KR101782547B1 - 화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 그 제조 및 용도 - Google Patents

화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 그 제조 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 그리고 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속을 포함하는, 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자는 수용성 또는 지용성 생물학적 활성 화합물을 캡슐화할 수 있다. 본 발명은 나노기술 뿐만 아니라 식품, 약품 및 화장품 분야에 적용될 수 있다.

Description

화합물을 캡슐화하기 위한 나노입자, 그 제조 및 용도 {NANOPARTICLES FOR THE ENCAPSULATION OF COMPOUNDS, PREPARATION THEREOF AND USE OF SAME}
본 발명은 식품, 약학 및 화장품 분야와 나노기술 분야에 포함되며, 코팅제로서 카제인(casein)을 이용한 생물학적 활성 화합물의 캡슐화로 구성된다.
식품 산업은 고객의 새로운 요구들을 충족하기 위해서 기술적으로 발전해야 한다. 나노기술은 많은 이점들, 예를 들어, 제품의 유통기한 증대; 사용될 생물학적 활성 화합물 양의 감소; 배출의 조절; 생체이용률의 향상; 원치 않는 맛의 차단 등의 이점들을 얻기 위하여, 이러한 기술을 통해 조미료, 비타민, 미네랄, 정유(essential oil), 산화방지제, 프리바이오틱스(prebiotics) 등과 같은 생물학적 활성 화합물 (biologically active compound, BAC)을 캡슐화할 수 있어, 식품 산업을 혁신시키는 많은 잠재력을 제공하고 있다.
BAC를 캡슐화하기에 적합한 운반체의 설계 시, 코팅제나 매트릭스로 사용되는 물질을 정확히 선택하는 것이 매우 중요하며; 그러기 위해서는, 다른 인자들 중에서도 제형, 그 독성, 제제가 포함될 제품(식품, 화장품, 약품, 등) 등을 고려하여야 한다. 식품 나노기술 분야에서, 합성 고분자는 독성 문제를 야기할 수 있기 때문에 합성 고분자의 사용은 권장할 만 하지 않다. 천연 고분자는 이러한 단점이 없으나; 이들의 사용은 더욱 복잡한 입자 생산 방법의 발전을 의미하며; 또한, 대부분의 경우에 있어서, 얻어진 입자 크기(많은 경우는 100 ㎛ 초과)의 조절이 어려우므로 이러한 나노입자는 소비자가 알아 채게 되며 목표 식품의 관능적 특성을 변화시킬 수 있다.
이러한 물질들 중에서 단백질은 BAC 코팅제로 전통적으로 사용되고 있다. 식품에서의 그 응용을 위해 소수성 BAC를 캡슐화하기 위한 운반체로서 카제인의 사용에 대해 기술된다(CA2649788 및 EP2011472).
엽산(프테로일모노글루탐산 또는 비타민 B9), 폴레이트(folate) 그룹 내에 포함된 수용성 B-형 비타민은 DNA 합성과 같은 중요한 생화학적 공정을 위해 필수적이다. 이들의 결핍은 거대적아구성빈혈, 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 안구액 질환, 몇몇 종류의 암(대장암, 자궁경부암, 백혈병, 췌장암), 태아 발달과정에서의 신경관 결손, 임신 중 합병증 및 남성불임의 존재와 연관된다. 하지만, 유기체에 의해 합성될 수 없으므로 다양한 보충제나 식품을 통해 공급받아야 한다.
폴레이트는 천연적으로 식품(예를 들어, 과일 및 채소)에 기본적으로 폴리글루타메이트(polyglutamate) 형태로 존재하지만, 그 생체이용률-통상 50% 이하-은 불완전하다. 그러므로, 폴레이트 섭취가 권장된 것 보다 낮은 경우에 있어서 엽산 강화 식품의 소비는 상기 비타민의 섭취를 증가시키는 상보적인 옵션을 형성할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 식품에 첨가되는 엽산의 생체이용률은 다른 원인들 중에서도 매트릭스 효과(엽산은 식품 성분에 결합하여 흡수를 방지할 수 있음)나 생체이용률을 감소시키는 식품 내 임의의 성분의 존재로 인해 완전하지 않다. 또한, 엽산은 장에서 용해되지 않은 경우 잘 흡수가 되지 않는다. 캡슐, 정제 등에 의해 복용되는 엽산을 가지는 보충제나 강화제는 위산으로 인해 위 내에서 분해되는 대로 엽산이 침전되고 난용성 형태로 변환되어 공급된 엽산의 오직 일부만이 장에 도달하게 되는 단점이 있다.
또한, 폴레이트나 엽산에 의한 식품의 강화는, 엽산뿐만 아니라 폴레이트와 그 유도체 모두 다른 인자들 중에서도 온도, 빛 그리고 pH 변화에 민감하기 때문에 복잡한 과정이므로; 그들의 안정성은 식품 처리 조건에 의해 손상되며 소비자에게 유용한 비타민의 생체 활성량은 크게 감소될 수 있다. 따라서, 상기 비타민으로 식품을 강화하는 경우, 식품의 저장과 제조 과정에서 최대 손실이 발생할 수 있으므로 이러한 측면들을 고려할 필요가 있다.
기본적으로 유제품 및 시리얼 제품에서 엽산에 의한 식품의 강화에 대하여 기술되었다. 식품 보충제(EP2002839) 혹은 엽산이나 폴레이트로 강화된 식품, 예컨대, 소시지 고기(ES2302571), 유제품(EP1941804), 유아 식품(US4753926), 또는 심지어 닭, 돼지나 소의 통조림 식품(RU2223672 및 RU2213493) 또한 기술되었다. 하지만, 상기 경우에 있어서, 비타민과 식품 매트릭스간의 가능한 상호작용이나 그 생체이용률에 대해서는 고려되고 있지 않다.
위 조건(gastric conditions)에서 처럼 분해를 초래하는 환경 인자들로부터 엽산을 보호하기 위한 엽산을 함유한 알긴산 염 및 펙틴 마이크로캡슐을 획득하고, 장으로의 배출을 달성하기 위한 방법 또한 기술되었다. 그러나, 획득된 마이크로캡슐은 너무 커서 목표 식품의 관능적 특성에 영향을 미친다. 폴리(락트산-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 나노구에서 엽산을 캡슐화하고 그 지속적인 배출을 달성하기 위한 방법도 고안되었으며; 비록 결과는 긍정적이긴 하지만 의학 및 약학 영역에 국한되어 있어 이러한 고분자의 사용은 식품에서의 응용에 제한적이다.
그러므로, 상기 단점들을 전부 또는 일부 극복한, 바람직하게는 수용성, 보다 바람직하게는 엽산과 같은 산성 수용성 BAC의 BAC 캡슐화 시스템을 개발할 필요가 있다.
염기성 아미노산(예컨대, 아르기닌 또는 리신) 및 식품에 적합한 금속(예컨대, 칼슘)을 더욱 포함하는 카제인으로 형성된 나노입자는 물과 지방에 모두 가용성인, 바람직하게는 수용성인, 보다 바람직하게는 수용성이며 산성인, 생물학적 활성 화합물(biologically active compound, BAC)을 위한, 그리고 식품, 화장품 및 약품에 적용하기 위한 신규한 캡슐화 및 안정화 시스템을 형성한다는 것을 놀랍게도 알아내었다.
그러므로 일 측면에서, 본 발명은 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 및 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 식품 등급 금속을 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자는 기술적 첨가제로 사용될 수 있으며; 나아가, 나노입자는, 지용성 BAC도 포함할 수 있지만, BAC, 바람직하게는 수용성 BAC, 더욱 바람직하게는 예를 들어 엽산, 판토텐산 및 아스코르브산과 같은 B 또는 C형 비타민과 같은 산성 수용성 BAC 를 캡슐화하거나 또는 다른 친수성 화합물을 캡슐화 하는 능력을 갖고 있다.
상기 나노입자는 안정적이며, 제품(예컨대, 식품, 약품 또는 화장품)의 처리 과정 및 저장 과정에서 외부 요인, 예를 들어, 빛, pH 변화, 산화, 등에 의한 분해로부터 BAC를 보호할 수 있으며, 또한, 식품에 적용할 경우, BAC를 위의 산성 조건으로부터 보호하여 위관을 따라 배출되는 것을 방지함으로써 침전을 방지할 수 있고 이에 따라 생체이용률의 감소를 방지할 수 있다. 또한, 상기 나노입자는 (모의) 장 매질에 용해될 수 있어 정확한 흡수를 위해 장 내에서 BAC의 완전한 배출을 가능하게 하고, 나아가 어떤 유형의 독성 문제도 막을 수 있다는 것을 알아내었다. 유리하게, 상기 나노입자는 도입되는 식품 내에서는 불활성이므로 BAC가 매트릭스의 다른 성분과 반응하는 것을 방지하며 생체이용률 저하를 방지한다.
또한, 카제인 자체가 BAC 자체의 유리한 효과를 보완하기 위한 영양적 특성을 보여주므로, 본 발명에 의해 제공되는 나노입자의 가장 중요한 특징 중의 하나는 BAC를 환경 조건 및 위 조건으로부터 보호하기 위해 카제인을 천연 운반체로 사용함으로써 장 내에서의 배출을 용이하게 하여 생체이용률을 향상시킨다는 데 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 나노입자를 제조하는 공정에 관한 것이다. 상기 공정은 간단하며 산업적 규모로 적용 가능하다. 유리하게, 상기 공정은 식품 첨가제로 승인되지 않은 합성 또는 반응성 고분자를 포함하지 않아 계면 활성제나 유화제의 함유를 최소화함으로써 조절 가능한 입자 크기를 가지는 나노미터 규모의 나노입자를 획득할 수 있도록 한다.
특정 실시예에서, 상기 공정은 분말 형태의 제제를 얻기 위해 상기 나노입자를 함유한 현탁액을 건조하여 BAC를 시간이 지나도 안정되게 유지하는 단계를 더 포함하며; 이러한 종류의 분말 제제는 고체 식품에 사용하기에 특히 적합하다. 유리하게, 상기 건조 처리는 나노입자 보호제의 존재 하에 실시된다. 이렇게 얻어진 BAC를 함유하는 나노입자는 수용액 매질에서 쉽게 현탁되어 BAC를 용액 내에서의 분해로부터 보호한다. 획득된 최종 산물은 안정적이고 오랜 저장 기간에 걸쳐 BAC를 보호하며 또한 액체 (예컨대, 드링크류, 등) 및 고체의 다른 종류의 식품에 적용 가능하다.
다른 측면에서, 본 발명은 식품, 약품 또는 화장품에 사용되는 상기 나노입자를 포함한 조성물에 관한 것이다. 사실, 상기 나노입자는 본 분야에 사용하기에 적합한 안정된 화장품용 제제를 얻기 위해 크림, 겔, 및 히드로겔에 포함될 수 있다. 상기 나노입자는 국소 경로(topical route)에 의해 상기 나노입자를 복용하기에 적합한 부형제를 이용하여 만들 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 카제인 나노입자를 기초로 한 상기 조성물을 포함하는 식품에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 식품은 액체, 반고체 또는 고체 형태이다.
본 발명의 나노입자는 안정적이며, 제품(예컨대, 식품, 약품 또는 화장품)의 처리 과정 및 저장 과정에서 외부 요인, 예를 들어, 빛, pH 변화, 산화, 등에 의한 분해로부터 BAC를 보호할 수 있으며, 또한, 식품에 적용할 경우, BAC를 위의 산성 조건으로부터 보호하여 위관을 따라 배출되는 것을 방지함으로써 침전을 방지할 수 있고 이에 따라 생체이용률의 감소를 방지할 수 있다. 또한, 상기 나노입자는 (모의) 장 매질에 용해될 수 있어 정확한 흡수를 위해 장 내에서 BAC의 완전한 배출을 가능하게 하고, 나아가 어떤 유형의 독성 문제도 막을 수 있다. 그리고, 상기 나노입자는 도입되는 식품 내에서는 불활성이므로 BAC가 매트릭스의 다른 성분과 반응하는 것을 방지하며 생체이용률 저하를 방지한다.
도1은 엽산을 함유한 카제인 나노입자를 획득하기 위해 적용되는 본 발명의 공정의 특정 실시예의 개략도를 나타낸다.
도2는 빈(empty) 카제인 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진을 나타낸다. 사진의 좌측 하단의 여백에 위치한 검은색 막대는 100 nm 기준에 해당된다.
도3은 엽산을 함유한 카제인 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진을 나타낸다. 사진의 좌측 하단의 여백에 위치한 검은색 막대는 100 nm 기준에 해당된다.
도4는 캡슐화된 엽산의 양과 제제에 첨가된 엽산 각각의 mg 당 카제인 양 사이의 비를 나타낸다. 모든 제제에서, 엽산 용액의 첨가 전 리신과 단백질 간의 중량비는 1:12이다.
도5는 고압 처리 하지 않은(A 및 B), 5분간 100 MPa에서 처리한(C), 5분간 400 MPa에서 처리한(D), 그리고 5분간 800 MPa에서 처리한(E) 제제 내에 엽산을 함유하고 리신을 가지는 카제인 나노입자의 주사전자현미경(SEM) 사진을 나타낸다.
도6은 5분간 400 MPa에서 처리한 제제 내에 엽산을 함유하고 아르기닌을 가지는 카제인 나노입자의 주사전자현미경(SEM) 사진을 나타낸다.
도7은 37±1℃에서 인공 위액(simulated gastric fluid, SGF)에서(처음 2시간 동안:0-2 시간) 그리고 인공 장액(simulated intestinal fluid, SIF)에서(2 내지 24 시간) 배양 후 고압 처리 없이 카제인 나노입자로부터 엽산을 배출한 것을 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준편자(n=6)을 보여준다.
도8은 37±1℃에서 인공 위액에서(처음 2시간 동안:0-2 시간) 그리고 인공 장액에서(2 내지 8 시간) 배양 후 고압처리(A) 5분간 150 MPa, 및 B) 5분간 400 MPa)를 한 카제인 나노입자로부터 엽산을 배출한 것을 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준편차(n=4)을 보여준다.
도9는 실험동물에 서로 다른 비타민 제제를 투여 후 시간에 따른 혈청 엽산 농도(ng/mL)을 나타낸다. 결과는 평균 ± 표준편차(n=5)을 보여준다.
A) 정맥 내 투여, 투여량 1 mg/kg.
B) 경구 투여, 투여량 1 mg/kg: 물에 용해된 비캡슐화된 엽산(●); 물에 분산된 카제인 나노입자에 캡슐화된 엽산(■); 물에 분산된 고압처리된 카제인 나노입자에 캡슐화된 엽산(▲).
본 발명은 빛, pH 변화, 산화 등의 외부 요인에 의한 분해로부터 보호하기 위한 카제인 나노입자 및 생물학 활성 화합물(BAC)을 캡슐화하기 위한 방법을 제공한다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본 발명의 맥락 속에서 사용된 몇몇 용어 및 표현의 의미를 이하에서 설명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "염기성 아미노산"은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "카제인"은 총 우유 단백질의 약 80%를 형성하는 복합 단백질을 지칭한다. 인단백질 형 단백질은 글로블린의 정의에 포함된 것으로; 가용성이며; 높은 수분 보유능력을 가지며; 20℃ 약 4.6 pH에서 침전한다. 아미노산 조성물, 전하 배치, 칼슘의 존재 하에 응집체를 형성하는 경향에 의해 서로 분화된 4개의 기본 분획물들(αs1-카제인, αs2-카제인, β-카제인 및 κ-카제인)에 의해 형성된다. 우유에서, 카제인은 "카제인 미셀(micelle)"이라고 하는 직경이 50 내지 600 nm (평균 약 150 nm) 의 커다란 콜로이드 입자를 형성한다. 이러한 입자는 소수성 상호작용에 의해 그리고 카제인 구조체에 존재하는 포스포세린 라디칼에 의한 인산칼슘 착화에 의해 형성된다. 상기 미셀은 우유에서 매우 안정한 콜로이드 계를 형성하여 그 색깔, 열 안정성 및 렌닌에 의한 응고에 대한 주요 원인 중의 하나가 된다.
본원에서 사용한 바와 같이, "생물학적 활성 화합물" 또는 "BAC"는 영양상, 치료상 및/또는 미용상 활성을 갖는 임의의 지용성 및 수용성 화합물을 칭한다. 본 발명에 따른 BAC의 비제한적인 예시적 일례는 아미노산, 항균제, 방향제, 보존제, 감미료, 스테로이드, 약물, 호르몬, 지질, 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 단백질, 프로테오글리칸, 향료, 비타민 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "수용성 생물학적 활성 화합물" 또는 "수용성 BAC"는 Royal Spanish Pharmacopoeia에 정의된 기준에 따라 수용액에 녹는 (매우 잘 녹는, 잘 녹는, 녹는, 좀 녹는, 또는 약간 녹는) 영양상, 치료상 및/또는 미용상 활성을 갖는 화합물을 칭한다:
기술적 용어 15℃와 25℃ 사이의 온도를 기준으로 용질 그램 당 용매 밀리리터(mL)로 나타낸 용매의 대략 부피
매우 잘 녹는 1 미만
잘 녹는 1 내지 10
녹는 10 내지 30
좀 녹는 30 내지 100
약간 녹는 100 내지 1,000
매우 녹기 어려운 1,000 내지 10,000
거의 녹지않는 10,000 초과
수용성 BAC의 비제한적인 예시적 일례는 비타민 B군이나 C 군 및 그 유도체와 같은 비타민, 그 염이나 에스테르; 히알루론산, 콘드로친 설페이트, 티옥산, 그 염 및 에스테르 등을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 수용성 BAC는 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신, 판토텐산, 티아민 모노포스페이트, 티아민 파이로포스페이트, 티아민 트리포스페이트, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산 (엽산 유도체; 폴레이트 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 폴레이트), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산 (알파 리포산), p-쿠마르산, 카페인산, 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품 등급인 유도체, 에스테르 또는 그 염, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지용성 생물학적 활성 화합물" 또는 "지용성 BAC"는 Royal Spanish Pharmacopoeia에 정의된 기준에 따라 지방 및 기름에 녹는 (매우 잘 녹는, 잘 녹는, 녹는, 좀 녹는, 또는 약간 녹는) 영양상, 치료상 및/또는 미용상 활성을 갖는 화합물을 칭한다. 지용성 BAC의 비제한적인 예시적 일례는 비타민 A, D, E, K군 및 그 유도체와 같은 비타민 및 그 유도체, 인지질, 카르티노이드(카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아잔틴 등), 오메가-3 지방산(도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 등), 피토스타놀 및 피토스테롤(시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 등), 폴리페놀(퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캄페롤, 미리세틴, 아이소람네틴 등) 및 그 유도체를 포함한다.
인간이나 동물의 식품에 사용되는 제품이 국가 또는 기관, 예를 들어, 유엔 식량농업기구(FAO)나 세계보건기구(WHO)의 식품 규격(Codex Alimentarius)에 따라 안전한 경우에는 "식품 등급"이라고 부르며; 따라서, "식품 등급" 제품은 "식품에 사용되기에 적합한" 무독성 제품이므로 두 표현은 유의어이며 본 설명에서는 구별 없이 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "2가 금속"은 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품에 사용하기에 적합하다는 가정 하에 원자가가 2인 금속 원소, 예를 들면, 칼슘, 마그네슘, 아연 등과 같은 알칼리토금속, 또는 여러 개의 원자가를 갖는 경우에는 그 중 하나가 2인 금속, 예를 들어 철과 같은 금속 원소를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "3가 금속"은 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품에 사용하기에 적합하다는 가정 하에 원자가가 3인 금속 원소 또는 여러 개의 원자가를 갖는 경우에는 그 중 하나가 3인 금속, 예를 들어 철과 같은 금속 원소를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "나노입자"는 크기가 1 마이크로미터(㎛) 미만, 바람직하게는 대략 10 내지 900 나노미터(nm)인 구형 또는 유사한 형태의 콜로이드 계를 칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "평균 크기"는 수용성 매질 내에서 함께 이동하는 나노입자 집단의 평균 직경을 칭한다. 본 시스템의 평균 크기는 당업자에 의해 공지된 표준 공정으로 측정할 수 있으며, 이는 예를 들어 실험 부분에서 설명된다(아래 참조). 본 발명의 나노입자는 평균 입자 크기가 1 ㎛ 미만, 통상적으로 1에서 999 nm 사이, 바람직하게는 10에서 900 nm 사이, 보다 바람직하게는 50에서 500 nm 사이, 보다 더 바람직하게는 100 내지 200 nm 사이인 것을 특징으로 한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 50 내지 200 nm 사이, 바람직하게는 대략 140 nm인 평균 입자 크기로 이루어진다.
나노입자
일 측면에서, 본 발명은 나노입자에 관한 것으로서, 이하, 본 발명의 나노입자는 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 그리고 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 금속을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 특정 실시예에서, 상기 금속은 바람직하게는 칼슘, 마그네슘, 아연, 철(2가 형태임) 및 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 식품 등급의 2가 금속이다.
다른 특정 실시예에서, 상기 금속은 예를 들어 3가 형태의 철과 같은 식품 등급의 3가 금속이다.
본 발명의 나노입자는 기술적 첨가제, 예를 들어, 지방 대체물질 등으로 사용될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 또한 생물학적 활성 화합물(BAC)를 캡슐화하는 능력을 갖는다.
따라서, 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 또한 생물학적 활성 화합물(BAC)를 포함한다. 상기 BAC는 수용성 BAC나 지용성 BAC일 수 있으며; 이 경우 본 발명의 나노입자는 본 설명서에서는 "본 발명의 로딩된 나노입자"로 종종 구별된다.
특정 실시예에서, 상기 BAC는 수용성 BAC, 바람직하게는 산성 수용성 BAC이다. 보다 특정 실시예에서, 상기 수용성 BAC는 다음의 군에서 선택된다:
a) B 또는 C 군의 비타민;
b) a)에 따른 비타민 유도체;
c) 히알루론산, 콘드로친 설페이트 및 티옥산으로부터 선택된 화합물;
d) 상기 a) 내지 c)의 어느 화합물의 염 또는 에스테르; 및
e) 그 조합.
구체적인 실시예에서, 상기 수용성 BAC는 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신 또는 비타민 B3, 판토텐산 또는 비타민 B5, 티아민 모노포스페이트, 티아민 파이로포스페이트, 티아민 트리포스페이트, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산 (엽산 유도체; 폴레이트 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 폴레이트), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산 또는 알파 리포산, p-쿠마르산, 카페인산, 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품 등급인 유도체, 에스테르 또는 그 염, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
구체적인 실시예에서, 상기 BAC는 엽산, 판토텐산, 아스코르브산 등과 같은 산성 수용성 BAC이다.
어떠한 이론에도 구속받고 싶지 않지만, 2가 금속(예, 칼슘)과 같은 금속의 존재 하에서 α 및 β 카제인은 친수성 및 구조체에 존재하는 포스포세린 라디칼이 양이온부에 결합 시 상실되는 표면 전하로 인하여 응집하는 것으로 알려져 있다. 수용성 BAC-바람직하게는 산성(예를 들어, 엽산)-는 또한 상기 금속과 정전기적으로 상호작용하여 이런 유형의 카제인에 의해 생성되는 소수성 매트릭스 내에 트랩될 것이다. 한편, κ 카제인은 금속(예, 칼슘)과 반응을 하지 않으므로 그 소수성 부분에 의해 입자에 결합되며 그 수용성 부분은 외부 수용성 매질과 접촉한다. 상기 수용성 부분은 높은 비율의 카보닐기(글루탐산 또는 아스파트산과 같은 아미노산의 산성기) 이 외에 3 탄당 및 4 탄당에 결합된 세릴 및 트레오닐 잔기에 대응하는 극성기를 갖는다. 따라서 나노입자 형성 후, 용액에 존재하는 염기성 아미노산(예, 리신)은 상기 부분의 카르복실기와 정전기 상호작용[예를 들어, (해당하는 경우) 스프레이 건조기를 통과하는 동안 열을 받은 후에는 공유결합일 수 있음]으로 인해 나노입자의 표면에 부착되는 것으로 여겨진다. 도1은 카제인 매트릭스, 리신 (염기성 아미노산) 및 칼슘(2가 금속)을 포함하는 본 발명의 로딩된 나노입자의 개략도를 나타낸다.
다른 구체적인 실시예에서, 상기 BAC는 지용성 BAC이고, 이 경우 수용성 매질에서 바람직하게는 BAC의 균질한 현탁액을 형성하거나, 보다 바람직하게는 유기 용액에 BAC를 용해시켜 천천히 카제인 소스(예, 카제인염)를 함유하는 용액에 상기 수용성 현탁액이나 상기 유기 용액을 첨가하고 그 혼합물을 배양할 필요가 있다.
지용성 BAC는 (2가 또는 3가) 금속과 상호작용할 능력을 갖고 있는 지와 무관하게 양 부분 간의 친화성으로 인해 나노입자의 내부 소수성 부분에 트랩될 것이므로 트랩 기작은 수용성 BAC에 대해 설명한 것과 상이할 것이다.
특정 실시예에서, 상기 BAC는 비타민 A, D, E, K군 및 그 유도체와 같은 비타민, 인지질, 카르티노이드(카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아잔틴 등), 오메가-3 지방산(예컨대, DHA, EPA 등), 아미노산(예컨대, 이소-루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린), 피토스타놀 및 피토스테롤(예컨대, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 등), 폴리페놀(예컨대, 퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캄페롤, 미리세틴, 아이소람네틴 등) 및 그 유도체 중에서 선택된 지용성 BAC이다.
본 발명의 로딩된 나노입자에서 BAC 대 카제인의 중량비는 넓은 범위 내에서 변할 수 있는 데; 비제한적인 예시적인 방식으로 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 BAC 대 카제인의 중량비는 1:1에서 1:200 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:80 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:15에서 1:35 사이로 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, BAC는 수용성 BAC이며, 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 (수용성) BAC 대 카제인의 중량비는 1:1에서 1:50 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:30 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:15에서 1:20 사이로 이루어질 수 있다. 다른 특정 실시예에서, BAC는 지용성 BAC이며, 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 (지용성) BAC 대 카제인의 중량비는 1:1에서 1:200 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:80 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:15에서 1:35 사이로 이루어질 수 있다.
또한, 원하는 경우, 본 발명의 나노입자-BAC로 로딩된 것과 그렇지 않은 것 모두-온도 및 산화에 대한 안정성을 높이기 위해 그 제제에 아스코르브산(비타민 C) 등과 같은 산화방지제를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, BAC는 엽산이고, 산화방지제는 아스코르브 산이며 이는 자외선 조사, pH 변화, 열, 산소 등에 의한 분해로부터 엽산을 보호하는 작용을 하는 것으로 보이며 또한 아스코르브산의 영양 지원을 제공한다. 상기 산화방지제는 BAC와 함께 캡슐화되어 본 발명의 나노입자 코팅에 도입될 수 있다.
나노입자 획득 공정
다른 측면에서, 본 발명은 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 그리고 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 금속을 포함하는 나노입자(본 발명의 나노입자)의 제조 공정에 관한 것으로서, 이하, "본 발명의 공정[1]"은 이하를 포함한다:
a) 카제인 소스 및 염기성 아미노산을 함유하는 수용액을 제조하는 단계; 및
b) 2가 금속, 3가 금속 및 이들의 조합으로부터 선택된 금속의 수용액을 단계 a)의 용액에 첨가하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 그리고 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 금속과 생물학적 활성 화합물(본 발명의 로딩된 나노입자)을 포함하는 나노입자의 제조 공정에 관한 것으로서, 이하, "본 발명의 공정[2]"은 이하를 포함한다:
a) (i) 카제인 소스과 제1염기성 아미노산을 함유하는 수용액을 (ii) 생물학적 활성 화합물을 함유한 용액과 혼합하는 단계; 및
b) 2가 금속, 3가 금속 및 이들의 조합으로부터 선택된 금속의 수용액을 단계 a) 결과 얻어진 혼합물에 첨가하는 단계.
본 발명의 공정[1]의 단계 a)에서, 카제인 소스 및 염기성 아미노산을 함유한 수용액은 당업자에 의해 알려진 통상의 방법, 예를 들어, 상기 카제인 소스 및 염기성 아미노산을 수용성 매질에 첨가하여 제조한다.
본 발명의 공정[2]의 단계 a)에서, 카제인 소스 및 염기성 아미노산을 함유한 수용액(i)이 BAC를 함유한 용액(ii)와 혼합된다. BAC를 함유한 상기 용액(ii)의 성질 및 조성은 BAC의 종류 및 성질에 따라 달라진다. 따라서, 특정 실시예에서, BAC가 수용성 BAC인 경우, BAC를 함유한 상기 용액(ii)은 수용액이고; 다른 특정 실시예에서, BAC가 산성 수용성 BAC인 경우, BAC를 함유한 상기 용액(ii)은 제2염기성 아미노산을 더 포함하는 수용액이며; 다른 특정 실시예에서, BAC가 지용성 BAC인 경우, BAC를 함유한 상기 용액(ii)은 수용성 매질 또는 바람직하게는 유기 용액, 보다 바람직하게는 알코올, 예를 들어, 에탄올과 같은 수혼화성 용매에서의 현탁액이다.
양 공정(본 발명의 공정[1] 및 [2])을 실행하는 데 사용될 수 있는 카제인은 예컨대 우유, 콩 등의 사실상 어떠한 카제인 소스로부터도 비롯될 수 있다. 카제인은 산성 카제인 또는 카제인염의 형태로 상기 용액에서 발견될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 카제인 소스는 카제인염 형태의 카제인, 바람직하게는 카제인 나트륨염을 포함한다. 비록 카제인 칼슘염 및 포스포칼슘도 사용할 수 있지만, 칼슘은 카제인염을 활성 성분과 혼합 후 나노입자를 형성하기 위해 사용되는 바 카제인염 용액이 이미 매질에 칼슘을 가지고 있다면 상기 공정의 실행이 심각하게 손상될 수 있기 때문에 카제인 칼슘염 및 포스포칼슘은 실제로는 덜 유리하다.
본 발명의 공정 [2]의 단계 a)에 사용된 [카제인 소스 및 제1염기성 아미노산을 함유한] 수용액 (i) 뿐만 아니라 본 발명의 공정 [1]의 단계 a)에서 형성된 수용액에 함유될 수 있는 카제인의 양은 광범위한 범위에서 변할 수 있지만; 특정 실시예에서, 상기 수용액에 함유된 카제인의 양은 0.1%에서 10% (w/v) 사이, 바람직하게는 0.5%에서 5% 사이, 보다 바람직하게는 1%에서 3% 사이로 이루어진다.
염기성 아미노산은 카세인 및, 해당하는 경우, BAC, 특히 산성 수용성 BAC를 용해하는 데 기여하므로, 본 발명의 나노입자가 로딩된 BAC와 로딩되지 않은 BAC의 제조에 중요한 역할을 한다. 사실, 용액의 pH가 증가하면 염기성 아미노산은 무기염을 사용할 필요 없이 카제인염을 용해할 수 있고, 또한 카제인의 카파(κ) 분획물의 친수성 말단을 음이온 형태로 유지하는 염기로서 작용하여 음의 표면전하를 가지는 입자가 현탁액에 유지되고 정전기 반발력으로 인해 응집되지 않는 것으로 보인다.
양 공정(본 발명의 공정 [1] 및 공정 [2])을 수행하는 데 사용될 수 있는 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그 혼합물, 바람직하게는 아르기닌, 리신 및 그 혼합물로 이루어진 군에선 선택된다. 본 발명의 나노입자의 내측 또는 외측에 있을 수 있는 염기성 아미노산은 나노입자 형성 전에 성분의 용해를 촉진하고 나노입자 양측(내측 및 외측)에서 수득된 후에 적절한 pH를 유지하기 때문에 근본적으로 기술적인 역할을 수행한다. 예시에 의해, 엽산은 물에 약간 녹지만 약알칼리성 수용액에는 잘 녹기 때문에 염기성 아미노산의 존재는 엽산의 용해에 도움이 된다.
본 발명의 공정 [2]의 특정 실시예에서, BAC가 산성 수용성 BAC인 경우 BAC를 함유한 상기 용액 (ii)은 (BAC 침전을 방지하기 위한) 제2염기성 아미노산을 더 포함한 수용액이다. 그 경우 두 개의 서로 다른 염기성 아미노산의 사용 가능성을 고려하지만, 특정 실시예에서 카제인 소스(제1염기성 아미노산)를 함유한 수용액을 제조하는 데 사용하는 염기성 아미노산 및 BAC(제2염기성 아미노산)를 함유한 수용액을 제조하는 데 사용하는 염기성 아미노산은 동일하며 아르기닌, 리신, 히스티딘, 및 그 혼합물, 바람직하게는 아르기닌, 리신, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 공정 [1]의 단계 a)에서 형성된 용액 및 본 발명의 공정 [2]의 단계 a)의 용액 (i)에 함유될 수 있는 염기성 아미노산의 양은 광범위하게 변할 수 있으며 일반적으로 사용되는 염기성 아미노산에 의해 결정된다. 따라서, 염기성 아미노산 대 카제인의 중량비가 크게 변할 수는 있지만, 특정 실시예에서 본 발명의 공정 [1]의 단계 a)에서 형성된 용액 또는 본 발명의 공정 [2]의 용액 (i) 내의 염기성 아미노산 대 카제인의 중량비는 1:1에서 1:50 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:40 사이, 보다 바람직하게는 사용되는 염기성 아미노산이 리신의 경우에는 대략 1:12 또는 사용되는 염기성 아미노산이 아르기닌의 경우에는 대략 1:25로 이루어질 수 있다
BAC가 산성 수용성 BAC인 경우, 상기 BAC를 함유하는 본 발명의 공정 [2]의 단계 a)의 용액 (ii)은, 이미 언급한 바와 같이, 상기 제1염기성 아미노산과 동일하거나 상이할 수 있는 제2염기성 아미노산을 더 포함하며; 이 경우, 본 발명의 공정 [2]에서, 즉, 상기 공정의 단계 a)의 용액 (i)과 (ii)를 혼합하는 단계 이후 염기성 아미노산 대 카제인 비는 1:1에서 1:50 사이, 바람직하게는 1:5에서 1:20 사이, 보다 바람직하게는 사용되는 염기성 아미노산이 리신의 경우에는 대략 1:6 또는 사용되는 염기성 아미노산이 아르기닌의 경우에는 대략 1:9로 이루어질 수 있다.
본 발명의 공정 [1] 및 본 발명의 공정 [2] 모두 2가 금속, 3가 금속 및 이들의 조합(단계 b))으로부터 선택된 금속의 a) 수용액을 단계의 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 어떠한 이론에도 구속 받고 싶지 않지만, 2가 금속(예, 칼슘)과 같은 상기 금속은 BAC, 특히 BAC가 수용성 BAC의 경우에는 바람직하게는 산성 수용성 BAC 또는 상기 금속(예, 칼슘)과 상호작용할 수 있는 수용성 BAC, 예를 들어, 엽산, 판토텐산 또는 비타민 B나 C 군 또는 그 유도체를 안정화하는데 도움이 되는 본 발명의 로딩된 나노입자 내에서 브릿지(bridge)를 형성하도록 하는 것으로 생각되는 데; 이 경우, 상기 2가 금속(예, 칼슘)과 같은 상기 금속은 (카제인 염 형태의) 카제인과 BAC, 바람직하게는 수용성 BAC, 보다 바람직하게는 산성 수용성 BAC나 상기 금속과 상호작용 할 수 있는 수용성 BAC 사이에서 브릿지로 작용을 하여 본 발명의 로딩된 나노입자의 소수성 부분에 상기 BAC가 트랩되도록 하는 것으로 보인다.
특정 실시예에서, 상기 금속은 칼슘, 마그네슘, 아연, 2가 형태의 철 및 그 조합으로부터 선택된 2가 금속, 바람직하게는 칼슘이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 금속은 예를 들어 3가 형태의 철과 같은 3가 금속이다.
사실상 어떤 칼슘 수용액, 유리하게는 식품 등급 용액[식품 마이크로 캡슐화에 사용되는 칼슘 염비에 대한 GSFA 온라인의 "식품 첨가물 일반 기준" 참조]도 본 발명의 공정 [1] 및 [2]를 수행하기 위해 사용될 수 있지만, 특정 실시예에서, 상기 칼슘염 수용액은 염화 칼슘, 아세트산 칼슘, 글루콘산 칼슘, 락트산 칼슘, 소르브산 칼슘, 아스코르브산 칼슘, 시트르산 칼슘, 프로피온산 칼슘, 황산 칼슘, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 염화 칼슘이다. 실제로는, 탄산 칼슘이나 알긴산 칼슘은 물에 불용성이거나 매우 녹기 어려운 염이므로 권장할 만 하지 않다. 마찬가지로, 식품 등급의 마그네슘, 아연 또는 2가 혹은 3가 철의 어떠한 수용액도 본 발명의 공정 [1] 및 [2]를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
금속 대 카제인의 중량비-여기서, "금속"은 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 상기 금속을 칭함-는 광범위하게 변할 수 있지만; 특정 실시예에서, 금속 대 카제인의 중량비는 1:5 내지 1:15, 바람직하게는 1:7 내지 1:10, 보다 바람직하게는 대략 1:8.5이다. 특정 실시예에서, 상기 금속은 2가 금속이다.
본 발명의 공정[2]에 의해 본 발명의 로딩된 나노입자를 얻게 되며, 이를 위해, 단계 a)는 카제인 소스 및 제1염기성 아미노산을 함유한 수용액 (i)을 BAC를 함유한 용액 (ii)과 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 BAC의 특성은 이미 언급하였다. 특정 실시예에서, 상기 BAC는 수용성 BAC, 바람직하게는 산성 수용성 BAC, 예를 들어, 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신 또는 비타민 B3, 판토텐산 또는 비타민 B5, 티아민 모노포스페이트, 티아민 파이로포스페이트, 티아민 트리포스페이트, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산 (엽산 유도체; 폴레이트 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 폴레이트), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산, p-쿠마르산, 카페인산, 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품 등급인 유도체, 에스테르 또는 그 염, 및 그 혼합물이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 BAC는 지용성 BAC, 예를 들어, 비타민 A, D, E, K군 및 그 유도체와 같은 비타민, 인지질, 카르티노이드(예컨대, 카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아잔틴 등), 오메가-3 지방산(예컨대, DHA, EPA 등), 아미노산(예컨대, 이소-루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린), 피토스타놀 또는 피토스테롤(예컨대, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 등), 폴리페놀(예컨대, 퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캄페롤, 미리세틴, 아이소람네틴 등) 및 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 로딩된 나노입자에서 BAC 대 카세인의 중량비는 광범위하게 변할 수 있는 데; 비제한적인 예시적인 방식으로 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 BAC 대 카세인의 중량비는 1:1에서 1:200 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:80 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:15에서 1:35 사이로 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, BAC는 수용성 BAC이며, 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 (수용성) BAC 대 카세인의 중량비는 1:1에서 1:50 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:30 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:15에서 1:20 사이로 이루어질 수 있다. 다른 특정 실시예에서, BAC는 지용성 BAC이며, 본 발명의 로딩된 나노입자에서의 (지용성) BAC 대 카세인의 중량비는 1:1에서 1:200 사이, 바람직하게는 1:10에서 1:80 사이, 보다 바람직하게는 대략 1:20에서 1:35 사이로 이루어질 수 있다.
마찬가지로, (본 발명의 공정 [2]의 단계 a)에 사용되는 제2염기성 아미노산 및 산성 수용성 BAC를 함유하는 수용액 (ii)에 해당하는) 염기성 아미노산 대 BAC의 중량비는 광범위하게 변할 수 있지만; 특정 실시예에서, 상기 수용액 (ii) 내의 염기성 아미노산 대 (산성 수용성) BAC의 중량비는 1:0.1에서 1:3 사이, 바람직하게는 1:0.5에서 1:1 사이, 보다 바람직하게는 약 1:0.75로 이루어진다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 나노입자-BAC로 로딩된 것과 그렇지 않은 것 모두-온도 및 산화에 대한 안정성을 높이기 위해 그 제제에 아스코르브산(비타민 C) 등과 같은 항산화제를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 항산화제는 (해당하는 경우) BAC와 함께 또는 본 발명의 나노입자의 코팅시 같이 캡슐화될 수 있는데; 이를 위해, 본 발명의 상기 공정 [1] 및 [2]은 예를 들어, 상기 BAC 및 염기성 아미노산을 함유한 수용액에 항산화제를 첨가함으로써 나노입자 제제에 항산화제를 포함하도록 적절히 개조될 것이다.
특정 실시예에서, BAC는 엽산이고, 항산화제는 아스코르브 산이며 이는 자외선 조사, pH 변화, 열, 산소 등에 의한 분해로부터 엽산을 보호하는 작용을 하는 것으로 보이며 또한 아스코르브산의 영양 지원을 제공한다. 상기 항산화제는 BAC와 함께 캡슐화되어 본 발명의 나노입자 코팅에 도입될 수 있다.
또한, 원하는 경우, 본 발명의 공정 [1] 및 본 발명의 공정 [2]는 모두 얻어진 나노입자를 서로 다른 처리에 의해 안정화시키는 하나 이상의 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 안정화 처리는 형성된 본 발명의 나노입자-BAC로 로딩된 것과 그렇지 않은 것 모두-를 함유하는 현탁액을 고압 처리, 예를 들어 100에서 800 MPa 사이, 통상적으로 350에서 600 MPa 사이의 압력에서 처리하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 처리는 3 내지 5분 주기로 100 MPa 내지 800 MPa의 압력, 통상적으로 350에서 600 MPa 사이 압력에서 나노입자의 현탁액을 처리하는 단계를 포함하는 데; 사실, 400 MPa 압력이 우수한 결과를 나타낸다.
다른 특정 실시예에서, 상기 안정화 처리는 형성된 본 발명의 나노입자-BAC로 로딩된 것과 그렇지 않은 것 모두-를 함유하는 현탁액을 예를 들어 2 내지 5초 동안 130℃ 와 140℃ 사이의 온도로 초고온(ultra high temperature, UHT) 처리한 후 급냉하는 단계를 포함한다.
또한, 원하는 경우, 본 발명의 공정 [1] 및 본 발명의 공정 [2]는 모두 본 발명의 나노입자-BAC로 로딩된 것과 그렇지 않은 것 모두-를 분말 형태로 얻기 위해 형성된 나노입자를 함유하는 현탁액을 건조하는 건조단계를 포함할 수 있다. 상기 나노입자의 이러한 제공 형태는 안정성에 기여하며 화장품 및/또는 약품에서뿐만 아니라 밀가루, 빵, 페이스트리 제품, 시리얼, 분유, 등과 같은 고체 식품에서의 최종적인 응용에 특히 더 유용하다.
사실상 나노입자를 함유한 현탁액을 건조하기에 적합한 어떠한 통상적인 기술이나 방법도 이러한 건조 단계를 실시하기 위해 사용될 수 있지만; 특정 실시예에서, 나노입자를 함유한 현탁액의 건조는 스프레이 건조나 동결건조에 의해 실시된다. 일반적으로 이러한 처리는 상기 나노입자의 적절한 보호제, 예를 들어, 락토스, 트레할로스, 마니톨, 수크로스, 말토덱스트린, 글루코스, 소비톨, 말토스 등과 같은 당류, 및 그 혼합물을 나노입자의 현탁액에 첨가함으로써 실시된다. 상기 보호제는 건조 과정에서 산화뿐만 아니라 열적 분해로부터 본 발명의 나노입자를 보호한다.
카제인 대 당류의 중량비는 광범위하게 변할 수 있지만; 특정 실시예에서, 카제인 대 당류의 중량비는 1:1에서 1:4 사이, 바람직하게는 약 1:2로 이루어진다.
또한, 특정 실시예에서, 당류를 함유한 용액은 아스코르브산(비타민 C) 등과 같은 항산화제를 더 포함할 수 있으며; 이 경우, 카제인 대 당류 대 항산화제(예를 들어, 비타민 C)의 중량비는 1:0.75 내지 2.5:0.01 내지 1.5, 바람직하게는 1:2.0:0.10일 수 있다.
본 발명의 공정 [1]에 따라 얻어진 본 발명의 나노입자, 즉, 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산 및 2가 금속, 3가 금속과 그 조합으로부터 선택된 금속을 포함하고 a) 카제인 소스 및 염기성 아미노산을 함유한 수용액을 제조하는 단계; 및 b) 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 금속의 수용액을 단계 a)의 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 나노입자는 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다.
또한, 본 발명의 공정 [2]에 따라 얻어진 본 발명의 로딩된 나노입자, 즉, 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산 및 2가 금속, 3가 금속과 그 조합으로부터 선택된 금속 및 BAC를 포함하며, a) 카제인 소스 및 제1염기성 아미노산을 함유한 수용액 (i)을 BAC를 함유한 용액 (ii)과 혼합하는 단계; 및 b) 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택된 금속의 수용액을 단계 a) 결과 얻어진 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 나노입자는 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다
응용
본 발명의 나노입자는 기술적 첨가제, 예를 들어, 지방 대체물질 등으로 사용될 수 있다. 또한 나노입자는 BAC, 예를 들어, 수용성 BAC나 지용성 BAC를 캡슐화하는 능력을 갖는다.
특정 실시예에서, (합성 고분자와 관련된 독성을 방지하는) 천연 고분자가 아니며 식품 등급이 아닌 다른 성분들은 그 제조 및 최종 산물(나노입자)에 사용되지 않으므로 본 발명의 나노입자는 BAC, 바람직하게는 수용성 BAC, 보다 바람직하게는 산성 수용성 BAC의 캡슐화 및 약학용, 화장품용 및 식품용 조성물에 포함되도록 할 수 있다. 상기 나노입자는 BAC를 외적 요인(빛, pH 변화, 산화 등)에 의한 분해로부터 보호한다.
유리하게, 본 발명의 나노입자는 관능적 특성(미각에 대한 조직)의 변화를 방지하기 위해 1 ㎛ 미만, 바람직하게는 50에서 200 nm 사이, 보다 바람직하게는 약 140 nm의 평균 크기를 갖는다.
또한, 본 발명의 나노입자는 장에서의 BAC 생체 이용률을 향상하여 상기 BAC를 위의 펩신산 조건으로부터 보호하고 장에서의 용해 및 배출을 용이하게 한다.
본 발명의 나노입자는 수용성 매질에 다시 현탁시켜 BAC를 용해시 분해로부터 보호할 수 있다. 나노입자는 또한 건조 분말 형태로 제공되어 BAC를 안정한 조건으로 유지할 수 있으며 장기간 저장할 수 있다(특히, 고체 식품 제제에 포함시키기 위해).
또한, 본 발명의 나노입자는 국소용 화장 및 약학 조성물을 제조하기에 적합하다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 조성물과 관련되는 데, 이하, "본 발명의 조성물"은 적어도 하나의 본 발명의 나노입자를 포함하며; 특정 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산 및 2가 금속, 3가 금속과 그 조합으로부터 선택된 금속을 포함하는 나노입자이고; 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 본 발명의 로딩된 나노입자로서, 즉, 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산 및 2가 금속, 3가 금속과 그 조합으로부터 선택된 금속, 및 영양상, 치료상 및/또는 미용상 활성을 갖는 BAC, 그리고 약학적으로 또는 화장품으로 허용된 운반체 또는 식품에 적합한 운반체를 포함하는 나노입자이다.
특정 실시예에서, 상기 BAC는 아미노산, 항균제, 방향제, 보존제, 감미료, 스테로이드, 약물, 호르몬, 지질, 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 단백질, 프로테오글리칸, 향료, 비타민, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 실시예에서, 상기 BAC는 수용성 BAC, 바람직하게는 산성 수용성 BAC이다. 수용성 BAC의 비제한적인 예시적 일례는 비타민 B군이나 C 군 및 그 유도체와 같은 비타민, 그 염이나 에스테르; 히알루론산, 콘드로친 설페이트, 티옥산, 그 염 및 에스테르 등을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 수용성 BAC는 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신, 판토텐산, 티아민 모노포스페이트, 티아민 파이로포스페이트, 티아민 트리포스페이트, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산 (엽산 유도체; 폴레이트 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 폴레이트), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산, p-쿠마르산, 카페인산, 약학적으로 또는 화장품으로 허용되거나 식품 등급인 유도체, 에스테르 또는 그 염, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 특정 실시예에서, 상기 BAC는 지용성 BAC이다. 지용성 BAC의 비제한적인 예시적 일례는 비타민 A, D, E, K군 및 그 유도체와 같은 비타민, 인지질, 카르티노이드(카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아잔틴 등), 오메가-3 지방산(예컨대, DHA, EPA 등), 아미노산(예컨대, 이소-루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린), 피토스타놀 및 피토스테롤(예컨대, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 등), 폴리페놀(예컨대, 퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캄페롤, 미리세틴, 아이소람네틴 등) 및 그 유도체를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 국소 경로에 의해 투여하기에 적합한 약학 조성물이며; 이를 위해, 상기 조성물은 예를 들어, 겔, 연고, 크림 등의 형태로 국소 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적으로 허용된 운반체를 포함한다. 약학조성물의 제조뿐만 아니라 국소 경로에 의한 투여를 위한 상기 약학 조성물 제제에 적합한 부형제에 관한 정보는 C. Fauli i Trillo의 책 "Tratado de Farmacia Galenica", 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones에서 알 수 있다. 투여될 본 발명의 나노입자의 투여량은 광범위하게 변동될 수 있는 데, 예를 들어, 0.1%에서 30% 사이, 바람직하게는 0.5%에서 5% 사이의 본 발명의 나노입자를 함유하는 본 발명의 조성물의 약 0.5(치료할 면적의 g/cm2) 및 약 2(치료할 면적의 g/cm2) 사이에서 변동될 수 있다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 국소 경로에 의해 투여하기에 적합한 화장품용 조성물이며; 이를 위해, 상기 조성물은 예를 들어, 겔, 크림, 샴푸, 로션 등의 형태로 국소 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 화장품으로 허용된 운반체를 포함한다. 약학 조성물의 제조뿐만 아니라 국소 경로에 의한 투여를 위한 상기 화장품 조성물 제제에 적합한 부형제에 관한 정보는 Octavio Diez Sales의 책 Manual de Cosmetologia", 1st Edition, 1998, Editorial Videocinco, S.A.에서 알 수 있다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 고체, 액체 또는 반고체 식품 제제와 같은 식품 조성물이다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 다음을 포함한다:
10에서 50 중량% 사이의 카제인;
0.9에서 2.5 중량% 사이의 엽산;
1에서 6 중량% 사이의 칼슘; 및
1에서 7 중량% 사이의 염기성 아미노산; 및
30에서 80 중량% 사이의 당류,
여기서, 모든 비율은 조성물의 전체 중량에 대한 중량비이다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 다음을 포함한다:
10에서 50 중량% 사이의 카제인;
0.9에서 2.5 중량% 사이의 엽산;
1에서 6 중량% 사이의 칼슘; 및
1에서 7 중량% 사이의 염기성 아미노산;
20에서 55 중량% 사이의 당류; 및
1에서 25 중량% 사이의 아스코르브 산,
여기서, 모든 비율은 조성물의 전체 중량에 대한 중량비이다.
대안적으로, 본 발명의 조성물은 식품에 포함될 수 있으며; 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 식품에 관한 것이다. 상기 식품은 액체, 반 고체 또는 고체 형태로 발견될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 나노입자가 전체적으로 혹은 부분적으로 용해되는 것을 방지하거나 최소화하여 안정성에 기여하기 위하여, 상기 식품은 산성 pH, 즉, 7 미만, 바람직하게는 6 이하, 보다 바람직하게는 5 이하이다. 본 발명의 조성물로 강화될 수 있는 예시적인 식품은 우유 및 그 유도체(요거트, 치즈, 커드(curd), 등), 쥬스, 잼, 베이커리 및 페스트리 제품, 발효육, 소스 등을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 사료 형태로 동물 제품에 포함될 수 있다.
실시예
아래의 실시예는 내부에 생물학적 활성 화합물, 구체적으로 엽산을 포함할 수 있는 카제인 입자의 제조에 관해 기술한다. 나노입자들은 앞서 언급한 여러 인자들로 인해 식품 내에서 겪을 수 있는 분해로부터 화합물을 보호할 수 있다. 상기 실시예는 또한 섭취 후에 엽산을 위 조건으로부터 보호하고 장 매질로 배출하기 위한 나노입자의 능력을 나타내었다.
빈( empty ) 카제인 나노입자를 제조하기 위한 일반 공정
카제인 나노입자를 제조하기 위한 공정은 정해진 양의 염기성 아미노산과 함께 수용성 매질에 카제인 나트륨염(ANVISA, Mardid, 스페인)를 용해한 후에 정해진 양의 칼슘 용액을 자기적 교반과 연속적인 흐름 하에서 첨가하는 단계를 포함으로써 우유같은 현탁액 모습의 나노입자를 형성한다.
나노입자의 물리화학적 특성
나노입자의 완전한 물리화학적 특성을 달성하는 데 필요한 서로 다른 연구가 이하에서 기술된다.
나노입자의 크기 및 표면 전하는 물리화학적 실험으로부터 정해졌는 데, 후자는 제타 전위의 측정을 통해 정해졌다. 첫번째 파라미터는 Zetasizer nano Z-S(Malvern Instruments/ Optilas, 스페인)를 이용한 광자산광분광법(photon correlation spectroscopy)으로 얻었고, 반면에 제타 전위는 Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, New York, 미국)를 이용하여 측정하였다.
나노입자 형성 공정의 수율은 제제를 원심분리(17,000 x g, 20분)하여 얻어진 상등액에서 수집된, 나노입자 획득 후 남아있는 자유 카제인의 정량화를 통해 산출하였다. 이렇게 하여, 제제 내에 입자를 형성하는 카제인의 양은 초기 첨가량과 정제 과정에서 수집된 상등액에서 정량화된 양 사이의 차이로서 추정하였다. 상기 정량화는 282 nm에서 자외선 분광법(Agilent 8453, UV-visible spectroscopy system)에 의해 실시하였다. 수율은 다음과 같이 추정되었다:
[수학식 1]
수율(%) = [(전체 카제인염(mg)- 상등액 내의 카제인염(mg))/전체 카제인염(mg)] x 100
다른 계산을 하기 위하여, 150과 1,500 μg/mL 사이의 보정 곡선(R2 = 0.9992; LD = 36 μg/mL; LQ = 119 μg/mL)이 사용되었다.
또한, 원심분리 후 얻어진 펠릿을 정량화하기 위한 연구를 수행하여 전체 카제인염 및 상등액에 함유된 카제인 염 간의 차이로 얻어진 결과를 확인하였다. 이 경우, 0.05 M NaOH를 사용하여 입자를 파쇄하였으며, 이는 보정 곡선을 만들기 위해 사용된 것과 동일한 매질이다. 따라서, 이 경우 수율은 다음과 같이 추정되었다:
[수학식 2]
수율(%) = [(펠릿 내의 카제인염(mg)/전체 카제인염(mg)] x 100
상기 매질에서 제조된 카제인 염에 대한 최대 흡수율은 300 nm로 밝혀졌다. 또한, 보정선을 그리기 위해 사용된 농도는 150과 1,500 μg/mL 사이의 범위였다(R2 = 0.9996; LD = 26 μg/mL; LQ = 85 μg/mL).
나노입자의 형태는 주사전자현미경(Zeiss, DSM 940A 독일)으로 관찰하였다. 이를 위해, 동결건조된 나노입자를 9 nm의 금 분자막으로 코팅하였고(Emitech K550 Team, Sputter-Coater, 영국), Zeiss DMS 940 A 현미경(미국)으로 사진을 촬영하였다.
엽산을 함유한 카제인 나노입자를 제조하기 위한 일반 공정
엽산을 함유한 카제인 나노입자를 제조하기 위한 공정은 정해진 양의 염기성 아미노산과 함께 수용성 매질에 카제인 나트륨염을 용해한 후에 자기적 교반 하에서 정해진 양의 미리 준비된 엽산 용액을 정해진 양의 염기성 아미노산과 함께 수용성 매질에 첨가하는 단계를 포함한다. 몇 분간 혼합물을 배양한 후 마지막 단계인 칼슘 염을 첨가함으로써, 우유 같은 누르스름한 현탁액 모습의 나노입자를 형성한다.
선택적으로, 안정화를 위해 100에서 800 MPa 사이에서 1 내지 5분간의 주기로 형성된 나노입자에 대해 고압의 정수압처리를 실시한다(Stansted Fluid Power, ISOLAB Model FPG11500B110; Series No.: 7844).
그런 다음, 교반에 의한 3분간의 균질화 이후, 정해진 양의 당류 용액(락토스, 트레할로스, 마니톨, 글루코스, 소비톨, 말토덱스트린 또는 말토스)을 교반을 멈추지 않은 상태에서 첨가한다. 마지막으로, 현탁액을 동결건조하거나 다음 조건 하에서 스프레이 건조기(Buchi Mini Spray Drier B-191, Buchi Labortechnik AG, 스위스)에서 분사한다:
- 공기 유입 온도: 60 내지 100℃
- 공기 유출 온도: 30 내지 90℃
- 공기압: 2 내지 10 bars [2 내지 10 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 2 내지 9 mL/min
- 흡인(aspiration): 30 내지 100%
- 공기 유량: 200 내지 900 L/h
선택적으로, 제제는 스프레이 건조 대신에 동결건조에 의해 당류를 첨가한 후 건조될 수 있다.
카제인 입자와 결합된 엽산 양의 결정
나노입자와 결합된 엽산 양은 페이(Faye)에 의해 기술된 공정에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량화하였다[Faye Russell, L., Quantitative Determination of Water-Soluble Vitamins. In Food Analysis by HPLC, Nollet, L.M.L. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, Second Edition, Chapter 10 (2000) pp. 444-445]. 분석은 다이오드-어레이 자외선 검출 시스템에 결합된 모델 1100 LC 계열의 크로마토그래피(Agilent, Waldbornn, 독일) 기종에서 실시되었다. 데이터는 Chem-Station G2171 소프트웨어에 의해 Hewlett-Packard 컴퓨터에서 분석되었다. 엽산의 분리를 위해, 40℃로 가열된 Alltech C18 AlltimaTM 컬럼 (5μm, 150 mm x 2.1 mm)이 호환 가능한 Gemini® C18 AJO-7596 컬럼과 함께 사용되었다. 이동상은 구배(표 1)를 가진 H3PO4 (33 mM, pH 2.3)/아세토니트릴의 혼합물로 이루어지며, 0.25 mL/min 유량으로 펌핑되었다. 검출은 290 nm에서 실시되었다. 샘플 주입량은 10μL였다. 엽산 체류시간은 22.6 ± 0.5분이다.
이동상에 대한 구배 조건(A: H3PO4 33 mM, B: 아세토니트릴)
시간(분) A (%) B (%)
0 95.0 5.0
8 95.0 5.0
33 82.5 17.5
45 95.0 5.0
샘플의 정량화에 앞서, 2에서 400μg/mL 사이의 서로 다른 농도 보정선을 준비하여 용액 내의 카제인 및/또는 아미노산의 존재는 엽산의 정확한 정량화에 지장이 되지 않을 것이라는 확신과 함께 95%가 넘는 정밀하고 정확한 결과를 얻었다.
(건조 전) 신규 샘플 분석을 위해, 정해진 부피의 제제를 여과한 후 얻어진 상등액을 Vivaspin® 300,000 MWCO 투석관(VIVASPIN 2, Sartorius stedim Biotech, 독일)을 통해 정량화하였다. 한편 펠릿을 0.05 M NaOH에 용해하여 입자를 파쇄하고 용액 내의 카제인과 엽산과 아미노산을 유지하여 그 정령화를 진행하였다. 양 분획물(상등액 및 펠릿)에서 발견된 엽산 함량의 합은 최초 첨가된 총량과 항상 일치하였다. 또한, 1 mL의 제제를 1 mL의 0.05M NaOH에 용해함으로써 총 엽산량을 정량화할 수도 있다. 본 연구에 의해 첨가된 엽산의 양과 상기 크로마토그래피법을 통해 정량화하여 얻어진 엽산의 양간의 차이는 모든 경우에 있어서 10%를 초과한다는 것을 확인하였다.
또한, 분말 샘플의 정량화를 위해 10 mg의 나노입자를 취했으며; 2 mL의 물에 다시 현탁하고, 원심분리한 후 신규 샘플과 동일한 방식으로 진행하였다.
인공 위장 매질 내 나노입자로부터의 엽산 배출에 관한 배출 동태학 연구
37±1℃에서 2 mL의 인공 위 매질에 약 10 mg의 나노입자들을 분산시켜(0~2 시간)(USP XXIII) 나노입자로부터의 엽산 배출에 관한 배출 동태학을 결정했다. 정해진 시간에 나노입자 현탁액들을 원심분리하고(17,000 x g, 20분) 상등액 내 엽산의 양을 전술한 HPLC 방법에 의해 측량했다. 위 매질로부터 상등액을 제거한 후, 37±1℃에서 인공 장 매질을 첨가하고(2~24시간) (USP XXIII), 이어서 위 경우와 동일한 방법으로 진행하였다.
모든 경우 배출된 엽산의 백분율은 각 연구에 선택된 제제 내에 존재하는 비타민의 총 함량을 고려하여 계산하였다.
약물동태학 연구. 카제인 나노입자 내에 캡슐화된 엽산의 생체이용률
실험 동물에 관한 유럽 법규(86/609/EU)뿐만 아니라, 제도적 윤리 위원회(Institution Ethics Committee)의 규정에 따라 약물동태학 연구를 수행했다. 이를 위해, 평균 중량 200 g의 수컷 위스타 쥐(Wistar rat) 25 마리를 정상적인 낮-밤(12시간-12시간) 조건 하에 두었으며, 연구 수행 전주 동안 엽산-결핍 먹이(Folic Acid Deficient Diet. TD. 95247. Harlan, 미국)와 물을 자유롭게 먹게 했다. 제제를 투여하기 12시간 전에, 쥐들을 대사 케이지(metabolic cage) 내에 격리하여 먹이는 주지 않고 물은 자유롭게 먹게 했다.
동물들은 5 개의 처리군(각 군당 5 마리)으로 나누었다. 제1 군에는 PBS(인산염 버퍼 pH 7.4)를 1 mL만 경구투여했다. 이어지는 세 군에는 임의의 하기 제제에 포함된 엽산을 1 mg/kg(200 μg/rat)만 경구투여했다: (i) 자유 엽산(비캡슐화)(Aditio, Panreac Quimica, Barcelona, 스페인); (ii) 캡슐화된 엽산을 함유하는 카제인 나노입자; (iii) 캡슐화된 엽산을 함유하는 고압처리된 카제인 나노입자. 물에 분산된 서로 다른 각 제제들 1 mL를 위-식도 캐뉼라(gastro-esophageal cannula)를 통해 투여했다. 마지막으로, 식염수 혈청(saline serum)(0.5 mL)에 용해된 동일한 양의 자유 엽산(1 mg/kg)을 제5 군에 정맥 내 투여를 통해 복재정맥으로 투여했다.
각 쥐의 기초 비타민 레벨을 확인하기 위해 제제 투여 전에 꼬리의 복재정맥으로부터 혈액을 채취했다. 투여 후, 혈청 분리관(SARSTEDT Microtube 1.1 mL Z-Gel)을 이용하여 서로 다른 시간에 약 500 μL 부피의 혈액을 채취했다. 모든 경우에, 쥐들이 통증을 느끼지 못하도록 흡입 마취(아이소플루레인:산소)를 이용하여 동물을 수면 상태로 만든 후 혈액을 채취했고, 항상 수면 상태를 확인했다.
그 후, 동물의 체온에 맞게 이전에 가열된 500 μL의 생리 식염수 혈청(physiological saline serum)을 복막 내 투여하여 혈액량을 교체했다 이 기간 동안 동물들의 상태(유동성, 공격성, 알러지 반응 및 온도)를 검사했으나, 주목할 만한 변화는 관찰되지 않았다.
혈청 샘플의 엽산에 관한 사전처리 및 정량화
혈액을 담은 관을 원심분리(6,000 rpm, 20 분, 20℃)하여 얻어진 혈청 샘플 내 엽산의 정량화를 효소면역기법(enzymatic immunoassay technique)에 의해 실시하였다. 이를 위해, 식품 내 엽산의 정량용으로 FDA의 승인을 받은 Elisa Kit(Diagnostic automation, INC. Calabasas, California, 미국)를 사용했다. 혈청 샘플을 사전 처리 없이 제조자의 지시에 따라 정량화하였다.
본 키트는 식품용으로 설계되었기 때문에, 혈청 샘플 내의 비타민에 관한 정량화 능력을 확인하기 위해 일련의 사전 연구들을 수행하였다. 이러한 연구들은 본 키트에 의해 얻어진 결과와, 이전 섹션에서 기재한 고성능 액체 크로마토그래피 방법에 의해 얻어진 결과를 철저하게 비교하는 것으로 구성하였으며, 이하의 사전 준비 공정을 포함한다: 1% (w/v) 아스코르브산 나트륨 내에서 제조된 사붕산 나트륨(sodium tetraborate) 용액 50 mM에 용해된 다양한 양(0 내지 300 μL)의 엽산을 50 μL의 혈청에 첨가했다. 결과 용액을 50 mM의 사붕산 나트륨 용액과 함께 350 μL(혈청 희석 1:7)의 최종 부피로 옮겼다. 각 혼합물을 30분간 끓인 후, 2℃로 냉각하여 그 온도에서 밤새 보존하였다.
결과 샘플을 20,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 20 μm 필터를 통해 여과한 후, 전술한 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 이용하여 엽산 함량을 정량화하였다. 이 경우, 비타민의 낮은 혈청 농도로 인해, 정량화 에러를 최소화하고 매트릭스 간섭을 제거하기 위해 표준 첨가 기법(standard addition technique)을 사용했다.
연구된 모든 경우에서, 두 가지 방법의 혈청 엽산 농도 차이는 10% 미만이었다. 따라서, 전체 샘플의 정량화 하기 위해 효소면역기법을 선택했는데, 이는, 효소면역기법의 경우, 더 적은 양의 혈청으로 분석을 할 수 있으며, 더욱 단순하고 빠른 방법이면서, 크로마토그래피 방법보다 검출 한계(2 ng/mL)가 훨씬 작기 때문이다.
지용성 활성 물질( 퀘르세틴 )을 포함하는 카제인 나노입자를 생산하기 위한 일반 공정
퀘르세틴(quercetin)을 포함하는 카제인 나노입자를 생산하기 위한 공정은, 소정 양의 염기성 아미노산과 함께 수성 매질 내에 카제인 나트륨을 용해시키는 단계, 이어서 자기적 교반 하에 소정 부피의 아스코르브산 용액과, 이어서 에탄올 내에 미리 용해시킨 퀘르세틴을 첨가하는 단계를 포함한다. 이 혼합물을 몇 분간 배양한 후, 마지막 단계는 칼슘염을 첨가하여 우유처럼 누르스름한 현탁액의 모습을 한 나노입자의 형성이 일어나도록 하는 단계로 구성된다.
선택적으로, 형성된 나노입자를 안정화시키기 위해, 100 내지 800 MPa에서 1 내지 5분의 주기로 고압의 정수압 처리(Stansted Fluid Power, ISOLAB Model FPG11500B110; Series No.: 7844)를 할 수 있다.
그리고, 3분간 교반을 통해 균질화한 후, 교반을 계속하면서 소정 부피의 당 용액(락토오스, 트레할로스, 마니톨, 글루코오스, 소르비톨, 말토덱스트린 또는 말토오스)을 첨가한다. 마지막으로, 현탁액을 동결건조하거나, 스프레이 건조기(Buchi Mini Spray Drier B-191, Buchi Labortechnik AG, Switzerland) 내에서 하기 조건으로 분사한다:
- 공기 유입 온도: 60 내지 100℃
- 공기 유출 온도: 30 내지 90℃
- 공기압: 2 내지 10 bars [2-10 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 2 내지 9 mL/min
- 흡인(aspiration): 30 내지 100%
- 공기 유량: 200 내지 900 L/h
선택적으로, 당류를 첨가 후, 스프레이 건조 대신 동결 건조에 의해 제제를 건조할 수도 있다.
카제인 입자들과 결합된 퀘르세틴의 양 결정
Lacopini가 설명한 공정(Lacopini et al., J Food Comp Anal 2008;21:589-598)를 따르되, 일부 변형하여, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 나노입자들과 결합된 퀘르세틴의 양을 정량화했다. 다이오드-어레이 자외선 검출 시스템과 결합된 모델 1100 LC 시리즈 크로마토그래프(Agilent, Waldbornn, 독일)에서 분석을 수행했다. Hewlett-Packard 컴퓨터에서 Chem-Station G2171 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석했다. 엽산 분리를 위해, 호환성 Gemini® C18 AJO-7596 컬럼 및 0.25 mL/min의 흐름으로 펌핑된 이동상으로서 구배(표 2 참조)를 가진 물/메탄올/빙초산 혼합물과 함께, 40℃로 가열된 Alltech C18 AlltimaTM 컬럼(5 ㎛, 150 mm x 2.1 mm)을 사용하였다. 상기 검출은 260 nm에서 시행되었고, 샘플 주입 부피는 10 μL이며, 퀘르세틴 유지 시간은 24.2 ± 0.2 분이었다.
이동상의 구배 조건 (A: 물, B: 메탄올, C: 빙초산)
시간(분) A (%) B (%) C (%)
0 80 15 5
15 70 25 5
20 10 85 5
30 10 85 5
35 80 15 5
40 80 15 5
샘플을 정량화하기 전에, 수성알코올성(hydroalcoholic) 매질(75% 에탄올) 내에 1 내지 100 ㎍/mL의 서로 다른 농도 보정선들을 준비함으로써, 95% 이상의 정밀하고 정확한 결과를 얻었다.
신규 샘플 분석을 위해(건조 전에), 여과(17000 rpm, 20 min)에 의한 나노입자의 정제 공정 후에 얻어진 상등액을, 50% (w/v) 에탄올 함량을 가지는 수성알코올성 용액을 얻을 때까지 희석했다.
마지막으로, 나노입자들과 결합된 퀘르세틴의 양[캡슐화 효율(E.E.)]은, 하기 식에 따라, 최초 추가된 퀘르세틴(Q)의 양과 상등액 중 정량화된 퀘르세틴의 양 사이의 차이 값으로서 계산되었다:
Figure 112012078142740-pct00001
실시예 1
빈 카제인 나노입자의 제조 및 분류. 획득 공정의 수율. 사용된 아미노산의 유형이 나노입자의 안정성 및 물리화학적 특성에 미치는 영향
75 mL의 물에 카제인 나트륨 1 g과 리신 90 mg을 함께 녹였다. 그 후, 자기적 교반과 연속 유동을 가하면서 이 용액에 40 mL의 0.8% CaCl2를 첨가했다. 이 공정을 세 차례 수행했다.
도 2(A 및 B)는 이 방법에 의해 얻어진 카제인 입자들에 대한 투과전자현미경 사진을 나타낸다.
또한, 아미노산의 유형이 입자들의 물리화학적 특성에 미치는 영향을 이해하기 위해, 아미노산 없이, 또는 리신 대신 50 mg의 아르기닌을 사용하여 동일한 연구를 수행하였다.
표 3은 결과적으로 얻어진 나노입자들의 주요 물리화학적 파라미터들을 요약한 것이다.
카제인 나노입자들의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n=10). 아미노산, 리신 또는 아르기닌과 단백질 간의 중량비는 각각 1:11 및 1:20
제제 크기(nm) PDIa 제타 전위(mV) 수율b(%)
카제인 NP
(아미노산 없음)		 154 ± 30 0.24 ± 0.04 - 17.6 ± 0.3 ---
카제인 NP
(리신)		 138 ± 13 0.19 ± 0.02 - 14.0 ± 0.5 95 ± 3
카제인 NP
(아르기닌)		 157 ± 19 0.21 ± 0.03 - 17.5 ± 0.6 97 ± 1
a PDI: 다분산(polydispersion);
b 수율: 나노입자로 변형된 단백질의 백분율.
수행된 통계학적 연구(비모수 독립 샘플 테스트: Kruskal-Wallis)는, 제제들의 물리화학적 파라미터들 사이에 차이가 있다는 것을 단언할 통계학적으로 주목할 만한 증거는 없다는 것을 보여주었다. 따라서, 아미노산의 유형은 빈 나노입자들의 상기 특성들에 대해 간섭하지 않는 것으로 결론 내릴 수 있다.
제제에 첨가된 아미노산의 비율을 변화시키면서 이러한 동일한 연구를 수행하여, 유사한 결론, 즉 아미노산의 비율과 유형은 빈 입자들의 최종 특성에 대해 간섭하지 않는다는 결론에 도달하였다.
제제들의 안정성을 이해하기 위해, 시간에 따른 세 가지 유형의 나노입자들의 물리화학적 파라미터들을 측정하였다. 얻어진 결과는 표 4에 포함되어 있다.
시간에 따른 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n=6). 아미노산, 리신 또는 아르기닌과 단백질 간의 중량비는 각각 1:11 및 1:20
시간
(시)		 카제인 NP
(아미노산 없음)		 카제인 NP
(리신)		 카제인 NP
(아르기닌)
크기 PDI 크기 PDI 크기 PDI
0 165 ± 40 0.25 ± 0.05 138 ± 13 0.19 ± 0.02 157 ± 21 0.21 ± 0.04
2 323 ± 64 0.45 ± 0.15 155 ± 11 0.14 ± 0.02 176 ± 12 0.16 ± 0.04
16 317 ± 6 0.40 ± 0.03 157 ± 5 0.18 ± 0.03 175 ± 2 0.14 ± 0.02
24 231 ± 5 0.36 ± 0.03 155 ± 5 0.13 ± 0.02 183 ± 4 0.25 ± 0.02
30 295 ± 60 0.73 ± 0.06 157 ± 3 0.13 ± 0.02 195 ± 4 0.32 ± 0.03
48 255 ± 20 0.79 ± 0.02 157 ± 4 0.16 ± 0.01 205 ± 3 0.33 ± 0.04
PDI: 다분산(polydispersion).
결과를 얻을 때, 세 유형의 나노입자들은 동일한 정도의 크기와 비교적 낮은 다분산을 가졌다(PDI 값이 0.3 미만이면 입자 크기 분포가 균일하다는 것 고려). 이러한 크기와 분산 값들은 아미노산을 함유하여 제조된 나노입자의 경우에 대한 전체 연구에 걸쳐 주목할 만한 변화를 보여주지 않는다. 그러나, 그로부터 두 시간 후에, 아미노산 없이 제조된 나노입자들은 평균 크기와 다분산이 모두 뚜렷하게 증가하여(다분산 값이 0.3을 초과하는 경우, 입자 크기 값은 대표적이지 않으며, 단지 직경이 매우 불균질하다는 가이드라인일 뿐임), 연구 종료 후에는 매우 높은 다분산 값에 도달하였다. 상기 증가는 입자들 사이의 응집(aggregation) 현상이 존재함을 나타낸다. 이러한 현상은 거시 스케일에서도 확인되었는데, 세 가지 제제들을 시간에 따라 관찰했을 때, 아미노산 침전이 없는 나노입자들은 젖빛 층의 형성을 초래하는 반면, 아미노산을 함유하여 제조된 나노입자들은 균일한 현탁액을 형성한다는 것이 확인되었다. 이러한 결과들을 고려할 때, 오랜 시간 동안 안정한 입자를 얻기 위해서는 아미노산의 존재가 필요한 것으로 생각된다.
또한, 세 가지 유형의 제제들을 다시 제조하고 스프레이 건조 기법으로 건조한 후의 물리화학적 특성들을 조사하였다. 공정 조건은 하기와 같다:
- 공기 유입 온도: 90℃
- 공기 유출 온도: 49℃
- 공기압: 6 bar [6 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 4.5 mL/min
- 흡인: 100%
- 공기 유량: 600 L/h
본 연구는 나노입자 획득 당시에 나노입자를 건조한 경우, 그 순간에는 어떤 제제도 응집 현상을 일으키지 않기 때문에, 그 경우에 있어 아미노산의 영향을 이해하기 위한 목적으로 수행하였다. 얻어진 결과들은 표 5에 포함되어 있다.
스프레이 건조에 의해 건조된 카제인 나노입자들의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n=3). 아미노산, 리신 또는 아르기닌과 단백질 간의 중량비는 각각 1:11 및 1:20
제제 크기(nm) PDIa 제타 전위(mV)
카제인 NP
(아미노산 없음)		 305 ± 56 0.45 ± 0.02 -9.8 ± 0.2
카제인 NP
(리신)		 170 ± 7 0.25 ± 0.02 -11.9 ± 0.9
카제인 NP
(아르기닌)		 184 ± 2 0.25 ± 0.01 -9.4 ± 0.2
분말로 건조된 아미노산을 함유한 나노입자들을 수성 매질 내에 재현탁한 직후, 크기 분포가 단분산을 계속하고, 그 크기는 스프레이 건조에 의해 건조되기 전의 동족체(homologues)보다 조금 더 큰 것으로 관찰되었다. 그러나, 아미노산 없이 제조된 나노입자들은 더 큰 크기를 가지며, 건조 중 응집 현상을 겪었음을 나타내는 다분산 값을 가진다. 따라서, 입자들이 스프레이 건조에 의해 건조된 경우에도 아미노산의 존재는 필요하다.
이를 고려할 때, 아미노산을 함유하는 나노입자는 아미노산을 함유하지 않는 나노입자와 물리화학적 특성이 다른 것으로 결론 내려졌고; 아미노산을 함유하는 나노입자는 더 약한 응집 경향을 보이므로, 따라서, 생물학적 활성 화합물의 캡슐화를 위한 제제로서 선택되었다.
실시예 2
엽산을 포함하는 카제인 나노입자의 제조 및 분류. 캡슐화 효율에 대한 리신과 엽산 함량의 영향
모두, 100 mg의 카제인 나트륨과 다양한 양의 리신(0 내지 8.5 mg)을 포함하는 서로 다른 용액들을 물 7.5 mL의 최종 부피 내에 제조하였다.
또한, 300 mg의 엽산과 400 mg의 리신을 50 mL의 물에 함께 녹였다.
그 후, 상기 카제인염 용액에 1 mL의 엽산 용액을 첨가하였다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에서 상기 혼합물에 4 mL의 0.8% CaCl2를 첨가하였다. 각 유형의 제제를 위해 이 공정을 세 차례 수행했다.
도 3은 이 방법에 의해 획득된 캡슐화된 엽산을 함유하는 카제인 입자들의 투과전자현미경 사진을 보여준다.
각 경우에 얻어진 물리화학적 특성들은 표 6에 포함되어 있다.
엽산과 다양한 양의 리신을 함유하는 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 6). 엽산과 단백질의 중량비는 1:17
중량비
리신:카제인a 		크기(nm) PDI 제타 전위(mV) 엽산 함량
μg FA/mg NP		 캡슐화 효율
0:100 159 ± 6 0.16 ± 0.04 - 7.9 ± 2.4 --- ---
1:26 139 ± 1 0.11 ± 0.05 - 17.5 ± 0.5 22.1 ± 0.9 32.2 ± 0.8
1:22 140 ± 1 0.10 ± 0.05 - 16.8 ± 0.7 22.3 ± 0.4 32.3 ± 0.4
1:12 136 ± 4 0.08 ± 0.02 - 16.4 ± 0.7 25.7 ± 3.2 37.6 ± 4.8
a 엽산 용액의 첨가 전
FA: 엽산; NP: 나노입자
수행된 통계학적 연구(비모수 독립 샘플 테스트: Kruskal-Wallis)는 표에 포함된 마지막 세 제제들(3.9; 4.5; 및 8.5 mg의 라이신 함량 함유)의 물리화학적 특성에 차이가 있다고 생각할 통계학적으로 주목할 만한 증거는 없다는 것을 보여주고 있다. 첫 번째 경우에, 비록 엽산 용액이 리신을 포함하지만, 초기 카제인염 용액 내에 아미노산이 존재하지 않음으로써 엽산이 칼슘과 함께 부분적으로 침전하기 쉬워진다는 것이 확인되었으며, 이는 비타민 정량화에 있어 에러를 발생시키는데, 펠릿 내의 모든 엽산이 원심분리 뒤에 캡슐화되는 것은 아니기 때문이다.
추가 연구를 통해, 비타민 용액은 아미노산을 포함하지만 카제인염 용액은 아미노산을 포함하지 않는 경우, 침전 없이 제제 내에 결합될 수 있는 엽산의 최대 양은 4 mg이고, 따라서 표 6과 유사한 결과(25.5 ± 1 μg FA/mg NP 및 캡슐화 효율: 68.7 ± 0.5)가 얻어진다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 아미노산의 존재가 캡슐화된 비타민의 양에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 그러나, 아미노산 없이 제조된 나노입자들은 비교적 안정성이 떨어지고 응집 경향을 강하게 나타내기 때문에(표 1 참조), 제제는 그러한 아미노산의 존재 하에서 제조가 이루어졌다.
제제에 첨가된 엽산의 양이 입자의 물리화학적 특성에 미치는 영향을 이해하기 위해, 첨가된 엽산 용액의 양만을 변화시키고, 초기 카제인 용액 내의 아미노산의 양은 모든 경우에 8.5 mg으로 일정하게 하여 동일한 연구를 수행하였다.
도 4는 제제에 첨가된 비타민의 양의 함수로서 캡슐화된 엽산의 양 사이의 비를 나타낸다.
연구된 제제에서 발견된 크기들은 132 내지 140 nm 범위였으며, 모든 경우에 있어 다분산은 0.2 미만이었다. 본 예에 있어서, 각 제제에 첨가된 엽산의 양이 서로 다르므로 캡슐화 효율 값들은 비교할 수 없었다. 카제인:엽산의 중량비가 13.5:1인 경우 최대 값은 73.1 ± 7.5였다.
본 연구의 결과로서, 제제 내의 mg 카제인/mg 엽산 비가 감소할수록(즉, 제제에 첨가된 초기 엽산 양이 증가할수록), 나노입자들 내에 캡슐화되는 엽산의 양은 증가한다고 결론지을 수 있다. 그러나, 엽산 mg 당, 제제 내에 존재하는 카제인의 양(mg)이 경험한 값보다 낮으면, 리신이 존재하지 않을 때 발생했던 것과 같은 침전 및 불안정한 제제가 관찰되었다.
실시예 3
스프레이 건조에 의해 건조된 엽산을 포함하는 카제인 나노입자의 제조 및 분류. 최종 제제에 대한 건조 공정의 영향
카제인 나트륨 1,000 mg과 리신 90 mg을 포함하는 두 용액을 물 75 mL의 최종 부피 내에 제조하였다.
또한, 엽산 600 mg과 리신 800 mg을 100 mL의 물에 함께 녹였다.
그 후, 각 카제인염 용액에 엽산 용액 7.5 mL를 첨가하였다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에 40 mL의 0.8% CaCl2를 혼합물에 첨가하였다.
마지막으로, 제제 중 하나는 상등액 및 펠릿 내의 엽산을 정량화하기 위해 원심분리하고, 다른 하나는 스프레이 건조기를 이용하여 건조하기 전에 1,900 mg의 락토오스를 첨가했다. 공정 조건은 하기와 같다:
- 공기 유입 온도: 90℃
- 공기 유출 온도: 45℃
- 공기압: 6 bar [6 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 4.5 mL/min
- 흡인: 95%
- 공기 유량: 600 L/h
양자의 경우에 관찰된 물리화학적 특성들은 표 7에 포함되어 있다.
신규 나노입자들 또는 스프레이 건조기에 의해 건조한 후의 나노입자들에서 정량화된 엽산을 함유한 카제인 나노입자들의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 6). 최종 제제에서 리신과 단백질 간의 중량비는 1:7이며, 엽산과 카제인 간의 비는 1:22
제제 유형 크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 엽산 함량
μg FA/ mg NP		 캡슐화 효율
스프레이 건조 157 ± 5 0.17 ± 0.01 - 15.7 ± 0.3 18.6 ± 3.4 41.4 ± 7.6
신규 137 ± 3 0.08 ± 0.02 - 16.7 ± 0.7 27.6 ± 0.7 58.7 ± 1.4
FA: 엽산; NP: 나노입자
수행된 통계학적 연구(비모수 독립 샘플 테스트: Kruskal-Wallis)는, 양 제제들에서 얻어진 캡슐화 효율들 사이에 통계학적으로 주목할 만한 차이(p<0.05)가 있다는 것을 보여주었다. 이 차이는, 카제인 나노입자들의 부분적 분해를 초래하여 앞서 캡슐화된 엽산의 일부의 배출을 일으키는 표시 온도에서 스프레이 건조에 의해 제제를 건조하는 공정에 기인한 것일 수 있다.
이러한 결과들은 입자들을 가교결합시키는 방법을 적용할 필요성을 보여주는데, 그렇게 함으로써 입자들의 안정성을 향상시킬 수 있고, 제제를 원심분리하거나 건조하는 공정에서 전술한 캡슐화 효율의 감소를 방지한다.
실시예 4
고압으로 안정화되고 스프레이 건조 기법에 의해 건조된 엽산을 포함하는 리신 함유 카제인 나노입자의 제조 및 분류. 그 처리가 나노입자의 물리화학적 특성에 미치는 영향
모두, 1,000 mg의 카제인 나트륨과 90 mg의 리신을 포함하는, 서로 다른 용액들을 물 75 mL의 최종 부피 내에 제조하였다.
또한, 600 mg의 엽산과 800 mg의 리신을 100 mL의 물에 함께 녹였다.
그 후, 상기 카제인염 용액에 7.5 mL의 엽산 용액을 첨가하였다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에서 40 mL의 0.8% CaCl2 를 혼합물에 첨가하였다.
일단 입자들이 형성되면, 제제들을 밀봉된 플라스틱 백에 옮겨 고압의 정수압 처리(0 MPa; 100 MPa, 5 분; 200 MPa, 5 분; 400 MPa, 5 분; 600 MPa, 5 분, 또는 800 MPa, 5 분)를 했다.
공정이 완료되면, 물에 용해된 1,900 mg의 락토오스를 각 제제에 첨가하고 스프레이 건조 기법을 이용하여 하기 조건으로 건조시켰다:
- 공기 유입 온도: 85℃
- 공기 유출 온도: 45℃
- 공기압: 6 bar [6 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 4.5 mL/min
- 흡인: 95%
- 공기 유량: 600 L/h
표 8은 결과 나노입자들의 주요 물리화학적 특성들을 요약하고 있다.
엽산을 함유하고 서로 다른 고압 처리를 거친 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 6). 리신과 카제인 간의 최종 중량비는 1:7이고, 엽산과 카제인 간의 비는 1:22
제제 유형 크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 수율
(질량%)		 엽산 함량
μg FA/mg NP		 캡슐화 효율 μg FA/mg 제제
고압
미처리		 157 ± 5 0.17 ± 0.01 - 15.7 ± 0.3 56.4 18.6 ± 3.4 41.4 ± 7.6 12.1 ± 0.4
100 MPa
5 min		 144 ± 3 0.13 ± 0.01 -13.6 ± 0.2 54.1 25.3 ± 4.5 55.1 ± 7.6 11.5 ± 1.4
200 MPa
5 min		 139 ± 1 0.22 ± 0.02 -13.2 ± 0.5 67.6 23.2 ± 0.9 52.1 ± 2.1 11.2 ± 1.4
400 MPa
5 min		 121 ± 3 0.14 ± 0.01 -13.3 ± 0.5 68.2 25.5 ± 3.2 58.7 ± 4.8 11.9 ± 1.4
600 MPa
5 min		 111 ± 2 0.15 ± 0.01 -12.8 ± 0.4 47.7 30.8 ± 3.0 67.8 ± 5.5 11.8 ± 0.9
800 MPa
5 min		 115 ± 3 0.12 ± 0.01 - 14.2 ± 0.8 --- 31.4 ± 3.5 65.8 ± 8.1 12.1 ± 1.5
FA: 엽산; NP: 나노입자
표 8에서 관찰할 수 있는 것처럼, 제제에 적용한 처리의 유형에 관계없이, 나노입자들은 유사한 표면 전하를 가진다. 그러나, 처리에 가해진 압력이 증가할수록, 얻어진 입자 크기가 작아져 최대 감소가 7%에 달한다는 것을 데이터로부터 알 수 있다. 그러나, 가해진 압력이 증가할수록 캡슐화된 비타민의 양(따라서 캡슐화 효율)은 더욱 큰 수치에 도달하여 (800 MPa로 처리된 샘플의 경우) 미처리 제제에 비해 65%의 증가가 관찰되었다.
또한, 도 5는 고압 처리를 하지 않은 제제와 100, 400 및 800 MPa로 처리된 제제의 주사전자 현미경 사진을 보여준다. 이로부터, 고압 정수압 처리를 하지 않은 나노입자들이 입자 획득(스프레이 건조에 의한 건조, 원심분리, 고온 도달 중 현미경 검사 수행) 후 그에 가해진 서로 다른 공정들에 의해 어떻게 부분적으로 변하는지를 확인할 수 있으며, 반면에 서로 다른 고압 처리를 거친 나노입자들은 더욱 안정하다.
이러한 결과들은, 가해진 고압 정수압 처리가 나노입자들을 가교결합시켜 더욱 안정화시키며, 따라서 원심분리, 건조, 및 사진촬영 후에 분해되는 것을 방지함을 보여준다. 이러한 모든 것들은, 처리 샘플들에서 얻어지는 더욱 큰 캡슐화 효율을 설명하는데, 건조 또는 원심분리를 위한 이러한 몇몇 공정들에서 나타나는 나노입자의 부분적 분해는 엽산의 배출을 수반하고, 따라서 더욱 낮은 캡슐화 효율을 얻게 하기 때문이다.
실시예 5
고압을 이용하고, 스프레이 건조에 의해 건조된 엽산을 포함하는 아르기닌 함유 카제인 나노입자의 제조 및 분류. 사용된 아미노산이 최종 결과에 미치는 영향
3,065 mg의 카제인 나트륨과 123 mg의 아르기닌의 용액이 물 210 mL의 최종 부피에서 제조되었다.
또한, 605 mg의 엽산과 800 mg의 아르기닌을 100 mL의 물에 함께 녹였다.
그 후, 카제인염 용액에 27 mL의 엽산 용액을 첨가하였다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에서 120 mL의 0.8% CaCl2를 혼합물에 첨가하였다.
일단 입자들이 형성되면, 제제들을 밀봉된 플라스틱 백에 옮겨 400 MPa에서 5분 주기로 구성되는 고압의 정수압 처리를 했다.
공정이 완료되면, 물에 용해된 5,880 mg의 마니톨을 고압 처리된 300 mL의 제제에 첨가하고 스프레이 건조 기법을 이용하여 하기 조건으로 건조시켰다:
- 공기 유입 온도: 85℃
- 공기 유출 온도: 45℃
- 공기압: 6 bar [6 x 105 Pa]
- 샘플 펌핑 속도: 4.5 mL/min
- 흡인: 95%
- 공기 유량: 600 L/h
결과 제제의 주요 물리화학적 특성들은 표 9에 요약되어있다.
고압 처리되고 스프레이 건조에 의해 건조된 아르기닌 및 엽산 함유 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 6). 아르기닌과 단백질 간의 최종 중량비는 1:9이고, 엽산과 카제인 간의 비는 1:19
제제
유형		 크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 수율
(질량%)		 엽산 함량
μg FA/mg NP		 캡슐화 효율 μg FA/mg 제제
400 MPa
5 min		 137 ± 6 0.20 ± 0.01 -11.9 ± 0.1 --- 33.5 ± 2.2 59.8 ± 3.9 13.9 ± 0.6
FA: 엽산; NP: 나노입자
도 6은 엽산을 포함하고 400 MPa에서 5분간 처리된 그 제제 내에 아르기닌을 함유하는 카제인 나노입자의 주사전자 현미경(SEM) 사진이다.
나타난 바와 같이, 결과 제제는 아르기닌 대신 리신을 이용하여 얻어진 나노입자와 유사한 특성을 가진다.
실시예 6
인공 위장 매질 내에서의 나노입자로부터의 엽산 배출에 관한 배출 동태학 연구. 고압 처리가 배출 동태학에 미치는 영향
배출 연구를 수행하기 위해서, 실시예 4에서 기술한 분말 제제(고압 미처리, 100 MPa 및 400 MPa 처리)를 취했다.
도 7은 고압 처리를 하지 않은 샘플의 경우에 얻어진 배출 동태학을 보여준다. 도면에서, 위 매질 내에서 2 시간 배양 후, 4 %의 최대 엽산 배출 값에 도달했음을 볼 수 있다. 그러나, 장 조건에서는, 카제인 입자들이 용해되어 증가된 백분율의 비타민을 배출(본 연구의 24 시간 시점에 90%까지 도달)한다. 나아가, 이 매질에서, 배양 후 원심분리된 샘플들은 사실상 카제인 펠릿을 가지지 않는데, 이는 그 용해와 그에 따른 비타민 배출로부터 명백하다. 따라서, 설계된 제제는 엽산이 위관을 관통하는 동안 내내 캡슐화되도록 하여, 위 내 조건이 생체이용률을 감소시키는 것을 방지하는 것으로 보인다. 또한, 나노입자들은 장에서 용해되어, 비타민의 배출을 촉진하고 나노입자의 존재로 인해 발생할 수 있는 독성 문제를 제거한다.
고압으로 처리된 샘플의 경우에, 도 8(A 및 B)은 그 배출 동태학을 보여준다. 도면에서, 프로파일이 고압 처리를 하지 않은 샘플과 매우 유사하고, 인공 장 매질에서 6 시간 후의 최대 배출 퍼센트(70%)는 미처리 샘플의 동일 시간대 결과(80%)보다 조금 낮은 것을 볼 수 있다.
따라서, 가교결합을 위해 카제인 나노입자에 고압 정수압을 가하는 것은, 비록 6시간 후 비타민 배출량을 10% 줄이기는 했으나, 동일한 것으로부터의 성분 배출 프로파일을 현저하게 바꾸지는 않는다.
실시예 7
카제인 나노입자로 캡슐화된 엽산의 약물동태학
표 10은 약물동태학 연구에서 테스트된 나노입자들의 주요 약물동태학적 특성들을 요약하고 있다. 예 5에서 기술한 공정에 따라 양 유형의 나노입자들(고압 처리를 한 것과 하지 않은 것)을 얻었다.
약물동태학 연구에서 사용된 엽산 함유 카제인 나노입자들의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 6)
제제 유형 크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 엽산 함량
μg FA/ mg NP
Cas NP FA 134 ± 3 0.17 ± 0.02 -11.8 ± 0.2 24.2 ± 1.1
Cas NP FA HP 134 ± 3 0.23 ± 0.03 - 14.4 ± 2.3 29.5 ± 1.8
FA: 엽산; NP: 나노입자; Cas NP FA: 캡슐화된 엽산을 함유한 카제인 나노입자; Cas NP FA HP: 고압 처리(400 MPa, 5 min)된 캡슐화된 엽산을 함유한 카제인 나노입자.
약물동태학 연구는 세 단계로 나뉘어진다. 제1 단계는 인산염 버퍼에 용해된 엽산 1 mg/kg을 정맥 내 투여하는 것으로 구성되고; 제2 단계는 5 마리의 수컷 위스타 쥐 군(이 군의 쥐들에서 시간에 따라 기초 비타민 레벨을 연구함)으로부터의 쥐에 대해 1 mL의 인산염 버퍼를 경구 투여하는 것으로 구성된다. 마지막으로, 제3 단계는 1 mg/kg의 (i) 물에 용해된 엽산, (ii) 카제인 나노입자 내에서 캡슐화된 엽산, 및 (iii) 고압 처리된 카제인 나노입자 내에서 캡슐화된 엽산을 5마리로 구성된 쥐 군에 대해 경구 투여하는 것으로 구성된다.
투여 후, 서로 다른 시간(0, 1, 2, 3, 8 및 24 시간)에 약 500 μL 부피의 혈액을 채취하여 혈청 분리관에 모은 후, 복막 내 경로에 의해 식염수 혈청에 상당하는 부피로 동물의 혈액 부피를 회복시켰다. WiNNonlin 1.5 약물동태학 조정 프로그램(Pharsight Corporation, Mountain View, United States)의 비구획 조정 공정을 이용하여, 엽산 투입 후에 얻어진 데이터에 대한 약물동태학 분석을 수행했다.
도 9에는 (기초 레벨을 제한 후) 얻어진 결과를 모아 놓았다. 도면에서, 엽산의 정맥 내 투여(도 9A)는 첫번째 샘플 유입에서 혈청 약물 농도 피크를 보인 후 이어서 혈청 약물 레벨의 급격한 감소를 보여준다. 비타민의 경구 투여 시 얻어진 프로파일(도 9B)은 이와 달리, 농도 최고점이 현저히 더 낮고; 좀 더 오랜 시간 동안 나타나며 더욱 완만한 형태로 감소한다. 그러나, (캡슐화 없이) 자유 형태로 또는 카제인 나노입자에 캡슐화하여 (고압 처리를 수반하거나 수반하지 않고) 엽산을 경구 투여한 후 발견되는 비타민 레벨들을 비교하면, 캡슐화된 비타민이 투여되었을 때 최대 값이 더 큰 것을 제외하고는 유사한 시간들에서의 농도 프로파일이 발견된다.
본 연구의 실험 데이터에 대한 비구획 분석을 수행한 후 얻어진 약물동태학 파라미터 값들이 표 11에 포함되어 있다.
다양한 테스트 제제들의 약물동태학 파라미터(평균 ± 표준편차, n = 5)
제제 Tmax
(min)		 Cmax
(ng/mL)		 AUC (x 104)
(ng x min/mL)		 MRT
(min)		 FR
(%)
비캡슐화 FA 58.8 ± 36.0 191.3 ±
41.0		 7.8 ± 1.5 383.8 ±
47.5		 36.3 ± 7.2
Cas NP FA 70.0 ± 24.5 240.9 ±
71.7		 11.2 ± 2.8* 485.8 ±
267.1		 52.1 ± 13.0*
Cas NP FA HP 52.8 ± 20.8 331.3 ±
45.7**		 11.3 ± 2.5* 560.4 ±
124.7*		 52.7 ± 11.6*
IV ---- 4227.1 ±
1651.5**		 21.5 ± 2.8** 57.8 ±
15.5**		 100**
* p< 0.05 vs. 비캡슐화 엽산. Mann Whitney U 테스트
** p< 0.01 vs. 비캡슐화 엽산. Mann Whitney U 테스트
AUC : 혈청 농도 곡선 아래의 면적
Cmax: 최대 농도
Tmax: Cmax 도달 시간
MRT: 평균 체류 시간
FR: 상대 생체이용률(%)
보이는 바와 같이, AUC 값은 사용된 제제의 유형에 따라 현저한 변화를 겪는다. 비타민이 카제인 나노입자 내에 캡슐화될 때, AUC 값은 자유 엽산을 투여한 후의 값에 비해 현저히 더 크고, 투여 후 24 시간까지 더욱 오랜동안 유지된다. 혈장 내 엽산의 평균 체류 시간(MRT, mean residence time)은 두 나노입자 제제들에서 유사하고 자유 형태(경구 및 정맥 내)에 비해 더 큰 것으로 관찰되었다.
이러한 결과들에 따라, 캡슐화된 엽산을 함유한 카제인 나노입자들의 경구 생체이용률을 계산했는데, 이는 양 제제들에서 52%였고, 경구를 통해 자유 엽산의 경구 투여 후 얻어진 값들에 비해 45% 더 컸다.
실시예 8
캡슐화된 엽산을 함유하는 카제인 나노입자를 포함하는 화장용 제제 [1]
200 mg의 카제인 나트륨과 18 mg의 리신을 포함하는 용액을 물 15 mL의 최종 부피 내에 제조하였다.
또한, 600 mg의 엽산과 800 mg의 리신을 100 mL의 물에 함께 녹였다.
그 후, 상기 카제인염 용액에 1.5 mL의 엽산 용액을 첨가했다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에서 상기 혼합물에 8 mL의 0.8% CaCl2을 첨가했다.
마지막으로, 상기 제제를 17,000 x g에서 20분간 원심분리했다. 상등액을 버리고 펠릿을 25 mL의 물에 재현탁했다.
또한, 42 mL의 물에 7 g의 글리세린과 0.2 g의 니파긴나트륨(sodium nipagin)을 포함하는 용액을 제조했다. 용액을 수조에 넣고 50℃까지 가열한 후 엽산을 포함하는 카제인 나노입자들의 수용액을 첨가하여, 화장용 제제 제조를 위한 최종 수용액을 얻었다.
또한, 25 g의 Neo PCL O/W도 70℃에서 완전히 녹을 때까지 가열했다. 일단 이 지방상(fat phase)이 녹으면, 적절하고 오랫동안 안정적인 O/W 에멀젼을 얻을 때까지 일정한 교반 하에 전술한 수용액을 첨가했다. 결과 크림의 관능 평가(organoleptic evaluation)는 긍정적이었고, 균질한 외양을 가지며 덩어리가 없었다.
고압 처리(400 MPa, 5분) 및 실시예 4에서 기술한 스프레이 건조기에 의한 건조를 거친 나노입자 제제를 이용하여 동일한 연구를 수행했다. 600 mg의 제제를 취하여 물 25 mL에 재현탁하고, 이후의 과정은 전술한 것과 동일하게 진행했다. 얻어진 결과 크림도 균질한 외양을 가지며 덩어리가 없었다.
실시예 9
캡슐화된 엽산을 함유하는 카제인 나노입자를 포함하는 화장용 제제 [2]
200 mg의 카제인 나트륨과 18 mg의 리신을 포함하는 용액을 물 15 mL의 최종 부피 내에 제조하였다.
또한, 600 mg의 엽산과 800 mg의 리신을 물 100 mL에 함께 녹였다.
그 후, 각 카제인염 용액에 1.5 mL의 엽산 용액을 첨가했다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에서 상기 혼합물에 8 mL의 0.8% CaCl2을 첨가했다.
마지막으로, 상기 제제를 17,000 x g에서 20분간 원심분리했다. 상등액을 버리고 펠릿을 25 mL의 물에 재현탁했다.
또한, 0.5 g의 Carbopol Ultrez 10을 물 75 mL에 녹였다. 이 용액에 나노입자 현탁액을 첨가했다. 일단 혼합물이 균질화되면, pH 10을 얻을 때까지 충분한 양의 트리메틸아민을 첨가했다. 균질하고 안정한, 약간 누르스름한 Carbopol 겔을 얻을 때까지 혼합물을 균질화시켰다.
고압 처리(400 MPa, 5분) 및 실시예 4에서 기술한 스프레이 건조기에 의한 건조를 거친 나노입자 제제를 이용하여 동일한 테스트를 수행했다. 600 mg의 제제를 취하여 물 25 mL에 재현탁하고, 이후의 과정은 전술한 것과 동일하게 진행했다. 결과 겔도 약간 누르스름한 색깔을 가지며, 균질하고 안정적인 외양을 가지고 있었다.
실시예 10
캡슐화된 엽산을 함유하는 카제인 나노입자를 포함하는 화장용 제제 [3]
3 g의 글리세릴 모노스테아레이트를 5 g의 이소프로필 미리스테이트와 2 g의 세틸 알코올과 함께 혼합했다. 혼합물을 수조에 넣고 70℃에서 가열했다.
또한, 실시예 8에 기술한 엽산 함유 카제인 나노입자를 포함하는 87 g의 Carbopol 겔을 3 g의 솔비톨 액체와 함께 수조에 넣고 50℃까지 가열했다. 이 용액을 상기 혼합물에 첨가하고 균질한 에멀젼을 얻을 때까지 부드럽게 교반했다.
실시예 11
퀘르세틴을 포함하는 카제인 나노입자의 제조 및 분류
카제인 나트륨 100 mg과 리신 8.5 mg (또는 아르기닌 5.5 mg)을 포함하는 용액을 물 7.5 mL 내에 제조하였다.
또한, 12 mg/mL의 농도를 가지는 아스코르브산나트륨 용액을 물 속에 제조하였고, 그 중 0.5 mL를 카제인염 및 리신 혼합물에 첨가했다. 아스크로브산나트륨을 이용하는 이유는 나노입자를 얻기위한 공정 중에 퀘르세틴 산화를 방지하기 위한 것이었다.
또한, 50 mg의 퀘르세틴을 5 mL의 에탄올에 녹였다.
그 후, 0.15 mL의 퀘르세틴 용액을 카제인염 용액에 첨가했다. 5분간 배양 후, 자기적 교반 및 연속 유동 하에 4 mL의 0.8% CaCl2를 혼합물에 첨가했다. 각 유형의 제제를 위해 이 공정을 세 차례 수행했다.
각 경우에서 얻은 물리화학적 특성들이 표 12에 포함되어 있다.
퀘르세틴, 아미노산 및 아스코르브산을 함유한 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 3). 퀘르세틴과 단백질 간의 중량비는 1:67; 퀘르세틴과 아스코르브산 간의 중량비는 1:3.4
제제 크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 퀘르세틴 함량
μg Q/mg NP		 캡슐화 효율
카제인 NP
(리신)		 115 ± 5 0.21 ± 0.03 -15.5 ± 0.3 11.1 ± 0.3 86.7 ± 2.6
카제인 NP
(아르기닌)		 112 ± 3 0.20 ± 0.02 -17.1 ± 0.3 11.7 ± 0.4 88.1 ± 2.5
Q: 퀘르세틴; NP: 나노입자
얻어진 결과들은 본 발명의 나노입자들도 지용성 특성을 가지는 생물학적 활성 화합물을 캡슐화하는 데 적합하고 높은 캡슐화 효율 퍼센티지를 확보할 수 있다는 것을 보여주었다.
또한, 본 결과들은 이런저런 아미노산의 존재가 결과 나노입자들의 물리화학적 특성들에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있게 한다.
캡슐화된 퀘르세틴의 양을 증가시키기 위해, 아미노산으로서 리신을 이용하고 다양한 양의 퀘르세틴(0.05 내지 0.50 mL 사이의 에탄올 퀘르세틴 용액)을 이용하여 연구를 반복했다. 얻어진 결과들이 표 13에 포함되어 있다.
리신, 아스코르브산 및 다양한 양의 퀘르세틴을 함유하는 카제인 나노입자의 물리화학적 특성(평균 ± 표준편차, n = 3). 아스코르브산과 단백질(카제인) 간의 중량비는 1:17
퀘르세틴:카제인
중량비 		크기
(nm)		 PDI 제타 전위
(mV)		 퀘르세틴 함량
μg Q/mg NP		 캡슐화 효율
1:180 147 ± 14 0.21 ± 0.03 -17.6 ± 0.3 4.3 ± 0.2 83.2 ± 4.2
1:67 115 ± 5 0.21 ± 0.03 -15.5 ± 0.3 11.1 ± 0.3 86.7 ± 2.6
1:20 --- --- --- 38.0 ± 1.3 89.3 ± 3.1
Q: 퀘르세틴; NP: 나노입자
얻어진 결과들은, 제제 내에서 퀘르세틴의 양이 증가할수록 캡슐화된 퀘르세틴의 양이 동일한 비율로 증가하는 반면, 캡슐화 효율은 변하지 않는다는 것을 보여준다.
또한, 전술한 프로세스를 따르되, 퀘르세틴을 카제인염 용액에 첨가하기 전에 (에탄올에 녹이는 대신) 물에 분산시켜 진행하는 테스트들을 수행하였다. 얻어진 결과들은, 퀘르세틴을 카제인염 용액에 첨가하기 전에 에탄올에 녹이는 이전 경우에 비해 캡슐화 효율이 낮지만 일부 퀘르세틴이 카제인 나노입자들 내에 캡슐화된다는 것을 보여주었다.

Claims (31)

  1. 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 및 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속을 포함하는 나노입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    생물학적 활성 화합물을 더 포함하는 나노입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 화합물은 엽산이고,
    상기 나노입자는 당류 및 아스코르브산을 추가로 포함하는 나노입자.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 및 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속을 포함하는 나노입자의 생산방법으로서,
    a) 카제인 소스와 염기성 아미노산을 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 용액에 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속의 수용액을 첨가하는 단계를 포함하는 생산방법.
  9. 카제인 매트릭스, 염기성 아미노산, 2가 금속, 3가 금속, 및 그 조합으로부터 선택되는 금속, 및 생물학적 활성 화합물을 포함하는 나노입자의 생산방법으로서,
    a) (i) 카제인 소스 및 제1 염기성 아미노산을 포함하는 수용액과 (ii) 생물학적 활성 화합물을 포함하는 용액을 혼합하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 결과로 얻어진 혼합물에 2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속의 수용액을 첨가하는 단계를 포함하는 생산방법.
  10. 삭제
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생산방법.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 금속은 칼슘, 마그네슘, 아연, 2가 형태의 철, 및 그 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 2가 금속인 생산방법.
  13. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    2가 금속, 3가 금속 및 그 조합으로부터 선택되는 금속의 상기 수용액은 염화 칼슘, 아세트산 칼슘, 글루콘산 칼슘, 락트산 칼슘, 소르브산 칼슘, 아스코르브산 칼슘, 시트르산 칼슘, 프로피온산 칼슘, 황산 칼슘 및 그 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 칼슘염의 수용액인 생산방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    형성된 나노입자를 포함하는 현탁액에 대해 100 내지 800 MPa 사이의 압력으로 적어도 한 주기의 정수압을 가하는 단계를 더 포함하는 생산방법.
  18. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    형성된 나노입자를 포함하는 현탁액을 건조시키는 단계를 더 포함하는 생산방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제1항, 제4항 또는 제5항에 따른 나노입자, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 생산방법에 따라 얻어지는 나노입자를 적어도 하나 이상 포함하고, 식품, 약품 또는 화장품에 허용되는 운반체를 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 크기는 50 내지 200 nm인 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    10 내지 50 중량%의 카제인;
    0.9 내지 2.5 중량%의 엽산;
    1 내지 6 중량%의 칼슘;
    1 내지 7 중량%의 염기성 아미노산; 및
    30 내지 80 중량%의 당류를 포함하되,
    모든 상기 비율은 조성물의 총 중량 대비 중량 비율인 조성물, 및
    10 내지 50 중량%의 카제인;
    0.9 내지 2.5 중량%의 엽산;
    1 내지 6 중량%의 칼슘;
    1 내지 7 중량%의 염기성 아미노산;
    20 내지 55 중량%의 당류; 및
    1 내지 25 중량%의 아스코르브산을 포함하되,
    모든 상기 비율은 조성물의 총 중량 대비 중량 비율인 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  27. 삭제
  28. 제24항에 있어서,
    상기 운반체는 국소 경로를 통한 투여가 허용되는, 약학적 또는 화장품용 부형제를 포함하는 조성물.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 나노입자는 건조 분말의 형태인 조성물.
  30. 제24항에 따른 조성물을 포함하는 식품.
  31. 삭제
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