KR20230049123A - 중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스 - Google Patents

중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스 Download PDF

Info

Publication number
KR20230049123A
KR20230049123A KR1020237008751A KR20237008751A KR20230049123A KR 20230049123 A KR20230049123 A KR 20230049123A KR 1020237008751 A KR1020237008751 A KR 1020237008751A KR 20237008751 A KR20237008751 A KR 20237008751A KR 20230049123 A KR20230049123 A KR 20230049123A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
whey protein
gsh
polymerized
glutathione
solution
Prior art date
Application number
KR1020237008751A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102651539B1 (ko
Inventor
애덤 킬패트릭
밍루오 구오
앨리사 험프리 켐프
Original Assignee
푸드사이언스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 푸드사이언스, 엘엘씨 filed Critical 푸드사이언스, 엘엘씨
Publication of KR20230049123A publication Critical patent/KR20230049123A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102651539B1 publication Critical patent/KR102651539B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
    • A23L2/39—Dry compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/40—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
    • A23L3/44—Freeze-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/40—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
    • A23L3/46—Spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/30—Encapsulation of particles, e.g. foodstuff additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A61K38/063—Glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5052—Proteins, e.g. albumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/302—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having a modulating effect on age
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00—Processes
    • A23V2300/24—Heat, thermal treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

특정 방식으로 중합될 수 있는 유청 단백질을 사용함으로써 글루타티온(GSH), 3,3'-디인돌릴메탄(DIM), 코엔자임-Q10(CoQ10), 및 기타 소수성 항산화제 화합물을 캡슐화하기 위한 프로세스가 제공된다. 추가로, 중합된 유청 단백질(PWP) 캡슐화된 글루타티온, 중합된 유청 단백질 5(PWP) 캡슐화된 CoQ10, 및 중합된 유청 단백질(PWP) 캡슐화된 DIM을 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스
본 발명은 특정 방식으로 중합될 수 있는 유청 단백질을 사용함으로써 글루타티온(GSH), 3,3'-디인돌릴메탄(DIM), 코엔자임 Q10(CoQ10), 및 기타 소수성 항산화제 화합물을 캡슐화하기 위한 프로세스에 관한 것이다. 중합된 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온, DIM, 코엔자임 Q10 등을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
글루타티온(GSH)은 식물, 동물, 진균 및 일부 박테리아에서 발견되는 항산화제이다. 글루타티온은 0.5 mM 내지 10 mM 범위로 동물 세포에서 가장 풍부한 티올이다. 이는 세포기질과 소기관 둘 모두에 존재한다(Guoyao Wu, Yun-Zhong Fang, Sheng Yang, Joanne R. Lupton, Nancy D. Turner. "Glutathione Metabolism and its Implications for Health," Journal of Nutrition (2004) 134 (3): 489-92).
글루타티온은 환원(GSH) 상태와 산화(GSSG) 상태로 존재한다. 세포 내에서 산화된 글루타티온에 대한 환원된 글루타티온의 비율은 세포 산화 스트레스의 척도이며, 여기서 증가된 GSH에 대한 GSSG 비율은 더 큰 산화 스트레스를 나타낸다(A. Pastore, et al., "Determination of blood total, reduced, and oxidized glutathione in pediatric subjects". Clinical Chemistry (August 2001) 47 (8): 1467-9; SC Lu. "Glutathione synthesis". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects (May 2013) 1830 (5): 3143-53). 건강한 세포 및 조직에서, 총 글루타티온 풀(pool)의 90% 초과는 환원된 형태(GSH)이고, 나머지는 디설파이드 형태(GSSG)이다(K.M. Halprin, A. Ohkawara "The measurement of glutathione in human epidermis using glutathione reductase". The Journal of Investigative Dermatology (1967) 48 (2): 149-52).
GSH는 반응성 산소 종을 중화(즉, 환원)시킴으로써 세포를 보호한다. 이러한 전환은 과산화물의 환원에 의해 예시된다:
2 GSH + R2O2 → GSSG + 2 ROH (R = H, 알킬)
또한, 자유 라디칼은 생체내에서 켄칭될 수 있다:
Figure pct00001
또한, 글루타티온은 세포 조절 및 대사에서 중요한 역할을 한다. 이러한 중요한 대사 및 세포 역할과 관련하여, 안정하고 생체이용 가능한 조성물로 글루타티온을 제공하는 것이 유리할 것이다.
글루타티온은 소화관에서 경구 생체이용률 부족을 겪는다. 이전의 캡슐화 기법은 흡수하기 어려운 화합물의 흡수를 증가시키기 위해 폴리소르베이트 80과 같은 합성 화학물질과 함께 지질 캡슐화(예컨대, 레시틴)를 주로 이용하여 개발되었지만, 유청 단백질 또는 중합된 유청 단백질의 적용은 지금까지 이러한 방식으로 적용되어 오지 않았다. 따라서, 생체이용률을 증가시키기 위해서는 안전하고 합성 화학물질이 없는 옵션이 필요하다.
포유동물, 특히 인간 대상체에 전달하기 위한 조성물에서 안정성을 개선하고 글루타티온의 분해를 감소시키는 방법이 발견될 수 있다면, 이는 당 분야에 유용한 기여를 제공할 것이다. 또한, 글루타티온의 흡수 및 신체에 의한 이용을 최적화하는, 예를 들어 생체이용률을 증가시키는 방법이 발견될 수 있다면, 이는 당 분야에 추가의 유용한 기여를 제공할 것이다.
영양소의 캡슐화와 관련하여, 특정 필름-형성 화합물 및 계면활성제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 소듐 콜레이트, 데옥시콜레이트 및 타우로콜레이트 포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜 콜린, 포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필에틸셀룰로스가 유용하며, 이들 중 하나 이상이 레시틴과 배합될 수 있다.
3,3'-디인돌릴메탄("DIM")은 십자화과 채소로부터 유래된 인돌-3-카비놀의 활성 대사산물이며, 광범위한 항암 성질을 나타낸다. DIM의 안정성은 제약 산업의 주요 과제이다. 또한, DIM은 이의 낮은 가용성 및 높은 친유성으로 인해 불량한 경구 생체이용률을 가진다. 조절된 크기 및 성질을 갖는 나노입자를 개발하기 위해 유청 단백질에 의한 캡슐화가 공지되어 있는데, 이러한 프로세스는 아로마(aroma) 또는 뉴트라수티컬(nutraceutical)과 같은 민감성 화합물의 보호, 보존 및 전달을 제공할 수 있다.
초음파를 사용하여 3,3'-디인돌릴메탄("DIM") 및 유사 종을 캡슐화하는 특정 방법이 공지되어 있다. 문헌[A. Khan, et al., "Physicochemical and Microstructural Properties of Polymerized Whey Protein Encapsulated 3,3'-Diindolylmethane Nanoparticles," Molecules (2019) 24:702]을 참조한다.
캡슐화 프로세스를 개선하여, 예를 들어 더 우수한 안정성, 가용성 및 경구 생체이용률과 같은 다른 개선된 성질을 가진 중합된 유청 단백질 캡슐화된 DIM을 제공하는 방법이 발견될 수 있다면, 이는 화학 및 제형 분야에 기여를 제공할 것이다.
중합된 유청 단백질 캡슐화 글루타티온을 포함하는 조성물이 기재된다.
중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 글루타티온을 제조하기 위한 프로세스로서, 유청 단백질 농축물 분말을 물에 약 8% w/v 내지 12% w/v로 용해시켜 수용액을 제공하는 단계; 유청 단백질 농축물 용액을 약 15분 내지 25분 동안 적어도 80℃까지 가열하여 중합된 유청 단백질 용액을 제공하는 단계; 냉각 프로세스 동안 중합된 유청 단백질 용액에 항산화제 화합물을 첨가하는 단계; 균질기 또는 전단 혼합기로 교반하여 투명한 균질 용액을 제공하는 단계; 및 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 항산화제 화합물을, 예를 들어 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 단리하여 분말을 제공하는 단계를 포함하는, 프로세스가 기재된다.
추가로, 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 DIM(PWP-DIM)을 제조하기 위한 프로세스로서, (a) 유청 단백질 농축물 분말을 물에 10% w/v로 용해시켜 수용액을 제공하는 단계; (b) 유청 단백질 농축물 용액을 적어도 약 70℃ 내지 80℃까지 가열하여 중합된 유청 단백질 용액을 제공하는 단계; (c) DIM을 중합된 유청 단백질 용액에 첨가하는 단계; (d) pH를 약 6.5 내지 약 9.0 범위로 조정하는 단계; (e) 중합된 유청 단백질 용액을 냉각시키는 단계; (f) 약 80℃로부터 약 45℃까지 냉각시키는 동안 교반하여 투명한 균질 용액을 제공하는 단계; 및 (g) 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 DIM을 단리하는 단계를 포함하는, 프로세스가 기재된다.
한 가지 목적은 소화관, 즉 GI 관을 통한 더 큰 보호를 위해 눈에 띄게 더 우수한 인케이스먼트(encasement)를 가진 PWP-DIM을 제조하는 것이다.
또 다른 목적은 소화관에서의 흡수가 개선된 PWP-DIM을 제조하는 것이다.
추가로, 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 항산화제 화합물을 제조하기 위한 프로세스로서, (a) 유청 단백질 농축물 분말을 물에 10% w/v로 용해시켜 수용액을 제공하는 단계; (b) 유청 단백질 농축물 용액을 약 15분 동안 약 70℃ 내지 80℃까지 가열하여 중합된 유청 단백질 용액을 제공하는 단계; (c) 글루타티온을 중합된 유청 단백질 용액에 첨가하는 단계; (d) 교반하여 투명한 균질 용액을 제공하는 단계; 및 (e) 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 글루타티온을, 예를 들어 동결-건조에 의해 단리하여 분말을 제공하는 단계를 포함하는, 프로세스가 기재된다.
일 구현예에서, 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 항산화제 화합물을 제조하기 위한 프로세스는 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 글루타티온(PWP-GSH)을 제조하는 데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 항산화제 화합물을 제조하기 위한 프로세스는 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 코엔자임-Q10(PWP-CoQ10)을 제조하는 데 사용된다.
도 1은 HPLC를 사용하여 환원 글루타티온(GSH)을 결정하기 위한 표준 곡선을 도시한 것이다. 표준 곡선은 피크 면적에 대한 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
도 2는 검정 키트를 사용하여 환원 글루타티온(GSH)을 결정하기 위한 표준 곡선을 도시한 것이다. 표준 용액은 절대 OD 값 대 GSH 농도(μM)로서 플롯팅되었다.
도 3은 마우스에서 시험 샘플의 경구 투여 후 시간의 함수로서 환원 글루타티온(GSH) 혈장 농도(μmol/L)를 도시한 것이다.
도 4는 혈장의 항산화제 활성을 결정하기 위한 표준 곡선을 도시한 것이다. 표준 곡선은 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM 및 1.0 mM에서 상이한 표준 샘플의 OD 값을 결정함으로써 플롯팅되었다.
도 5는, 일 구현예에서, 검정 키트(ABTS 방법)에 의해 측정된 바와 같은 유리 GSH, WPC/PWPC 기반 GSH, WPC/PWPC의 경구 투여 후 마우스의 혈장의 생체내 항산화제 활성을 도시한 것이다. 개별 시점에서의 수직 막대의 순서는 좌측에서 우측으로 다음과 같다: 대조군, WPC, PWP, GSH, WPC-GSH 및 PWP-GSH.
도 6a 내지 도 6f는, 또 다른 구현예에서, 유리 GSH, WPC/PWPC 기반 GSH, WPC/PWPC의 경구 투여 후 측정된 마우스의 조직에서 GSH 농도(μM)를 도시한 것이다. 개별 시점에서의 수직 막대의 순서는 좌측에서 우측으로 다음과 같다: 대조군, WPC, PWP, GSH, WPC-GSH 및 PWP-GSH. 도 6a 내지 도 6f는 뇌(도 6a), 심장(도 6b), 폐(도 6c), 신장(도 6d), 간(도 6e) 및 장(도 6f)에서의 측정치를 보여준다.
도 7은, 또 다른 구현예에서, 사료에 PWP-GSH를 혼입한 28일 사육 시험(feeding test)에서 래트의 체중 곡선(그램)을 도시한 것이다.
도 8은, 또 다른 구현예에서, 사료에 PWP-GSH를 혼입한 28일 사육 시험에서 래트의 식품 소비 곡선(그램/래트/일)을 도시한 것이다.
도 9는, 또 다른 구현예에서, 사료에 PWP-GSH를 혼입한 28일 사육 시험에서 래트의 식품 효율 곡선을 도시한 것이다.
도 10a는, 일 구현예에서, 대조군에 비하여 사료에 4 중량%의 PWP-GSH를 혼입한 28일 사육 시험에서 수컷 래트의 여러 기관 조직의 염색된 절편에 대한 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 10b는, 일 구현예에서, 대조군에 비하여 사료에 4 중량%의 PWP-GSH를 혼입한 28일 사육 시험에서 암컷 래트의 여러 기관 조직의 염색된 절편에 대한 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 11은 환원 글루타티온(GSH) 검정 키트(A006-2-1)를 사용하여 고체 샘플에서 환원 GSH 함량을 결정하기 위한 표준 곡선을 도시한 것이다.
도 12는 표준 기법을 사용하여 결정된 PWPC 및 PWPC-GSH의 TEM 이미지를 도시한 것이다. 하단에서의 눈금은 1.0 마이크로미터이다.
도 13a는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC에 기반한 PWPC-GSH의 입도 분포를 도시한 것이다.
도 13b는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPI에 기반한 PWPI-GSH의 입도 분포를 도시한 것이다.
도 14는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC 및 WPI 출발 물질에 기반한 PWPI-GSH의 다분산 지수(PDI)를 도시한 것이다. 문자 a 내지 문자 c는 유의미함을 의미한다(P ≤ 0.05).
도 15는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC 및 WPI 출발 물질에 기반한 PWPI-GSH의 제타 전위(mV)를 도시한 것이다. 문자 a 내지 문자 d는 유의미함을 의미한다(P ≤ 0.05).
도 16a는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC에 기반한 PWPC-GSH의 겉보기 점도(mPa-sec) 대 전단 속도(1/s)를 도시한 것이다.
도 16b는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPI에 기반한 PWPI-GSH의 겉보기 점도(mPa-sec) 대 전단 속도(1/s)를 도시한 것이다.
도 17a는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC에 기반한 PWPC-GSH의 원형 이색성 [Θ] x 103deg cm2 dmol-1 대 파장(nm)을 도시한 것이다.
도 17b는 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPI에 기반한 PWPI-GSH의 원형 이색성 [Θ] x 103deg cm2 dmol-1 대 파장(nm)을 도시한 것이다.
도 18a는 표준 기법을 이용하여 수득된 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPC에 기반한 PWPC-GSH의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 18b는 표준 기법을 이용하여 수득된 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자, 예를 들어 WPI에 기반한 PWPI-GSH의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 19는 100:1, 80:1, 60:1, 40:1 및 20:1(PWPI:CoQ10)의 비율의 PWPI std., PWPI-CoQ10 샘플에 대한 표준 방법에 의해 측정된 평균 입도(nm)를 도시한 것이다.
도 20은 100:1, 80:1, 60:1, 40:1 및 20:1(PWPI:CoQ10)의 비율의 PWPI std., PWPI-CoQ10 샘플에 대한 표준 방법에 의해 측정된 다분산 지수(PDI)를 도시한 것이다.
도 21은 100:1, 80:1, 60:1, 40:1 및 20:1(PWPI:CoQ10)의 비율의 PWPI std., PWPI-CoQ10 샘플에 대한 표준 방법에 의해 측정된 제타 전위(mV)를 도시한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 분해로부터 영양소를 보호하고 체내 흡수 및 이용을 최적화하려는 명시된 목적을 위한 중합된 유청 단백질에 의한 지용성 항산화제와 수용성 항산화제 둘 모두의 마이크로캡슐화에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 문헌[S. Zhang, et al., "Polymerized Whey Protein Concentrate-Based Glutathione Delivery System: Physicochemical Characterization, Bioavailability and Sub-Chronic Toxicity Evaluation," Molecules (2021) 26:1824]에서 본 발명의 중합된 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온(PWP-GSH)의 제조 방법에 기여하고 이를 기재하였고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 보호 및 최적의 흡수 및 이용을 위해 영양소, 특히 항산화제 주위에 단백질을 캡슐화할 수 있도록 온도 및 pH를 조정함으로써 유청 단백질을 조작하는 신규한 프로세스에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 성공적으로 캡슐화된 항산화제는 글루타티온, 디인돌릴메탄 및 코엔자임 Q10이다. 식이 보충물(예를 들어, 정제화, 캡슐화, 즉석 음료 분말로의 혼입)에 사용하기 위해 이러한 기법을 적용하고, 항산화제가 식품 또는 음료의 건강상 이점을 증가시키도록 다양한 식품 및 음료에 성공적으로 혼입될 수 있도록 현재 연구가 진행 중이다.
현재 프로세스의 이점은 천연 식품 또는 식이 보충물 업체에서 전형적으로 원하지 않는 특정 화학적 작용제의 사용 없이 기술적으로 단순화되고 더 천연인 프로세스가 실현되었다는 것이다.
주요 구현예에서, 항산화제 화합물 및 다른 유도체의 인케이스먼트는 더 고르게 균일한데, 이는 소화관에서 활성 성분의 더 우수한 보호를 가능하게 한다. 추가로, 이러한 프로세스 구현예는, 예를 들어 SEM 또는 TEM을 사용하여 현미경으로 볼 때 더 우수한 인케이스먼트를 제공한다.
본원에 기재된 PWP-GSH 조성물 및 제형은 유리 GSH와 비교하였을 때 개선된 생체내 흡수, 더 우수한 약동학, 더 우수한 생체이용률 및 더 높은 항산화제 능력을 입증하였다. 본원에 기재된 PWP-GSH 조성물 및 제형은 또한 비교 GSH 제품과 비교하였을 때 개선된 생체내 흡수, 더 우수한 약동학 및 더 우수한 생체이용률을 입증하였다.
마이크로캡슐화
마이크로캡슐화는 광범위한 생체분자의 보호에 사용되는 기법이다. 본원에 참조로 포함되는 문헌[Whey Protein Production, Chemistry, Functionality, and Applications, Ed. Mingruo Guo(본 발명자들 중 한 명) Chap. 7, "Whey Protein Functional Properties and Applications in Food Formulation," pp. 157-204(및 이에 인용된 참고문헌), (Wiley: Hoboken, New Jersey, 2019)]을 참조한다.
제형은 재구성 가능한 분말, 즉석 공급(ready-to-feed) 액체, 비경구(정맥내) 제형 및 희석 가능한 액체 농축물을 포함하는 인간 개체에 사용하기에 적합한 임의의 제품 형태로서 제조될 수 있으며, 이들 제품 형태는 모두 영양 포뮬라 분야에 잘 알려져 있다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 제형 또는 조성물에 존재하는 성분의 양은 제형 또는 조성물이 인간 개체에 의해 소비될 준비가 될 때의 양을 지칭한다.
제형 또는 조성물은 선택적으로 멸균되고, 후속하여 즉석 공급 기반으로 사용될 수 있거나, 농축물로서 보관될 수 있다. 농축물은 상기와 같이 제조된 액체 제형을 분무 건조시킴으로써 제조될 수 있고, 제형은 농축물을 재수화시킴으로써 재구성될 수 있다. 제형 농축물은 안정한 액체이고, 적합한 저장 수명을 가진다.
본 발명의 방법에 사용되는 GSH, 유청 단백질 캡슐화된 GSH(WP-GSH) 또는 중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH)를 포함하는 제형 또는 조성물의 분말 구현예의 경우, 분말의 재구성은 적합한 수성 액체, 바람직하게는 물로 수행될 수 있다. 재구성 가능한 분말은 전형적으로 유동 가능한 또는 실질적으로 유동 가능한 미립자 조성물, 또는 스푼 또는 유사한 다른 장치로 용이하게 떠서 측정될 수 있는 적어도 특정한 조성물의 형태이며, 여기서 조성물은 액체 제형 또는 조성물을 형성하기 위하여 의도된 사용자에 의해 적합한 수성 유체, 전형적으로 물로 용이하게 재구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, "즉시" 사용은 일반적으로 약 48시간 이내, 가장 전형적으로 약 24시간 이내, 바람직하게는 재구성 직후를 의미한다. 이러한 분말 구현예는 분무 건조, 응집, 건조 혼합 또는 다른 공지되거나 달리 효과적인 미립자 형태를 포함한다. 1회 제공량에 적합한 부피를 제작하는 데 필요한 영양 분말의 양은 다양할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 영양 포뮬라는 일회용 또는 다회용 용기에 패키징되고 밀봉된 후, 최대 약 36개월 이상, 더욱 전형적으로 약 12개월 내지 약 24개월 동안 주위 조건 하에 보관될 수 있다. 다회용 용기의 경우, 이들 패키지는 개봉된 후, 최종 사용자에 의한 반복 사용을 위해 커버될 수 있으며, 단, 커버된 패키지는 이후 주변 조건 하에 보관되고(예를 들어, 극한 온도를 피함), 내용물은 약 1개월 정도 이내에 사용되어야 한다.
GSH, 유청 단백질 캡슐화된 GSH(WP-GSH) 또는 중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH)를 포함하는 식이 보충 조성물을 전달하는 데 유용한 경구 제형용 조성물은, 예를 들어 불활성 희석제와 함께 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 이는 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 또는 하이드록시프로필 메틸셀로스(즉, 하이프로멜로스) 캡슐에 담길 수 있거나, 이는 정제로 압축될 수 있거나, 이는 식이의 식품과 직접 혼입될 수 있다. 경구 투여를 위해, GSH, 유청 단백질 캡슐화된 GSH(WP-GSH) 또는 중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH)를 포함하는 식이 조성물은 부형제와 함께 혼입되고, 섭취 가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 정제, 트로키제, 알약, 캡슐 등은 또한 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트, 미정질 셀룰로스 등과 같은 부형제; 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있고; 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리 향미료와 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 투여형이 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅으로서 또는 달리 투여 단위의 물리적인 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락, 당 또는 이 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료, 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향미료를 함유할 수 있다. 수중유 에멀젼은 유아의 경구 사용에 더 우수할 수 있는데, 이는 이들이 수-혼화성이어서 이들의 유성이 차단되기 때문이다. 이러한 에멀젼은 제약 과학에 잘 알려져 있다.
HPLC를 사용한 GSH의 측정
HPLC 분석을 위한 최적 조건:
컬럼: 대칭 C18
이동상: 물:아세토니트릴 = 90:10
유량: 0.5 ml/min
파장: 218 nm(UV 검출기)
주사량: 0.5 μL
GSH 분말이 초순수에 용해되어 10 mg/ml의 스톡 용액이 제조되었다. 초순수를 사용하여 스톡 용액을 희석함으로써 일련의 표준 용액(0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml)이 수득되었다. GSH가 HPLC를 사용하여 측정되었다. 표준 곡선은 도 1에 제시된 바와 같이 피크 면적에 대한 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
상기 구현예에 기재된 조성물 및 방법은 하기 실시예와 연관하여 추가로 이해될 수 있다. 또한, 하기 비-제한적인 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 임의의 주어진 구현예에 대한 절차를 변경하는 것, 예를 들어 방법의 순서 또는 단계를 변경하는 것이 필요할 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 1
유청 단백질 - GSH 혼합물(WP-GSH)
실온에서 탈이온수에 유청 단백질 농축물 분말을 용해시킨 다음, 2시간 동안 교반(700 rpm)함으로써 유청 단백질 농축물(WPC) 용액(10% 단백질, w/v)을 제조하였다. 완전한 수화를 위해 스톡 용액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 유청 단백질 용액을 주위 온도까지 가온시킨 다음, WPC(분말):GSH = 1:1, 1:1.5 및 1:2의 중량비로 환원-GSH와 혼합하였다. 혼합물을 20분 동안 교반하여 완전한 용해를 달성하였다.
중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH)
실온에서 탈이온수에 유청 단백질 농축물 분말을 용해시킨 다음, 2시간 동안 교반(700 rpm)함으로써 유청 단백질 농축물(WPC) 용액(10% 단백질, w/v)을 제조하였다. 완전한 수화를 위해 용액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 유청 단백질 용액을 주위 온도까지 되돌리고, pH를 7 또는 8로 조정한 다음, 80℃에서 15분 동안 가열하였다. 혼합된 물-얼음에서 가열된 유청 단백질 용액을 실온(25℃ ± 1℃)까지 신속하게 냉각시킴으로써 중합된 유청 단백질(PWPC) 용액을 수득하였다. 이후, PWPC 용액을 GSH 분말과 PWPC:GSH=1:1, 1:1.5 및 1:2의 중량비로 혼합하였다. 혼합물을 20분 동안 혼합하여 완전한 용해를 달성하였다.
안정성 실험
모든 유청 단백질 기반 GSH 용액을 실온에서 20시간 동안 안정성에 대하여 관찰하였다. 하기 표 1은 중합된 구현예를 포함하여 유청 단백질 기반 글루타티온 용액의 안정성을 나열한 것이다.
[표 1]
Figure pct00002
표 1에 제시된 바와 같이, PWP-GSH 샘플은 적어도 4시간까지 안정하다.
실시예 2
약동학적 연구
ICR 마우스, 수컷, SPF, 3주, 체중 18 g 내지 22 g은 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd(베이징, 중국)에서 제공받았다. 환원 글루타티온(GSH) 검정 키트(A006-2-1), 총 항산화 용량 측정 키트(ABTS 방법)(A015-2-1)는 Nanjing Jiancheng bioengineering institute(난징, 중국 장쑤성)에서 구입하였다.
모든 마우스를 환기가 잘 되는 방의 플라스틱 실험실 동물 케이지에 수용하였다. 방을 12시간 명/암 주기로 20℃ ± 2℃ 및 60% ± 10% 상대 습도에서 유지하였다. 마우스를 위한 물 및 상용 실험실 완전 식품은 자유식으로 이용 가능하였다. 이들을 치료 전 7일 동안 이러한 환경에 적응시켰다. 모든 동물 실험은 지린 대학교의 동물 복지 및 연구 윤리 위원회의 승인을 받았다(승인 ID: SY201905018).
혈액 채취. 혈액 채취 전에, 30 μL의 헤파린 용액을 1.5 mL 원심분리 튜브에 첨가하고 볼텍싱하였다. 마우스의 한쪽 눈을 제거하여 혈액 샘플(약 0.5 mL)을 채취하였다. 혈액을 실온에서 2분 동안 6000 rpm으로 원심분리하였다. 상부 혈장을 새로운 원심분리 튜브로 옮겼다. GSH의 혈장 농도를 GSH 검정 키트를 사용하여 분석하였다.
GSH 스톡 용액(1 mmol/L)을 0 μmol/L, 5 μmol/L, 10 μmol/L, 20 μmol/L 및 100 μmol/L의 농도로 일련의 표준 용액으로 희석하였다. 표준 용액은 절대 OD 값 대 GSH 농도로서 플롯팅하였다(도 2).
A. 6마리 마우스의 각각의 군에서 여러 시점(0, 15분, 30분, 1시간, 2시간 및 4시간)에 위관영양으로 유리 GSH, 유청 단백질 기반 GSH, 유청 단백질, 중합된 유청 단백질 기반 GSH 및 중합된 유청 단백질을 경구 투여 후 혈액 샘플을 채취하였다. 유청 단백질 기반 GSH의 용량을 100 mg/kg의 GSH의 등가량을 갖도록 조정하였다. 혈액 샘플 중 GSH 농도를 검정 키트로 측정하였다.
표 2는 시험군 및 위관영양 부피를 보여준다.
[표 2]
Figure pct00003
도 3에 제시된 바와 같이, PWP-GSH 시험 물질은 경구 투여 후 혈장 중 GSH 농도를 우수하고 유의하게 증가시킨다.
B. 생체내 항산화제 활성
트롤록스(Trolox) 스톡 용액(10 mM)을 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 1.0 mM까지 희석하였다. 표준 곡선은 상이한 표준 샘플의 OD 값을 측정하여 플롯팅하였다(도 4). 혈장의 항산화제 활성은 트롤록스의 TAOC(총 항산화 용량)를 1로 하여, 트롤록스에 대한 용량의 배수로서 표현되었다.
모든 샘플의 총 항산화 용량을 또한 검정 키트를 사용하여 측정하였고, 결과는 도 5에 제시되어 있다. 유리 GSH, WPC/PWPC 기반 GSH, WPC/PWPC의 경구 투여 후 마우스의 혈장의 생체내 항산화제 활성을 검정 키트(ABTS 방법)로 측정하였다.
도 5에 제시된 바와 같이, 시간 경과에 따른 PWP-GSH 샘플은 가장 강력한 항산화제 활성을 나타낸다.
C. GSH의 조직 분포
GSH의 기관으로의 전달 효율을 평가하기 위해, 6마리 마우스의 각각의 군에서 경구 투여 후 0시간, 1시간, 2시간, 4 시간 및 6시간째에 뇌, 심장, 신장, 간, 폐 및 장의 조직 샘플을 채취하였다. 조직을 균질화하고, 단백질을 침전시키고, 원심분리한 다음, 검정 키트를 사용하여 GSH 함량에 대해 분석하였다(도 6a 내지 도 6f).
도 6a 내지 도 6f에 제시된 바와 같이, 다양한 조직에서 유리 GSH의 분포는 대조군보다 유의하게 더 컸다. 추가로, 다양한 조직에서 PWP-GSH 군에 대한 GSH의 분포는 대조군보다 유의하게 더 컸다.
D. 중합된 유청 단백질 기반 GSH(PWP-GSH)의 독성 연구
유청 단백질 농축물은 Fonterra Co-operative Group(오클랜드, 뉴질랜드)에서 제공받았다. 펜토바르비탈 나트륨, 포르말린 및 무수 에탄올은 Beijing Works(베이징, 중국)에서 제공받았다. 3주차 SD 래트는 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd(베이징, 중국)에서 제공받았다.
식이 제형
10%의 중합된 유청 단백질 농도 및 1:1의 유청 단백질 및 GSH 비율로 실시예 1에 따라 중합된 유청 단백질 농축물 기반 GSH(PWP-GSH)를 제조하였다. 이어서, 제조된 중합된 유청 단백질 GSH를 동결 건조기(Alpha 1-4 LDplus, 독일)를 사용하여 건조시켰다. 이어서, 분말화된 중합된 유청 단백질 기반 GSH를 GSH에 대한 0.25%, 1% 및 2% 백분율에 상응하는 0.5%, 1% 및 4%(w/w)의 백분율로 일반 사료에 혼입시켰다. 식이는 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd(베이징, 중국)에서 제조된 것이었다. 용량은 건강한 인간의 1일 섭취량(1일 100 mg)을 기준으로 설정하였다. 인간에 대한 용량은 60 Kg의 평균 체중으로 계산된 1.6 mg/kg일 것이다. 전환 방정식에 따르면, 이는 래트의 경우 10 mg/kg과 같다. 용량을 인간의 1일 섭취량의 25배, 50배 및 200배에 상응하는 0.5%, 1% 및 4%로 설정하였다.
실험 설계
3주령의 래트 80마리(반으로 수컷 및 암컷)를 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd(베이징, 중국)에서 구입하였다. 모든 래트를 환기가 잘 되는 방의 플라스틱 실험실 동물 케이지에 수용하였다. 방을 12시간 명/암 주기로 20℃ ± 2℃ 및 60% ± 10% 상대 습도에서 유지하였다. 물은 자유식으로 이용 가능하였다. 대상체 래트를 치료 전 7일 동안 이러한 환경에 적응시켰으며, 이때 일반적인 상태에는 분명한 변화가 없었다. 적응 후, 래트를 체중 평균을 기준으로 4개의 군(군 당 성별 당 10마리)에 무작위 배정하였다. 무작위화 시 군의 개별 체중은 전체 평균의 ± 20% 이내였다. 대조군의 동물과 비교하여, 저용량, 중간 용량 및 고용량 군 동물은 각각 이들의 식이에 0.5%, 1% 및 4%의 유청 단백질 기반 GSH를 제공받았다. 모든 동물 실험은 지린 대학교의 동물 복지 및 연구 윤리 위원회의 승인을 받았다(승인 ID: SY201905018).
임상 관찰
각각의 래트의 털 상태, 피부, 점막, 분비물 및 배설물의 발생, 자율 신경계 활성, 보행의 변화, 및 자세를 연구 내내 관찰하였다.
체중 및 식품 섭취
개별 체중뿐만 아니라 4일 간격의 체중을 재고 총 28일의 기간 동안 기록하였다. 예정된 부검 전에 마지막 체중(금식)을 기록하였다. 사료 섭취량을 또한 측정하고, 상응하는 간격으로 계산하여 평균 식품 소비량(g/래트/일로 표현됨)으로 표현하였다.
혈액 채취
실험 종료 시, 모든 동물은 혈액 채취 전에 12시간 동안 금식하였지만 물은 마실 수 있었다. 래트에 0.2 ml/100 g의 수준으로 2% 펜토바르비탈 나트륨 용액을 주사하였다. 이후, 혈액학 및 혈청 화학을 위한 2개의 별개의 혈액 샘플을 심장을 통해 채취하였다. 혈액학 분석을 위해 혈액 샘플을 EDTA-2K 코팅된 튜브로 채취한 다음, Exigo 동물 혈액학 분석기를 사용하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB), 헤마토크릿(HCT), 혈소판 수(PLT), 평균 혈구 용적(MCV), 평균 혈구 헤모글로빈(MCH), 평균 혈구 헤모글로빈 농도(MCHC), 적혈구 용적 분포(RDW), 평균 혈소판 용적(MPV) 림프구(LYM), 호중구과립구(GRAN), 단핵구(MONO), 림프구(LYM%), 과립구(GRA), 단핵구 퍼센트(MON%)에 대하여 측정하였다.
혈청 화학 분석을 위해 혈액 샘플을 실온에서 3분 동안 10000 rpm으로 원심분리하였다. 상부 혈청을 새로운 원심분리 튜브로 옮긴 후, Smt-120v 자동 생화학 분석기를 사용하여 알부민(ALB), 칼슘(Ca), 크레아티닌(Crea), 총 빌리루빈(TB), 총 단백질(TP), 무기 인(PHOS), 우레아(UREA), 아밀라제(AMY), 트리글리세리드(TG), 글루코스(GLU), CR에 대한 BUN의 비율(U/C), 크레아틴 키나제(CK), 글로불린(GLOB), 아스파르테이트 아미노트랜스페라제(AST)에 대하여 측정하였다.
기관 중량, 육안 부검 및 조직병리학
종료 시, 모든 래트를 펜토바르비탈 나트륨으로 마취시키고, 아노셀리아(anocelia)를 절개함으로써 방혈시켰다. 이후, 부검 동안 시각적 검사에 의해 완전한 육안 병리학 검사를 수행하였다. 모든 동물에 대한 뇌, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 방광, 난소, 자궁, 고환, 부고환 및 정낭을 절개하고 칭량하였다. 각각의 기관(또는 쌍을 이루는 기관)의 상대 중량을 종료일에 측정된 최종 개별 체중을 기준으로 계산하였다. 고환을 Bouin 용액에 고정시키고, 파라핀에 포매하고, 2 μm 내지 5 μm로 절단하고, 유리 현미경 슬라이드 상에 마운팅하고, 표준 헤마톡실린-에오신으로 염색하고, 광학 현미경을 사용하여 검사한 것을 제외하고, 이들 기관으로부터의 조직 절편을 10% 완충된 포름알데하이드로 고정하였다. 모든 조직병리학 절차는 지린 대학교의 동물 과학 및 수의과 대학에서 수행되었다.
결과
실험 과정 동안, 대조군과 비교하여 실험군에서 관찰된 부작용은 없었다.
실험 과정 동안, 동물의 임상 외관에서 부작용의 치료-관련 징후는 관찰되지 않았다. 체중은 치료 기간이 진행됨에 따라 점진적으로 증가하였다(도 7). 암컷군들 간의 체중에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 수컷군의 경우, 16일부터 1%의 수컷군이 대조군과 유의하게 상이하였다. 체중 변화는 수컷 군에서만 관찰되었으며, 용량-의존적 효과는 없었다.
28일 동안 래트의 식품 소비 및 식품 효율에 대한 결과는 도 8 및 도 9에 제시되어 있다. 일부 시점에서 실험군과 대조군 사이에 일부 유의한 차이가 있었지만, 실험군에서는 PWPC-GSH 관련 독성 효과가 관찰되지 않았다. 0.5% 및 4% 암컷군은 8일차에 대조군과 비교하여 식품 효율에서 유의한 차이를 나타냈다(p<0.05).
표 3은 28일 독성 연구에서 수컷 래트에 대한 혈청 생화학을 보여준다.
[표 3]
Figure pct00004
주: 대조군과 비교하여 *는 0.05의 유의한 수준을 의미하고, **는 0.01의 유의한 수준을 의미함
수컷 래트의 혈청 생화학에 대한 결과는 상기 표 3에 제시되어 있다. 4% 수컷군의 알부민은 33.01 g/L ± 1.34 g/L의 값을 나타내는데, 이는 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 혈청 중 알부민의 낮은 함량은 합성 결핍에 기인할 수 있다. 이러한 변화에는 두 가지 이유가 있을 수 있다. 간염으로 인해, 간에 의한 알부민 흡수가 감소될 수 있다. 다른 이유는 소변과 함께 다량의 알부민의 배설을 초래할 수 있는 낮은 신장원성(nephrogenic)으로 인한 신장 배설 기능장애일 수 있다. 4% 수컷에서의 글로불린은 28.1 g/L ± 2.77 g/L인데, 이는 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 그러나, 이 값은 정상 범위(15 g/L 내지 28 g/L)에 있다. 4% 수컷에서의 아스파르테이트 아미노트랜스페라제는 91.17 U/L ± 8.13 U/L이었는데, 이는 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 그러나, 이 값도 정상 범위(39 U/L 내지 111 U/L)에 있었다. 4% 수컷에서의 알라닌 아미노트랜스페라제는 39 U/L ± 7.73 U/L이었는데, 이는 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 그러나, 이 값은 정상 범위(20 U/L 내지 61 U/L)에 있었다. 아스파르테이트 아미노트랜스페라제 및 알라닌 아미노트랜스페라제는 간 기능에 대한 지표이다. 2개의 파라미터의 증가는 간에서 일부 병리학적 변화를 가리킬 수 있고, 감소는 임상적으로 유의하지 않을 수 있다. 대조군과 비교하여, 모든 실험군은 유의하게 더 낮은 유리한 아밀라제 값(p<0.05)을 나타냈고 이는 이점이었다. 실험군의 크레아틴 키나제 값은 대조군보다 유의하게 더 낮은(p<0.05) 유리한 값이었고 이는 이점이었다. 4% 수컷에서의 글루코스는 대조군보다 유의하게 더 낮았고, 정상 범위(2.78 μmol/L 내지 7.50 μmol/L)에 있었다. 1% 수컷군 및 4% 수컷군의 칼슘 수준은 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 칼슘 수준의 감소는 (1) 부갑상선 호르몬의 결핍; (2) 비타민 D 결핍 또는 대사 이상; (3) 만성 신장 질환에 기인할 수 있다.
결론적으로, 혈청 생화학의 유의한 변화는 주로 4% 수컷군에서 관찰되었으며, 대부분 간 또는 신장의 기능과 관련이 있다.
표 4는 28일 독성 연구에서 암컷 래트에 대한 혈청 생화학을 보여준다(n = 10).
[표 4]
Figure pct00005
주: 대조군과 비교하여 *는 유의한 수준이 0.05임을 의미하고, **는 유의한 수준이 0.01임을 의미함
암컷 래트의 혈청 생화학에 대한 결과는 표 4에 제시되어 있다. 1% 암컷군에서의 총 단백질은 68.02 g/L ± 4.31 g/L이었고, 이는 대조군보다 유의하게 더 높았다(p<0.05). 그러나, 이는 정상 범위(53 g/L 내지 69 g/L)에 있었다. 증가된 총 단백질 수준은 만성 간 질환에 기인할 수 있다. 1% 및 4% 암컷에서의 아밀라제 및 글루코스는 대조군보다 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 1% 및 4% 암컷군에서의 무기 인 수준은 대조군보다 유의하게 더 높았다. 그러나, 이들은 정상 범위(1.87 μmol/L 내지 3.6 μmol/L)에 있었다.
혈액학
표 5는 28일 독성 연구에서 수컷 래트에 대한 혈액학을 보여준다(동물 수 = 10).
[표 5]
Figure pct00006
주: 대조군과 비교하여 *는 유의한 수준이 0.05임을 의미하고, **는 유의한 수준이 0.01임을 의미함
수컷 래트의 혈액학 파라미터에 대한 PWPC-GSH 분말의 치료-관련 부작용은 없었다. 그러나, 대조군과 치료군 사이에 일부 통계적으로 유의한 차이가 발생하였다. 4% 군의 PLT, MPV는 대조군과 유의하게 상이하였다(p<0.05). 0.5% 군의 MPV와 LYM도 대조군과 유의하게 상이하였다(p<0.05).
표 6은 28일 독성 연구에서 암컷 래트에 대한 혈액학을 보여준다(동물 수 = 10).
[표 6]
Figure pct00007
주: 대조군과 비교하여 *는 유의한 수준이 0.05임을 의미하고, **는 유의한 수준이 0.01임을 의미함
암컷 래트의 혈액학 파라미터에 대한 PWPC-GSH 분말의 치료-관련 부작용은 없었다. 그러나, 대조군과 치료군 사이에 일부 통계적으로 유의한 차이가 발생하였다. 대조군과 비교하여, 1% 군의 RBC는 6.76 ± 0.56×1012/L의 유의하게 더 높은 값을 나타냈다(p<0.05). 이러한 변화는 물의 결핍에 의해 초래될 수 있으며, 시험-물질과 관련된 것으로 간주되어서는 안 된다. 1% 암컷군(14.46 g/dL ± 0.88 g/dL) 및 4% 암컷군(14.10 g/dL ± 0.36 g/dL)에서의 HGB는 대조군보다 유의하게 더 높았다(p<0.05). 그러나, 이 값은 정상 범위(13.2 g/dL 내지 16.4 g/dL)에 있었으며, 부작용으로 간주되어서는 안 된다.
상대 기관 중량
상대 기관 중량에 대한 결과는 표 7 및 표 8에 제시되어 있다. PWPC-GSH 분말을 갖는 수컷 래트는 대조군보다 유의하게 더 낮은 마지막 체중을 나타냈다(p<0.05). 대조군과 비교하여, 4% 수컷군에서의 간 및 신장을 제외하고 PWPC-GSH 분말을 공급받은 모든 래트의 경우 기관에 대한 상대 기관 중량에는 유의한 차이가 없었다.
표 7은 28일 독성 연구에서 수컷 래트에 대한 상대 기관 중량을 보여준다(동물 수 = 10).
[표 7]
Figure pct00008
주: 대조군과 비교하여 *는 유의한 수준이 0.05임을 의미하고, **는 유의한 수준이 0.01임을 의미함
암컷 래트의 경우, 4% 군에서의 래트는 유의하게 더 낮은 마지막 체중을 나타냈다(p<0.05). PWPC-GSH 분말을 공급받은 래트와 대조군 사이의 상대 기관 중량에는 유의한 차이가 없었다.
표 8은 28일 독성 연구에서 암컷 래트에 대한 상대 기관 중량을 보여준다(동물 수 = 10).
[표 8]
Figure pct00009
주: 대조군과 비교하여 *는 유의한 수준이 0.05임을 의미하고, **는 유의한 수준이 0.01임을 의미함
병리학 및 조직병리학
도 10a 및 도 10b는 4% 공급군 대 대조군의 수컷 및 암컷 래트에서 여러 조직의 염색된 절편을 보여준다. 조직 샘플을 통상적인 방법으로 제조하고 염색하고, 표준 현미경 방법으로 관찰하였다.
결론
PK 연구의 결과는 중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH)의 혈청 흡수가 Kyowa의 Setria GSH의 혈청 흡수보다 3배 더 높았다는 것을 나타냈다. 상용 GSH 식이를 공급받은 군과 비교하여 중합된 유청 단백질 캡슐화된 GSH를 공급받은 래트에 대한 뇌 및 간 조직에서 GSH의 수준은 투여 3시간 내지 4시간 후에 유의하게 더 높았다. 대조군과 비교하여, 4% 공급 수컷군에서 체중, 혈청 생화학 및 상대 기관 중량의 파라미터에 약간의 변화가 있다. 따라서, 관찰되지 않은 부작용 수준(NOAEL)은, 인간 1일 섭취 값의 약 50배 및 200배에 상응하는, 수컷 래트의 경우 적어도 1% 및 암컷 래트의 경우 4%인 것으로 추정되었음이 결론지어질 수 있다.
요약하면, 유청 단백질 캡슐화된 GSH(WP-GSH, PWP-GSH)의 생체이용률은 표준 대조군과 비교하여 훨씬 개선되었고, 이는 안전한 형태의 전달 시스템이다.
실시예 3
중합된 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온(PWP-GSH)의 제조
유청 단백질 농축물(5 Kg)을 10%(w/v)의 농도로 증류수에 용해시키고, 4℃에서 밤새 보관하였다. 이어서, 유청 단백질 농축물 용액을 80℃에서 15분 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 이어서 PWPC 용액을 GSH 분말(5 Kg)과 PWPC:GSH = 1:1의 중량비로 혼합하였다. 혼합물을 완전한 용해를 위해 20분 동안 교반하였다. 블렌딩 후, 이어서 혼합물을 동결-건조시켜 PWP-GSH 분말 생성물을 제공하였다.
환원 글루타티온(GSH) 검정 키트(A006-2-1), 총 항산화 용량 측정 키트(ABTS 방법)(A015-2-1)는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute(난징, 중국 장쑤성)에서 구입할 수 있다. GSH 함량은 여러 방법을 이용하여 검정될 수 있다. 하기 절차는 소화 없이 GSH 함량을 측정하였다.
PWPC 기반 GSH 분말(2 g)을 20 mL의 PBS 완충제에 용해시킨 다음, 완전한 추출을 위해 20분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 1 mL의 상청액을 취하고, 800배 희석하였다. 그 후에, 1 mL의 희석된 용액을 1 mL의 단백질 제거제와 혼합한 다음, 3500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, GSH 검정 키트를 사용하여 상청액을 GSH 함량에 대해 측정하였다.
대안적으로, GSH 함량을 트립신 소화 후에 측정하였다.
방출 용액: 1:250의 효소 활성을 갖는 트립신(10 g)을 1 L의 NaCl 용액(0.5%, w/v)에 용해시킨 다음, 0.1 M NaOH 용액을 사용하여 pH 8까지 조정하였다. PWPC 기반 GSH 분말(0.3 g)을 30 mL의 방출 용액에 넣고, 6시간 동안 37℃에서 100 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 5,000 × g에서 20분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 100배 희석하였다. 이어서, 희석된 현탁액을 1:1(v/v)의 비율로 단백질 제거 용액과 혼합한 다음 원심분리하였다. 이어서, GSH 검정 키트를 사용하여 상청액을 GSH 함량에 대해 측정하였다.
도 11의 표준 곡선을 참조하면, 소화 없이, 2개의 샘플의 OD 값은 각각 0.2883 및 0.2862였으며, 이는 PWPC-GSH 생성물에서 43.2% 및 42.9%(w/w)의 GSH 함량에 상응한다. 트립신 소화 후, 2개의 샘플의 OD 값은 각각 0.2654 및 0.2627이었고, 이는 PWPC-GSH 생성물에서 49.8% 및 49.2%(w/w)의 GSH에 상응한다.
이에 따라, 유청 단백질 캡슐화된 GSH(PWP-GSH) 제조를 위한 가공 기법이 확립되었고, 매트릭스에서 글루타티온의 회수율은 99.2%였는데, 이는 이러한 열 민감성 화합물의 손실이 프로세스 전반에 걸쳐 0.8%에 불과하였다는 것을 가리킨다.
실시예 4
PWP-GSH 샘플의 화학적 특징화. 본 개시내용의 원리에 따라 제조된 샘플은 점도 측정 및 다른 레올로지 측정, FT-IR, TEM/SEM 광학현미경, 미세구조 및 형태 연구, 안정성 연구(고체상, 용액상, 습도, 열), 입도, 제타 전위 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 당업계에 잘 알려진 다양한 수단에 의해 특징화될 수 있음이 잘 이해된다. 상기 화학적 분석은 본원에 기재된 조성물의 독특한 품질 및 성질을 추가로 나타낼 것으로 예상된다. 문헌[Khan, et al., 2019] 참조.
실시예 4A
1. 유청 단백질 농축물(PWC)을 사용한 PWPC-GSH의 제조
PWPC-GSH 시스템은 폴리 이소부틸시아노아크릴레이트, Eudragit RS 100/사이클로덱스트린 및 몬트모릴로나이트를 기반으로 한 다른 담체와 비교하여 단순성, 온화성 및 유기 용매-비함유의 이점을 갖고 제조되었다. 문헌[Zhang et al. (2021)]에 따라 측정된 하나의 특징화 시험에서, PWPC는 이전 연구와 일관되게 넓은 입도 분포(9.22의 범위)와 함께 594 nm 및 4580 nm에서 2개의 피크를 갖는 바이모달 패턴을 나타냈다. GSH(287.83 nm ± 6.18 nm)와의 조합은 9.22 ± 0.22에서 6.86 ± 0.19로 감소된 범위로 1085 nm ± 35.35 nm에서 1115 nm ± 7.07 nm로 입도(D50)를 약간 증가시켰다. PWPC-GSH에 대한 제타 전위는 30.37 mV ± 0.75 mV인 것으로 밝혀졌다. 높은 표면 전하는 분자 사이의 강한 정전기적 반발력이 중합, 침전 및 응집을 방지하기 때문에 PWPC-GSH 시스템에 높은 안정성을 부여하였다. 또한, PWPC-GSH의 양의 표면 전하는 세포막이 음전하를 운반하기 때문에 생체내 흡수에 유리할 것이다. PWPC-GSH 시스템은 1 s-1 내지 300 s-1 범위의 전단-담화 거동을 나타냈는데, 이는 액적 사이의 상호작용이 더 높은 전단 속도에서 약화되었다는 것을 가리킨다.
GSH의 DSC 써모그램은 198℃에서의 발열 피크 및 PWPC-GSH 시스템에서 이러한 용융 피크의 소멸을 나타냈는데, 이는 GSH가 PWPC 입자에 분자적으로 분산되었다는 것을 암시한다. FTIR 스펙트럼 분석은 PWPC가 1654.39 cm-1에서 아미드 I(C=O 진동) 스펙트럼 피크를 나타냈고, GSH와의 결합 후에 적색 이동이 발생하였음을 보여주어, PWPC가 구조적으로 변하고 분자간 수소 결합이 형성되었다는 것을 가리켰다. 이러한 PWPC-GSH 시스템은 대부분이 대략 200 nm의 크기로 연동하는 응집체의 형태를 나타냈고, 일부 더 큰 응집체는 표준 TEM 영상화 기법에 의해 결정 시 대략 400 nm 이상으로 측정되었다(도 12).
2. PWPC-GSH의 생체내 약동학적 및 항산화제 활성
유청 단백질은 펩신에 의한 소화에 대한 이의 내성, 이의 비-독성 성질, 널리 이용 가능한 공급원 및 광범위한 생체적합성으로 인해 영양소 전달의 효과적인 수단으로서 널리 연구되어 왔다. PWPC-GSH 전달 시스템 및 유리 GSH의 약동학적 연구를 수행하고, 모든 군에 대한 혈장 GSH 농도-시간 프로파일을 결정하였다. GSH 농도는 혈장에서 PWPC-GSH 군이 가장 높았고, 이어서 유리 GSH, PWPC 및 대조군이 그 뒤를 따르는 것으로 관찰되었다. 유리 GSH 군보다 PWPC-GSH로 마우스 위관영양의 혈장에서의 더 높은 값은, GSH를 내부에 임베딩하고 위장 효소 및 산성 환경에 대한 손상을 방지함에 의한 고점성 PWPC의 보호 효과에 기인할 수 있다. 이들 결과는 퀘르세틴 및 비타민 D의 생체이용률이 유청 단백질 캡슐화를 통해 개선되었다는 이전의 연구와 일치하였다.
마우스 모델을 사용하여 약동학적 파라미터를 계산하였다. 유리 GSH(7.37 mg/L의 최대 농도(Cmax) 및 19.23 h x mg/L의 농도-시간 곡선하 면적(AUC))와 비교하여, 더 높은 Cmax(19.41 mg/L) 및 AUC(48.63 h x mg/L) 값이 관찰되었는데, 이는 PWP-GSH를 투여한 후 마우스의 혈액 순환에서 GSH 흡수의 더 높은 속도 및 정도를 가리킨다. PWPC-GSH 군에서 2.5배 및 2.6배 더 높은 Cmax 및 AUC는 PWPC-GSH 전달 시스템이 그 자체로 이의 순수한 형태의 GSH에 비해 GSH의 생체내 생체이용률을 효과적으로 개선할 수 있다는 것을 시사하였다. 유청 단백질은 또한 장관으로 흡수되는 동안 담체로서 GSH에 대한 보호 효과를 갖는 것으로 보이며, 이는 펩신에 의한 소화에 대한 내성에 기인할 수 있다. GSH 자체의 전달 외에도, 유청 단백질 보충은 또한 속도-제한적 아미노산으로서 GSH의 생합성을 촉진시키는 능력을 갖는 유청 단백질 고유의 풍부한 시스테인 잔기로 인해 생체내 GSH 수준의 증가에 기여했을 수 있다. 유리 GSH(2시간)에서와 비교하여 PWPC-GSH 군에서 더 낮은 최대 농도까지의 시간(Tmax)(1시간)이 발생하였는데, 이는 투여 후 최대 농도에 도달하는 데 더 적은 시간이 요구되었다는 것을 가리킨다. GSH 군에서 GSH의 혈장 농도는 1.5시간 내지 2시간 후에 이의 최대 수준에 도달하였고, 이는 경구 투여된 유리 GSH에 비해 초기 문헌에 보고된 데이터에 반영되어 있다.
검정 키트를 사용하여 상이한 시점에서 샘플의 총 항산화 용량을 측정하였다. PWPC-GSH로의 마우스 위관영양에서 혈장의 항산화제 능력은 전체 기간 동안 유리 GSH보다 유의하게 더 높았다(p < 0.05). 마우스에서 PWPC-GSH의 위관영양 후 혈장의 항산화제 능력이 증가한 첫 번째 이유는 PWPC를 전달 담체로서 사용하여 혈장 중 GSH 농도가 개선되었기 때문이다. 두 번째 이유는 유청 단백질의 항산화제 성질에 기인할 수 있다. T-AOC(mM)에 의해 측정된 바와 같이, PWPC로의 위관영양 후 마우스의 혈장 항산화제 능력은 또한 상가 효과와 일치할 수 있거나 일치하지 않을 수 있는 정도까지 약간 개선되었다.
실시예 4B
실시예 3, 실시예 4 및 실시예 4A에 따라, 유청 단백질 농축물(WPC) 및 유청 단백질 단리물(WPI) 표준과 비교하여 PWPC-GSH 및 PWPI-GSC에 대해 다양한 파라미터를 측정하였다.
도 13a 및 도 13b는 각각 WPC 및 WPI 출발 물질에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 입도 분포를 보여준다.
도 14는 WPC 및 WPI 출발 물질 둘 모두에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 다분산 지수(PDI)를 보여준다.
도 15는 WPC 및 WPI 출발 물질 둘 모두에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 측정된 제타 전위(mV)를 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 각각 WPC 및 WPI 출발 물질에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 겉보기 점도 및 전단 속도 관계를 보여준다.
도 17a 및 도 17b는 각각 WPC 및 WPI 출발 물질에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 원형 이색성을 보여준다.
도 18a 및 도 18b는 각각 WPC 및 WPI 출발 물질에 대한 유청 단백질 캡슐화된 글루타티온 나노입자의 FT-IR 스펙트럼을 보여준다.
실시예 5
PWP-DIM의 제조. 문헌[Khan, et al. (2019)]의 절차는 하기와 같이 수정되었다.
성분은 연속 스크래치형 교반식 온도- 및 pH-조절 탱크, 또는 등가의 연속 교반형 반응기(CSTR) 시스템에 첨가된다. 특히, 탱크는 재킷형이고, 증기 공급원에 연결되어 있다. 온도는 열전쌍에 의해 조절된다. 다른 부품에는 기계적 교반 시스템과 함께 측면에 pH 프로브와 바닥에 온도계가 포함된다.
DIM을 첨가하기 전에 유청 단백질을 탱크에서 분산시키고 중합시켰다.
온도는 70℃ 내지 95℃의 범위이고, pH 범위는 6.5 내지 9.0이다.
중합 전 및 후 물질의 혼합에 대한 측정된 점도 값은 각각 3000 mPas에 대한 100 mPas 내지 300 mPas이다.
결과 및 고찰.
DIM 및 유청 단백질 농축물은 소수성/수화 성질의 관점에서 정반대이다. 이러한 프로세스를 연속상에서 중합된 유청 단백질 폴리머로 분산상(DIM)을 캡슐화하도록 설계하였다. 교반 및 가열 시, 시스템의 점도가 요망되는 범위에 이를 때, 분산상을 현탁시키고 폴리머로 래핑하였다. 물질의 2개의 상은 연속적이고 균일한 마이크로 겔 또는 응집체로서 형성되었다.
마지막으로, 표준 방법을 이용하여 반응 생성물을 분무 건조시키고, 캡슐화된 분말로서 수집하였다.
실시예 6
PWP-DIM 샘플의 화학적 특징화. 본 개시내용의 원리에 따라 제조된 샘플은 점도 측정 및 다른 레올로지 측정, FT-IR, TEM/SEM 광학현미경, 미세구조 및 형태 연구, 안정성 연구(고체상, 용액상, 습도, 열), 입도, 제타 전위 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 당업계에 잘 알려진 다양한 수단에 의해 특징화될 수 있음이 잘 이해된다. 상기 화학적 분석은 본원에 기재된 조성물의 독특한 품질 및 성질을 추가로 나타낼 것으로 예상된다. 문헌[Khan, et al., 2019] 참조.
실시예 7
유사한 방식으로, 유청 단백질 단리물(WPI)을 사용하여 중합된 유청 단백질 캡슐화된 코엔자임-Q10(PWP-CoQ10)을 상기 방법으로 제조하고, 오렌지색 박편상 분말로서 특징화하였다. 검정(HPLC): 20.69 중량%.
도 19, 도 20 및 도 21에 제시된 바와 같이, 20:1(PWPI:CoQ10) 내지 100:1 1(PWPI:CoQ10) 범위의 다양한 비율을 갖는 PWP-CoQ10을 각각 입도(nm), 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위(mV)로 특징화하였다.
본원에서 달리 명시하지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 본원에 청구된 발명을 기술하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 용어 부정관사("a", "an"), 정관사("the") 및 유사한 지시어의 사용은 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 인용은 본원에서 달리 명시하지 않는 한, 단지 그러한 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 별도의 값은 본원에서 개별적으로 인용되는 것과 같이 본 명세서에 포함된다. 용어 "약"의 사용은 대략 ±10% 범위의 명시된 값 초과 또는 미만의 값을 나타내는 것으로 의도되고; 다른 구현예에서, 값은 대략 ±5% 범위의 명시된 값 초과 또는 미만의 값 범위일 수 있고; 다른 구현예에서, 값은 대략 ±2% 범위의 명시된 값 초과 또는 미만의 값 범위일 수 있고; 다른 구현예에서, 값은 대략 ±1% 범위의 명시된 값 초과 또는 미만의 값 범위일 수 있다. 전술한 범위는 문맥에 의해 명확하게 되도록 의도되며, 추가 제한은 암시되지 않는다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 명시하지 않거나 달리 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 의도된 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 임의의 청구되지 않은 구성요소를 본 발명의 실행에 필수적임을 가리키는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
전술한 명세서에서 본 발명은 이의 특정 구현예와 관련하여 설명되었고, 예시의 목적으로 많은 세부사항이 제시되었지만, 본 발명이 추가 구현예를 허용하고 본원에 기재된 특정 세부사항은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상당히 변경될 수 있음이 당업자에게 분명할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 본 발명은 이의 사상 또는 본질적인 속성을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위를 가리키는 것으로 전술한 명세서보다는 첨부된 청구범위를 참조해야 한다.

Claims (13)

  1. 3,3'-디인돌릴메탄(DIM), 글루타티논(GSH), 및 코엔자임-Q10(CoQ10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항산화제 화합물을 캡슐화하는 중합된 유청 단백질을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 중합된 유청 단백질은 중합된 유청 단백질 농축물인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 중합된 유청 농축물 및 항산화제 화합물은 약 2:1(wt/wt) 내지 약 10:1(wt/wt) 범위의 비율인, 조성물.
  4. 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 3,3'-디인돌릴메탄(DIM)을 제조하기 위한 프로세스로서,
    (a) 유청 단백질 농축물 분말을 물에 10% w/v로 용해시켜 수용액을 제공하는 단계;
    (b) 유청 단백질 농축물 용액을 적어도 약 70℃ 내지 80℃까지 가열하여 중합된 유청 단백질 용액을 제공하는 단계;
    (c) DIM을 중합된 유청 단백질 용액에 첨가하는 단계;
    (d) pH를 약 6.5 내지 약 9.0 범위로 조정하는 단계;
    (e) 중합된 유청 단백질 용액을 냉각시키는 단계;
    (f) 약 80℃로부터 약 45℃까지 냉각시키는 동안 교반하여 투명한 균질 용액을 제공하는 단계; 및
    (g) 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 DIM을 단리하는 단계를 포함하는, 프로세스.
  5. 제4항에 있어서, 유청 단백질 농축물 및 DIM은 중량 기준 등가량으로 사용되는, 프로세스.
  6. 제4항에 있어서, DIM에 대한 유청 단백질 농축물의 중량비는 약 1:1 내지 20:1인, 프로세스.
  7. 제4항에 있어서, 단리 단계는 분무-건조인, 프로세스.
  8. 제4항에 있어서, 단리 단계는 동결-건조인, 프로세스.
  9. 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 글루타티온을 제조하기 위한 프로세스로서,
    (a) 유청 단백질 농축물 분말을 물에 10% w/v로 용해시켜 수용액을 제공하는 단계;
    (b) 유청 단백질 농축물 용액을 약 15분 동안 약 70℃ 내지 80℃까지 가열하여 중합된 유청 단백질 용액을 제공하는 단계;
    (c) 글루타티온을 중합된 유청 단백질 용액에 첨가하는 단계;
    (d) 교반하여 투명한 균질 용액을 제공하는 단계; 및
    (e) 중합된 유청 단백질 마이크로캡슐화된 글루타티온을 단리하는 단계를 포함하는, 프로세스.
  10. 제9항에 있어서, 유청 단백질 농축물 및 글루타티온은 중량 기준 등가량으로 사용되는, 프로세스.
  11. 제9항에 있어서, 글루타티온에 대한 유청 단백질 농축물의 중량비는 약 1:1 내지 1:2인, 프로세스.
  12. 제9항에 있어서, 단리 단계는 분무-건조인, 프로세스.
  13. 제9항에 있어서, 단리 단계는 동결-건조인, 프로세스.
KR1020237008751A 2020-08-18 2021-08-17 중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스 KR102651539B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063067091P 2020-08-18 2020-08-18
US63/067,091 2020-08-18
PCT/US2021/046219 WO2022040129A1 (en) 2020-08-18 2021-08-17 Polymerized whey protein encapsulated antioxidant compound and a process for preparation of same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230049123A true KR20230049123A (ko) 2023-04-12
KR102651539B1 KR102651539B1 (ko) 2024-03-29

Family

ID=80270285

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237008751A KR102651539B1 (ko) 2020-08-18 2021-08-17 중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11766407B2 (ko)
KR (1) KR102651539B1 (ko)
CN (1) CN116209450A (ko)
CA (1) CA3189890A1 (ko)
WO (1) WO2022040129A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090028951A1 (en) * 2005-07-13 2009-01-29 Al Czap Compositions for Oral Administration of Sustained Release Glutathione, Methods for Their Production and Uses Thereof
WO2009070011A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Nizo Food Research B.V. Method for making protein-based encapsulates
KR20130138240A (ko) * 2010-09-21 2013-12-18 리포텍 에스.에이. 마이크로에멀젼을 포함하는 나노캡슐

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180441B1 (en) * 1984-10-30 1989-08-09 H.M.O. Nominees Pty. Ltd. Manufacture of cheese flavour powder
ES2365246T3 (es) * 2006-03-27 2011-09-27 Nestec S.A. Vehículo de proteína del suero de la leche para el suministro de un agente activo.
WO2009070012A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Nizo Food Research B.V. Protein-based probiotic encapsulates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090028951A1 (en) * 2005-07-13 2009-01-29 Al Czap Compositions for Oral Administration of Sustained Release Glutathione, Methods for Their Production and Uses Thereof
WO2009070011A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Nizo Food Research B.V. Method for making protein-based encapsulates
KR20130138240A (ko) * 2010-09-21 2013-12-18 리포텍 에스.에이. 마이크로에멀젼을 포함하는 나노캡슐

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecules 2019, 24(4), 702; https://doi.org/10.3390/molecules24040702. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11766407B2 (en) 2023-09-26
WO2022040129A1 (en) 2022-02-24
CN116209450A (zh) 2023-06-02
US20220054422A1 (en) 2022-02-24
US20240016752A1 (en) 2024-01-18
CA3189890A1 (en) 2022-02-24
KR102651539B1 (ko) 2024-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3003281B1 (en) Novel core-shell nanoparticles for oral drug delivery
JP4850986B2 (ja) カルノシンあるいはその誘導体および分枝アミノ酸を含む抗酸化活性を有する医薬組成物および／または栄養組成物
EP2540169B1 (en) Nanoparticles for the encapsulation of compounds, preparation thereof and use of same
TW201249477A (en) Methods of making liposomes, liposome compositions made by the methods, and methods of using the same
Wang et al. The stability and bioavailability of curcumin loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink
AU2015210650A1 (en) Formulations for microparticle delivery of zinc protoporphyrins
EP2197493B1 (en) Microencapsulated liposomal compositions
Premjit et al. Recent trends in Folic acid (Vitamin B9) encapsulation, controlled release, and mathematical modelling
Yang et al. Stability and bioavailability of protein matrix‐encapsulated astaxanthin ester microcapsules
KR20170097601A (ko) 생물활성, 나노입자포집된 항산화제의 운반
He et al. Simultaneous refolding of wheat proteins and soy proteins forming novel antibiotic superstructures by carrying eugenol
Wang et al. Carboxymethylpachymaran-Coated Zein Nanoparticles for Oral Delivery of Curcumin: Formation, Characterization, Physicochemical Stability, and Controlled Release Properties
Rashwan et al. Physicochemical and antioxidant properties of set-type yogurt supplemented by lyophilized water-soluble Melastoma dodecandrum extract-bearded chitosan-coated nutriosomes
KR102651539B1 (ko) 중합된 유청 단백질 캡슐화된 항산화제 화합물 및 이를 제조하기 위한 프로세스
JP2016159206A (ja) 生理活性物質の担持力を向上させたナノ粒子の製造方法
Ok et al. Development of nanoparticulate formulation of coenzyme Q 10 and comparison of plasma coenzyme Q 10 response in a single supplementation with regular coenzyme Q10 using rats
KR101830893B1 (ko) 장 투과성 나노입자 및 그의 제조방법
EP4289287A1 (en) Curcumin nanoparticle complex having modified particle surface and method for preparing same
JP6464745B2 (ja) 生理活性物質の担持力を向上させたナノ粒子の製造方法
JP2011240221A (ja) 脂溶性機能性化合物エマルション及びその製造方法
CA3041914C (en) Anaerobic antioxidant composition
EP3733197A1 (en) Anaerobic antioxidant composition
JP6443009B2 (ja) 生理活性物質の担持力を向上させたナノ粒子の製造方法
IT201800003503A1 (it) Composizione comprendente coenzima q10 e/o ubichinolo, piperina, curcumina da estratti vegetali
Malcata et al. In vitro digestion and stability assessment of beta-lactoglobulin/riboflavin nanostructures

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right