CN114641317B - 一种高生物利用度的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料及其制备方法和用途 - Google Patents

一种高生物利用度的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种高生物利用度的7,8‑二羟基黄酮复合纳米生物材料及其制备方法和用途。具体地，所述材料以玉米醇溶蛋白和乳铁蛋白为包材，以7,8‑二羟基黄酮为芯材。所述材料具有高生物利用度、高脑靶向性、优异稳定性、良好贮藏稳定性、便于长期储存等优点。还公开了所述材料的制备和应用。

Description

一种高生物利用度的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料及其 制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物、天然产物等领域。更具体地涉及高生物利用度的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料及其制备方法和用途。
背景技术
7,8-二羟基黄酮(7,8-DHF)是自然界存在的一种出现频率和丰度都很低的黄酮苷元，最早发现于西方人用作沙拉的一种蔬菜中，迄今报道仅在美国中南部植物Godmaniaaesculifolia、长柄菊(Tridax procumbens)、报春花(Primula)及湖北海棠(Malushupehensis)中被检出。大量的研究表明，7,8-DHF能透过血脑屏障，有效模拟脑源性神经营养因子(BDNF)，专一性地激活TrkB受体，从而诱导TrkB发生二聚化及自磷酸化，并进一步激活其下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt和PC3K三条神经信号通路。目前，7,8-DHF已被广泛应用于各类BDNF/TrkB信号相关疾病及其肥胖、糖尿病等代谢综合征的防治，并取得了一系列令人振奋的研究成果。
然而，动物试验证实，它易在体内被糖醛酸化、硫酸化和甲酯化，实测天然来源或化学合成的7,8-DHF(称为原药)在试验动物(代码为C57BL/6的阿尔氏海默症模式小鼠)中的口服生物利用度仅为4.8％。美国Emory大学医学院的叶克强教授是7,8-DHF防治大脑退行性疾病研究领域的领军科学家，目前该团队采用化学结构修饰得到了两个有潜力的新药：(1)原药A环7,8-位上的两个OH被保护后的仿真药物R13(称为前药)的口服生物利用度接近18％(相比原药提高了3.75倍)，目前已获得美国FDA的临床试验批件。(2)进一步在原药B环上结构改造后的纯化学药物(CF3-CN)的口服生物利用度又提高了136％。
7,8-DHF、R13和CF3-CN的化学结构示意如下：
上述均为通过化学结构改造提升7,8-DHF生物利用度的研究，目前尚未见有采用物理改性提升7,8-DHF生物利用度的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高生物利用度、高脑靶向性、优异消化道稳定性、良好贮藏稳定性、便于长期储存等优点的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料及其制备方法和用途。
本发明的第一方面，提供了一种复合纳米生物材料，包含如下组分：
1)药物载体，所述药物载体包含玉米醇溶蛋白和乳铁蛋白；和
2)药物，所述药物为7,8-二羟基黄酮；
所述药物载体包封所述药物。
在另一优选例中，所述药物载体具有核壳结构，玉米醇溶蛋白为核，乳铁蛋白为壳。
在另一优选例中，所述玉米醇溶蛋白的分子量为25-45Kda，较佳地25-35Kda，更佳地25-29Kda，优选25Kda。
在另一优选例中，所述乳铁蛋白为来源于人乳、牛乳或羊乳中的铁结合蛋白。
在另一优选例中，所述乳铁蛋白的分子量为60-200Kda，较佳地65-150Kda，更佳地70-120Kda，最佳地75-100Kda，优选80Kda。
在另一优选例中，所述乳铁蛋白是糖基化的乳铁蛋白。
在另一优选例中，所述糖基化的乳铁蛋白为葡聚糖糖基化的乳铁蛋白。
在另一优选例中，所述葡聚糖的分子量为5-100Kda，较佳地10-80Kda，更佳地20-60Kda，最佳地30-50Kda，优选为40Kda。
在另一优选例中，所述葡聚糖糖基化的乳铁蛋白是通过美拉德反应，如在温度40-80℃(较佳地50-70℃)、相对湿度60-90％(较佳地70-85％)、反应时间20-60h(较佳地30-55h)的条件下得到的接枝产物。
在另一优选例中，所述药物还包含选自下组的生物黄酮：竹叶碳苷黄酮、橙皮素、柚皮素、EGCG、黄芩素、漆黄素、山奈酚、鹰嘴豆芽素A、槲皮素、杨梅素、染料木素或其组合。
在另一优选例中，所述竹叶碳苷黄酮选自下组：荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、或其组合。
在另一优选例中，所述药物为7,8-二羟基黄酮与70％纯度的竹叶碳苷黄酮。
在另一优选例中，所述药物载体包封所述药物，且包封率＞60％(较佳地＞70％，较佳地＞80％，较佳地＞90％，较佳地＞92％，更佳地＞95％)。
在另一优选例中，所述药物载体中，所述玉米醇溶蛋白和所述乳铁蛋白的质量比为0.8-1.5(较佳地0.9-1.2，更佳地0.95-1.1)。
在另一优选例中，以所述复合纳米生物材料的冻干总重计，所述药物的质量含量为3-10wt％(较佳地4-8wt％，更佳地5-7wt％)。
在另一优选例中，所述的复合纳米生物材料中，7,8-二羟基黄酮与玉米醇溶蛋白的质量比为1：5-15，较佳地为1：8-12。
在另一优选例中，所述的复合纳米生物材料中，7,8-二羟基黄酮、竹叶碳苷黄酮与玉米醇溶蛋白的质量比为1：1：5-15，较佳地为1：1：8-12。
在另一优选例中，具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述复合纳米生物材料的平均粒径为50-150nm(较佳地为60-140nm，更佳地为70-130nm，最佳地为80-120nm)；
2)所述复合纳米生物材料的分散系数为0.2-0.5(较佳地为0.25-0.4)；
3)所述复合纳米生物材料为非晶态。
本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的复合纳米生物材料的制备方法，包括步骤：
1)提供第一混合液和第二混合液；
所述第一混合液包含第一溶剂、药物和玉米醇溶蛋白；
所述第二混合液包含第二溶剂和乳铁蛋白；
2)将所述第一混合液加入所述第二混合液中，搅拌得到第三混合液；
3)旋转蒸发所述第三混合液，得到所述的复合纳米生物材料。
在另一优选例中，所述第一溶剂选自下组：乙醇、水、或其组合。
在另一优选例中，所述第一溶剂为乙醇-水溶液，优选地乙醇浓度为70-95％，较佳地为75-90％，更佳地为80-85％。
在另一优选例中，所述第一混合液中，所述药物和所述玉米醇溶蛋白的质量比为1：4-15，较佳地为1：5-12，更佳地为1：7-11，优选1：10。
在另一优选例中，所述第二溶剂为水。
在另一优选例中，步骤2)中，所述第一混合液和所述第二混合液的体积比为1：2-5，较佳地为1：2.5-4。
在另一优选例中，所述第三混合液中，所述玉米醇溶蛋白和所述乳铁蛋白的质量比为0.3-20，较佳地为0.5-15，更佳地为0.8-10，最佳地为0.9-2。
本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的复合纳米生物材料的用途，用于选自下组的用途：
1)用于制备预防和/或治疗选自下组的疾病的药物制剂：阿尔茨海默症、帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、Rett综合症、抑郁症、肥胖症、糖尿病、骨质疏松症、更年期综合征；
2)用于制备预防和/或治疗BDNF/TrkB信号相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述产品的形态选自下组：片剂、颗粒剂、胶囊剂、冻干粉针剂、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为不同zein和LF质量比条件下zein/LF二元纳米递质的平均粒径和分散系数；A为原始pH，B为调节pH＝6。
图2为糖基化LF化学性质表征：A为LF和LF-葡聚糖接枝物的SDS-PAGE图，条带0：LF、条带1：LF10K、条带2：LF40K和条带3：LF70K；B为LF-葡聚糖接枝物的接枝效率和褐变程度；C为LF和LF-葡聚糖接枝物的zeta电位电动势；D为圆二色谱图；E为傅里叶红外光谱图。
图3为不同纳米粒子的TEM图像；A为DHF-zein纳米粒子，B为DHF-zein/LF纳米粒子，C为DHF-zein/LF10K纳米粒子，D为DHF-zein/LF40K纳米粒子，E为DHF-zein/LF70K纳米粒子，50000×放大倍数。
图4为不同纳米粒子的FE-SEM图像；A为zein纳米粒子，B为DHF-zein纳米粒子，C为DHF-zein/LF纳米粒子，D为DHF-zein/LF10K纳米粒子，E为DHF-zein/LF40K纳米粒子，F为DHF-zein/LF70K纳米粒子，50000×放大倍数。
图5为7,8-DHF和不同纳米粒子的热行为。
图6为不同试样的X-射线衍射图。
图7为空载和负载纳米粒子的傅里叶红外光谱图；A为空载，B为负载。
图8为纳米载体的理化稳定性；A为不同pH条件对不同纳米体系平均粒径的影响，B为不同离子强度和pH值对zein平均粒径的影响，C为为不同离子强度和pH值对zein/LF平均粒径的影响，D为不同离子强度和pH值对zein/LF10K平均粒径的影响，E为不同离子强度和pH值对zein/LF40K平均粒径的影响，F为不同离子强度和pH值对zein/LF70K平均粒径的影响，G为贮藏时间对对不同纳米粒子平均粒径的影响，H为热处理对对不同纳米粒子平均粒径的影响。
图9为体外消化模拟对负载纳米粒子平均粒径和体外生物可及度的影响；A为平均粒径，B为体外生物可及度。
图10为不同纳米粒子的体外消化前与后的FE-SEM图；15000×放大倍数。
图11为口服游离7,8-DHF和负载7,8-DHF复合纳米粒子后的7,8-DHF浓度与时间曲线。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地制备了一种7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料，所述材料以7,8-二羟基黄酮单独或与其他生物黄酮组成的复合物为芯材，以玉米醇溶蛋白(Zein)和(糖基化)乳铁蛋白(LF)为包材。具体地，通过所述包材对所述芯材的包覆负载使得所得材料具有如下优点：具有高生物利用度、高脑靶向性、优异消化道稳定性、良好贮藏稳定性、便于长期储存等。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
本发明中，“芯材”是指7,8-DHF单独或与其他生物黄酮的组合物。优选地，所述芯材为7,8-DHF与70％精度的竹叶碳苷黄酮按1:1质量比组成的复合物。
本发明中，术语“包材”是指采用玉米醇溶蛋白(Zein)和乳铁蛋白(LF)两种食用蛋白，优选地，是由Zein与糖基化的LF共同组成。其中，糖基化LF是LF分别与不同分子量的葡聚糖(如10、40和70kDa)通过美拉德反应(如在温度60℃、相对湿度79％、反应48h的条件下)后得到的接枝产物(记为LF10K、LF40K和LF70K)，更为优选地，是指LF与40kDa葡聚糖的接枝物(记为LF40K)。
本发明中，术语“纳米递质”是指以Zein和LF组成的复合纳米载体，优选以Zein与糖基化LF组成的复合纳米载体。更为优选地，是Zein与LF40K共同构建的复合纳米递质。
本发明中，术语“复合纳米粒子”是指以Zein与LF或糖基化LF组成的纳米递质，包裹7,8-DHF或与其他植物黄酮组成的复合物后制备而成的复合生物纳米材料。优选地，是指以Zein和糖基化LF(LF10K、LF40K和LF70K)组成的纳米载体，以7,8-DHF为芯材制成复合纳米粒子。更为优选地，是指以Zein与LF40K组成的载包裹7,8-DHF与竹叶碳苷黄酮组合物为芯材制备而成的复合生物纳米材料。
本发明中，术语“体外抗消化性能”是指载有7,8-DHF的不同复合纳米粒子经过体外模拟的胃肠道消化后，其平均粒径和粒子结构呈现出的不同变化程度。
本发明中，术语“生物可及度”是指在体外模拟消化过程中，经过胃液和肠液依次消化后的混合胶束中的7,8-DHF含量水平与未经消化的初始试样中7,8-DHF含量的比值。
本发明中，术语“口服生物利用度”指的是“相对生物利用度”，即为载有7,8-DHF的不同复合纳米制剂之间及其与原物质(7,8-DHF)之间相互比较吸收程度与吸收速度后而得出的生物利用度值。
本发明中，术语“药物靶向性”是指试验动物口服不同的7,8-DHF复合纳米生物材料后，在主要靶器官(即脑组织)中实际检测到的7,8-DHF含量水平相较口服非纳米化原物质的提升程度。
复合纳米生物材料
7,8-二羟基黄酮(7,8-DHF)是天然存在的黄酮类化合物家族成员之一。大量的研究表明，它能够穿过血脑屏障，有效模拟脑源性神经营养因子(BDNF)，专一性地结合TrkB受体，从而诱导TrkB发生二聚化及自磷酸化，并进一步激活受体下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt以及PCγ1三条信号通路。目前，7,8-DHF被应用于各类BDNF/TrkB信号相关疾病(如阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症、Rett综合症、抑郁症及肥胖等)中的防治研究，并取得一系列令人振奋的成果。发明人近期的细胞、动物和人体试验研究均表明，7,8-DHF在妇女更年期(又称围绝经期)综合征及其骨质疏松症的防治中表现出十分突出的效果。
以天然来源的化合物为先导，通过结构修饰和改造，实现更高的口服生物利用度、更好的药物靶向性、更加卓越的药效，同时具有更小的毒副作用，是天然产物研发领域的常规路径和终极目标。7,8-DHF的终端产品以药物(或天然药物)的形态出现，创造性地集成生物纳米材料的制备技术(即采用物理的方法和手段，而非化学性改造)以提高7,8-DHF的口服生物利用度，进而防治老龄化社会日益高发的神经退行性疾病和其他代谢性疾病，都是人类慢病干预首选的最佳路径。
采用合适的纳米递质有效包封7,8-DHF，相较于化学法的结构修饰而言，具有工艺简单、过程环保、材料天然、产品安全性高等特点。迄今，除了发明人的研究工作外，国内外尚未见有关7,8-DHF复合生物纳米材料的研究报道。其技术关键在于：(1)在复合纳米粒子制备时，首选载体材料的安全性和可食性，并采用绿色、环保的制备工艺和方法。(2)确保7,8-DHF复合纳米粒子能耐受广阔的pH、离子强度和温度范围，具有优良的贮藏稳定性和商品性。(3)保证7,8-DHF复合纳米粒子口服后在消化道中的结构稳定性，使其更多地到达小肠吸收部位，进而提高其口服生物利用度。(4)如何使得7,8-DHF复合纳米粒子达到靶器官(如大脑)后，能高效透过血脑屏障、并在脑组织中有效释放目标物。(5)从中药配伍优化的理论出发，如何充分考量7,8-DHF与其他天然产物(如其他来源的生物黄酮)的协同增效作用，并以口服后在试验动物脑匀浆中能够检测到的7,8-DHF实际浓度作为唯一的刚性评价指标。
这些都是本发明需要解决的技术难题，并已达到预期效果。
本发明提供的一种高生物利用度的7,8-DHF复合纳米生物材料是指：以玉米醇溶蛋白和(糖基化)乳铁蛋白为包材，以7,8-DHF或与其他生物黄酮组成的复合物(即前者为君药、后者为臣药)为芯材，采用反溶剂沉淀法制备而成的复合纳米粒子。
该纳米材料具有远高于游离态7,8-DHF的生物利用度和脑靶向性。它在广泛的pH范围(pH 3～9)、不同的离子强度(0～500mmol/L NaCl)和高温(95
℃)下均具有优良的稳定性，同时有着良好的贮藏稳定性。该纳米粒子的平均粒径在50～150nm之间，目标物(即芯材)的包封率在90％以上,冻干后可长期储存，并具有良好的复水性。
体外模拟消化试验结果显示，经过胃液和肠液消化后，该纳米材料仍能保持完整的结构到达小肠吸收部位。体内生物利用度试验结果显示，与游离态的7,8-DHF相比口服生物利用度增加了3～8倍，在脑组织中的有效浓度也显著增加，表现出良好的血脑屏障靶向性，这一点与纳米粒子表面存在的乳铁蛋白密切相关。此外，将7,8-DHF与竹叶碳苷黄酮(如荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷)、槲皮素、山奈酚等生物黄酮复配，有利于提高肠粘膜细胞的吸收，显著提高其口服生物利用度。
本发明采用的乳铁蛋白是来源于人乳、牛乳或羊乳中的分子量约为80Kda的铁结合蛋白，具有一定的胃蛋白酶和胰蛋白酶抵抗性，并且在人的肠上皮细胞和血脑屏障中均有相应的受体。将乳铁蛋白与不同分子量(10、40和70kDa)的葡聚糖按质量比1:1复配，通过美拉德反应制备得到的糖基化乳铁蛋白具有更加强大的功能和更加稳定的结构。
该纳米材料的制备方法大致为：将玉米醇溶蛋白溶于高浓度的乙醇溶液中(如80％的乙醇水溶液)，按一定的体积比加入乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白，玉米醇溶蛋白与乳铁蛋白/糖基化乳铁蛋白的质量比大致为1:1。以其为载体、采用反溶剂沉淀法包封目标物(7,8-DHF和/或其它生物黄酮)，制备得到本发明的7,8-DHF复合纳米材料(7,8-DHF在纳米冻干粉中的质量占比大约为5～7
％)。
本发明的纳米材料大幅度提高了7,8-DHF的生物利用度和脑靶向性，其生物学功效更为强大，可广泛应用于新药领域，起到防治阿尔茨海默症、帕金森综合症、抑郁症、肥胖症、骨质疏松症和更年期综合征等慢性疾病。制剂可以以片剂、颗粒剂、胶囊剂、冻干粉针剂等多种形态出现。
更具体地，本发明提供了一种高生物利用度的7,8-DHF复合纳米生物材料，它是以玉米醇溶蛋白(Zein)和(糖基化)乳铁蛋白(LF)为载体，以7,8-DHF或与其他植物黄酮的复合物(前者为君药、后者为臣药)为芯材，采用反溶剂沉淀法制备而成的复合纳米粒子，具有远高于原物质(7,8-DHF)的口服生物利用度和脑靶向性，同时具有高度的pH、离子强度、高温、贮藏稳定性及其抗消化性，平均粒径在60～150nm范围内，载体对目标物(即芯材)的包封率在90％以上，纳米混悬液冷冻干燥后可长期储存，冻干粉具有良好的复水性。
所述的复合纳米粒子是指以Zein和LF为包材、以7,8-DHF为芯材构建而成的复合纳米生物材料。优选地，是指以Zein和糖基化LF组成的二元递质包裹7,8-DHF制备而成的复合纳米生物材料。其中，糖基化LF是LF与不同分子量的葡聚糖(如10、40和70kDa)通过美拉德反应(如在温度60℃、相对湿度79％、反应48h的条件下)得到的接枝产物，记作LF10K、LF40K和LF70K。。
更为优选地，所述的复合纳米粒子是指以Zein和LF40K组成的复合纳米递质(即包材)，负载以7,8-DHF或与竹叶黄酮的组合物(即芯材)后制备而成的复合纳米生物材料。
更为优选地，所述的芯材是由7,8-DHF与70％精度的竹叶黄酮制剂(BLF70)组合而成，BLF70中四个碳苷黄酮(荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷)合计占制剂总质量的65～75％(w/w)。
本发明还同时提供了上述复合纳米生物材料的制备方法：将芯材和Zein以不同的质量比分别溶解于80％的乙醇-水溶液中作为溶剂相，将LF或糖基化LF溶解于蒸馏水中作为反溶剂相，将溶剂相以1:3的体积比(v/v)快速加入反溶剂相中，搅拌30min，混合溶剂体系中的Zein与LF或糖基化LF的质量比控制在20:1～1:3之间；随后，用旋转蒸发仪在减压条件(40℃、-0.1Mpa)下除去多余的乙醇溶液，最后得到平均直径在60～150nm、芯材包封率为66～99.5％的复合纳米粒子的混悬液；将此混悬液在-80℃下预冻24h后真空冷冻干燥(-50℃、-0.1Mpa)36h，得到7,8-DHF复合纳米生物材料的冻干粉。
所述关键芯材与壁材的质量比中，7,8-DHF：Zein在1:5～1:15之间。
优选的，7,8-DHF与Zein的质量比为1:10(w/w)。
更为优选地，7,8-DHF:BLF70:Zein的质量比为1:1:10(w/w)。
所述的反溶剂体系即为LF或糖基化LF的水溶液。
优选的，所述反溶剂体系为糖基化LF的水溶液。
所述Zein与LF或糖基化LF的质量比分别可为20:1、10:1、5:1、3:1,、2:1、1:1、1:2、1:3(w/w)。
优选的，所述Zein与LF的质量比为1:1(w/w)。
更优选地，所述Zein与糖基化LF的质量比为1:1(w/w)。
本发明中复合递质对芯材的包封率：当7,8-DHF与Zein的质量比在1:5～
1:15之间，且Zein与LF或糖基化LF的质量比为1:1时，可实现66～99.5％的包封率。
优化的，所述复合递质对芯材的包封率为：7,8-DHF和Zein的质量比为1:10，且Zein与LF或糖基化LF的质量比为1:1时，可实现98～99.5％的包封率。
当使用复合芯材时，即当7,8-DHF:BLF70:Zein的质量比为1:1:10时，且Zein与糖基化LF的质量比为1:1时，纳米递质对二种芯材(即7,8-DHF与BLF70的组合物)的包封率分别为96.21％(以7,8-DHF计)和92.13％(以BLF70计)。
本发明的复合纳米生物材料的优化制备方法如下：将芯材(7,8-DHF或与其他植物黄酮的组合物)和Zein以1:10的质量比溶于80％的乙醇-水溶液中作为溶剂相，将LF或糖基化LF溶解于蒸馏水中作为反溶剂相，将溶剂相以1:3的体积比快速加入反溶剂相中搅拌30min(搅拌强度800rmp/min)，混合溶剂体系中Zein与LF(或糖基化LF)的质量比为1:1。随后，用旋转蒸发仪在减压(40℃、-0.1Mpa)条件下除去多余的乙醇溶液，得到平均粒径约为70～100nm、芯材包封率达70～99.5％的7,8-DHF复合生物纳米粒子的混悬液。将此混悬液在-80℃条件下预冻24h后进行真空冷冻干燥(-50℃、-0.1Mpa、36h)，即可得到7,8-DHF纳米粒子的冻干粉。
更为优选的制备方法为：将7,8-DHF:BLF70:Zein以1:1:10的质量比共同溶于80％的乙醇-水溶液中作为溶剂相，将糖基化的LF溶于蒸馏水中作为反溶剂相，将溶剂相以1:3的体积比快速加入反溶剂相中，搅拌30min(搅拌强度800rmp/min)，随后用旋转蒸发仪在减压(40℃、-0.1Mpa)条件下除去多余乙醇，得到平均粒径在70～100nm之间、7,8-DHF和BLF包封率分别为96.21％和92.13％的复合生物纳米粒子的混悬液，将其在-80℃下预冻24h后进行真空冷冻干燥(-50℃，-0.1Mpa、36h)，即可得到7,8-DHF与竹叶黄酮复合的纳米粒子冻干粉。
本发明还同时提供了负载7,8-DHF(及其竹叶黄酮)后复合纳米生物材料的结构表征，符合以下所有或任一条件：
①复合纳米材料的微观和表面形态：复合纳米材料外观成球形，平均粒径在60～150nm范围内；并且,由于LF或糖基化LF的存在，LF的吸附显著改变了普通Zein纳米粒子的表面结构。如附图3和图4所示。
②复合纳米材料的热特性：糖基化LF与Zein组成的复合递质显著提高了纳米材料的热稳定性；同时，随着结枝时所用的葡聚糖碳链的增长(即分子量加大)，复合纳米递质的热稳定性也随之增加(熔融温度从68.57℃分别增加到75.74、80.89和85.60℃)。如附图5所示。
③复合纳米材料的晶体衍射特性：被上述纳米递质包封后的7,8-DHF分子从原先的结晶态转变为非结晶态(7,8-DHF在2θ值5°～90°范围内高度结晶形态的特征衍射峰消失)。如附图6所示。
④复合纳米材料的红外特性:7,8-DHF通过氢键、疏水力和静电相互作用被包封于复合递质中，同时LF或糖基化LF与Zein以氢键和疏水相互作用形成了递质表面的特殊结构(类似于Zein为核、LF或糖基化LF为壳的核-壳结构)。如附图7所示。
本发明还同时提供了复合纳米递质及其负载目标物后的纳米粒子的理化稳定性及体外模拟的抗消化性：
理化稳定性：Zein与LF的复合纳米递质可在pH 3～9的范围内保持稳定，在中性和碱性条件下能耐受广阔范围的离子强度(0～500mmol/L NaCl)，具有良好的贮藏稳定性(纳米混悬液可稳定保持30d)和热稳定性(95℃下加热60min)。
优选的，所述的纳米递质的理化稳定性为Zein与糖基化LF(LF10K、LF40K和LF70K)共同构建的复合递质可在pH 3～9的范围内保持稳定，在pH 3～9条件下能耐受广阔范围的离子强度(0～500mmol/L NaCl)，具有良好的贮藏稳定性(纳米混悬液可稳定保持30d)和热稳定性(95℃下加热60min)。
更优选的，所述的纳米递质的理化稳定性为Zein与LF40K共同构建的复合纳米递质可在pH 3～9的范围内保持稳定，在pH 3～9条件下能耐受广阔范围的离子强度(0～500mmol/L NaCl)，具有良好的贮藏稳定性(纳米混悬液可稳定保持30d)和热稳定性(95℃下加热60min)。
负载7,8-DHF后的复合纳米粒子的体外模拟的抗消化性为负载7,8-DHF的Zein/LF复合纳米粒子经历胃肠道消化后，其平均粒径增大出现沉淀，载体结构变化明显。体外生物可及度相比较于游离7,8-DHF增加了3.52倍。
优选的，所述负载7,8-DHF后的复合纳米粒子的体外模拟的抗消化性为负载7,8-DHF的Zein/糖基化LF(LF10K、LF40K和LF70K)复合纳米粒子经历胃肠道消化后，其平均粒径稳定无沉淀，载体结构变化不明显。体外生物可及度相比较于游离7,8-DHF增加了4.46～4.65倍。
更优选的，所述负载7,8-DHF后的复合纳米粒子的体外模拟的抗消化性为负载7,8-DHF的Zein/糖基化LF(LF40K)复合纳米粒子经历胃肠道消化后，其平均粒径稳定无沉淀，载体结构仍为球形。体外生物可及度相比较于游离7,8-DHF增加了4.65倍。
本发明还同时提供了小鼠口服7,8-DHF复合纳米生物材料的生物利用度改善数据以及在主要靶器官(脑匀浆)中7,8-DHF水平的大幅度提升。
相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF复合纳米粒子中的同等质量的7,8-DHF(即DHF-Zein/LF)的相对口服生物利用度最高增加了5.28倍。
优选的，相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF40K复合纳米粒子中的同等质量的7,8-DHF(即DHF-Zein/LF40K)的相对口服生物利用度最高增加了8.46倍。
更优选的，相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF40K复合纳米粒子中的同等质量7,8-DHF与BLF70的复合物(即DHF-BLF70-Zein/LF40K)的相对口服生物利用度最高，增加了10.12倍。
实验动物脑匀浆(主要靶器官)中7,8-DHF含量水平的测定采用液质联用法：小鼠口服剂量为25mg/kg.bw，不同试样均折算成相同的7,8-DHF绝对质量。色谱条件：ShimadzuNexerra UPLC系统，分析柱AcquityHSS T3 1.8μm 2.1×50mm；流动相流速：0.7mL/min，流动相A为0.1％甲酸铵溶液，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸，v/v)。质谱条件：AB Sciex Qtrap6500，离子源ESI(+)和(-)，扫描模式为MRM。
所述，当试验小鼠口服复合纳米粒子DHF-Zein/LF(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为45.1ng/g，2h时为25.5ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了1.75倍，2h时增加了1.86倍。
优选的，所述当试验小鼠口服复合纳米粒子DHF-Zein/LF40K(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为70.1ng/g，2h时为42.5ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了2.73倍，2h时增加了3.10倍。
更优选的，所述当试验小鼠口服复合纳米粒子DHF-BLF70-Zein/LF40K(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为93.2ng/g，2h时为36.8ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了3.63倍，2h时增加了2.67倍。
更具体地，本申请提供如下：
一种以玉米醇溶蛋白(Zein)和(糖基化)乳铁蛋白(LF)为载体，以7,8-DHF或与其他植物黄酮的复合物(前者为君药、后者为臣药)为芯材，采用反溶剂沉淀法制备而成的复合纳米生物粒子及其制备方法和用途。
该复合纳米生物粒子平均粒径在60～150nm，载体对目标物(即芯材)的包封率在90％以上，纳米混悬液冷冻干燥后可长期储存，冻干粉具有良好的复水性具有远高于原物质(7,8-DHF)的口服生物利用度和脑靶向性，同时具有良好的贮藏稳定性和抗消化性能。
该7,8-DHF复合纳米生物材料其特征是：所述的复合纳米生物材料是以Zein和LF组成的复合纳米载体，以7,8-DHF为芯材，制备而成的复合纳米粒子。优选以Zein和糖基化LF组成的二元递质包裹7,8-DHF制备而成的复合纳米生物材料。其中，糖基化LF是LF与不同分子量的葡聚糖(如10、40和70kDa)通过美拉德反应(如在温度60℃、相对湿度79％、反应48h的条件下)得到的接枝产物，记作LF10K、LF40K和LF70K。
该7,8-DHF复合纳米生物材料其特征是：所述的复合纳米生物材料是以Zein和LF40K组成的复合纳米递质(即包材)，负载以7,8-DHF或与竹叶黄酮的组合物(即芯材)后制备而成的复合纳米生物材料。其芯材为7,8-DHF与竹叶黄酮的组合物,优选70％精度的竹叶碳苷黄酮制剂(BLF70)组合而成，即BLF70中四个碳苷黄酮(荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷)合计占制剂总质量的65～75％(w/w)(其中各成分所占比例为荭草苷：异荭草苷：牡荆苷：异牡荆苷＝1:2.4:1.4:1)。
制备7,8-DHF复合纳米生物材料的反溶剂沉淀法：是将芯材和Zein以不同的质量比分别溶解于80％的乙醇-水溶液中作为溶剂相，将LF或糖基化LF溶解于蒸馏水中作为反溶剂相，将溶剂相以1:3的体积比(v/v)快速加入反溶剂相中，搅拌30min，混合溶剂体系中的Zein与LF或糖基化LF的质量比控制在20:1～1:3之间；随后，用旋转蒸发仪在减压条件(40℃、-0.1Mpa)下除去多余的乙醇溶液，最后得到平均直径在60～150nm、芯材包封率为66～99.5％的复合纳米粒子的混悬液；将此混悬液在-80℃下预冻24h后真空冷冻干燥(-50℃、-0.1Mpa)36h，得到7,8-DHF复合纳米生物材料的冻干粉。
7,8-DHF复合纳米生物材料的制备方法，其特征是：所述关键芯材与壁材的质量比中，7,8-DHF：Zein在1:5～1:15之间。特别地，优选7,8-DHF与Zein的质量比为1:10(w/w)，zein与LF或糖基化LF的质量比为1:1(w/w)，7,8-DHF:BLF70:Zein的质量比为1:1:10(w/w)。
7,8-DHF复合纳米材料的结构表征，符合以下所有或任一条件：
微观和表面形态；
热特性；
晶体衍射特性；
红外特性。
该复合纳米生物材料具有良好的稳定性和储存性。Zein与糖基化LF共同构建的复合递质可在pH 3～9的范围内保持稳定，在pH 3～9条件下能耐受广阔范围的离子强度(0～500mmol/L NaCl)，具有良好的贮藏稳定性(纳米混悬液可稳定保持30d)和热稳定性(95℃下加热60min)。
该复合纳米生物材料具有良好的抗消化性能。负载7,8-DHF的Zein/LF复合纳米粒子经历胃肠道消化后，其平均粒径增大出现沉淀，载体结构变化明显，体外生物可及度相比较于游离7,8-DHF增加了3.52倍；负载7,8-DHF后的复合纳米粒子的体外模拟的抗消化性为负载7,8-DHF的Zein/糖基化LF(LF40K)复合纳米粒子经历胃肠道消化后，其平均粒径稳定无沉淀，载体结构仍为球形。体外生物可及度相比较于游离7,8-DHF增加了4.65倍。
该复合纳米生物材料显著提高了7,8-DHF复合纳米生物材料的生物利用度改善数据以及主要靶器官(脑匀浆)中7,8-DHF水平的大幅度提升：
(1)相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF复合纳米粒子中的同等质量的7,8-DHF(即DHF-Zein/LF)的相对口服生物利用度最高增加了5.28倍；
(2)相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF40K复合纳米粒子中的同等质量的7,8-DHF(即DHF-Zein/LF40K)的相对口服生物利用度最高增加了8.46倍；
(3)相比于7,8-DHF原物质，包封于Zein/LF40K复合纳米粒子中的同等质量的7,8-DHF与BLF70复合物(即DHF-BLF70-Zein/LF40K)的相对口服生物利用度最高增加了10.12倍。
该复合纳米生物材料显著提高了7,8-DHF在主要靶器官(脑匀浆)中的有效浓度水平：
(1)当实验小鼠口服复合纳米粒子DHF-Zein/LF(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为45.1ng/g，2h时为25.5ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了1.75倍，2h时增加了1.86倍
(2)当实验小鼠口服复合纳米粒子DHF-Zein/LF40K(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为70.1ng/g，2h时为42.5ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了2.73倍，2h时增加了3.10倍
(3)当试验小鼠口服复合纳米粒子DHF-BLF70-Zein/LF40K(折算成7,8-DHF的绝对质量为25mg/kg.bw)后，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量为93.2ng/g，2h时为36.8ng/g；与口服7,8-DHF原物质(溶解5％羧甲基纤维素钠水溶液中)的对照组相比，0.5h时测得小鼠脑匀浆中7,8-DHF的实际含量提高了3.63倍，2h时增加了2.67倍。
本发明提供的高生物利用度的7,8-DHF复合纳米生物材料与原物质(7,8-DHF)相比，生物学功效更为强大，适用于7,8-DHF原物质可能应用的绝大多数用途，如口服的药物、以及日用化学品或个人护理用品等，起到防治阿尔茨海默症、帕金森综合症、抑郁症、肥胖症、骨质疏松症和更年期综合征、改善睡眠和皮肤等多种作用。终端产品可以是胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、凝胶等多种形态。
本发明公开了一种高生物利用度的7,8-DHF复合纳米生物材料，它是以玉米醇溶蛋白(Zein)和/或糖基化乳铁蛋白(LF)为载体，以7,8-DHF或与竹叶黄酮组成的复合物为芯材，采用反溶剂沉淀法制备而成的复合纳米粒子，包封率在90％以上，平均粒径在100nm左右，具有高度的理化稳定性和抗消化性能，冻干粉可长期稳定储存，并具有良好的复水性。与7,8-DHF原物质相比，该复合纳米材料的体外生物可及度提供了3～5倍。动物试验表明，与7,8-DHF原物质相比，口服本发明的复合纳米生物材料，7,8-DHF的相对生物利用度提高了5～10倍，在主要靶器官(脑组织)中的有效浓度提高了1.75～3.63倍。本发明的复合合纳米生物材料，除7,8-DHF既可以天然产物也可以是化学合成外，其他原辅材料均来自食物或新食品原料；制备过程除乙醇(食用酒精)外，无任何其他有机溶剂或化学催化剂，工艺绿色、环保。本发明的7,8-DHF复合纳米生物材料适用于7,8-DHF原物质可能应用的绝大多数用途，如口服的药物、以及日用化学品或个人护理用品等，起到防治阿尔茨海默症、帕金森综合症、抑郁症、肥胖症、骨质疏松症和更年期综合征、改善睡眠和皮肤等多种作用。终端产品可以是胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、凝胶等多种形态。
与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：
1)原辅材料均可食用、体内可降解、安全性高，同时制备方法便捷、绿色；对7,8-DHF而言，包封于Zein-LF的复合纳米递质中是一种物理过程(吸附与包埋)，并未发生实质性的化学结构变化。
2)该复合纳米生物材料(DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF40K和DHF-BLF70-Zein/LF40K)的平均粒径范围在60～150nm之间，目标物(即芯材)的包封率在90％以上。冻干后可长期储存，并具有良好的复水性。在宽泛的pH值(3～9)和离子强度(0～500mmol/L NaCl)范围内以及高温(95℃)下和30d贮藏过程中具有良好的体系稳定性，不易沉淀。
3)经过胃液和肠液消化后，该复合纳米粒子(DHF-Zein/LF40K)仍能保持完整的结构到达试验动物的小肠吸收部位。
4)本发明的复合纳米生物材料大幅度提高了7,8-DHF的生物利用度和脑靶向性，是由于本发明的特定的复合纳米材料构建方式所带来的。主要优势表现在，①吸收度增加：由于纳米粒子分散系数高具有较大的表面积，使其与吸收部位的生物膜接触面积大增，提高了生物利用度；②透膜性增加：纳米粒子进入细胞主要通过内吞方式，有利于药物吸收度的提高和胞内作用的发挥；③靶向性增加：纳米载体中的LF和糖基化LF具有高度的靶向性，可识别肠道和血脑屏障细胞膜上的LF受体，通过LF受体介导、靶向性地与脑部位结合；④缓释性增加：纳米载药系统的释放效率可可调节7,8-DHF的释放，增强其体内保留时间。
5)本发明的复合纳米生物材料生物学功效较7,8-DHF更为强大，可广泛应用于新药领域，起到防治阿尔茨海默症、帕金森综合症、抑郁症、肥胖症、骨质疏松症和更年期综合征等慢性疾病。可以以片剂、颗粒剂、胶囊剂、冻干粉针剂等多种形态出现。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
试验材料与仪器
试验材料
试验仪器
实施例1负载7,8-DHF的zein/LF和zein/糖基化LF二元纳米粒子的构建1.1Zein/LF二元纳米递质的构建
采用反溶剂沉淀法制备Zein一元和二元(Zein/LF)纳米递质。准确称量zein粉末置于80％的乙醇-水中，水浴超声5min，制备储存溶液(1％，w/v)。随后将储存溶液以1:3体积比快速加入蒸馏水(即反溶剂)中，于室温下连续搅拌(800rpm)30min。利用旋转蒸发仪在40℃、减压(-0.1Mpa)条件下除去多余的乙醇溶液。最后，得到zein一元递质，zein在体系中的终浓度为2.5mg/mL。同时配置不同zein/LF质量比(20:1、10:1、5:1、3:1,、2:1、1:1、1:2、1:3)的复合醇溶液，以LF的水溶液作为反溶剂，制备zein/LF二元递质。并将均匀分散的各纳米体系的pH调至6.0，测定其平均粒径和分散系数(PDI)。
利用纳米粒度分析仪在25℃下测定zein一元和zein/LF二元递质的平均粒径和PDI，测量角度90°，水的折射率为1.45。
不同zein和LF质量比条件下Zein/LF二元纳米递质的平均粒径和分散系数见图1。如图1A所示，Zein一元递质的平均粒径为169.56nm，随着LF与Zein质量比的逐渐增加，二元递质的平均粒径先减后增。当Zein与LF质量比为1:1时，平均粒径最小(74.63nm)。同时随着LF质量占比的增加，PDI值也表现出先升后降的态势，当Zein：LF的质量比为5:1时，PDI值最高。当质量比在2:1～1:3范围内，PDI值均处于一个较低的数值(＜0.200)，表明形成了稳定、尺寸均一的纳米胶体体系。
如图1B所示，将一元体系的pH值调节到Zein的等电点附近(pH约为6)，Zein一元胶体体系极不稳定，纳米粒子的平均粒径超过1000nm，并出现沉淀现象，推测是由于Zein之间疏水相互作用和静电斥力减弱所致。当加入LF后，体系PDI均处于较低水平，尤其是在1:1～1:3质量比范围内，Zein/LF二元纳米粒子的PDI值低于0.200，表明有足够多的LF吸附在Zein粒子表面，增加了粒子之间的空间位阻和静电斥力。同时当Zein与LF质量比为1:1时，平均粒径最小。综上所述，确定Zein与LF质量比为1:1为最佳配比。
1.2美拉德反应制备糖基化LF及其化学性质表征
将分子量为10、40和70kDa的葡聚糖(1.00％w/v)和LF(1.00％w/v)分别溶解在0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)中，搅拌过夜。完全溶解后的样品按1:1的葡聚糖：LF质量比(w/w)混合。将混合物冻干后在60℃、相对湿度79％密封玻璃干燥器中孵育48h(干燥器中放入饱和KBr溶液)，48h后得到的美拉德产物再行冻干以去除多余水分，即得到LF-葡聚糖的接枝产物(即糖基化LF)，分别记做LF10K、LF40K和LF70K。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：采用5％浓缩胶和8％分离胶。取5μL样品溶液(2mg/mL)与20μL蛋白上样缓冲液混合，置于沸水中加热5min，并快速冷却。取10μL混合样品加到凝胶电泳每个凹槽中，电压为80～120mV。电泳完毕后，用0.25％((w/v)的考马斯亮蓝R-250溶液染色，并用脱色液(10％乙酸、50％甲醇和40％蒸馏水，v/v)脱色过夜。
接枝效率：用邻苯二醛(OPA)法测定样品的接枝效率。OPA工作液配置如下：40mg的OPA(溶于1mL甲醇)、2.5mL 20％ SDS溶液、25mL 0.1mol/L四硼酸钠缓冲液和100μLβ-巯基乙醇溶液混合均匀，用蒸馏水定容到50mL。将4.0mL OPA工作液与200μL乳铁蛋白-葡聚糖共轭物(2mg/mL)混合，室温下反应3min后测定340nm处的吸光度。氨基含量标准曲线以不同浓度的L-亮氨酸(0.25～2.5mmol/L)建立。接枝效率通过以下公式(4-5)计算：
褐变程度：为了评估美拉德反应引起的褐变程度，将接枝物溶于蒸馏水(1.0mg/mL)中，在420nm处用紫外-可见分光光度计测量LF-葡聚糖接枝物的吸光度。
Zeta电动电位势：用动态光散射仪(DLS)在25℃下测试Zeta电动电位势。为了避免分析前的多重散射现象，测定前用蒸馏水将非接枝物和接枝物分别稀释至2.0mg/mL浓度。
圆二色谱：在室温、持续通氮气的条件下扫描，扫描速度为50nm/min，带宽1.0nm，路径长度为0.1cm。将LF-葡聚糖接枝物溶解在蒸馏水中，测定二级结构时的试样浓度为0.2mg/mL，在190～260nm波长范围内进行扫描。并对获得的数据进行分析。
红外光谱：将1％ LF-葡聚糖接枝产物与KBr混合后置于玛瑙研钵中充分研磨均匀，利用FTIR对样品进行扫描，扫描范围为500～4000cm-1，分辨率为4cm-1。使用OMNIC软件8.0版进行分析。
如图2A所示，使用SDS-PAGE测定LF和糖基化LF的分子量。LF对应的主要区带约在80kDa处(条带0)。相比较于LF，三个LF-葡聚糖接枝物在80kDa的条带减少，颜色变淡，而在高分子量处的区带颜色变深，导致高的迁移率产生，说明两者通过美拉德反应生成了高分子量的糖化蛋白(条带1～3)。同时发现分子量为10和40kDa的葡聚糖与LF共价结合后在高分子量区域的条带颜色要深于70kDa糖化产物，表明随着葡聚糖分子量的增加，还原性羰基末端的数量减少，从而导致美拉德反应的减弱。
当表征形成蛋白质-多糖接枝物时，评估氨基含量是分析多糖结合程度很重要的指标。美拉德反应发生时，蛋白质的游离氨基和与还原糖的羰基通过共价连接形成席夫碱。采用OPA方法测定游离氨基的数量。如图2B所示，LF与分子量为10、40和70kDa葡聚糖的接枝效率分别为24.96、16.54和11.39％，表明葡聚糖的分子量大小对LF接枝效率有明显影响。
美拉德反应产物的颜色深浅能够直观地反映美拉德反应的程度，通常用420nm波长处的吸光度值大小作为褐变产物多少的指标。如图3B所示，10、40和70kDa的葡聚糖与LF共价结合后，A420分别为0.081、0.041和0.030。此外，LF-葡聚糖接枝产物的zeta电位电动势要明显低于LF与葡聚糖的混合物(p<0.05)(图3C)，这是由于LF上带正电的-NH2基参与了席夫碱的形成，从而导致zeta电位电动势降低。
CD能够反映蛋白质的二级结构信息。研究了糖基化对LF二级结构的影响，结果如图4.12D所示。LF的远紫外区域的CD扫描在208nm和215nm处显示了负的最小值，在190-195nm处显示最大值，是典型的含α-螺旋和β-折叠结构较多的蛋白质光谱。图3D中的插表显示糖基化修饰后，LF的α-螺旋和β-折叠减少，无序结构增加，表明糖基化LF的二级结构发生了一定变化。
FTIR光谱数据显示，四种LF试样在3300～3600cm-1和950～1150cm-1附近差异明显(图3E)，3300～3600cm-1的吸收峰被认为是N-H拉伸振动和O-H拉伸振动。天然LF的吸收峰主要在3291cm-1处(酰胺A带，代表N-H拉伸结合氢键)。与LF相比，糖基化的LF在3351cm-1处的吸收峰出现明显蓝移，LF10K、LF40K和LF70K分别增加了54、66和72cm-1，说明LF的-NH2基团参与了美拉德反应。950～1150cm-1处的吸收峰反映了C-O拉伸和O-H变形振动，原LF在1060cm-1处的吸收峰，在LF10K、LF40K和LF70K中分别红移了42、44和43cm-1，说明葡聚糖的还原羰基参与了美拉德反应。此外，LF在1500～1700cm-1波段出现了两个典型峰，分别为1651cm-1(酰胺I带)、1538cm-1(酰胺II带)。酰胺I带主要与C＝O伸缩振动有关，而酰胺II带主要与C-N的伸缩振动有关。美拉德反应后，C＝O和C-N伸缩振动强度发生了变化。综上所述，葡聚糖的接枝反应改变了LF的二级结构和一级结构。
1.3负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF二元纳米粒子构建
具体操作参考1.1，不同之处在于将7,8-DHF与Zein按10:1和5:1的质量比(w/w)充分溶解到80％的乙醇-水溶液中，分别以蒸馏水、LF和糖基化LF水溶液作为反溶剂，分别制备负载7,8-DHF的一元(DHF-Zein)和二元(DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K)纳米粒子。
包封率(EE)测定：通过高速离心(4℃、10000×g、10min)去除纳米悬浮液中游离的7,8-DHF。取上清液(含负载7,8-DHF的纳米粒子)，用甲醇破乳稀释5倍，并用甲醇将等量的初始纳米悬浮液稀释5倍。7,8-DHF由UPLC法测定方法。EE和LC计算公式(4-1和4-2)如下:
表1、DHF-Zein/糖基化LF二元纳米体系的理化特性
注：各行不同的字母，表示存在显著性关系(p<0.05)。
表1总结了不同纳米递送体系负载的7,8-DHF的EE、平均粒径和PDI值。当Zein与7,8-DHF质量比为5:1时，DHF-Zein、DHF-Zein/LF DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K纳米粒子的EE分别为37.27、66.10、72.41、84.75和83.61％。LF、LF10K、LF40K和LF70K与Zein复合使用包封率提高了约1.7、1.9、2.3和2.2倍。当Zein与7,8-DHF质量比为10:1时，DHF-Zein、DHF-Zein/LF DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K纳米粒子的EE分别为46.38、98.31、98.66、99.41、99.21％。表明LF和糖基化LF稳定了Zein纳米粒子，通过非共价相互作用(氢键和疏水力)形成稳定的二元递质体系从而增强了包封7,8-DHF的效果，尤其是LF40K与Zein复合为载体的包封效果最佳。此外，Zein一元体系的平均粒径为169.56nm，而Zein/糖基化LF二元体系的平均粒径下降至78.63～87.24nm。与Zein/LF粒子相比，Zein/LF10K、Zein/LF40K和Zein/LF70K的平均粒径略微增大，与LF上结合的糖链有关。PDI也表现出与平均粒径相似的变化趋势。
此外，负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF二元纳米粒子显示良好的水复溶性，复溶的EE有所下降，但仍高于90％，同时平均粒径为103.6-110.3nm范围内，PDI在0.265-0.295范围内，展现粒径低，分散均匀的稳定体系。其中以DHF-Zein/LF40K纳米粒子的效果最好。
实施例2负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF二元纳米粒子的结构表征2.1材料与方法
2.1.1微观和表面形态
利用透射电镜(TEM)观察样品的微观结构和形貌。将新鲜制备的纳米悬浮液滴在Formvar-carbon载样铜网上，风干5min。然后，用2％乙酸双氧铀染色样品，用滤纸除去多余的染色剂。电镜加速电压为120kV。采用场发射扫描电镜(FE-SEM)捕获冻干纳米粒子的表面形貌。分析之前，利用溅射涂布机于真空条件下在样品表面涂上3-6nm厚的金层。电镜加速电压为10.0kV。
2.1.2热特性分析
利用示差扫描量热仪对冻干试样进行热特性分析。准确称取6-10mg样品放入铝坩埚中，密封。用相同条件的空坩埚作参比。采用N2氛围以10℃/min的升温速度从20℃升温至300℃进行扫描量热分析。
2.1.3晶体衍射特性分析
X-射线衍射(XRD)分别进行粉末状7,8-DHF、干燥空载或负载纳米粒子(冻干粉)的XRD分析。仪器的铜阳极产生铜Kα辐射，加速电压为40kV，管电流为40mA。Soller狭缝设置为2.5°，散度狭缝设置为0.5°。2θ角范围为5°～70°，步长0.02°，步长时间0.2s。
2.14红外特性分析
傅里叶红外光谱(FTIR)分析：将1％冻干样品与KBr混合，置于玛瑙研钵中充分研磨均匀，利用傅里叶红外光谱分析仪(FTIR)对样品进行扫描。光谱扫描范围为500-4000cm-1，分辨率为4cm-1，使用OMNIC软件8.0版进行分析。
2.2试验结果
2.2.1纳米粒子的微观和表面形态
TEM展示了胶体递质的形状、大小、均匀性和完整性。从图3可以看出，在DHF-Zein(负载7,8-DHF的Zein纳米粒子)纳米粒子的平均粒径在100nm以上3。此外，DHF-Zein纳米粒子之间呈相互连接状态，这可能是由于Zein胶体体系被稀释10倍后，Zein粒子之间的疏水相互作用导致了聚集。然而，在添加糖基化LF后，DHF-Zein/糖基化LF纳米粒子均呈现70～100nm范围内的球形形态(图3的C、D和E)，并且分散均匀，表明糖基化乳铁蛋白的吸附可增加静电排斥和空间排斥效应。从而可以防止DHF-Zein纳米粒子的聚集。此外，与DHF-Zein/LF纳米粒子相比，DHF-Zein/糖基化LF纳米粒子的平均粒径相对较大(图3B)。
为进一步观察不同复合纳米粒子的表面形态，利用FE-SEM进行表征。如图4所示，Zein和DHF-Zein纳米粒子均呈典型的球形，且大小均匀。然而，糖基化LF后，DHF-Zein/糖基化LF纳米粒子相比Zein和DHF-Zein纳米粒子发生了巨大的变化，表面粗糙且不规则(图3的D、E和F)。表明糖基化LF通过非共价力吸附到了DHF-Zein纳米粒子表面。这一结果与天然LF吸附到DHF-Zein纳米粒子表面的结果一致。并且相比较于Zein一元体系，负载后二元体系的平均粒径均有所下降。
2.2.2热特性分析
如图5所示，包封7,8-DHF后，DHF-Zein、DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K、DHF-Zein/LF70K纳米粒子中均未出现7,8-DHF的吸热峰，说明7,8-DHF从结晶态转变为非晶态。此外，添加LF和糖基化LF后，DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K的吸热峰值分别为72.61、75.74、80.89℃和85.60℃，说明它们提高了纳米粒子的热稳定性，尤其是LF40K和LF70K。
2.2.3晶体衍射特性分析
利用X-射线衍射在2θ值5°-90°范围内测定各试样的晶体衍射模式。如图6所示，LF10K、LF40K和LF70K也出现了与LF类似的峰型，表明这些接枝蛋白质均以非结晶形态存在。然而，在负载7,8-DHF的复合纳米粒子(DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K)中，并没有观察到7,8-DHF结晶形态的特征衍射峰，表明其被有效包封后呈现为非晶态，这一现象与热特性分析结果吻合。与DHF-Zein相比，在19.6°衍射角度，DHF-Zein/LF70K纳米粒子的峰值显著增加，而DHF-Zein/LF10K和DHF-Zein/LF40K纳米粒子的特征峰几乎消失。这一结果证实了Zein、LF和糖基化LF之间存在着氢键、疏水相互作用等非共价力。
2.2.4红外特性分析
如图7展示了4000-500cm-1波数范围内不同样品的吸收峰。Zein的O-H基团拉伸特征峰为3306cm-1(图7A)，当Zein与糖基化LF结合形成Zein/LF10K、Zein/LF40K和Zein/LF70K纳米粒子后，其氢键特征峰分别从3306cm-1转移至3406、3404和3417cm-1，表明Zein和糖基化LF的结合有氢键的参与，同时对比Zein/LF纳米粒子，其氢键结合能力更为强烈。此外，2953cm-1处被认为是Zein疏水性的C-H基团的拉伸振动峰。形成Zein/LF10K、Zein/LF40K和Zein/LF70K纳米粒子后，其特征峰从2953cm-1年红移至2932、2930和2931cm-1，表明更强的疏水相互作用参与了Zein/糖基化LF二元纳米粒子的形成。此外，Zein波段在1652cm-1(酰胺I带)和1538cm-1(酰胺II带)出现另外两个特征峰。随着糖基化LF的加入，与Zein相比，酰胺I和酰胺II的特征峰没有变化，说明静电相互作用不参与Zein/糖基化LF二元纳米粒子的形成。这一结果与上一部分Zein与LF的结合方式相同。如图7B所示，DHF-Zein、DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K、DHF-Zein/LF70K纳米粒子中7,8-DHF的典型特征峰全部消失，说明7,8-DHF被成功包封于纳米粒子中。相比较于未负载的纳米粒子，负载后的纳米粒子几个主要特征峰的波数均发生了变化，说明7,8-DHF的存在也会在一定程度上改变复合载体间的非共价结合能力。
实施例3纳米递质的理化稳定性和负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF复合纳米粒子的胃肠道稳定性
3.1材料与方法
3.1.1纳米载体的理化稳定性
pH值的影响：用2mmol/L NaOH或2mmol/L HCl分别调节Zein一元、Zein/LF和Zein/糖基化LF二元纳米体系的pH值分别至3-9，静止2h后进行平均粒径、浊度和分散系数测定。
离子强度的影响：室温下，分别添加不同浓度的NaCl溶液(0、10、25、50、100、200和500mmol/L)处理24h，评价不同离子强度和不同pH条件下纳米粒子的稳定性。
贮存时间的影响：将新鲜制备的纳米悬浮液调节pH至3.0-9.0，在25℃下见光保存30d。
贮藏温度的影响：新鲜制备的纳米悬浮液置于95℃加热60min，室温冷却。研究不同贮藏温度对试样稳定性的影响，利用DLS测定贮藏过程中平均粒径的变化，并以未加热的样品作为对照。
3.1.2负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF二元纳米粒子的胃肠道稳定性和体外生物可及度
分别将10mL的7,8-DHF溶液、DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF10K、DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K纳米悬浮液混合于10mL的模拟胃液(SGF，配方组成为：2mg/mL NaCl和3.2mg/mL胃蛋白酶，pH＝2.5)中，置于水浴摇床中37℃孵化60min，转速为100rpm；调整pH至7.4后,取上述模拟胃消化液10mL与等体积的模拟肠液(SIF，配方组成为：4mg/mL胰酶、5mg/mL胆汁盐、8.8mg/mL NaCl和6.8mg/mL K2HPO4，pH＝7.4)混合，置于水浴摇床中37℃孵化120min,转速为100rpm。最后，将最终消化液在20000×g的离心力下离心1h，收集上清液(即混合胶束相，内含溶解的7,8-DHF)，利用UPLC法测定其7,8-DHF含量，生物可及度按下式计算:
此外，每隔30和60(胃消化液)、120和180min(肠消化液)收集2mL消化液)，测定其平均粒径。
另将最终消化液制成冻干粉，进行FE-SEM表征，并观察其微观表面形态。
3.2试验结果
3.2.1Zein/LF和Zein/糖基化LF纳米递质的理化稳定性
pH稳定性：Zein一元纳米体系在pH 5～7范围内极其不稳定，添加LF后的二元体系可有效改善其稳定性。进一步将LF糖基化后，在更宽的pH范围内(3～9)，Zein/LF10K、Zein/LF40K和Zein/LF70K的二元体系均能保持稳定，纳米粒子处在一个较低的平均粒径范围(80-120nm)(图8A)。
离子强度稳定性：图8的B、C、D、E和F显示了不同pH条件下离子强度在对纳米载体稳定性的影响。Zein一元体系对离子强度高度敏感(图8B)，添加LF后的二元体系虽然有所改善，但在低pH(3～5)条件下依然不稳定(图8C)，而LF糖基化后则发挥了不同程度的稳定效果。如在Zein/LF10K的二元体系中，纳米粒子的平均粒径随着离子强度的增强而不断增大，在高浓度NaCl(500mmol/L)和低pH(3和4)条件下,其平均粒径超过350nm(图8D)。然而随着葡聚糖分子量的增大，其对Zein纳米粒子的稳定性越来越好，Zein/LF40K(图8E)和Zein/LF70K(图8F)的平均粒径在广阔范围的pH(3-9)和离子强度(0-500mmol/L NaCl)下分别小于250nm和200nm，Zein/LF70K表现了最佳的稳定效果。表明随着葡聚糖分子量的增大，其链长相应增加，从而产生了更大的空间位阻，阻止了纳米粒子的团聚效应，同时糖基化的LF在粒子表面形成的界面层也起到了屏蔽外界电荷的作用。
贮藏稳定性：Zein一元体系在30天的储存过程(25℃常温光照)中不稳定。与Zein/LF相比，Zein/糖基化LF的二元体系在30天的储存过程中更加稳定，说明LF的糖接枝化能有效提高纳米粒子的稳定性。
热稳定性：95℃加热60min后，Zein一元体系的平均粒径＞400nm。之前的研究也表明，未包覆的Zein纳米粒子在加热条件下不稳定。然而，在相同的加热条件下，二元体系(Zein/LF和Zein/糖基化LF)的平均粒径与加热前先比均无显著变化(p>0.05)，表明糖基化LF的存在显著改善了Zein纳米粒子的热稳定性。
3.2.2负载7,8-DHF的Zein/LF和Zein/糖基化LF复合纳米粒子的外抗消化性和生物可及度
目标物在模拟胃肠道中的有效保护和持续释放是评价纳米载体有效性的关键。本研究采用模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)的体外消化体系，测定了负载7,8-DHF的一元、二元纳米粒子在模拟消化过程(30、60、120、180min)中的平均粒径变化。如图9A所示，在SGF中消化60min后，一元纳米粒子(DHF-Zein)均粒径显著增大(p<0.05)继续在SIF相中消化后，其粒径减小，可能是由于肠液中胰酶的作用，水解了聚集物，同时由于含有胆汁盐，具有较强的乳化能力，可以乳化水解的聚合物。二元纳米粒子(DHF-Zein/LF)在SIF消化过程中发生了聚集，当LF经过糖基化处理后的体系(DHF-Zein/LF 10K、DHF-Zein/LF40K、DHF-Zein/LF70K)，经过SGF消化后的粒径略有增大，继而经SIF消化后也无显著变化。这可能是由于纳米粒子表明的LF经过接枝化处理后，既提供了强大的空间斥力以克服粒子间的相互吸引(疏水相互作用和范德华力)，又在粒子表明形成了新的界面，屏蔽了酸、碱及酶的降解作用。
通过体外胃肠道消化模拟试样，还对游离7,8-DHF及其不同建构的复合纳米材料进行了体外生物可及度的评价。如图9B所示，7,8-DHF对照样的溶解度相对较低，经体外消化模拟后，其生物可及度为18.06％。纳米化技术表现出显著的改善作用，一元纳米粒子(DHF-Zein)的生物可及度即提升至31.85％
(p<0.05)，二元纳米粒子中由于LF存在，7,8-DHF的生物可及度增加到63.51％，比对照样(游离7,8-DHF)提高了3倍(p<0.05)。进一步将LF糖基化后，生物可及度超过80％，如DHF-Zein/LF40K达到最大值(84.05％)。
FE-SEM图像显示，体外消化模拟对负载纳米粒子的表面形态有重要影响。如图10所示，体外消化后，DHF-Zein和DHF-Zein/LF颗粒的形貌发生了明显的变化，尤其是DHF-Zein(原颗粒呈球形，消化后呈块状结构)。对于DHF-Zein/LF二元粒子经过胃肠道消化后，由球形变为方形，是由于DHF-Zein/LF二元粒子在SIF消化过程中，大量聚集所致。然而，消化后的DHF-Zein/LF40K和DHF-Zein/LF70K虽然粒径有所增大，但仍保持相对的球状。表明糖基化LF的引入有助于提高纳米粒子的抗消化能力。
实施例4 7,8-DHF复合纳米生物材料的口服生物利用度及其在靶器官中的含量4.1基于纳米化技术的7,8-DHF口服生物利用度的显著提升
42只SD雄性大鼠，体重250-300g，随机分成7组，每组6只。经过一周适应后(12h光暗循环，22±2℃恒温，RH 55±5％，SPF屏障系统)，口服灌胃进行药代动力学实验。动物试样批准的伦理号为：ZJU 20190101。
将7,8-DHF(制成0.5％ CMC的悬浮液)、DHF-Zein、DHF-Zein/LF和DHF-Zein/LF 40K试样分别灌胃，灌胃剂量为50mg/kg(均以7,8-DHF绝对含量计算)。分别于0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、10和24h时眼眶取血(200μL)至K2-EDTA预处理抗凝管中。收集的血液样品于4000×g离心10min后收集上层血浆样品。将血样存储于-80℃下，待测。
将100μL血样与20μL山柰酚(内标，300ng/mL)混合，加入280μL纯甲醇震荡2min以去除内源蛋白。13800×g离心10min后，将上清液转移至新的1.5mL试管中，室温下用氮气吹干。加入100μL纯甲醇复溶并震荡2min后，于13800×g离心10min。最后，取5μL上清液注入UPLC系统分析。
UPLC测试条件：色谱柱：C18,1.7μm,2.1mm×50mm。流动相为甲醇(溶剂A)和0.05％三氟乙酸(溶剂B)。梯度洗脱程序如下：20％溶剂A(0～1min),20～80％溶剂A(1～5min),80～100％溶剂A(5～7min)，100～20％溶剂A(7～8min)和20％溶剂A(8min)。流速为0.2mL/min，温度为37℃，PDA检测波长为330nm。校准曲线经三次试验获得。回归方程为y＝37.93x+299.32，相关系数r为0.9998，其中y为峰面积，x为血样中7,8-DHF浓度(ng/mL)。UPLC法的7,8-DHF定量范围为10～10000ng/mL。
药代动力学参数分析采用非房室模型，达峰浓度(浓度最大值，Cmax)、达峰时间(达到最大浓度的时间，Tmax)、半衰期(浓度下降一半所需时间，t1/2)、消除速率常数(Ke)、平均驻留时间(MRT)、总清除率(Cl)、表观分布容积(Vd)、浓度时间曲线下面积(AUC)和相对生物利用度(Frel)利用Kinetica 4.4.1软件模拟获得。相对生物利用度通过下式计算得到:
药代试验的血浆浓度-时间曲线如图11所示。对照样(游离态的7,8-DHF)口服后吸收迅速，在0.25h(Tmax)时达到127.36ng/mL的峰值浓度(Cmax)。排除半衰期(t1/2)、排除率常数(Ke)、平均保留时间(MRT)、曲线下面积(AUC(0-t))分别为2.23h、0.20h-1、2.67h、278.98ng·h/mL(表2)。
而被包封于Zein、Zein/LF和Zein/LF40K纳米递质中以后，7,8-DHF的Cmax分别为241.74、306.69和450.84ng/mL，相对生物利用度(Frel)分别增加到252.95、528.33和846.20％，表明在复合纳米材料中7,8-DHF的口服生物利用度得到了大幅度提升。同时，Tmax、t1/2、MRT值也分别增加，说明纳米材料延长了7,8-DHF的在血液中的保留时间。其中，二元体系中的DHF-Zein/LF40K对7,8-DHF口服生物利用度的改善作用最为突出。
表2、口服7,8-DHF负载纳米粒子后的药代动力学参数
4.2 7,8-DHF复合纳米生物材料的构建和口服生物利用度
7,8-DHF:竹叶黄酮(BLF):Zein以1:1:10的质量比溶解于80％的乙醇-水溶液中作为溶剂体系，将糖基化LF溶解于蒸馏水中作为反溶剂体系，将溶剂体系以1:3体积比快速加入反溶剂体系中搅拌30min，混合溶剂体系中Zein和糖基化LF的质量比为1:1，随后利用旋转蒸发仪在40℃、减压(-0.1Mpa)条件下除去多余的乙醇溶液，得到7,8-DHF复合纳米生物材料(DHF-BLF-Zein/LF40K)。同时测定其包封率、平均粒径和口服生物利用度(表3)。
表3、7,8-DHF复合纳米生物材料包封率、平均粒径和相对口服生物利用度
如表3所示，同时包封7,8-DHF和竹叶黄酮(BLF)构建7,8-DHF复合纳米生物材料后，其7,8-DHF的包封率为96.21％，相比较于DHF-Zein/LF和DHF-Zein/LF40K有所下降，但仍保持较高的包封率。同时BLF的包封率也达到了92.13％。同时，7,8-DHF复合纳米生物材料相比较于DHF-Zein/LF和DHF-Zein/LF40K，平均粒径增大，达到97.8nm。此外，7,8-DHF复合纳米生物材料的相对口服生物利用度达到1012.41％，相对于DHF-Zein/LF和DHF-Zein/LF40K也发生了增大。
4.3 7,8-DHF复合纳米生物材料在试验小鼠脑组织中的含量
40只1.5-2月龄的C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重20-30g。分成7,8-DHF(制成0.5％CMC的悬浮液)、DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF40K和DHF-BLF70-Zein/LF40K共4组，又分为0.5h和2h两个时间节点，每组在每个时间节点取5只小鼠。将试样分别灌胃，灌胃剂量为25mg/kg(均以7,8-DHF的绝对含量计)。每个时间点将小鼠处死取脑组织，测定脑匀浆中的7,8-DHF含量。
脑组织中7,8-DHF含量定量分析及样品前处理方法：称取0.1g脑组织，加入3倍体积(v/w)的PBS(1X，pH 7.4)，匀浆，取50μL脑匀浆液，加入200μL乙腈溶液，涡旋振荡1min，4℃、3000rmp离心10min，取100μL上清液转移至新试管中，加入100μL超纯水，振荡混匀后备用。
7,8-DHF的LC-MS/MS检测条件参数，液相条件：Shimadzu Nexerra UPLC(分析柱：AcquityHSS T3 1.8μm 2.1×50mm)，流速：0.7mL/min；流动相A：0.1％甲酸铵溶液，流动相B：乙腈(含0.1％甲酸，v/v))。质谱条件：AB Sciex Qtrap 6500，离子源ESI(+)和(-)，扫描模式MRM。
表4、不同组别实验小鼠在不同时间节点时脑匀浆中的7,8-DHF含量水平
如表4所示，DHF-Zein/LF、DHF-Zein/LF40K和DHF-BLF-Zein/LF40K的脑组织相比较于游离7,8-DHF组均有所增加，0.5小时分别提高了1.75、2.76和3.63倍；2小时时，虽然7,8-DHF水平有所降解，但含量仍高于7,8-DHF对照组分别，含量分别为25.5，42.5和368ng/g。尤其是DHF-BLF70-Zein/LF40K组，脑部7,8-DHF的含量最高，表现出高度的脑靶向性和极强的透过血脑屏障的能力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种高生物利用度的7,8-二羟基黄酮复合纳米生物材料，其特征在于，包含如下组分：
1）药物载体，所述药物载体为玉米醇溶蛋白和乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白；和
2）药物，所述药物为7,8-二羟基黄酮或7,8-二羟基黄酮和竹叶碳苷黄酮；
所述药物载体包封所述药物；
所述复合纳米生物材料是采用反溶剂沉淀法制备的；
所述复合纳米生物材料是如下制备的：
将玉米醇溶蛋白溶于80 %的乙醇-水溶液中，按一定的体积比加入乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白，玉米醇溶蛋白与乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白的质量比为1:1；以其为载体、采用反溶剂沉淀法包封目标物7,8-二羟基黄酮或7,8-二羟基黄酮和竹叶碳苷黄酮，制备得到所述复合纳米生物材料，其中，7,8-二羟基黄酮在纳米冻干粉中的质量占比为5～7 %；
所述糖基化的乳铁蛋白为葡聚糖糖基化的乳铁蛋白。
2.如权利要求1所述的复合纳米生物材料，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为10Kda。
3.如权利要求1所述的复合纳米生物材料，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为40Kda。
4.如权利要求1所述的复合纳米生物材料，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为70Kda。
5.如权利要求1所述的复合纳米生物材料，其特征在于，所述药物载体包封所述药物，且包封率≥90%。
6.如权利要求1所述的复合纳米生物材料，其特征在于，所述复合纳米生物材料的平均粒径为50-150 nm。
7.一种权利要求1所述的复合纳米生物材料的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将玉米醇溶蛋白溶于80 %的乙醇溶液中，按一定的体积比加入乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白，玉米醇溶蛋白与乳铁蛋白或糖基化乳铁蛋白的质量比为1:1；以其为载体、采用反溶剂沉淀法包封目标物7,8-二羟基黄酮或7,8-二羟基黄酮和竹叶碳苷黄酮，制备得到所述复合纳米生物材料，其中，7,8-二羟基黄酮在纳米冻干粉中的质量占比为5～7 %；
所述糖基化的乳铁蛋白为葡聚糖糖基化的乳铁蛋白。
8.一种权利要求1所述的复合纳米生物材料的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗BDNF/TrkB信号相关疾病的药物；
所述BDNF/TrkB信号相关疾病选自下组：阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症、Rett综合症、抑郁症及肥胖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023288069A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Emory University Methods of using substituted flavones for treating bone disorders
CN114235980A (zh) * 2021-11-16 2022-03-25 武汉人福创新药物研发中心有限公司 检测广金钱草提取物中黄酮类化合物含量的方法
CN114948869A (zh) * 2022-05-26 2022-08-30 中国药科大学 一种染料木素纳米混悬液的制备方法及该方法制备的染料木素纳米混悬液

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105682646A (zh) * 2013-06-04 2016-06-15 南达科他州立大学 用于口服药物递送的新型核-壳纳米颗粒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102076769B1 (ko) * 2018-04-24 2020-02-12 바이오스트림테크놀러지스(주) 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트, 이를 포함하는 나노입자 및 이의 제조방법
CN109574975B (zh) * 2019-01-14 2023-07-14 上海博芮健制药有限公司 7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105682646A (zh) * 2013-06-04 2016-06-15 南达科他州立大学 用于口服药物递送的新型核-壳纳米颗粒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
7,8-Dihydroxyflavone nano-liposomes decorated by crosslinked and glycosylated lactoferrin: storage stability, antioxidant activity, in vitro release, gastrointestinal digestion and transport in Caco-2 cell monolayers;Yufeng Chen etal.;《Journal of Functional Foods》;第65卷;第1-13页 *
Fabrication and characterization of zein/lactoferrin composite nanoparticles for encapsulating 7,8-dihydroxyflavone: Enhancement of stability, water solubility and bioaccessibility;Yufeng Chen etal.;《International Journal of Biological Macromolecules》;第146卷;第179-192页 *
Food Protein Based Core−Shell Nanocarriers for Oral Drug Delivery: Effect of Shell Composition on in Vitro and in Vivo Functional Performance of Zein Nanocarriers;Mohammed S. Alqahtani etal.;《molecular pharmaceutics》;第14卷;第757-769页 *

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