BR112012021372B1

BR112012021372B1 - Processo para produção de nanopartículas, nanopartícula produzida pelo referido processo, composição e gênero alimentício

Info

Publication number: BR112012021372B1
Application number: BR112012021372-5A
Authority: BR
Inventors: Maite Agüeros Bazo; Carlos Javier González Navarro; Juan Manuel Irache Garreta; Irene Esparza Catalán; Carolina González Ferrero; Ana Romo Hualde
Original assignee: Universidad De Navarra; Centro Nacional De Tecnologia Y Seguridad Alimentaria, Laboratorio Del Ebro
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2021-04-06
Also published as: US10894006B2; AU2011219694B2; RU2012141088A; JP5758919B2; BR112012021372B8; MX342700B; RU2552957C2; JP2013520191A; KR20130045849A; DK2540169T3; BR112012021372A2; PL2540169T3; CA2789518C; AU2011219694A1; CN102869271A; US20130209530A1; EP2540169B1; PT2540169T; MX2012009863A; CA2789518A1

Abstract

nanopartícula, processo para produção de nanopartículas, composição e gênero alimentício. a presente invenção refere-se a nanopartículas para encapsular compsotos, sua preparação e usos, compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações. as referidas nanopartículas podem encapsular um compsoto biologicamene ativo hidrossolúvel ou lipossolúvel. a invenção é aplicável nos setores alimentício, farmacêutico e cosmético e no setor de nanotecnologia.

Description

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS, NANOPARTÍCULA PRODUZIDA PELO REFERIDO PROCESSO, COMPOSIÇÃO E GÊNERO ALIMENTÍCIO

Campo da Invenção

A presente invenção é abrangida nos setores alimentício, farmacêutico e cosmético e no setor da nanotecnologia e consiste no encapsulamento de compostos biologicamente ativos usando caseína como um agente de revestimento.

Fundamentos da Invenção

A indústria alimentícia precisa se desenvolver tecnologicamente para atender à demanda dos novos consumidores. A nanotecnologia apresenta um grande potencial para revolucionar a indústria alimentícia, já que, através da sua tecnologia, é possível encapsular compostos biologicamente ativos [BAC], por exemplo, aromas, vitaminas, minerais, óleos essenciais, antioxidantes, prebióticos etc., a fim de obter inúmeros benefícios, por exemplo, aumentar a validade do produto; reduzir a quantia de BAC a ser usada; controlar sua liberação; aumentar sua biodisponibilidade; mascarar sabores indesejáveis etc.

Ao projetar um transportador adequado para encapsular um BAC, é muito importante selecionar corretamente o material usado como agente de revestimento ou matriz; para tal propósito, a forma de dosagem, sua toxicidade, o produto (alimentício, cosmético, farmacêutico etc.) no qual a formulação será incorporada etc., entre outros fatores, devem ser levados em consideração. No campo da nanotecnologia alimentícia, não é recomendável usar polímeros sintéticos, já que podem apresentar problemas de toxicidade. Polímeros naturais não têm essas desvantagens; entretanto, seu uso implica o desenvolvimento de métodos mais complicados de produção de partículas; adicionalmente, na maioria dos casos, o tamanho de partícula obtido (maior que 100 µm em muitos casos) é difícil de ser controlado, portanto tais nanopartículas podem ser percebidas pelo consumidor e modificar as características organolépticas do alimento alvo.

As proteínas estão entre os materiais tradicionalmente usados como agente de revestimentos de BAC. O uso de caseína com um as um transportador para encapsular BAC hidrofóbico para sua aplicação alimentícia foi descrito (CA2649788 e EP2011472).

O ácido fólico (ácido pteroilpoliglutâmico ou vitamina B9), uma vitamina hidrossolúvel do tipo-B incluída dentro do grupo folato, é essencial para processos bioquímicos importantes, tais como síntese de DNA. Sua falta é associada à presença de anemia megaloblástica, doença de Alzheimer, síndrome de Down, distúrbios de humor, alguns tipos de câncer (câncer de cólon, câncer cervical, leucemia, câncer pancreático), defeitos do tubo neural durante o desenvolvimento fetal, complicações durante a gravidez e infertilidade masculina. Entretanto, ele não pode ser sintetizado pelo organismo; portanto, deve ser fornecido através de vários suplementos ou dieta.

Apesar dos folatos estarem presentes naturalmente nos alimentos (por exemplo, frutas e vegetais), fundamentalmente na forma de poliglutamatos, sua biodisponibilidade, tipicamente 50% ou menos, é incompleta. Portanto, o consumo de alimentos fortificados com ácido fólico pode formar uma opção complementar para aumentar a ingestão de tal vitamina nos casos em que a ingestão de folatos é menor do que aquela recomendada. Não obstante, a biodisponibilidade de ácido fólico adicionada aos alimentos não é completa devido, entre outras causas, ao efeito matriz (o ácido fólico pode ser ligado a um componente alimentício, evitando assim sua absorção), ou a presença de qualquer componente no alimento que reduz sua biodisponibilidade. Adicionalmente, o ácido fólico não é bem absorvido quando não é solubilizado no intestino. Suplementos ou fortificantes com ácido fólico administrados por meio de cápsulas, comprimidos etc., têm a desvantagem de que, ao se quebrarem no estômago devido aos ácidos gástricos, o ácido fólico se precipita, sendo convertido em sua forma menos solúvel, em que apenas parte do ácido fólico fornecido alcança o intestino.

Adicionalmente, a fortificação de alimentos com folatos ou com ácido fólico é um processo complicado, já que tanto os folatos e seus derivados quanto o ácido fólico são sensíveis a, entre outros fatores, alterações de temperatura, luz e pH; portanto, sua estabilidade fica comprometida pelas condições de processamento de alimentos e a quantia de bioativos da vitamina disponível para o consumidor pode ser amplamente reduzida. Assim, ao fortificar alimentos com tal vitamina, é necessário levar estes aspectos em consideração, já que as maiores perdas podem acontecer durante a estocagem e preparação de alimentos.

O enriquecimento dos alimentos com ácido fólico, fundamentalmente em produtos laticínios e cereais, foi descrito. Suplementos dietéticos (EP2002839) ou alimentos enriquecidos com ácido fólico ou folatos, tais como embutidos (ES2302571), laticínios (EP1941804), alimentos infantis (US4753926), ou mesmo alimentos enlatados baseados em carne de frango, porco ou gado (RU2223672 e RU2213493) também foram descritos. Entretanto, nos casos descritos, nenhuma das possíveis interações da vitamina com a matriz do alimento nem a sua biodisponibilidade são contempladas.

Um método para obter microcápsulas de alginato e pectina contendo ácido fólico para protegê-lo dos fatores ambientais que levam a sua degradação, tais como condições gástricas, atingindo sua liberação no intestino, também foi descrito. Entretanto, as microcápsulas obtidas são excessivamente grandes, o que afeta as características organolépticas do alimento alvo. Um método para encapsular ácido fólico em nanoesferas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e atingir sua liberação sustentável também foi projetado; apesar dos resultados serem positivos, sua aplicação em alimentos fica comprometida pelo uso daquele polímero, já que é restrito às áreas de medicina e farmácia.

Portanto, há uma necessidade de se desenvolver sistemas de encapsulamento de BAC, preferencialmente hidrossolúvel, mais preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, por exemplo, ácido fólico, que inteira ou parcialmente supera as desvantagens mencionadas acima.

Resumo da invenção

Foi agora verificado que nanopartículas formadas com caseína compreendendo adicionalmente um aminoácido básico (por exemplo, arginina ou lisina) e um metal adequado para alimento (por exemplo, cálcio), formam um novo sistema de encapsulamento e de estabilidade para compostos biologicamente ativos (BAC) que são ambos hidro e lipossolúveis, preferencialmente hidrossolúveis, mais preferencialmente BAC hidrossolúveis ácidos, para sua aplicação em alimentos, cosméticos e farmácia.

Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a nanopartículas compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal grau alimentício selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações. As referidas nanopartículas podem ser usadas como aditivos tecnológicos; elas têm adicionalmente a capacidade para encapsular BAC, preferencialmente um BAC hidrossolúvel, mais preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, tal como, por exemplo, uma vitamina do tipo B ou C, tal como ácido fólico, ácido pantotênico e ácido ascórbico, ou outros compostos hidrofílicos, apesar de que eles também podem incorporar BAC lipossolúvel.

As referidas nanopartículas são estáveis e capazes de proteger os BAC da degradação por agentes externos, por exemplo, luz, alterações de pH, oxidação etc., ambos durante o processamento do produto (por exemplo, produto alimentício, farmacêutico ou cosmético) e durante a estocagem e, adicionalmente, quando são aplicados em alimentos, protegem os BAC das condições ácidas do estômago, evitando sua liberação ao longo do trato gástrico, evitando, assim, sua precipitação e, portanto, evitando a biodisponibilidade reduzida. Adicionalmente, foi verificado que as referidas nanopartículas são capazes de se dissolverem em meio intestinal (simulado) facilitando a liberação completa dos BAC no intestino para sua absorção correta, e adicionalmente evitando problemas de toxicidade de qualquer tipo. Vantajosamente, as referidas nanopartículas são inertes no alimento no qual elas são introduzidas, evitando, assim que os BAC reajam com componentes diferentes da matriz e reduzindo sua biodisponibilidade.

Adicionalmente, um dos fatores mais importantes das nanopartículas providos por invenção está em usar a caseína como um transportador natural para proteger os BAC tanto de condições ambientais quanto de condições gástricas, facilitando sua liberação no intestino e assim melhorando sua biodisponibilidade, já que a caseína por si demonstrou propriedades nutritivas de forma a complementar, ela própria, os efeitos benéficos dos BAC.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para produzir as referidas nanopartículas. Tal processo é simples e aplicável em uma escala industrial. Vantajosamente, tal processo não inclui polímeros sintéticos ou reativos que não são aprovados como aditivos alimentares, minimizando a inclusão de surfactantes ou emulsificantes, e permite obter nanopartículas em uma escala nanométrica, com um tamanho de partícula controlável.

Em uma modalidade particular, tal processo compreende adicionalmente a secagem da suspensão contendo as referidas nanopartículas a fim de obter a formulação em forma de pó, mantendo os BAC estáveis com o tempo; este tipo de formulação em pó é particularmente adequado para seu uso em alimentos sólidos. Vantajosamente, tal tratamento de secagem é realizado na presença de um agente protetor de nanopartícula. As nanopartículas contendo um BAC obtido assim podem ser facilmente suspensas em meio aquoso, protegendo os BAC de degradação em solução. O produto final obtido é estável e protege os BAC por longos períodos de estocagem e é adicionalmente aplicável em tipos diferentes de alimentos, ambos líquidos (por exemplo, bebidas etc.) e sólidos.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo as referidas nanopartículas para seu uso nos setores alimentício, farmacêutico ou cosmético. De fato, as referidas nanopartículas podem ser incorporadas em cremes, géis e hidrogéis a fim de obter preparações cosméticas estáveis adequadas para uso neste campo. As referidas nanopartículas também podem ser formuladas com excipientes adequados para a administração das referidas nanopartículas por via tópica.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um gênero alimentício, compreendendo a referida composição baseada nas nanopartículas de caseína providas por esta invenção. Em uma modalidade particular, o referido gênero alimentício tem forma líquida, semi-sólida ou sólida.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra uma representação esquemática de uma modalidade particular do processo da invenção aplicada para obter as nanopartículas de caseína contendo ácido fólico.
A figura 2 mostra imagens de microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de nanopartículas de caseína vazias. A barra preta localizada na margem esquerda inferior das imagens corresponde a uma referência de 100 nm.
A figura 3 mostra imagens de microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico. A barra preta localizada na margem esquerda inferior das imagens corresponde a uma referência de 100 nm.
A figura 4 mostra a proporção entre a quantia de ácido fólico encapsulada e a quantia de caseína para cada mg de ácido fólico adicionado à formulação. Em todas as formulações a proporção em peso entre lisina e a proteína, anteriormente à adição da solução de ácido fólico, é 1:12.
A figura 5 mostra micrografias de microscópio eletrônico de varredura (SEM) de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico e com lisina na sua formulação sem tratamento de alta pressão (A e B), com tratamento a 100 MPa, 5 minutos (C), com tratamento a 400 MPa, 5 minutos (D) e com tratamento a 800 MPa, 5 minutos (E).
A figura 6 mostra uma micrografia de microscópio eletrônico de varredura (SEM) de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico e com arginina na sua formulação com tratamento a 400 MPa, 5 minutos.
A figura 7 mostra a liberação de ácido fólico das nanopartículas de caseína sem tratamento de alta pressão depois da sua incubação em fluido gástrico simulado (SGF) (durante as duas primeiras horas: 0-2 h) e fluido intestinal simulado (SIF) (2 a 24h) a 37±1°C. Os dados mostram a média ± desvio padrão (n=6).
A figura 8 mostra a liberação de ácido fólico das nanopartículas de caseína com tratamento de alta pressão (A) 150 MPa, 5 minutos e B) 400 MPa, 5 minutos) depois da sua incubação em fluido gástrico simulado (SGF) (durante as duas primeiras horas: 0-2 h) e fluido intestinal simulado (SIF) (2 a 8h) a 37±1°C. Os dados mostram a média ± desvio padrão (n=4).
A figura 9 mostra a concentração de ácido fólico no soro (ng/ml) como uma função de tempo depois da administração formulações de vitaminas diferentes em animais de laboratório. Os resultados mostram uma média ± desvio padrão (n = 5).

A) Via intravenosa, dose 1 mg/kg.
B) Via oral, dose 1 mg/kg: ácido fólico não encapsulado dissolvido em água (●); ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína dispersas em água (■); ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína tratadas por altas pressões dispersas em água (▲).

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção provê nanopartículas de caseína e métodos para encapsular compostos biologicamente ativos (BAC) a fim de preservá-los da degradação por agentes externos, tais como luz, alteração de pH, oxidação etc.

Definições

Com o propósito de facilitar a compreensão da presente invenção, o significado de alguns termos e expressões conforme usados no contexto da invenção são estabelecidos abaixo.

Como é usado aqui, um “aminoácido básico” inclui lisina, arginina e histidina.

Como é usado aqui, “caseína” refere-se a uma proteína conjugada formando aproximadamente 80% do total de proteínas do leite. É uma proteína do tipo fosfoproteína que está dentro da definição de globulinas; é solúvel; tem uma alta capacidade de retenção de água e precipita a um pH aproximado de 4,6 a 20°C. É formada pelas quatro frações fundamentais (αs1-caseína, αs2-caseína, β-caseína e κ-caseína) diferenciadas uma da outra por suas composições de aminoácidos, sua distribuição de carga e sua tendência a formar agregados na presença de cálcio. No leite, as caseínas formam partículas coloidais grandes entre 50 a 600 nm de diâmetro (aproximadamente 150 nm em média) referidas como “micelas de caseína”. Estas partículas são formadas por interações hidrofóbicas e por complexo de fosfato de cálcio por radicais de fosfoserina presentes na estrutura da caseína. Tais micelas formam um sistema coloidal no leite, sendo uma das principais causas para sua cor, estabilidade térmica e coagulação por renina.

Como é usado aqui, um “composto biologicamente ativo” ou “BAC” refere-se a qualquer composto lipo e hidrossolúvel tendo atividade nutritiva, terapêutica e/ou cosmética. Exemplos ilustrativos não limitantes de BAC, de acordo com a presente invenção, incluem aminoácidos, agentes antimicrobianos, agentes aromatizantes, conservantes, adoçantes, esteroides, drogas, hormônios, lipídios, peptídeos, polinucleotídeos, polisacarídeos, proteínas, proteoglicanos, agentes saborizantes, vitaminas etc.

Como é usado aqui, um “composto biologicamente ativo hidrossolúvel” ou “BAC hidrossolúvel” refere-se a um composto tendo atividade nutritiva, terapêutica e/ou cosmética e que é solúvel (muito solúvel, livremente solúvel, solúvel, moderadamente solúvel ou pouco solúvel) em uma solução aquosa de acordo com os critérios definidos pela Real Farmacopeia Espanhola:

Exemplos ilustrativos não limitantes de BACs hidrossolúveis incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias B ou C e derivados, seus sais ou ésteres; ácido hialurônico, sulfato de condroitina, ácido tióctico, seus sais ou ésteres etc. Em uma modalidade particular, o referido BAC hidrossolúvel é selecionado dentre o grupo consistindo de ácido fólico, ácido 4-aminobenzoico, niacina, ácido pantotênico, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutâmicos (derivados de ácido fólico: folato poliglutamatos; poliglutamato folatos), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialurônico, ácido tióctico (ácido alfa lipoico), ácido p-coumárico, ácido cafeico, seus ésteres ou sais farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou derivados grau alimentício e suas misturas.

Como é usado aqui, um “composto biologicamente ativo lipossolúvel” ou “BAC lipossolúvel” refere-se a um composto tendo atividade nutritiva, terapêutica e/ou cosmética e que é solúvel (muito solúvel, livremente solúvel, solúvel, moderadamente solúvel ou pouco solúvel) em gorduras e óleos de acordo com os critérios definidos pela Real Farmacopeia Espanhola. Exemplos ilustrativos não limitantes de BAC lipossolúvel incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias A, D, E, K e seus derivados, fosfolipídios, carotenoides (carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), ácidos graxos ômega 3 (ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA) etc.), fitostanóis e fitosteróis (sitosterol, campesterol, estigmasterol etc.), polifenóis (quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isorhamnetin etc.) e seus derivados.

Diz-se que um produto é “grau alimentício” quando seu uso em alimento humano ou animal é seguro, de acordo com o Codex Alimentarius de um país ou de uma organização, por exemplo, a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) ou a Organização Mundial da Saúde (WHO); consequentemente, um produto “grau alimentício” é um produto não tóxico, “adequado para seu uso na alimentação” e, portanto, ambas as expressões são sinônimas e são indistintivamente usadas nesta descrição.

Como é usado aqui, um “metal divalente” inclui qualquer elemento metal cuja valência é 2, por exemplo, um metal alcalino terroso, por exemplo, cálcio, magnésio, zinco etc., ou, se tiver várias valências, uma delas é 2, por exemplo, ferro etc., com a condição de que seja farmacêutica ou cosmeticamente aceitável, ou adequado para uso na alimentação.

Como é usado aqui, um “metal trivalente” inclui qualquer elemento metal cuja valência é 3, ou, se tiver várias valências, uma delas é 3, por exemplo, ferro etc., com a condição de que seja farmacêutica ou cosmeticamente aceitável, ou adequado para uso na alimentação.

Como é usado aqui, “nanopartícula” refere-se a sistemas coloidais do tipo esférico ou de formato similar com um tamanho menos que 1 micrômetro (μm), preferencialmente da ordem de 10 a 900 nanômetros (nm).

Como é usado aqui, “tamanho médio” refere-se ao diâmetro médio de uma população de nanopartículas que se movem juntas em um meio aquoso. O tamanho médio desses sistemas pode ser medido por processos padrão conhecidos pela pessoa versada na técnica, e que são descritos, por exemplo, na parte experimental (ver abaixo). As nanopartículas da invenção caracterizadas por ter um tamanho médio de partícula menor que 1 μιτι, tipicamente compreendido entre 1 e 999 nm, preferencialmente entre 10 e 900 nm, mais preferencialmente entre 50 e 500 nm, ainda mais preferencialmente entre 100 e 200 nm. Em uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção têm um tamanho médio de partícula compreendido entre 50 e 200 nm, preferencialmente em torno de 140 nm aproximadamente.

Nanopartículas

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma nanopartícula, doravante a nanopartícula da invenção, compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações.
Em uma modalidade particular, o referido aminoácido básico é selecionado dentre o grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e suas misturas.
Em outra modalidade particular, o referido metal é preferencialmente um metal divalente grau alimentício selecionado dentre o grupo consistindo de cálcio, magnésio, zinco, ferro (em sua forma divalente) e suas combinações.
Em outra modalidade particular, o referido metal é um metal trivalente grau alimentício, tal como, por exemplo, ferro na sua forma trivalente.

As nanopartículas da invenção podem ser usadas como aditivos tecnológicos, por exemplo, como substitutos de gordura etc. As nanopartículas da invenção têm adicionalmente a capacidade para encapsular um composto biologicamente ativo (BAC).

Assim, em outra modalidade particular, a nanopartícula da invenção compreende adicionalmente um composto biologicamente ativo (BAC). O referido BAC pode ser um BAC hidrossolúvel ou um BAC lipossolúvel; neste caso a nanopartícula da invenção é ocasionalmente identificada nesta descrição como “nanopartícula carregada da invenção”.

Em uma modalidade particular o referido BAC é um BAC hidrossolúvel, preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido. Em uma modalidade mais particular, o referido BAC hidrossolúvel é selecionado dentre o grupo consistindo de:

a) uma vitamina da família B ou C;
b) uma vitamina derivada de acordo com a);
c) um composto selecionado dentre ácido hialurônico, sulfato de condroitina e ácido tióctico;
d) um sal ou um éster de qualquer um dos compostos a)-c) mencionados acima; e
e) suas combinações.

Em uma modalidade específica, o referido BAC hidrossolúvel é selecionado dentre o grupo consistindo de ácido fólico, ácido 4-aminobenzoico, niacina ou vitamina B3, ácido pantotênico ou vitamina B5, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutâmicos (derivados de ácido fólico: folato poliglutamatos; poliglutamato folatos), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialurônico, ácido tióctico ou ácido alfa lipoico, ácido p-coumárico, ácido cafeico, seus ésteres ou sais farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou derivados grau alimentício e suas misturas.
Em uma modalidade específica, o referido BAC é BAC hidrossolúvel ácido tal como ácido fólico, ácido pantotênico, ácido ascórbico etc.

Sem desejar ser compelido por qualquer teoria, acredita-se que na presença de metal tal como metal divalente (por exemplo, cálcio), a- e β-caseínas se agregam devido a sua hidrofilia e carga de superfície ser perdidas quando radicais de fosfoserina presentes na sua estrutura ligam-se à parte de cátion. O BAC hidrossolúvel, preferencialmente ácido (por exemplo, ácido fólico), também interage eletrostaticamente com o referido metal, portanto ele seria preso na matriz hidrofóbica gerada por esses tipos de caseína. A κ-caseína, por sua vez, não reage com o metal (por exemplo, cálcio), portanto é ligada por sua parte hidrofóbica à partícula, sua fração hidrossolúvel estando em contato com o meio aquoso externo. A referida fração hidrossolúvel tem, em adição a uma alta proporção de grupos carbonil (grupos ácidos de aminoácidos tais como ácido glutâmico ou aspártico), grupos polares correspondentes aos resíduos seril e treonil ligados ao tri- e tetra-sacarídeos. É assim considerado que depois da formação das nanopartículas, o aminoácido básico (por exemplo, lisina) presente na solução seria aderido á superfície destas nanopartículas devido a sua interação eletrostática [por exemplo, elas podem ser ligações covalentes depois de passar por aquecimento durante sua passagem pelo atomizador (onde apropriado)] com os grupos carboxílicos de uma referida fração. A figura 1 mostra uma representação esquemática das nanopartículas carregadas da presente invenção compreendendo uma matriz de caseína, lisina (aminoácido básico) e cálcio (metal divalente).

Em outra modalidade específica o referido BAC é um BAC lipossolúvel apesar de que, neste caso, seria necessário formar uma suspensão preferencialmente homogênea de BAC em meio aquoso, ou mais preferencialmente, dissolver o BAC em uma solução orgânica, adicionando lentamente a referida suspensão aquosa ou a referida solução orgânica dentro da solução contendo a fonte de caseína (por exemplo, caseinato) e incubar a mistura.

O mecanismo para prender seria diferente daquele descrito para o BAC hidrossolúvel porque o BAC lipossolúvel seria preso na fração hidrofóbica interna das nanopartículas devido à afinidade entre ambas as frações, independentemente de terem ou não a capacidade de interagir com o metal (divalente ou trivalente).

Em uma modalidade particular, o referido BAC é um BAC lipossolúvel selecionado dentre vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias A, D, E, K e seus derivados, fosfolipídios, carotenoides (carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), ácidos graxos ômega 3 (por exemplo, DHA, EPA etc.), aminoácidos (por exemplo, iso-leucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofan, e valina), fitostanóis e fitosteróis (por exemplo, sitosterol, campesterol, stigmasterol etc.), polifenóis (por exemplo, quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isorhamnetin etc.) e seus derivados.

A proporção BAC:caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção pode variar dentro de uma ampla gama; de uma maneira ilustrativa não limitante, a proporção BAC:caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção pode ser compreendida entre 1:1 e 1:200, preferencialmente entre 1:10 e 1:80, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:15 e 1:35. Em uma modalidade particular, o BAC é um BAC hidrossolúvel, e a proporção BAC (hidrossolúvel):caseína em peso na nanopartícula carregada de uma invenção é compreendida entre 1:1 e 1:50, preferencialmente entre 1:10 e 1:30, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:15 e 1:20, Em outra modalidade particular, o BAC é um BAC lipossolúvel, e a proporção BAC (lipossolúvel):caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção é compreendida entre 1:1 e 1:200, preferencialmente entre 1:10 e 1:80, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:20 e 1:35.

Adicionalmente, se desejado, as nanopartículas da invenção, ambas aquelas que são carregadas com um BAC e aquelas que não são, podem incorporar um antioxidante, por exemplo, ácido ascórbico (vitamina C) etc., em sua formulação com o propósito de aumentar sua estabilidade com relação à temperatura e oxidação. Em uma modalidade particular, o BAC é ácido fólico e o antioxidante é ácido ascórbico, que parece agir protegendo o ácido fólico de degradação por radiação ultravioleta, alteração de pH, calor, oxigênio etc., e provê adicionalmente o suporte nutritivo do ácido ascórbico. O referido antioxidante poderia ser co-encapsulado com o BAC ou introduzido no revestimento das nanopartículas da invenção.

Processo para obtenção de nanopartículas

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para produção de nanopartículas compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações (nanopartículas da invenção), doravante “processo [1] da invenção”, que compreende:

a) preparar uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um aminoácido básico; e
b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à solução da etapa a).

Em outro aspecto, a invenção também refere-se a um processo para produção de nanopartículas compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico, um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, e um composto biologicamente ativo (nanopartículas carregadas da invenção), doravante “processo [2] da invenção”, o que compreende:

a) misturar (i) uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um primeiro aminoácido básico com (ii) uma solução contendo um composto biologicamente ativo; e
b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à mistura resultante da etapa a).

Na etapa a) do processo [1] da invenção, uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um aminoácido básico é preparada por métodos convencionais conhecidos por pessoas versadas na técnica, por exemplo, por meio da adição da referida fonte de caseína e do aminoácido básico a um meio aquoso.

Na etapa a) do processo [2] da invenção, uma solução aquosa (i) contendo uma fonte de caseína e um aminoácido básico é misturada com uma solução (ii) contendo um BAC. A natureza e a composição da referida solução (ii) contendo o BAC podem variar dependendo do tipo e da natureza do BAC. Assim, em uma modalidade particular, quando o BAC é um BAC hidrossolúvel, a referida solução (ii) contendo o BAC é uma solução aquosa; em outra modalidade particular, quando o BAC é BAC hidrossolúvel ácido, a referida solução (ii) contendo o BAC é uma solução aquosa compreendendo adicionalmente um segundo aminoácido básico; e, em outra modalidade particular, do BAC o BAC é um BAC lipossolúvel, a referida solução (ii) contendo o BAC é a sua suspensão em um meio aquoso ou preferencialmente uma solução orgânica, mais preferencialmente uma solução orgânica de um solvente hidromiscível tal como um álcool, por exemplo, etanol.

A caseína, que pode ser usada para colocar ambos os processos [processos [1] e [2] da invenção] em prática pode vir de virtualmente qualquer fonte de caseína, por exemplo, leite, feijão etc. A caseína pode ser encontrada na referida solução na forma de caseína ácida ou caseinato. Em uma modalidade particular, a referida fonte de caseína compreende caseína na forma de caseinato, preferencialmente caseinato de sódio. Apesar do caseinato de cálcio e fosfocálcio também poder ser usados, são menos vantajosos na prática porque o cálcio é usado para formar as nanopartículas depois de misturar o caseinato com o ingrediente ativo, portanto, se a solução de caseinato já tem cálcio no meio, a colocação dos referidos processos em prática pode ser seriamente comprometida.

A quantia de caseína que pode ser contida na solução aquosa formada na etapa a) do processo [1] da invenção, bem como a solução aquosa (i) [contendo uma fonte de caseína e um primeiro aminoácido básico] usada na etapa a) do processo [2] da invenção pode variar dentro de uma ampla gama; entretanto, em uma modalidade particular, a quantia de caseína contida na referida solução aquosa é compreendida entre 0,1% e 10% (w/v), preferencialmente entre 0,5% e 5%, mais preferencialmente entre 1% e 3%.

O aminoácido básico contribui para dissolver a caseína e, onde apropriado, o BAC, particularmente BACs hidrossolúveis ácidos, portanto ele tem um papel muito importante na produção dos BAC que são carregados com as nanopartículas da invenção e daqueles que não são. De fato, parece que ao aumentar o pH da solução, o aminoácido básico permite dissolver o caseinato sem a necessidade de usar sais inorgânicos, e adicionalmente age como uma base para manter as extremidades hidrofílicas das frações kappa (κ) de uma caseína em uma forma aniônica, de modo que as partículas com carga de superfície negativa são mantidas em suspensão e não se agregam devido a repulsões eletrostáticas.

O aminoácido básico que pode ser usado para colocar ambos os processos [processos [1] e [2] da invenção] em prática é selecionado dentre o grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e suas misturas, preferencialmente, de arginina, lisina e suas misturas. O aminoácido básico, que pode estar dentro ou fora das nanopartículas da invenção, tem um papel fundamentalmente tecnológico, já que facilita a dissolução dos componentes antes da formação das nanopartículas e mantém o pH adequado depois de obtê-los em ambos os lados de uma nanopartícula (dentro e fora). A título ilustrativo, o ácido fólico é pouco solúvel em água, mas livremente solúvel em solução aquosa pouco alcalina, portanto a presença do aminoácido básico auxilia na dissolução do ácido fólico.

Em uma modalidade particular do processo [2] da invenção, quando o BAC é BAC hidrossolúvel ácido, a referida solução (ii) contendo o BAC é uma solução aquosa compreendendo adicionalmente um segundo aminoácido básico (a fim de evitar que o BAC precipite). Apesar da possibilidade de usar dois aminoácidos básicos diferentes ser contemplada naquele caso, em uma modalidade particular o aminoácido básico usado ao preparar a solução aquosa contendo uma fonte de caseína (primeiro aminoácido básico) e aquele usado na preparação da solução aquosa contendo um BAC (segundo aminoácido básico) é o mesmo e é selecionado dentre o grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e suas misturas, preferencialmente de arginina, lisina e suas misturas.

A quantia de aminoácido básico que pode ser contida na solução formada na etapa a) do processo [1] da invenção e na solução (i) da etapa a) do processo [2] da invenção pode variar dentro de uma ampla gama e geralmente depende do aminoácido básico usado. Portanto, apesar da proporção aminoácido básico:caseína em peso poder variar muito, em uma modalidade particular a proporção aminoácido básico:caseína em peso na solução formada na etapa a) do processo [1] da invenção ou na solução (i) do processo [2] da invenção é compreendida entre 1:1 e 1:50, preferencialmente entre 1:10 e 1:40, mais preferencialmente aproximadamente 1:12 quando o aminoácido básico usado é lisina ou aproximadamente 1:25 quando o aminoácido básico usado é arginina.

Quando o BAC é BAC hidrossolúvel ácido, a solução (ii) da etapa a) do processo [2] da invenção contendo o referido BAC compreende adicionalmente um segundo aminoácido básico, que, como mencionado anteriormente, pode ser o mesmo ou diferente do referido primeiro aminoácido básico; neste caso, a proporção aminoácido básico:caseína no processo [2] da invenção, ou seja, depois de misturar as soluções (i) e (ii) da etapa a) do referido processo, é compreendida entre 1:1 e 1:50, preferencialmente entre 1:5 e 1:20, mais preferencialmente aproximadamente 1:6 quando o aminoácido básico usado é lisina ou aproximadamente 1:9 quando o aminoácido básico usado é arginina.

Ambos o processo [1] da invenção e o processo [2] da invenção compreendem a etapa da adição de a) uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações [etapa b)] à solução da etapa. Sem desejar ser compelido por qualquer teoria, acredita-se que o referido metal, tal como um metal divalente (por exemplo, cálcio), permite a criação de uma ponte dentro da nanopartícula carregada da invenção que auxilia na estabilidade do BAC, particularmente quando o BAC é um BAC hidrossolúvel, preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, ou um BAC hidrossolúvel capaz de interagir com o referido metal (por exemplo, cálcio), por exemplo, ácido fólico, ácido pantotênico ou uma vitamina do grupo B ou C ou seus derivados; neste caso, parece que o referido metal, por exemplo, o referido metal divalente (por exemplo, cálcio), age como uma ponte entre a caseína (na forma de caseinato) e o BAC, preferencialmente um BAC hidrossolúvel, mais preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, ou um BAC hidrossolúvel capaz de interagir com o referido metal, deixando o referido BAC preso na fração hidrofóbica das nanopartículas carregadas da invenção.

Em uma modalidade particular, o referido metal é um metal divalente selecionado dentre cálcio, magnésio, zinco, ferro na forma divalente e suas combinações, preferencialmente cálcio. Em outra modalidade particular, o referido metal é um metal trivalente, tal como ferro na forma trivalente.

Apesar de virtualmente qualquer solução aquosa de cálcio, vantajosamente solução grau alimentício, [ver o “Código Geral Padrão para Aditivos Alimentares” GSFA online para uma proporção de sal de cálcio usada em microencapsulamento alimentar] poder ser usada para colocar os referidos processos [1] e [2] da invenção em prática, em uma modalidade particular, a referida solução aquosa de um sal de cálcio é selecionada dentre o grupo consistindo de cloreto de cálcio, acetato de cálcio, gluconato de cálcio, lactato de cálcio, sorbato de cálcio, ascorbato de cálcio, citrato de cálcio, propionato de cálcio, sulfato de cálcio e suas misturas, preferencialmente cloreto de cálcio. Na prática, carbonato de cálcio ou alginato de cálcio não são recomendáveis porque são sais insolúveis ou muito pouco solúveis em água. Similarmente, qualquer solução aquosa de grau alimentício magnésio, zinco ou ferro na forma divalente ou trivalente pode ser usada para colocar os referidos processos [1] e [2] da invenção em prática.

A proporção metahcaseína em peso, em que “metal” refere-se ao referido metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, pode variar dentro de uma ampla gama; entretanto, em uma modalidade particular, a proporção metalxaseína em peso é compreendida entre 1:5 e 1:15, preferencialmente entre 1:7 e 1:10, mais preferencialmente em torno de 1:8,5. Em uma modalidade particular, o referido metal é um metal divalente.

O processo [2] da invenção lava à obtenção de nanopartículas carregadas da invenção e, para isso, a etapa a) compreende misturar (i) uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um primeiro aminoácido básico com (ii) uma solução contendo um BAC. As características do referido BAC foram previamente mencionadas. Em uma modalidade particular o referido BAC é um BAC hidrossolúvel, preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, por exemplo, ácido fólico, ácido 4-aminobenzoico, niacina ou vitamina B3, ácido pantotênico ou vitamina B5, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutâmicos (derivados de ácido fólico: folato poliglutamatos; poliglutamato folatos), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialurônico, ácido tióctico, ácido p-coumárico, ácido cafeico, seus ésteres ou sais farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou derivados grau alimentício e suas misturas. Em outra modalidade particular, o referido BAC é um BAC lipossolúvel, por exemplo, uma vitamina das famílias A, D, E, K e seus derivados, um fosfolipídio, um carotenoide (por exemplo, carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), um ácido graxo omega-3 (por exemplo, DHA, EPA etc.), um aminoácido (por exemplo, iso-leucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofan, e valina), um fitostanol ou um fitosterol (por exemplo, sitosterol, campesterol, stigmasterol etc.), um polifenol (quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isorhamnetin etc.) ou seus derivados.

A proporção BACxaseína em peso na nanopartícula carregada da invenção pode variar dentro de uma ampla gama; em uma maneira ilustrativa não limitante, a proporção BAC:caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção pode ser compreendida entre 1:1 e 1:200, preferencialmente entre 1:10 e 1:80, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:15 e 1:35. Em uma modalidade particular, o BAC é um BAC hidrossolúvel, e a proporção BAC (hidrossolúvel):caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção é compreendida entre 1:1 e 1:50, preferencialmente entre 1:10 e 1:30, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:15 e 1:20, Em outra modalidade particular, o BAC é um BAC lipossolúvel, e a proporção entre BAC (lipossolúvel):caseína em peso na nanopartícula carregada da invenção é compreendida entre 1:1 e 1:200, preferencialmente entre 1:10 e 1:80, mais preferencialmente entre aproximadamente 1:20 e 1:35.

Da mesma forma, a proporção aminoácido básico:BAC em peso (correspondente à solução aquosa (ii) contendo BAC hidrossolúvel ácido e um segundo aminoácido básico usado na etapa a) do processo [2] da invenção) pode variar dentro de uma ampla gama; entretanto, em uma modalidade particular, a proporção aminoácido básico: BAC (hidrossolúvel ácido) em peso em uma referida solução (ii) é compreendida entre 1:0,1 e 1:3, preferencialmente entre 1:0,5 e 1:1, mais preferencialmente em torno de 1:0,75.

Como mencionado anteriormente, as nanopartículas da invenção, ambas aquelas que são carregadas com um BAC e aquelas que não são, podem incorporar um antioxidante, por exemplo, ácido ascórbico (vitamina C) etc., na sua formulação com o propósito de aumentar sua estabilidade em relação à temperatura e oxidação. Neste caso, o referido antioxidante poderia ser co-encapsulado com o BAC (onde apropriado) ou no revestimento das nanopartículas da invenção; para isso, os referidos processos [1] e [2] da invenção serão adequadamente adaptados para incorporar o antioxidante na formulação das nanopartículas, por exemplo, através da adição do antioxidante à solução aquosa contendo o referido BAC e um aminoácido básico.

Em uma modalidade particular, o BAC é ácido fólico e o antioxidante é ácido ascórbico, que parece agir protegendo o ácido fólico de degradação por radiação ultravioleta, alteração de pH, calor, oxigênio etc., e adicionalmente provê o suporte nutritivo do ácido ascórbico. O referido antioxidante poderia ser co-encapsulado com o BAC ou introduzido no revestimento das nanopartículas da invenção.

Adicionalmente, se desejado, ambos o processo [1] da invenção e o processo [2] da invenção podem incluir uma ou mais etapas adicionais para estabilizar as nanopartículas obtidas por meio do uso de tratamentos diferentes.

Em uma modalidade particular, o referido tratamento de estabilidade compreende submeter a suspensão contendo as nanopartículas da invenção formadas, ambas aquelas que são carregadas com um BAC e aquelas que não são, a um tratamento de alta pressão, por exemplo, a uma pressão compreendida entre 100 e 800 MPa, tipicamente entre 350 e 600 MPa. Em uma modalidade particular, o referido tratamento compreende submeter a suspensão de nanopartículas a ciclos de 3 a 5 minutos a uma pressão de 100 MPa a 800 MPa, tipicamente entre 350 e 600 MPa; de fato, uma pressão de 400 MPa provê bons resultados.

Em outra modalidade particular, o referido tratamento de estabilidade compreende submeter a suspensão contendo as nanopartículas da invenção formadas, ambas aquelas que são carregadas com um BAC e aquelas que não são, a um tratamento UHT (Temperatura Super Alta), por exemplo, a uma temperatura compreendida entre 130°C e 140°C por 2 a 5 segundos, seguido por rápido resfriamento.

Da mesma forma, se desejado, ambos o processo [1] da invenção e o processo [2] da invenção podem incluir uma etapa de secagem para secar a suspensão contendo as nanopartículas formadas a fim de obter as nanopartículas da invenção, ambas aquelas que são carregadas com um BAC e aquelas que não são, na forma de um pó. Esta forma apresentação das referidas nanopartículas contribui para sua estabilidade e é ainda particularmente útil para sua eventual aplicação em alimentos sólidos, tais como farinha, pão, produtos de pastelaria, cereais, leite em pó etc., bem como em produtos cosméticos e/ou farmacêuticos.

Virtualmente, qualquer técnica ou método convencional adequado para secar suspensões contendo nanopartículas pode ser usado para realizar esta etapa de secagem; entretanto, em uma modalidade particular, a secagem da suspensão contendo nanopartículas é realizada por meio de atomização ou por meio de liofilização. Este tratamento é geralmente realizado através da adição de um agente protetor adequado das referidas nanopartículas, tal como um sacarídeo, por exemplo, lactose, trealose, manitol, sacarose, maltodextrina, glicose, sorbitol, maltose etc., e suas misturas à suspensão das nanopartículas. O referido agente protetor protege as nanopartículas da invenção contra degradação por calor as bem como oxidação durante o processo de secagem.

A proporção caseína:sacarídeo em peso pode variar dentro de uma ampla gama; entretanto, em uma modalidade particular, a proporção caseína:sacarídeo em peso é compreendida entre 1:1 e 1:4, preferencialmente em torno de 1:2.

Da mesma forma, em uma modalidade particular, a solução contendo o sacarídeo poderia ainda conter um agente antioxidante, tal como ácido ascórbico (vitamina C) etc.; neste caso, a proporção caseína:sacarídeo: agente antioxidante, por exemplo, vitamina C, em peso poderia ser 1:0,75-2,5:0,01-1,5, preferencialmente 1:2.0:0,10,

As nanopartículas da invenção obtidas de acordo com o processo [1] da invenção, ou seja, as nanopartículas compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, produzidas por meio de um processo que compreende: a) preparar uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um aminoácido básico; e b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à solução da etapa a), formam um aspecto adicional da presente invenção.

Da mesma forma, as nanopartículas carregadas da invenção obtidas de acordo com processo [2] da invenção, ou seja, as nanopartículas compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico, um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, e um BAC, produzidas por meio de um processo que compreende: a) misturar (i) uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um primeiro aminoácido básico com (ii) uma solução contendo um BAC; e b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à mistura resultante da etapa a), forma um aspecto adicional da presente invenção.

Aplicações

As nanopartículas da invenção podem ser usadas como aditivos tecnológicos, por exemplo, lipo substituintes etc. Eles também têm a capacidade para encapsular um BAC, por exemplo, um BAC hidrossolúvel ou um BAC lipossolúvel.

Em uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção permitem o encapsulamento de um BAC, preferencialmente um BAC hidrossolúvel, mais preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido, e sua incorporação em composições farmacêuticas, cosméticas e alimentícias, já que outros ingredientes que não são polímeros naturais (evitando toxicidade associada com polímeros sintéticos) e não grau alimentício não são usados na sua preparação e nos produtos finais (nanopartículas). As referidas nanopartículas protegem o BAC de degradação através de agentes externos (luz, alteração de pHs, oxidação etc.).

Vantajosamente, as nanopartículas da invenção têm um tamanho menor que 1 µm, preferencialmente compreendido entre 50 e 200 nm, mais preferencialmente em torno de 140 nm, a fim de evitar a alteração de propriedades organolépticas (textura no palato).

Da mesma forma, as nanopartículas da invenção melhoram a biodisponibilidade do BAC no intestino, protegendo o referido BAC das condições do ácido péptico do estômago e facilitando sua dissolução e liberação no intestino.

As nanopartículas da invenção podem ser resuspensas em meio aquoso protegendo o BAC de degradação em dissolução. Elas podem ainda ser apresentadas na forma de pó seco, mantendo o BAC em uma condição estável e permitindo sua estocagem por longos períodos de tempo (particularmente, para sua incorporação em preparados alimentícios sólidos).

Adicionalmente, as nanopartículas da invenção também são adequadas para a preparação de composições cosméticas e farmacêuticas para uso tópico.

Portanto, em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição, doravante “composição da invenção”, compreendendo pelo menos uma nanopartícula da invenção; em uma modalidade particular, a nanopartícula da invenção é uma nanopartícula compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações; em outra modalidade particular, a nanopartícula da invenção é uma nanopartícula carregada de uma invenção, ou seja, uma nanopartícula compreendendo uma matriz de caseína, um aminoácido básico, um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, e um BAC com atividade nutritiva, terapêutica e/ou cosmética, e um transportador farmacêutico ou cosmeticamente aceitável ou um transportador adequado para alimento.

Em uma modalidade particular, o referido BAC é selecionado dentre o grupo consistindo de aminoácidos, agentes antimicrobianos, agentes aromatizantes, conservantes, adoçantes, esteroides, drogas, hormônios, lipídios, peptídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos, proteínas, proteoglicanos, agentes saborizantes, vitaminas, e suas misturas.

Em uma modalidade particular, o referido BAC é um BAC hidrossolúvel, preferencialmente BAC hidrossolúvel ácido. Exemplos ilustrativos não limitantes de BACs hidrossolúveis incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias B ou C e os derivados, seus sais ou ésteres; ácido hialurônico, sulfato de condroitina, ácido tióctico, seus sais ou ésteres etc. Em uma modalidade particular, o referido BAC hidrossolúvel é selecionado dentre o grupo consistindo de ácido fólico, ácido 4-aminobenzoico, niacina, ácido pantotênico, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutâmicos (derivados de ácido fólico: folato poliglutamatos; poliglutamato folatos), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialurônico, ácido tióctico, ácido p-coumárico, ácido cafeico, seus ésteres ou sais farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou derivados grau alimentício e suas misturas.

Em outra modalidade particular, o referido BAC é um BAC lipossolúvel. Exemplos ilustrativos não limitantes de BAC lipossolúvel incluem vitaminas, por exemplo das famílias A, D, E, K e seus derivados, fosfolipídios, carotenoides (carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), ácidos graxos ômega 3 (por exemplo, DHA, EPA etc.), aminoácidos (por exemplo, iso-leucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofan, e valina), fitostanóis e fitosteróis (por exemplo, sitosterol, campesterol, stigmasterol etc.), polifenóis (por exemplo, quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isorhamnetin etc.) e seus derivados.

Em uma modalidade particular, a composição da invenção é uma composição farmacêutica adequada para sua administração por via tópica; para isso, a referida composição compreende um transportador farmaceuticamente aceitável, o que compreende um ou mais excipientes adequados para administração por via tópica, por exemplo, na forma de um gel, pomada, creme etc. Informações sobre excipientes adequados para a formulação de composições farmacêuticas destinadas à administração por via tópica bem como sobre a produção das referidas composições farmacêuticas podem ser encontradas no livro “Tratado de Farmacia Galénica”, de C. Faulí i Trillo, 10a Edição, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones. A dose de nano partículas da invenção a ser administrada pode variar dentro de uma ampla gama, por exemplo, entre aproximadamente 0,5 (g/cm2 de área a ser tratada) e aproximadamente 2 (g/cm2 de área a ser tratada) de uma composição da invenção contendo entre 0,1% e 30% das nanopartículas da invenção, preferencialmente entre 0,5% e 5%.

Em outra modalidade particular, a composição da invenção é uma composição cosmética adequada para administração por via tópica; para isso, a referida composição compreende um transportador cosmeticamente aceitável compreendendo um ou mais excipientes adequados para administração por via tópica, por exemplo, na forma de um gel, creme, xampu, loção etc. Informações sobre excipientes adequados para a formulação de composições cosméticas destinadas à administração por via tópica bem como sobre a produção das referidas composições farmacêuticas podem ser encontradas no livro “Manual de Cosmetología”, de Octavio Díez Sales, 1a Edição, 1998, Editorial Videocinco, S.A.

Em outra modalidade particular, a composição da invenção é uma composição alimentícia, tal como um preparado alimentício sólido, líquido ou semi-sólido.

Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende:
caseína, entre 10% e 50% em peso;
ácido fólico, entre 0,9% e 2,5% em peso;
cálcio, entre 1% e 6% em peso; e
um aminoácido básico, entre 1 % e 7% em peso; e
um sacarídeo, entre 30% e 80% em peso,
em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total de uma composição.
Em outra modalidade particular, a composição da invenção compreende:
caseína, entre 10% e 50% em peso;
ácido fólico, entre 0,9% e 2,5% em peso;
cálcio, entre 1% e 6% em peso; e
um aminoácido básico, entre 1 % e 7% em peso;
um sacarídeo, entre 20% e 55% em peso; e
ácido ascórbico, entre 1% e 25%,
em que todas as proporções são em peso em relação ao peso total de uma composição.

Alternativamente, a composição da invenção pode ser incorporada em um gênero alimentício ; portanto, em outro aspecto, a invenção refere-se a um gênero alimentício compreendendo uma composição da invenção. O referido gênero alimentício pode ser encontrado em forma líquida, semi-sólida ou sólida. Vantajosamente, a fim de evitar ou minimizar a dissolução total ou parcial das nanopartículas da invenção e assim contribuir para sua estabilidade, o referido gênero alimentício tem um pH ácido, ou seja, menor que 7, preferencialmente menor que ou igual a 6, mais preferencialmente menor que ou igual a 5. Exemplos ilustrativos de gêneros alimentícios que podem ser enriquecidos ou fortificados com a composição da invenção incluem leite e seus derivados (iogurtes, queijos, coalhada etc.), sucos, geleias, produtos de padaria e pastelaria, carne fermentada, molhos etc. Similarmente, a composição da invenção pode ser incorporada em produtos alimentícios para animais, por exemplo, em rações.

Exemplos

Os seguintes exemplos descrevem a produção de partículas de caseína que podem incorporar um composto biologicamente ativo .especificamente ácido fólico, dentro delas. Eles são capazes de proteger o composto de degradações às quais ele pode ser submetido no alimento devido a fatores múltiplos previamente mencionados. Os referidos exemplos também têm mostrado a capacidade destas nanopartículas de proteger o ácido fólico de condições gástricas depois da sua ingestão e de liberá-lo no meio intestinal.

Processo geral para produzir nanopartículas de caseína vazias

O processo para a produção de nanopartículas de caseína compreende a dissolução do caseinato de sódio (ANVISA, Madrid, Espanha) em um meio aquoso com uma determinada quantia de aminoácido básico seguida da adição, sob agitação magnética e com fluxo contínuo, de um determinado volume da solução de cálcio, dando origem à formação das nanopartículas com a aparência de uma suspensão leitosa.

Caracterização físico-química das nanopartículas

Os diferentes estudos necessários para alcançar uma caracterização físico-química completa das nanopartículas são descritos abaixo.

O tamanho e a carga da superfície das nanopartículas foram determinados a partir de teses físico-químicos, a última sendo determinada através da medição do potencial zeta. O primeiro dos parâmetros foi obtido através de espectroscopia de correlação de fóton usando um Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments/ Optilas, Espanha), em que o potencial zeta foi medido usando um Analisador de Potencial Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Nova Iorque, EUA).

O rendimento do processo para a formação de nanopartículas foi calculado através da quantificação da caseína livre remanescente depois de obtidas as nanopartículas, coletadas nos sobrenadantes obtidos na centrifugação da formulação (17.000 x g, 20 minutos). Assim, a quantia de caseína que forma partículas em uma formulação foi estimada como a diferença entre a quantia inicial adicionada e a quantia quantificada nos sobrenadantes coletados durante a etapa de purificação. A referida quantificação foi realizada por espectrometria ultravioleta (UV) a 282 nm (Agilent 8453, sistema de espectroscopia de UV visível). O rendimento foi estimado como:
Rendimento (%) = [(mg caseinato total - mg caseinato em sobrenadante) /mg caseinato total] x 100 [Eq. 1]
Para realizar cálculos diferentes, uma curva de calibração entre 150 e 1.500 µg/ml (R2 = 0,9992; LD = 36 µg/ml; LQ = 119 µg/ml) foi usada.

Ademais, um estudo para quantificar o pellet obtido depois da centrifugação foi realizado para confirmar os resultados obtidos pela diferença entre o caseinato total e o caseinato contido no sobrenadante. Neste caso, 0,05 M NaOH foi usado para quebrar as partículas, sendo este o mesmo meio usado para a preparação da curva de calibração. Portanto, neste caso o rendimento foi estimado como:
Rendimento (%) = [(mg caseinato em pellet)/mg caseinato total] x 100 [Eq. 2]

A absorbância máxima encontrada para o caseinato preparado no referido meio foi 300 nm. As concentrações usadas para construir a linha de calibração também variaram entre 150 e 1.500 µg/ml (R2 = 0,9996; LD = 26 µg/ml; LQ = 85 µg/ml).

A morfologia das nanopartículas foi observada através de microscópio eletrônico de varredura (Zeiss, DSM 940A Alemanha). Para isso, as nanopartículas liofilizadas foram revestidas com uma camada de 9 nm de ouro molecular (Emitech K550 Team, Sputter-Coater, Reino Unido) e fotografias foram tiradas com um microscópio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos).

Processo geral para produção de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico

O processo para a produção de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico compreende a dissolução de caseinato de sódio em um meio aquoso com uma determinada quantia de aminoácido básico seguida da adição, sob agitação magnética, de um determinado volume de uma solução de ácido fólico previamente preparada em um meio aquoso com uma determinada quantia de aminoácido básico. Depois de incubar a mistura por alguns minutos, a última etapa consiste da adição de sal de cálcio, dando origem à formação das nanopartículas com a aparência de uma suspensão leitosa amarelada.

Opcionalmente, as nanopartículas formadas podem ser submetidas a tratamentos hidrostáticos de alta pressão (Stansted Fluid Power, ISOLAB Modelo FPG11500B110; Número de série: 7844) em ciclos de entre 1 a 5 minutos entre 100 e 800 MPa a fim de estabilizá-las.

Então, e depois 3 minutos de homogeneização por meio de agitação, um determinado volume de uma solução de sacarídeo (lactose, trehalose, manitol, glicose, sorbitol, maltodextrina ou maltose) é adicionado sem parar a agitação. Finalmente, a suspensão é liofilizada ou é pulverizada em um atomizador (Büchi Mini Spray Drier B-191, Büchi Labortechnik AG, Suíça) sob as seguintes condições:

- Temperatura da entrada de ar: 60-100°C
- Temperatura da saída de ar: 30-90°C
- Pressão do ar: 2-10 bar [2-10 x 105 Pa]
- Taxa de bombeamento de amostra: 2-9 ml/min
- Aspiração: 30-100%
- Fluxo de ar: 200-900 l/h

Opcionalmente, as formulações podem ser secas depois da adição do sacarídeo por meio de liofilização em vez de por meio de atomização.

Determinação da quantia de ácido fólico associada às partículas de caseína

A quantia de ácido fólico associada às nanopartículas foi quantificada através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de acordo com o processo descrito por Faye [Faye Russell, L, Quantitative Determination of Water -Soluble Vitamins. Em Food Analysis by HPLC, Nollet, L.M.L. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, Segunda Edição, Capítulo 10 (2000) pp. 444-445]. A análise foi realizada em um modelo de cromatografia da série 1100 LC (Agilent, Waldbornn, Alemanha) acoplado a um sistema de detecção de UV de arranjo de diodos. Os dados foram analisados em um computador Hewlett-Packard por meio do software Chem-Station G2171. Para a separação do ácido fólico, uma coluna Alltech C18 Alltima™ (5µm, 150 mm x 2,1 mm) aquecida a 40°C foi usada com uma coluna compatível Gemini® C18 AJO-7596. A fase móvel foi feita de uma mistura de H3PO4 (33 mM, pH 2,3)/acetonitrila em um gradiente (Tabela 1) e foi bombeada a um fluxo de 0,25 ml/min. A detecção foi realizada a 290 nm. O volume de injeção de amostra foi 10 μΙ. O tempo de retenção de ácido fólico é 22,6 ± 0,5 minutos.
Tabela 1
Condições gradientes para a fase móvel (A: H3PQ4 33 mM, B: Acetonitrila)

Previamente à quantificação da amostra, diferentes linhas de calibração de concentrações entre 2 e 400 µg/ml foram preparadas, obtendo resultados precisos e exatos maiores que 95% com a confirmação de que a presença de caseína e/ou aminoácidos na solução não interferiria na quantificação correta do ácido fólico.

Para análise de amostras frescas (antes de secá-las), os sobrenadantes obtidos depois da filtração de um determinado volume de uma formulação foram quantificados através de tubos de diálise Vivaspin® 300.000 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius stedim Biotech, Alemanha). O pellet foi, por sua vez, dissolvido em 0,05 M NaOH para quebrar as partículas e para manter a caseína e o ácido fólico e o aminoácido em solução e para, assim, proceder a sua quantificação. A soma do conteúdo de ácido fólico encontrado em ambas as frações (sobrenadante e pellet) coincidiu todas as vezes com o total inicialmente adicionado. Adicionalmente, também foi possível quantificar a quantia total de ácido fólico através da dissolução de 1 ml de uma formulação em 1 ml de 0,05M NaOH. Este estudo permitiu confirmar que as diferenças entre a quantia de ácido fólico adicionada e o ácido fólico obtido por quantificação através de cromatografia descrito são maiores do que 10% em todos os casos.

Além disso, 10 mg de nanopartículas foram retirados para a quantificação das amostras em pó; elas foram resuspensas em 2 ml de água e centrifugadas, então procedeu-se da mesma forma que com as amostras frescas.

Estudo da cinética de liberação para a liberação de ácido fólico das nanopartículas em meio gastrointestinal simulado

A cinética de liberação para a liberação de ácido fólico das nanopartículas foi determinada através da dispersão de aproximadamente 10 mg dele em 2 ml de meio gastrointestinal simulado (0 a 2 h) (USP XXIII) a 37±1°C. Em tempos determinados as suspensões de nanopartículas foram centrifugadas (17,000 x g, 20 minutos) e a quantia de ácido fólico no sobrenadantes foi quantificada pelo método HPLC mencionado acima. Depois da remoção dos sobrenadantes do meio gástrico, o meio intestinal simulado foi adicionado (2 a 24 horas) (USP XXIII) a 37±1°C, então procedeu-se da mesma forma que no caso acima.

A porcentagem de ácido fólico liberada em todas as vezes foi calculada considerando-se o conteúdo total da vitamina presente em uma formulação tomada para cada estudo.

Estudos farmacocinéticos. Biodisponibilidade de ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína

Os estudos farmacocinéticos foram realizados de acordo com as regras do Comitê de Ética Institucional, bem como a legislação europeia sobre animais de laboratório (86/609/EU). Para isso, 25 ratos Wistar machos com um peso médio de 200 g foram submetidos a condições de luz escura normal (12 horas - 12 horas) e, durante a semana anterior ao estudo, foram alimentados por demanda com uma ração deficiente de ácido fólico (Folic Acid Deficient Diet. TD. 95247. Harlan, EUA) e água. Doze horas antes da administração das formulações, os ratos foram isolados em gaiolas metálicas sem acesso à comida, mas com livre acesso à água potável.

Os animais foram divididos em 5 grupos de tratamento (5 ratos por grupo). Apenas 1 ml de PBS (tampão fosfato pH 7.4) foi administrado por via oral para o primeiro grupo. Os três grupos seguintes foram tratados com doses orais de apenas 1 mg/kg (200 µg/rato) de ácido fólico incorporado em qualquer uma das seguintes formulações: (i) ácido fólico livre (não-encapsulado) (Aditio, Panreac Química, Barcelona, Espanha); (ii) nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado; (iii) nanopartículas de caseína tratadas através de alta pressão com ácido fólico encapsulado. 1 ml de cada uma das diferentes formulações dispersas em água foi administrado através de uma cânula gastresofágica. Finalmente, a mesma dose de ácido fólico livre (1 mg/kg) dissolvido em soro salino (0,5 ml) foi administrada para o quinto grupo por via intravenosa na veia safena.

Antes de administrar as formulações, o sangue foi drenado da veia safena do rabo a fim de conferir o nível de vitamina basal em cada rato. Depois da administração, um volume de aproximadamente 500 μΙ de sangue foi drenado em tempos diferentes usando tubos separadores de soro (SARSTEDT Microtubo 1.1 ml Z-Gel). Em todos os casos, o sangue foi drenado depois de fazer o animal dormir usando anestesia inalatória (isoflurano:oxigênio) para evitar que os ratos sintam dor, conferindo suas constantes em todos os tempos.

Subsequentemente, o volume de sangue foi substituído pela administração intraperitoneal de 500 μΙ de soro fisiológico salino previamente aquecido a temperatura do animal. Durante este período a condição dos animais foi examinada (mobilidade, agressividade, reações alérgicas e temperatura), nenhuma alteração significativa foi observada.

Pré-tratamento e quantificação do ácido fólico das amostras de soro

A quantificação de ácido fólico nas amostras de soro obtidas depois de centrifugar os tubos com sangue (6,000 rpm, 20 min, 20°C) foi realizada por meio de uma técnica de imunoensaio enzimático. Para isso, um Kit Elisa (Diagnostic automation, INC. Calabasas, Califórnia EUA) aprovado pelo FDA para a determinação quantitativa de ácido fólico em alimentos foi usado. A amostra de soro foi quantificada sem tratamento prévio e seguindo as instruções do fabricante.

Como o kit é projetado para uso em alimentos, uma série de estudos prévios foi realizada a fim de confirmar sua capacidade de quantificar uma vitamina em amostras de soro. Os referidos estudos consistiram na realização de uma comparação exaustiva entre os resultados obtidos por meio do kit e aqueles obtidos pelo método de cromatografia líquida de alto desempenho descrito em sessões anteriores, com o seguinte processo de preparação prévia: quantias variáveis (0-300 µl) de ácido fólico dissolvido em uma solução 50 mM de tetraborato de sódio preparado em 1% (w/v) de ascorbato de sódio foram adicionadas a 50 µl de soro. A solução resultante levou a um volume final de 350 μΙ (diluição de soro 1:7) com solução de 50 mM de tetraborato de sódio. Cada mistura foi levada à fervura por 30 minutos e foi subsequentemente resfriada a 2°C e foi conservada de um dia para o outro à temperatura referida.

Depois de centrifugar as amostras resultantes a 20,000 rpm por 20 minutos e filtrá-las através de um filtro de 20 µm, seu conteúdo de ácido fólico foi quantificado por meio do uso do método de cromatografia líquida de alto desempenho previamente descrito. Neste caso, e devido à baixa concentração de soro da vitamina, a técnica de adição padrão foi usada para minimizar erros na quantificação e remover qualquer interferência da matriz.

Em todos os casos estudados, as diferenças nas concentrações de ácido fólico no soro de ambos os métodos foram menores que 10%. Portanto, a técnica de imunoensaio enzimático foi escolhida para quantificar a integridade das amostras, uma vez que requer menos quantia de soro para análise e é uma técnica mais simples e rápida, cujo limite de detecção (2 ng/ml) é muito menor que aquele da técnica de cromatografia.

Processo geral para a produção de nanopartículas de caseína contendo uma substância ativa lipossolúvel: quercetina

O processo para a produção de nanopartículas de caseína contendo quercetina compreende a dissolução de caseinato de sódio em meio aquoso com uma determinada quantia de aminoácido básico seguida pela adição, sob agitação magnética, de um determinado volume de uma solução de ácido ascórbico e, subsequentemente, quercetina previamente dissolvida em etanol. Depois de incubar a mistura por alguns minutos, a última etapa consiste da adição de sal de cálcio, dando origem à formação de nanopartículas com uma aparência de uma suspensão leitosa amarelada.

Opcionalmente, as nanopartículas formadas podem ser submetidas à tratamentos hidrostáticos de alta pressão (Stansted Fluid Power, ISOLAB Model FPG11500B110; Número de série: 7844) em ciclos de entre 1 a 5 minutos entre 100 e 800 MPa a fim de estabilizá-las.

Então, e depois 3 minutos de homogeneização por meio de agitação, um determinado volume de uma solução de sacarídeo (lactose, trehalose, manitol, glicose, sorbitol, maltodextrina ou maltose) é adicionado sem parar a agitação.

Finalmente, a suspensão é liofiiizada, ou é pulverizada em um atomizador (Büchi Mini Spray Drier B-191, Büchi Labortechnik AG, Suíça) sob as seguintes condições:

Opcionalmente, depois de adicionar o sacarídeo, as formulações podem ser secas por meio de liofilização em vez de por meio de atomização.

Determinação da quantia de quercetina associada às partículas de caseína

A quantia de quercetina associada às nanopartículas foi quantificada através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), de acordo com o processo descrito por Lacopini (Lacopini et al., J Food Comp Anal 2008;21:589-598), apesar de com algumas variações. A análise foi realizada em um modelo cromatografia da série 1100 LC (Agilent, Waldbornn, Alemanha) acoplado a um sistema de detecção de UV de arranjo de diodos. Os dados foram analisados em um computador Hewlett-Packard por meio do software Chem-Station G2171. Para a separação do ácido fólico, uma coluna Alltech C18 Alltima™ (5µm, 150mm x 2,1 mm) aquecida a 40°C foi usada com uma coluna compatível Gemini® C18 AJO-7596 e uma mistura de água/metanol/ácido acético glacial em um gradiente (ver Tabela 2) com fase móvel bombeada a um fluxo de 0,25 ml/min. A detecção foi realizada a 260 nm, o volume de injeção da amostra foi 10 µl e o tempo de retenção da quercetina foi de 24.2 ± 0,2 minutos.
Tabela 2
Gradiente de condições para a fase móvel
(A: água, B: metanol, C: ácido acético glacial)

Previamente à quantificação da amostras, diferentes linhas de calibração de concentrações entre 1 e 100 µg/ml em meio hidroalcoólico (75% etanol) foram preparadas, obtendo resultados precisos exatos maiores que 95%.

Para análises de amostras frescas (antes de secá-las), os sobrenadantes obtidos depois do processo para a purificação das nanopartículas por filtração (17000 rpm, 20 min) foram diluídos até a obtenção da solução hidroalcoólica com um conteúdo de 50% (w/v).

Finalmente, a quantia de quercetina associada às nanopartículas [eficiência de encapsulamento (E.E.)] foi calculada como a diferença entre a quantia de quercetina (Q) adicionada inicialmente e a sua quantia quantificada nos sobrenadantes, de acordo com a seguinte equação:

EXEMPLO 1 Preparação e caracterização de nanopartículas vazias de caseína. Rendimento do processo para obtê-las. Influência do tipo de aminoácido usado na estabilidade e características físico-químicas das nanopartículas

1 g de caseinato de sódio foi dissolvido com 90 mg de lisina em 75 ml de água. Subsequentemente, 40 ml de 0,8% de CaCl2 foram adicionados à esta solução sob agitação magnética e fluxo contínuo. Este processo foi realizado em triplicata.

A figura 2 (A e B) mostra as imagens obtidas pelo microscópio eletrônico de transmissão das partículas de caseína obtidas por este método.

Além disso, o mesmo estudo foi realizado na ausência de aminoácido, ou usando 50 mg de arginina em vez de lisina, a fim de entender a influência do tipo de aminoácido nas características físico-químicas das partículas.

A tabela 3 resume os principais parâmetros físico-químicos das nanopartículas resultantes.
Tabela 3
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína (média ± SD, n=10). A proporção em peso entre o aminoácido, lisina ou arginina, e a proteína é 1:11 e 1:20 respectivamente

a PDI: polidispersão;
b Rendimento: Porcentagem de proteína transformada em nanopartículas.

Os estudos estatísticos realizados (teste de amostras independentes não paramétrico: Kruskal-Wallis) mostraram que não há evidência estatisticamente significativa para afirmar que há diferenças entre os parâmetros físico-químicos das formulações. Portanto, pode ser concluído que o tipo de aminoácido não interfere nas referidas características das nanopartículas vazias.

Este mesmo estudo foi realizado através da variação da proporção de aminoácido adicionado à uma formulação, alcançando conclusões similares, ou seja, a proporção e o tipo de aminoácido não interferem nas características finais das partículas vazias.

A fim de entender a estabilidade das formulações, os parâmetros físico-químicos dos três tipos de nanopartículas com o tempo foram medidos. Os resultados obtidos estão incluídos na Tabela 4.
Tabela 4
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína (média ± SD, n=6) com o tempo. A proporção em peso entre o aminoácido, lisina ou arginina, e a proteína é 1:11 e 1:20 respectivamente

PDI: polidispersão.

No momento da sua obtenção, os três tipos de nanopartículas tinham tamanhos da mesma ordem e relativamente polidispersões baixas (considerando que para valores de PDI menores que 0,3 a distribução do tamanho da partícula é homogênea). Estes valores de tamanho e dispersão não mostram variações significativas ao longo do estudo integral no caso das nanopartículas formuladas com aminoácido. Entretanto, duas horas depois de obtê-las, as nanopartículas que não foram formuladas com aminoácido tinham um incremento considerável tanto no seu tamanho médio quanto na sua polidispersão (para valores de polidispersão maiores que 0,3 o valor do tamanho da partícula não é representativo, é apenas uma diretriz, já que há grande heterogeneidade nos diâmetros), alcançando valores de polidispersão muito altos depois do término do estudo. Os referidos incrementos são indicativos da existência de agregação de fenômenos entre as partículas. Estes fenômenos são até confirmados em uma escala macroscópica desde que quando as três formulações são observadas com o tempo, foi confirmado que as nanopartículas sem aminoácido precipitam dando origem à formação de uma camada leitosa, enquanto as nanopartículas formuladas com aminoácido formam uma suspensão homogênea. Em vista destes resultados, é considerado que a presença do aminoácido é essencial para se obter partículas que são estáveis com o tempo.

Além disso, os três tipos de formulações foram novamente preparados e suas características físico-químicas depois de serem secos por meio da técnica de atomização foram estudados. As condições do processo foram:

- Temperatura da entrada de ar: 90°C
- Temperatura da saída de ar: 49°C
- Pressão do ar: 6 bar [6 x 105 Pa]
- Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 ml/min
- Aspiração : 100%
- Fluxo de ar: 600 l/h

Este estudo foi desenvolvido com o propósito de entender a influência do aminoácido quando as nanopartículas estão secas no momento da sua obtenção já que, naquele instante, nenhuma das formulações apresentam fenômenos de agregação. Os resultados obtidos estão incluídos na Tabela 5.
Tabela 5
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína (média ± SD, n=3) secas por meio de atomização. A proporção em peso entre o aminoácido, lisina ou arginina, e a proteína é 1:11 e 1:20 respectivamente

Após a ressuspensão as nanopartículas com aminoácido seco em pó em meio aquoso, foi observado que a distribução do tamanho continua a ser monodispersado e seus tamanhos são ligeiramente maiores que aqueles dos seus homólogos antes de serem secos por atomização. Entretanto, as nanopartículas formuladas sem aminoácido têm valores de tamanho polidispersão maiores, que indicam que podem ter sofrido fenômenos de agregação durante a secagem. Assim, a presença de aminoácido também é necessária quando as partículas são secas por meio de atomização.

Em vista disto, conclui-se que as características físico-químicas das nanopartículas com aminoácido diferem daquelas que não o contêm; elas têm menos tendência de agregação e são, portanto, as formulações escolhidas para encapsular compostos biologicamente ativos.

EXEMPLO 2 Preparo e caracterização de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico. Influência de conteúdo de lisina e ácido fólico na eficiência de encapsulamento

Soluções diferentes, todas contendo 100 mg de caseinato de sódio e quantias variáveis de lisina (0-8,5 mg) foram preparadas em um volume final de 7,5 ml de água.

Além disso, 300 mg de ácido fólico foram dissolvidos com 400 mg de lisina em 50 ml de água.

Subsequentemente, 1 ml de solução de ácido fólico foi adicionada à solução de caseinato. Depois 5 minutos de incubação, 4 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo. Este processo foi realizado triplicata para cada tipo de formulação.

A figura 3 mostra as imagens, obtidas por microscópio eletrônico de transmissão, das partículas de caseína com ácido fólico encapsulado obtidas por este método.

As características físico-químicas obtidas em cada caso estão incluídas na Tabela 6:
Tabela 6
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com ácido fólico e quantias variáveis de lisina (média ± SD, n = 6). A proporção em peso entre o ácido fólico e a proteína é 1:17

a Anterior à adição de solução de ácido fólico
FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

Os estudos estatísticos estudos realizados (teste de amostras independentes não paramétrico: Kruskal-Wallis) mostraram que não há evidência significativa estatisticamente para considerar que há diferenças nas características físico-químicas das últimas três formulações incluídas na tabela (com conteúdos de lisina de 3.9; 4,5; e 8,5 mg). No primeiro caso, foi confirmado que, apesar da solução de ácido fólico ter lisina, a ausência do aminoácido na solução inicial de caseinato favorece a precipitação parcial de ácido fólico com cálcio, o que causa erros em uma quantificação de vitamina, já que nem todo o ácido fólico no pellet é encapsulado depois da centrifugação.

Estudos adicionais permitiram a confirmação de que quando a solução de vitamina contém aminoácido, mas a solução de caseinato não, a quantia máxima de ácido fólico que pode ser incorporada em uma formulação sem que ela precipite é 4 mg, resultados similares àqueles na Tabela 6 (25,5 ± 1 µg FA/mg NP e eficiência de encapsulamento: 68.7 ± 0,5) sendo então obtidos. Assim, é confirmado que a presença de aminoácido não influencia a quantia de vitamina encapsulada. Entretanto, como as nanopartículas formuladas sem aminoácido são menos estáveis e têm maior tendência de agregação (ver Exemplo 1), as formulações foram executadas na presença de tal aminoácido.

A fim de entender a influência da quantia de ácido fólico adicionada a uma formulação nas características físico-químicas das partículas, o mesmo estudo foi realizado apenas variando a quantia de solução de ácido fólico adicionada, a quantia de aminoácido na solução do caso inicial em todos os casos sendo constante: 8,5 mg.

A figura 4 mostra a proporção entre a quantia de ácido fólico encapsulado como uma função da quantia de vitamina adicionada à formulação.

Os tamanhos encontrados nas formulações estudadas oscilaram entre 132 e 140 nm com a polidispersão menor que 0,2 em todos os casos. Neste exemplo, os valores de eficiência de encapsulamento não são comparáveism já que a quantia de ácido fólico adicionada a cada formulação é diferente. O valor máximo foi 73.1 ± 7,5 para uma proporção caseína:ácido fólico em peso de 13,5:1.

Como consequência deste estudo, pode ser concluído que, como a proporção mg caseína/mg FA em uma formulação é reduzida (ou seja, como a quantia inicial de ácido fólico adicionada à formulação aumenta), uma quantia aumentada de ácido fólico encapsulado dentro das nanopartículas é obtida. Entretanto, quando a quantia de caseína presente em uma formulação (em mg) para cada mg de ácido fólico é menor que os valores experimentados, formulações precipitadas e instáveis, tais como aquelas que ocorreram em uma ausência de lisina, são observadas.

EXEMPLO 3 Preparação e caracterização de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico seco por atomização. Influência do processo de secagem na formulação final

Duas soluções, ambas contendo 1.000 mg de caseinato de sódio e 90 mg de lisina, foram preparadas em um volume final de 75 ml de água.

Além disso, 600 mg de ácido fólico foram dissolvidos com 800 mg de lisina em 100 ml de água.

Subsequentemente, 7,5 ml da solução de ácido fólico foram adicionados a cada solução de caseinato. Depois de 5 minutos de incubação, 40 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo.

Finalmente, uma das formulações foi centrifugada para a quantificação de ácido fólico no sobrenadante e pellet, enquanto 1.900 mg de lactose foram adicionados à outra antes de secá-la por meio do uso de um atomizador. As condições do processo foram:

- Temperatura da entrada de ar: 90°C
- Temperatura da saída de ar: 45°C
- Pressão do ar: 6 bar [6 x 105 Pa]
- Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 ml/min
- Aspiração : 95%
- Fluxo de ar: 600 l/h

As características físico-químicas observadas em ambos os casos estão incluídas na Tabela 7.
Tabela 7
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com ácido fólico quantificado em nanopartículas frescas ou depois de secá-las pelo atomizador (média ± SD, n = 6). A proporção em peso entre lisina e proteína na formulação final é 1:7, e a proporção entre o ácido fólico e a caseína é 1:22

FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

Os estudos estatísticos realizados (teste de amostras independentes não paramétrico: Kruskal-Wallis) mostraram que há uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre as eficiências de encapsulamento obtidas para ambas as formulações. Esta diferença pode ser devida ao processo para secagem de uma formulação por atomização à temperatura indicada, causando uma degradação parcial das nanopartículas de caseína, dando origem à liberação de parte do ácido fólico previamente encapsulado.

Estes resultados mostram a necessidade de se aplicar um método para reticular as partículas, já que assim sua estabilidade pode ser aumentada e a já mencionada redução de eficiência de encapsulamento no processo de centrifugação ou secagem de uma formulação é evitada.

EXEMPLO 4 Preparação e caracterização de nanopartículas de caseína com lisina. contendo ácido fólico estabilizado através de alta pressão e seco por meio da técnica de atomizacão. Influência do tratamento nas características físico-químicas das nanopartículas

Soluções diferentes, todas contendo 1.000 mg de caseinato de sódio e 90 mg de lisina, foram preparadas em um volume final de 75 ml de água.

Subsequentemente, 7,5 ml da solução de ácido fólico foram adicionados à solução de caseinato. Depois 5 minutos de incubação, 40 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo.

Uma vez que as partículas foram formadas, as formulações foram transferidas para selar sacos plásticos e submetidas à tratamento hidrostático de alta pressão (0 MPa; 100 MPa, 5 minutos; 200 MPa, 5 minutos; 400 MPa, 5 minutos; 600 MPa, 5 min, ou 800 MPa, 5 min).

Uma vez terminado o processo, 1.900 mg de lactose dissolvidos em água foram adicionados a cada formulação e a secagem foi realizada usando a técnica de atomização sob as seguintes condições:

- Temperatura da entrada de ar: 85°C
- Temperatura da saída de ar: 45°C
- Pressão do ar: 6 bar [6 x 105 Pa]
- Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 ml/min
- Aspiração : 95%
- Fluxo de ar: 600 l/h

A tabela 8 resume as principais características físico-químicas das nanopartículas resultantes.
Tabela 8
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com ácido fólico e tratamentos de alta pressão diferentes (média ± SD, n = 6). A proporção final em peso entre a lisina e caseína é 1:7, e a proporção entre o ácido fólico e a caseína é 1:22

FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

Como pode ser observado na Tabela 8, independentemente do tipo de tratamento aplicado às formulações, as nanopartículas têm cargas de superfície similares. Entretanto, os dados permitem detectar que, conforme a pressão aplicada no tratamento aumenta, o tamanho de partícula obtido é menor, alcançando uma redução máxima de 7%. Entretanto, a quantia de vitamina encapsulada (e portanto a eficiência de encapsulamento) alcança valores maiores conforme a pressão aplicada aumenta, 65% de incrementos com relação às formulações sem tratamento (no caso da amostras tratada com 800 MPa) sendo obtidos.

Além disso, A figura 5 mostra as micrografias das formulações sem tratamento de alta pressão e aquelas tratadas com 100, 400 e 800 MPa obtidas através de microscópio eletrônico de varredura. Elas mostram como as nanopartículas sem tratamento hidrostático de alta pressão são parcialmente alteradas pelos diferentes processos aos quais foram submetidas depois de serem obtidas (secas por atomização, centrifugação, realização de micrografia no processo em que altas temperaturas são alcançadas) é confirmado, enquanto que aquelas que foram submetidas ao tratamento de alta pressão diferente são mais estáveis.

Estes resultados mostram que os tratamentos hidrostáticos de alta pressão aplicados reticulam as nanopartículas tornando-as mais estáveis e, portanto, evitando sua degradação depois da centrifugação, secagem e fotografia. Isso tudo explica as eficiências de encapsulamento maiores obtidas nas amostras tratadas porque a degradação parcial das nanopartículas em alguns destes processos para secagem ou centrifugação ocasionaria a liberação de ácido fólico e, portanto, eficiências de encapsulamento mais baixas são obtidas.

EXEMPLO 5 Preparação e caracterização de nanopartículas de caseína com arginina, contendo ácido fólico usando altas pressões, secas por atomizacão. Influência do aminoácido usado no resultado final

Uma solução de 3,065 mg de caseinato de sódio e 123 mg de arginina foi preparada em um volume final de 210 ml de água.

Além disso, 605 mg de ácido fólico foram dissolvidos com 800 mg de arginina em 100 ml de água.

Subsequentemente, 27 ml da solução de ácido fólico foram adicionados à solução de caseinato. Depois de 5 minutos de incubação, 120 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo.

Uma vez que as partículas foram formadas, a formulação foi transferida para um saco plástico vedado e foi submetido a um tratamento hidrostático de alta pressão consistindo de um ciclo de 5 minutos a 400 MPa.

Uma vez terminado o processo, 5.880 mg de manitol dissolvidos em água foram adicionados a 300 ml de uma formulação tratada através de alta pressão e a secagem foi realizada usando a técnica de atomização sob as seguintes condições:

- Temperatura da entrada de ar: 85°C
- Temperatura da saída de ar: 45°C
- Pressão do ar: 6 bar [6 x 105 Pa]
- Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 ml/min
- Aspiração: 95%
- Fluxo de ar: 600 l/h

As principais características físico-químicas da formulação resultante estão resumidas na Tabela 9.
Tabela 9
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com arginina e ácido fólico tratadas através de alta pressão e secas por meio de atomização (média ± SD, n = 6). A proporção final em peso entre a arginina e a proteína é 1:9, e a proporção entre o ácido fólico e a caseína é 1:19

FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

A figura 6 mostra a micrografia de microscópio eletrônico de varredura (SEM) de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico e com arginina em sua formulação com tratamento a 400 MPa, 5 minutos.

Como pode ser visto, a formulação resultante tem características similares às nanopartículas obtidas usando lisina em vez de arginina.

EXEMPLO 6 Estudo da cinética de liberação para a liberação de ácido fólico das nanopartículas em meio gastrointestinal simulado. Influência do tratamento de alta pressão na cinética de liberação

A fim de realizar os estudos de liberação, as formulações em pó descritas no Exemplo 4 (sem tratamento através de altas pressões, tratadas a 100 MPa e a 400 MPa) foram tomadas.

A figura 7 mostra a cinética de liberação obtida para o caso das partículas de amostras sem tratamento através de altas pressões. Nela, é visto que depois de duas horas de incubação em meio gástrico, os valores de liberação de ácido fólico máximos de 4% são alcançados. Entretanto, em condições intestinais, as partículas de caseína foram dissolvidas liberando uma porcentagem aumentada da vitamina (alcançando até 90% nas 24 horas do estudo). Adicionalmente, neste meio, as amostras centrifugadas depois da sua incubação virtualmente não tiveram um pellet de caseína, o que é evidente em sua dissolução, e portanto, uma liberação da vitamina. Assim, é visto que a formulação projetada faz com que o ácido fólico seja encapsulado através do trato gástrico, evitando que as condições do estômago reduzam sua biodisponibilidade. Adicionalmente, as nanopartículas foram dissolvidas no intestino, favorecendo a liberação da vitamina e eliminando qualquer problema de toxicidade que possa se originar devido à presença de nanopartículas.

No caso das amostras tratadas através de altas pressões, A figura 8 (A e B) mostra sua cinética de liberação. Nelas, pode ser visto que o perfil é muito similar àquele encontrado para amostras sem altas pressões tratamento, a porcentagem máxima de liberação depois de 6 horas em meio intestinal simulado sendo (70%), ligeiramente menor que aquela encontrada para as amostras sem tratamento neste momento (80%).

Assim, a aplicação de alta pressão hidrostática às nanopartículas de caseína para sua reticulação não modifica significativamente o perfil de liberação de ingrediente das mesmas, apesar da quantia total da vitamina liberada depois de 6 horas reduzir em até 10%.

EXEMPLO 7 Estudo farmacocinético de ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína

A tabela 10 resume as principais físico-químicas das nanopartículas testadas no estudo farmacocinético. Ambos os tipos de nanopartículas (com e sem tratamento de alta pressão) foram obtidos seguindo o processo descrito no Exemplo 5.
Tabela 10
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com ácido fólico (média ± SD, n = 6) usada nos estudos farmacocinéticos

FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula; Cas NP FA: Nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado; Cas NP FA HP: nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado tratado com alta pressão (400 MPa, 5 min).

O estudo farmacocinético foi dividido em três fases. A primeira fase consistiu da administração intravenosa de 1 mg/kg de ácido fólico dissolvido em tampão de fosfato; a segunda fase consistiu da administração oral de 1 ml de tampão de fosfato aos ratos de um grupo de 5 ratos Wistar machos (os níveis basais de vitamina com o tempo foram estudados neste grupo de ratos). Finalmente, a terceira fase consistiu da administração oral de 1 mg/kg de (i) ácido fólico dissolvido em água, (ii) ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína, e (iii) ácido fólico encapsulado em nanopartículas de caseína tratado através de altas pressões, a grupos de ratos feitos de 5 animais.

Depois da administração, um volume de aproximadamente 500 µl de sangue foi drenado em tempos diferentes (0, 1, 2, 3, 8 e 24 horas) e coletado em tubos separadores de soro, subsequentemente recuperando o volume de sangue do animal com um volume equivalente ao soro salino por via intraperitoneal. A análise farmacocinética dos dados obtidos depois da administração de ácido fólico foi realizada usando o processo de ajuste não-compartimental do programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, Estados Unidos).

Os resultados obtidos (depois da subtração dos níveis basais) são coletados na Figura 9. Como pode ser observado, a administração i.v. do ácido fólico (Figura 9A) mostra um pico de concentração de droga no soro na primeira entrada de amostra seguida por uma redução drástica dos níveis de droga no soro. Os perfis obtidos quando a vitamina é administrada por via ora! (Figura 9B) são diferentes porque o máximo de concentração é significativamente mais baixo; eles aparecem por tempos mais longos e diminuem de modo mais gradual. Entretanto, ao comparar os níveis de vitamina encontrados depois da administração oral do ácido fólico em sua forma livre (sem ser encapsulado) ou encapsulado em nanopartículas de caseína (com ou sem tratamento de alta pressão), os perfis de concentração em tempos similares foram encontrados, mas os valores máximos foram maiores quando a vitamina encapsulada foi administrada.

Os valores dos parâmetros farmacocinéticos obtidos depois da realização da análise não-compartimental dos dados experimentais do presente estudo estão incluídos na Tabela 11.
Tabela 11
Parâmetros farmacocinéticos das diferentes formulações testadas (média ± SD, n = 5)

* p< 0,05 vs. fólico ácido não encapsulado. Teste Mann Whitney U.
** p< 0,01 vs. ácido fólico não encapsulado. Teste Mann Whitney U.
AUC : área sob a curva de concentração de soro
Cmax: concentração máxima
Tmax: tempo em que Cmax é alcançado
MRT: média de tempo de residência
FR: biodisponibilidade relativa por porcentagem.

Como pode ser observado, os valores da AUC submetem-se a variações significativas dependendo do tipo de formulação usada. Quando a vitamina é encapsulada em nanopartículas de caseína, os valores da AUC são significativamente maiores do que aqueles depois da administração do ácido fólico livre e são adicionalmente mantidos com o tempo até 24 horas depois da administração. Foi observado que uma média do tempo de residência (MRT) do ácido fólico em plasma foi similar nas duas formulações de nanopartícula e maior se comparado à forma livre (oral e i.v.).

De acordo com estes resultados, a biodisponibilidade oral das nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado, que era 52% em ambas as formulações, 45% maior do que aqueles valores obtidos depois da administração oral do ácido fólico livre por via oral, foi calculada.

EXEMPLO 8 Preparação cosmética [1] com nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado

Uma solução contendo 200 mg de caseinato de sódio e 18 mg de lisina foi preparada em um volume final de 15 ml de água.

Subsequentemente, 1,5 ml da solução de ácido fólico foram adicionados à solução de caseinato. Depois de 5 minutos de incubação, 8 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo.

Finalmente, a formulação foi centrifugada a 17,000 x g, 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi resuspenso em 25 ml de água.

Além disso, uma solução contendo 7 g de glicerina e 0,2 g de sódio de nipagin em 42 ml de água foi preparada. A solução foi aquecida em uma água de banho até 50°C e subsequentemente a solução aquosa de nanopartículas de caseína contendo ácido fólico foi adicionada, uma solução aquosa final com a qual a formulação cosmética será preparada, sendo obtida.

Além disso, 25 g de Neo PCL O/W também aquecidos a 70°C até seu completo derretimento. Uma vez derretida esta fase de gordura, a solução aquosa foi adicionada sob constante agitação até a obtenção de uma emulsão O/W que foi correta e estável com o tempo. A avaliação organoléptica do creme resultante foi positiva, tendo uma aparência homogênea e sem caroços.

Este mesmo estudo também foi realizado usando a formulação de nanopartículas tratada através de alta pressão (400 MPa, 5 minutos) e seca pelo atomizador descrito no Exemplo 4. 600 mg de uma formulação foram tomados e resuspensos em 25 ml de água, procedendo, depois disso, da mesma maneira já descrita acima. O creme resultante obtido também tinha uma aparência homogênea e sem caroços.

EXEMPLO 9 Preparação cosmética [2] com nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado

Subsequentemente, 1,5 ml da solução de ácido fólico foram adicionados a cada solução de caseinato. Depois de 5 minutos de incubação, 8 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo.

Finalmente, a formulação foi centrifugada a 17,000 x g, 20 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi resuspenso em 25 ml de água.

Além disso, 0,5 g de Carbopol Ultrez 10 foram dissolvidos em 75 ml de água. A suspensão de nanopartículas foi adicionada à solução. Uma vez homogeneizada a mistura, a quantia suficiente de trimetilamina foi adicionada até a obtenção do pH 10. A mistura foi homogeneizada até a obtenção de um gel Carbopol ligeiramente amarelado, homogêneo e estável.

Este mesmo teste também foi realizado usando a formulação de nanopartículas tratada através de alta pressão (400 MPa, 5 minutos) e seca pelo atomizador descrito no Exemplo 4. 600 mg de uma formulação foram tomados e resuspensos em 25 ml de água, procedendo, depois disso, da mesma maneira já descrita acima. O gel resultante também tinha uma cor ligeiramente amarelada e uma aparência homogênea e estável.

EXEMPLO 10 Preparação cosmética [3] com nanopartículas de caseína com ácido fólico encapsulado

3 g de monoestearato de glicerila foram misturados com 5 g de miristato de isopropil e 2 g de álcool de cetil. A mistura foi aquecida em água de banho a 70°C.

Além disso, 87 g de gel de Carbopol contendo as nanopartículas de caseína com ácido fólico descritas no Exemplo 8 foram aquecidos a 50°C em uma água de banho com 3 g de sorbitol líquido. Esta solução foi adicionada à primeira, gentilmente agitada até a obtenção de uma emulsão homogênea.

EXEMPLO 11 Preparação e caracterização de nanopartículas de caseína contendo quercetina

Uma solução contendo 100 mg de caseinato de sódio e 8,5 mg de lisina (ou 5,5 mg de arginina) foi preparada em 7,5 ml de água.

Além disso, uma solução de ascorbato de sódio com a concentração de 12 mg/ml foi preparada em água, 0,5 ml da mesma foram adicionados à mistura de caseinato e Iisina. A razão para usar o ascorbato de sódio foi evitar a oxidação da quercetina durante o processo para obter as nanopartículas.

Além disso, 50 mg de quercetina foram dissolvidos em 5 ml de etanol.
Subsequentemente, 0,15 ml da solução de quercetina foram adicionados à solução de caseinato. Depois 5 minutos de incubação, 4 ml de 0,8% de CaCI2 foram adicionados à mistura sob agitação magnética e fluxo contínuo. Este processo foi realizado em triplicata para cada tipo de formulação.

As características físico-químicas obtidas em cada caso estão incluídas na Tabela 12.
Tabela 12
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com quercetina, aminoácido e ácido ascórbico (média ± SD, n = 3). A proporção em peso entre a quercetina e a proteína é 1:67; a proporção em peso entre a quercetina e o ácido ascórbico é 1:3.4

Q: Quercetina; NP: Nanopartícula

Os resultados obtidos mostraram que as nanopartículas da invenção também são adequadas para encapsular compostos biologicamente ativos com características lipossolúveis e permitir a obtenção de altas porcentagens de eficiência de encapsulamento.

Além disso, os resultados permitem confirmar que a presença de um ou outro aminoácido não influencia as características físico-químicas das nanopartículas resultantes.

A fim de aumentar a quantia de quercetina encapsulada, o estudo foi repetido usando lisina como o aminoácido e quantias variáveis de quercetina (entre 0,05 e 0,50 ml da solução de etanol quercetina). Os resultados obtidos estão incluídos na Tabela 13.
Tabela 13
Características físico-químicas das nanopartículas de caseína com lisina, ácido ascórbico e quantias variáveis de quercetina (média ± SD, n = 3). A proporção em peso entre o ácido ascórbico e a proteína (caseína) é 1:17

Q: Quercetina; NP: Nanopartícula

Os resultados obtidos mostram que a quantia de quercetina em uma formulação aumenta, a quantia da quercetina encapsulada aumenta na mesma proporção, enquanto a eficiência de encapsulamento permanece constante.

Adicionalmente, testes seguindo o processo previamente descrito foram realizados, mas através da dispersão da quercetina em água (em vez de dissolvê-la em etanol) antes de adicioná-la à solução de caseinato. Os resultados obtidos mostram que parte da quercetina foi encapsulada nas nanopartículas de caseína apesar da eficiência de encapsulamento ser menor que aquela no caso anterior em que a quercetina foi dissolvida em etanol previamente à adição da mesma à solução de caseinato.

Claims

Processo para produção de nanopartículas, caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, que compreende as etapas de:
- a) preparar uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um aminoácido básico; e
- b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à solução da etapa a).
Processo para produção de uma nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, um composto biologicamente ativo e as etapas de:
- a) misturar (i) uma solução aquosa contendo uma fonte de caseína e um primeiro aminoácido básico com (ii) uma solução contendo um composto biologicamente ativo; e
- b) adicionar uma solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações à mistura resultante da etapa a).
Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o metal da referida solução aquosa de um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações é um sal de cálcio selecionado dentre o grupo consistindo de cloreto de cálcio, acetato de cálcio, gluconato de cálcio, lactato de cálcio, sorbato de cálcio, ascorbato de cálcio, citrato de cálcio, propionato de cálcio, sulfato de cálcio e suas misturas.
Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, submeter a suspensão contendo as nanopartículas formadas a pelo menos um ciclo de pressão hidrostática, a uma pressão compreendida entre 100 e 800 MPa.
Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a secagem da suspensão contendo as nanopartículas formadas.
Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz de caseína, um aminoácido básico e um metal selecionado dentre um metal divalente, um metal trivalente e suas combinações, e é obtida por meio de um processo conforme definido na reivindicação 1.
Nanopartícula, de acordo com reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende, adicionalmente, um composto biologicamente ativo e é obtida por meio de um processo conforme definido na reivindicação 2.
Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o referido aminoácido básico é selecionado dentre o grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e suas misturas.
Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que o referido metal é um metal divalente selecionado dentre o grupo consistindo de cálcio, magnésio, zinco, ferro na forma divalente e suas combinações, preferencialmente cálcio.
Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma nanopartícula conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, ou uma nanopartícula obtida conforme o processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um transportador aceitável em alimentação, farmácia ou cosméticos.
Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o tamanho médio das nanopartículas é compreendido entre 50 e 200 nm, preferencialmente 140 nm.
Composição, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo de:
uma composição compreendendo:
caseína, entre 10% e 50% em peso;
ácido fólico, entre 0,9% e 2,5% em peso;
cálcio, entre 1% e 6% em peso;
um aminoácido básico, entre 1% e 7% em peso; e
um sacarídeo, entre 30% e 80% em peso,
em que todas as proporções são em peso com relação ao peso total da composição; e
uma composição compreendendo:
caseína, entre 10% e 50% em peso;
ácido fólico, entre 0,9% e 2,5% em peso;
cálcio, entre 1 % e 6% em peso; e
um aminoácido básico, entre 1% e 7% em peso;
um sacarídeo, entre 20% e 55% em peso; e
ácido ascórbico, entre 1% e 25%,
em que todas as proporções são em peso com relação ao peso total da composição.
Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o referido transportador compreende um excipiente farmacêutica ou cosmeticamente aceitável para a administração do mesmo por via tópica.
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que as referidas nanopartículas estão na forma de um pó seco.
Gênero alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12 ou 14.