicação de sonda. A sonicação de sonda foi ajustada a 38% de amplitude por 10 min (ciclo de 10 seg. em e 1 seg. fora) e sonicado por energia de 500 kJ. A dispersão de zeína- lactoferrina foi deixada sob agitador magnético (300 rpm) por 4 horas para evaporar o EtOH. Além disso, as nanopartículas foram separadas utilizando filtros centrífugos Millipore (30k MWCO) e lavadas diversas vezes com água deionizada utilizando uma pipeta. Opcionalmente, um crioprotetor foi adicionado (trehalose) e, então, a mistura foi colocada em -80°C, seguido por liofilização por 48 horas em vácuo de -105°C/100 mTorr. Por fim, a formulação foi armazenada em frascos fechados em um dissecador até uso adicional.

[0218] Nanopartículas de Zeína-lactoferrina (ZLF) ligadas de maneira cruzada de Genipina.

[0219] Nanopartículas ZLF foram ligadas de maneira cruzada ao adicionar genipina (0,5-10 mg/ml) como um agente de ligação cruzada à fase orgânica (EtOH), seguido pelas etapas conforme delineadas acima. Subsequentemente, as nanopartículas ligadas de maneira cruzada resultantes foram purificadas, lavadas e liofilizadas, conforme delineado acima.

[0220] Exemplo 9. Caracterização Físico-química de nanopartículas de ZLF

[0221] Caracterização do tamanho de partícula, distribuição e potencial zeta foram determinados por dispersão de luz laser dinâmica utilizando o Malvern Zetasizer-S 3600 (Malvern Instruments Inc. Southborough, MA). RESULTADOS

[0222] Exemplo 10. Análise Morfológica

[0223] Estudos de microscopia de força atômica

[0224] Aproximadamente 1 mg de nanopartículas em 1 mL de água destilada foi utilizado para análise de AFM. 100 μl da dispersão foi colocado em uma superfície mica recentemente clivada utilizando lamínula de vidro revestida de amina de polietileno e seco ao ar durante a noite. Imagens AFM foram coletadas na área de escaneamento de 1 μm.

[0225] Microscopia por Transmissão de Elétron (TEM):

[0226] Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de transmissão de elétron Tecnai Sprint G2 Twin (FEI Company), Department of Chemistry Churchill-Haines Laboratories, University of South Dakota, Vermillion. O instrumento foi operado em uma tensão de aceleração de 120 kV. Os modelos de nanopartícula foram preparados ao gotejar dispersões diluídas de nanopartículas de ZLF em redes de cobre de malha de 200 revestidas de carbono (Electron Microscopy Sciences) e foi permitido evaporar durante a noite. Todos os micrográficos de elétron foram registrados utilizando uma câmera SC200 CCD acoplada ao TEM. A análise de imagem foi realizada utilizando software DitialMicrograph. A imagem de TEM apresentam que as nanopartículas de ZLF são esféricas, aproximadamente de 100 nm em tamanho com características de invólucro de núcleo. A barra de escala é de 50 nm (não apresentada). TABELA 24. INFLUÊNCIA DE PH NO TAMANHO DE NANOPARTÍCULA DE ZLF E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO

[0227] Potencial zeta apresenta que o potencia zeta foi altamente positivo (+30 mV) de pH 2 a 4, moderadamente positivo (+20 mV) em pH 5 a 6. Nanopartículas de ZLF foram estáveis à agregação por toda a variação de pH examinada. Embora não seja vinculado à teoria, isso pode ser atribuível à repulsão estérica de invólucro que é típica de variação de tempo de espero devido aos grupos de carboidrato hidrofílicos afixados à cadeia de polipeptídios de lactoferrina e o peso molecular maior de LF comparado à β- caseína. TABELA 25. INFLUÊNCIA DE POTÊNCIA IÔNICA NO TAMANHO, DISTRIBUIÇÃO E POTENCIAL ZETA DA NANOPARTÍCULA DE ZLF

[0228] Da Tabela 25, não houve alteração no tamanho de partícula devido a alterações em potência iônica. Entretanto, reversão de carga foi observada indo de altamente positivo para livremente positivo com concentração de sal crescente. Embora não seja vinculado à teoria, esses dados sugerem que pode haver alguma ligação de íons de cloreto aniônico a grupos carregados positivamente no invólucro das nanopartículas de ZLF.

[0229] Formulações reconstruídas em fluidos gástricos simulados apresentadas e arranjo de caracteres de solução. Por exemplo, dispersões etanoicas de zeína apresentaram agregados leitosos, enquanto as nanopartículas de zeína-caseína (ZC) apresentaram uma leve turbidez, com um brilho azulado, e ZLF apresentou leve turbidez com um brilho avermelhado.

[0230] Exemplo 11. Conteúdo de droga e eficiência de encapsulamento.

[0231] Conteúdo de ATRA ou saquinavir e eficiência de encapsulamento foram medidos por método HPLC. Resumidamente, 4 mg de nanopartículas ZLF carregadas de droga foram dispersas em 1 ml de água DI e, então, centrifugadas a 1400 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi mantido para análise. Cuidadosamente, o pélete foi disperso em 50% de EtOH/CB e sonicado em sonda por 5 min., seguido por sonicação em banho para garantir uma solubilidade completa. Uma curva padrão foi gerada no mesmo dia para quantificação de ATRA ou saquinavir.

[0232] Para partículas de ZLF carregadas de Vermelho Nilo (Sigma, St. Louis, MO), a fluorescência do Vermelho Nilo foi medida em um espectrofotômetro (por exemplo, SpectromaxM2, Molecular Devices, Sunnydale, CA) em comprimento de onda de excitação e emissão de 559 e 629 nm.

[0233] Condições cromatográficas para ATRA foram como segue:

[0234] Coluna: C-18 coluna, 100Â, 5 um, 4,6 mm x 150 mm; Fase móvel: acetonitrila (1,13 ml/min)-1% p/v de tampão de acetato de amônia (0,12 ml/min); Comprimento de onda de detecção: 342 nm; Volume de injeção: 50 μl; Tempo de execução: 10 min.

[0235] Condições cromatográficas para saquinavir foram como segue:

[0236] Coluna: C-18 coluna, 3,5 μm, 4,6 mm x 75 mm; Fase móvel: acetonitrila (0,48 ml/min)-0,7% p/v de tampão de acetato de amônia (0,32/min); Comprimento de onda de detecção: 240 nm; Volume de injeção: 20 μl; Tempo de execução: 8 min. TABELA 26. CARACTERÍSTICAS PARA NANOPARTÍCULAS ZLF DE ENCAPSULAMENTO DE VERMELHO NILO, ATRA E SQ

ATRA: todos ácidos retinoicos trans.

[0237] Para comparação de encapsulamento e eficiência de carregamento com zeína-PEG, vide Figuras).

[0238] Exemplo 12. Calorimetria de Escaneamento Diferencial (DSC).

[0239] O estado físico de saquinavir na formulação foi determinado por DSC utilizando um DSC Q200 (TA Instruments, Inc., USA). Amostras pesadas precisamente (5 mg) foram seladas em tabuleiros de selagem de alumínio (T Zero Lid no T100819) e aquecidas em uma taxa de 10°C/min. de 23 a 300°C sob uma atmosfera de nitrogênio (vazão 20 ml/min). Uma célula de alumínio branca foi utilizada como uma referência. Os termogramas (não apresentados) foram processados utilizando software de Análise Universal da TA (TA Instruments, Inc., USA).

[0240] Exemplo 13. Estudos de liberação de droga in vitro.

[0241] A cinética de liberação de droga foi avaliada em fluidos gástrico e intestinal simulados ao medir uma concentração de droga deixada nas nanopartículas (método de tubo) com alteração concomitante das condições de meio de liberação. Resumidamente, 10 mg de nanopartículas de ZLF carregadas de droga foram suspensos em tubos Eppendorf de 2 ml contendo o meio de liberação com enzimas. O pH do meio de liberação foi ajustado utilizando um medidor de pH Accumet. Fluido gastrointestinal simulado em estado “alimentado” (FeSSGIF) e Fluido gastrointestinal simulado em estado “em jejum” (FaSSGIF) foram preparados de pó de fluido intestinal simulado (SIF) (Biorelevant, Croydon, Surrey, UK), que contém taurocolate de sódio e lecitina em uma proporção específica. Em diferentes pontos no tempo, duas amostras foram obtidas e centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi removido cuidadosamente utilizando uma pipeta de 1 ml e o pélete restante foi dissolvido em 50% de EtOH para análise de HPLC. A concentração de droga foi determinada utilizando HPLC, conforme descrito anteriormente.

[0242] Exemplo 14. Estudos de liberação de droga in vitro em alimentos e bebidas comuns

[0243] Para liberação de ATRA em fluidos GIT simulados e alimentos e bebidas comuns, ATRA foi quantificado utilizando 3H-ATRA. Amostragem concomitante foi realizada para simular o estado alimentado e em jejum. Resumidamente, 10 mg de nanopartículas ZLF carregadas de ATRA foram suspensos em tubos Eppendorf de 2 ml contendo meio de liberação, suco de maçã ou leite (3% de gordura). Os tubos foram colocados em um agitador a 37°C, em 600 rpm. Em diferentes pontos no tempo, amostras foram removidas e centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi removido cuidadosamente utilizando uma pipeta de 1 ml e o pélete restante foi dissolvido em 50% de EtOH. Conteúdo de ATRA foi analisado utilizando análise radioquímica (vide FIGURA 4).

[0244] Para liberação de saquinavir em alimentos e bebidas comuns, foi realizada análise por extração e quantificação utilizando análise HPLC, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as nanopartículas ZLF carregadas de saquinavir foram centrifugadas, e o pélete resultante foi congelado a -80°C e liofilizado. O material liofilizado foi, então, extraído com 50% de EtOH e sonicado em banho. O material resultante foi, então, extraído com 90% de EtOH e sonicado em banho. Após a sonicação, o material foi, então, centrifugado, e o sobrenadante resultante foi injetado em um HPLC (vide FIGURA 5).

[0245] Exemplo 15. Método de secagem por pulverização

[0246] Um processo de secagem por pulverização foi realizado ao dissolver tanto zeína quanto lactoferrina em solução etanólica binária (isto é, 55% de EtOH/tampão de citrato[CB]), de modo que o pH fosse 4 a 5 e a concentração total de proteínas foi entre 1 a 10% p/v. Após a dissolução, uma solução foi sonicada em banho e examinada visualmente antes da pulverização para garantir a solubilidade completa. Saquinavir foi adicionado da solução-mãe etanólica em uma concentração de 1% e misturado antes da secagem por pulverização. A secagem por pulverização foi realizada utilizando um Nano Spray Dryer (B-90, BÜCHI) em temperatura ambiente por 6-8 horas. Os parâmetros operacionais foram como segue.

[0247] Secagem por pulverização através de uma malha de pulverização de 4 μm, taxa de pulverização de 100%, a temperatura de entrada foi ajustada a 100 °C e vazão de nitrogênio de 150L/min.

[0248] As partículas secas foram coletadas do tambor de coleta utilizando um raspador adequado e armazenadas em um dissecador até o uso.

[0249] Subsequentemente, nanopartículas de ZLF podem ser ligadas de maneira cruzada utilizando genipina como um agente de ligação cruzada. Após a secagem por pulverização, as nanopartículas de ZLF foram ligadas de maneira cruzada por incubação da dispersão de nanopartícula em 10 mM de solução de tampão de citrato contendo genipina (1,0 mg/ml) por 3 a 4 horas em temperatura ambiente. As nanopartículas resultantes foram purificadas utilizando filtros de centrífuga Millipore (30k MWCO) e lavadas com água DI. Opcionalmente, crioprotetor (por exemplo, trehalose) foi adicionado. Após isso, as nanopartículas foram colocadas a - 80 °C seguido por liofilização por 48 horas em vácuo de -105 °C/100 mTorr. Por fim, as partículas liofilizadas foram armazenadas em um dissecador até o uso. TABELA 27. CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DE NANOPARTÍCULAS DE ZLF SECAS POR PULVERIZAÇÃO

[0250] Exemplo 16. Avaliação in vitro de nanopartículas de zeína-lactoferrina em comparação a nanopartículas a base de zeína desenvolvidas anteriormente.

[0251] Cultura celular de Caco-2

[0252] Células Caco-2 (ATCC, Manassas, VA) foram gentilmente providas por Dr. Gunaje Jayarama (Department of Pharmaceutical Sciences, South Dakota State University, Brookings, SD) na passagem no 4. As células foram cultivadas em 1 x 106 células em membranas de filtro de poliéster TRANSWELL® (tamanho de poro de 0,4 μm, área de crescimento 4,67 cm2) em placas estéreis com 6 poços (TRANSWELL®, Corning Costar Corp., Cambridge, MA). As células foram cultivadas em meio DMEM (4,5 g/L de glicose) suplementado com 20% de FBS, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de L-glutamina, estreptomicina (100 μg/ml) e penicilina (100 IU/ml). As culturas foram mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar, e 95% de umidade relativa a 37 °C (incubadora de CO2, Galaxy 170S). O meio de crescimento foi alterado a cada dia nas primeiras duas semanas seguidas por três vezes por semana até o tempo de uso. Ao atingir confluência, as células foram tripsinizadas e os números de passagem 25-35 foram utilizados nos experimentos. As células foram permitidas a diferenciarem-se na membrana de filtro TRANSWELL® durante 3 semanas em meio de crescimento completo.

[0253] A permeabilidade de saquinavir e nanopartículas de ZLF carregadas de saquinavir foi estudada por monocamadas de célula Caco-2 em uma direção absortiva apical a basolateral (AP-BL) ou direção secretória basolateral a apical (BL-AP). Antes dos experimentos de monocamada, as monocamadas celulares foram enxaguadas duas vezes com HBSS, pH 7,4, e equilibradas sob condições experimentais por 20 min. Então, fluido apical foi substituído por 1,5 ml de solução experimental. Resistência Elétrica Transepitelial (TEER) foi medida utilizando um medidor EVOM (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) para garantir a confluência de monocamada e integridade. TEER foi calculada como segue:

[0254] Em que R(Q) é a resistência medida e A é a área de superfície (cm2). Céiuias foram utiiizadas para experimentação com um valor de TEER maior ou igual a 1000Q • cm2. No momento zero, amostras (0,5 mi) da câmara apicai foram retiradas para determinar a concentração inicial de saquinavir. Monocamadas foram incubadas a 37°C sob atmosfera controladas (5% de CO2, 95% de umidade relativa). Durante 3 horas, amostras (1 ml) foram retiradas do compartimento basolateral e imediatamente substituídas por solução de tampão fresca. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados são expressos como coeficiente de permeabilidade aparente (Papp), calculado de acordo com:

[0255] Papp (cm/s) = (dQ/dt) X (1/A.C0)

[0256] Em que dQ/dt é o fluxo de saquinavir pela monocamada de Caco-2, C0 é a concentração inicial de saquinavir na câmara apical, e A é a área de superfície do filtro TREANSWELL® (4,71 cm2).

[0257] Conteúdo de saquinavir após a extração foi analisado nas amostras utilizando HPLC, conforme aqui mencionado. (Vide FIGURA 6)

[0258] Transporte bidirecional e proporção de efluxo.

[0259] A proporção de permeabilidade eficaz para saquinavir ou proporção de efluxo foi calculado como segue: EfR = (Papp B-A/Papp A-B)

[0260] Em que (Papp B-A) é o coeficiente de permeabilidade aparente para saquinavir na direção de basolateral para apical, e (Papp A-B) é o coeficiente de permeabilidade aparente para saquinavir na direção apical para basolateral. (vide FIGURA). Os resultados podem ser vistos na Tabela 28. TABELA 28. PROPORÇÕES DE TRANSPORTE E EFLUXO PARA SQ.

[0261] Permeabilidade transepitelial de nanopartículas carregadas de Vermelho Nilo por Caco-2.

[0262] A permeabilidade de nanopartículas de ZLF carregadas de NR e NR foi estudada pelas monocamadas celulares de Caco-2, conforme descrito anteriormente. Para quantificar o conteúdo de NR, a fluorescência foi medida em um espectrofotômetro (SpectromaxM2, Molecular Devices, Sunnydale CA) em comprimentos de onda de extinção e emissão de 559 e 629 nm, respectivamente. (Vide FIGURA 7)

[0263] Exemplo 17. Efeito de nanopartículas em TEER.

[0264] TEER foi medido para cada uma das inserções de TRANSWELL®. A ponta do eletrodo foi equilibrada com tampão HBSS durante a noite em condição estéril antes da medição. Após tratamento de nanopartícula, TEER foi medido em três posições diferentes em temperatura ambiente. O TEER final (ohm) para cada inserção foi a média de três leituras durante um experimento de 6 horas. (Vide FIGURA 8).

[0265] Exemplo 18. Absorção celular de nanopartículas carregadas de Vermelho Nilo (NR)

[0266] A absorção celular foi realizada utilizando sonda fluorescente NR (ex. 559 e em. 629 nm), encapsulada em nanopartículas a base de zeína. Células Caco-2 foram cultivadas em uma placa de 6 poços em uma concentração de 2 x 105 células/poço e foram permitidas aderir durante a noite. No dia seguinte, o meio de cultura foi descartado e as células foram equilibradas pelo menos por 30 min. com HBSS antes do estudo de absorção. As células foram, então, tratadas com as nanopartículas em uma concentração de 2 mg/ml para diferentes pontos no tempo (por exemplo, 30 min., 1 hora e 2 horas) a 37°C. No fim da incubação, as células foram lavadas com HBSS três vezes, destacadas dos poços por tripsinização, foi com HBSS frio e fixadas com 2% de formaldeído. As células foram mantidas a 4°C e analisadas utilizando citometria de fluxo (FACS, BD Biosciences, San Jose, CA), o valor de fluorescência médio para cada amostra foi obtido pode compilação da fluorescência de 20.000 eventos. (vide FIGURA 9)

[0267] Exemplo 19. Ensaio de inibição de competição (Análise de citometria de fluxo)

[0268] Para verificar que a absorção é mediada por meio de um receptor de lactoferrina, um experimento competitivo foi realizado na presença de lactoferrina bovina. As células foram tratadas com 2mg/ml de lactoferrina por 60 min. antes da incubação com nanopartículas de ZLF e NR (vide FIGURA 10).

[0269] Exemplo 20. Inibição de P-gp (Ensaio de Calceína)

[0270] Células Caco-2 foram cultivadas em placas de 96 poços pretas durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com 50 μl de nanopartículas brancas diluídas em tampão de HBSS por 15, 30 e 60 min. As células foram lavadas três vezes e 50 μl de 0,25 μM de calceína AM (Sondas Moleculares) foi adicionado a cada poço. A fluorescência da calceína foi medida utilizando um leitor de microplaca com 485/589 excitação/emissão em temperatura ambiente. Para determinar a inibição de P-gp, a % de fluorescência relativa foi calculada = (fluorescência após tratamento -fluorescência de base)/fluorescência de base x 100. (Vide FIGURA 11).

[0271] A visualização de distribuição de ZO-1 por microscopia de escaneamento de laser cofocal (CLSM) ou CLSM, as células foram tratadas com nanopartículas em uma concentração de 2 mg/ml por 30 min. As nanopartículas foram removidas por lavagem das células três vezes com PBS. As células foram fixadas com 0,25 ml de 4% de paraformaldeído por 20 min. em temperatura ambiente. As células foram, então, permeabilizadas utilizando 0,25 Triton-X 100 em solução de bloqueamento, feita de 1% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) por uma hora. As células foram, então, lavadas e incubadas com (1:1000) anticorpo ZO-1 (InVitrogen, Camarillo, CA) durante a noite a 4°C. O anticorpo ZO-1 se liga a junções apertadas (ou oclusões de zonula). Após a remoção dos anticorpos ZO-1, as células foram tratadas com 1% de BSA e, então, incubadas com 100 μl de flúor alexa de cabra, 488 IgG anticamundongo por 1 hora em temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS e secas com DAPI durante a noite a 4°C. Os dados (imagens não apresentadas) demonstram que as nanopartículas de ZLF carregadas de NR foram capazes de atravessar as membranas celulares.

[0272] Perfil de liberação in vitro apresenta liberação sustentada sem liberação de dose muito alta particular às nanopartículas de ZC. Estudos in vitro em células Caco-2 demonstraram a capacidade de nanopartículas de ZLF para aumentar a solubilidade e permeabilidade de saquinavir. Embora não seja vinculado à teoria, essa absorção celular eficiente é provavelmente devido à utilização de vias de endocitose mediadas por receptor. A baixa proporção de efluxo para todas nanopartículas comparada a saquinavir livre indica o escape de efluxo mediado por P-gp.

[0273] Tendo em vista esses dados, nanopartículas de invólucro de núcleo a base de proteína representam uma abordagem atrativa para proteger cargas úteis do ambiente externo do GIT. O invólucro ao redor provê uma camada de difusão adicional que pode servir como uma barreira extra e que pode prolongar o tempo de liberação em relação a uma única proteína. Assim, as nanopartículas com características de invólucro de núcleo podem ser pré- administradas com alimentos sem uma perda significativa da droga encapsulada, que é uma via comum para a administração de droga pediátrica. Nanopartículas de zeína mantêm-se promissoras em termos de acessibilidade em países em desenvolvimento e potenciais em melhorar a aderência do paciente assim como a biodisponibilidade oral em uma dosagem sólida mais estável, segura, escalável e re-dispersível. O próximo objetivo é avaliar a farmacocinética in vivo dessas nanopartículas após administração oral.

[0274] Exemplo 21. Estudo Animal

[0275] Nanopartículas a base de proteína carregadas de saquinavir (SQ) foram preparadas pelo método de separação de fase, conforme descrito aqui. A farmacocinética oral de SQ foi avaliada em ratos Sprague Dawley (6-8 semanas de idade) pesando 250 g. Ratos com veias jugulares com cateter para amostragem de sangue foram comprados de Charles River (Wilmington, MA). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na South Dakota State University. Os ratos foram divididos em 5 grupos com 4 animais em cada grupo, conforme apresentado na Tabela 29. TABELA 29. GRUPOS DE ANIMAIS E DESCRIÇÕES

ZC, nanopartículas de zeína-caseína; ZLF, nanopartículas de zeína-lactoferrina; PZ, nanopartículas de polietileno glicol-zeína; SQ, saquinavir.

[0276] Os ratos foram mantidos em um ciclo de luz/escuridão de 12 h a 24±2 °C e providos de uma dieta de roedores padrão. Antes de iniciar os experimentos, os ratos estavam em jejum por 12 horas mas tinham acesso livre a água. A formulação de SQ foi administrada por gavagem oral utilizando um tubo estomacal. Amostras de sangue (200 μl) foram retiradas da cânula de cateter na veia jugular em diferentes pontos no tempo (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, e 48 h) em tubos de coleta de sangue heparinizados (1 ml). A patência do cateter foi mantida ao lavá-lo com solução fisiológica estéril após cada amostragem. As amostras foram centrifugadas por 15 min. a 12.000 rpm, então, o plasma foi coletado e armazenado a -80 °C até analisado por HPLC.

[0277] Preparação de amostra e Cromatografia.

[0278] Alíquotas (50 μl) do plasma de amostra foram transferidas e um tubo de centrífuga de 1,5 ml e 100 μl de tampão de borato (pH 10) foi adicionado. Subsequentemente, 200 μl de uma mistura de etil acetato-hexano (50:50) foi adicionada para extrair a droga. A extração foi repetida duas vezes e as fases orgânicas foram coletadas e evaporadas para secagem sob um fluxo suave de gás nitrogênio. O resíduo obtido foi reconstituído com 50% de EtOH e sujeitas a vórtice por 10 min. A análise de SQ foi feita em uma coluna C-18 de simetria (Waters Corporation, Milford, USA), 5 um, 250 x 4,6 mm i.d., a 25 °C. A fase móvel foi uma mistura de 10 mM de tampão de acetato de amônia-acetonitrila (35:65 v/v) bombeada em uma vazão de 1,0 ml/min. A detecção foi realizada em um comprimento de onda de 240 nm e tempo de retenção de 3,6 min. Um limite de qualificação de 10 ng/ml foi obtido sob o método analítico, conforme descrito.

[0279] Análise não compartimental de concentrações plasmáticas de SQ foi realizada utilizando software Solutions PK 2.0 (Summit Research Services, Montrose, CO). A seguinte tabela (Tabela 30) apresenta parâmetros farmacocinéticos para AQ mediante administração oral única de diferentes formulações a base de proteína em ratos utilizando uma abordagem não compartimental. TABELA 30. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS PARA ANÁLISE DE SQ IN VIVO.

[0280] ZC, nanopartículas de zeína-caseína; ZLF, nanopartículas de zeína-lactoferrina; PZ, polietileno glicol- nanopartículas de zeína; CMC, carboximetil celulose; Cmax, A concentração máxima observada; Tmax, o tempo na concentração máxima observada; t1/2, o tempo para a concentração a ser reduzida pela metade na fase de eliminação; AUC , a área total sob a curva calculada utilizando pontos de dados observados combinados com um valor extrapolado; Ke, constante de taxa de eliminação; MRT, tempo de resistência médio de momento de primeira ordem; Fabs, biodisponibilidade absoluta; Frel, biodisponibilidade relativa.

[0281] O perfil de concentração de plasma para SQ em ratos após administração oral pode ser visto na FIGURA 12. A biodisponibilidade de SQ foi aprimorada de nanopartículas a base de zeína. Conforme pode ser visto do perfil, a droga é liberada lentamente e a concentração de plasma foi mantida até cerca de 48 horas no fluxo sanguíneo.

[0282] Embora as realizações específicas tenham sido descritas acima com referência às realizações e exemplos revelados, essas realizações são somente ilustrativas e não limitam o escopo da invenção. Alterações e modificações podem ser feitas de acordo com o técnico no assunto em questão sem desviar da invenção em seus aspectos mais amplos, conforme definidos nas seguintes reivindicações.

[0283] Todas as publicações, patentes e documentos de patente são incorporados por referência aqui, como se fossem incorporados individualmente por referência. A invenção foi descrita com referência a diversas realizações e técnicas específicas e preferidas. Entretanto, deve ser entendido que muitas variações e modificações podem ser feitas, enquanto se permanece no espírito e escopo da invenção.

Claims (8)

1. NANOPARTÍCULA, caracterizada por compreender duas ou mais proteínas e uma molécula de carga, em que uma primeira proteína é uma prolamina e a segunda proteína é lactoferrina, e em que a dita nanopartícula apresenta uma estrutura de invólucro de núcleo, em que a molécula de carga é um retinoide selecionado do grupo de consiste em: retinol, ácido 13-trans- retinoico (tretinoína) ou todos ácidos trans retinoicos (ATRA), ácido 13-cis- retinóico (isotretinoína), ácido 9-cis- retinoico (alitretinoína), retinaldeído, etretinato, acitretina, α-caroteno, β-caroteno, Y—caroteno, β — criptoxantina, luteína, zeaxantina e combinações destes ou saquinavir.

2. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela proteína prolamina compreender zeína branca, zeína amarela, gliadina, hordeína ou kafirina.

3. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela nanopartícula ser formada por secagem por pulverização ou separação de fase.

4. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita carga ser adsorvida à superfície da nanopartícula.

5. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela nanopartícula ser reticulada, e em que um agente de reticulação é genipina.

6. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela proteína prolamina da nanopartícula ser de PEGuilatado, em que o PEG tem um peso molecular entre 3 kDa e 20 kDa.

7. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela nanopartícula estar na forma de um pó seco, fluidizante, incolor ou branco, não higroscópico.

8. NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ainda compreender um diluente, um excipiente ou carreador para formar uma composição farmaceuticamente aceitável, em que a dita composição é uma formulação oral contida em um alimento ou uma bebida.

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