CN116209450A - 聚合乳清蛋白包封的抗氧化化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种通过使用可以以特定方式聚合的乳清蛋白包封谷胱甘肽(GSH)、3,3’‑二吲哚甲烷(DIM)、辅酶‑Q10(CoQ10)和其他疏水性抗氧化化合物的方法。此外，提供了包含聚合乳清蛋白(PWP)包封的谷胱甘肽、聚合乳清蛋白5(PWP)包封的CoQ10和聚合乳清蛋白(PWP)包封的DIM的组合物。

Description

聚合乳清蛋白包封的抗氧化化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种通过使用可以以特定方式聚合的乳清蛋白包封谷胱甘肽(GSH)、3,3’-二吲哚甲烷(DIM)、辅酶Q10(CoQ10)和其他疏水性抗氧化化合物的方法。本文描述了包含聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽、DIM、辅酶Q10等的组合物。
背景
谷胱甘肽(GSH)是一种在植物、动物、真菌和一些细菌中发现的抗氧化剂。谷胱甘肽是动物细胞中最丰富的硫醇，范围从0.5到10mM。它存在于胞质溶胶和细胞器中(GuoyaoWu,Yun-Zhong Fang,Sheng Yang,Joanne R.Lupton,Nancy D.Turner.“GlutathioneMetabolism and its Implications for Health[谷胱甘肽代谢及其对健康的影响],”Journal of Nutrition[营养学杂志](2004)134(3):489–92)。
谷胱甘肽以还原(GSH)和氧化(GSSG)状态存在。细胞内还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比率是细胞氧化应激的量度，其中GSSG与GSH比率的增加表明氧化应激更大(A.Pastore,等人,"Determination of blood total,reduced,and oxidizedglutathione in pediatric subjects[儿童受试者中血液总谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的确定]".Clinical Chemistry[临床化学](2001年8月)47(8):1467–9；SCLu."Glutathione synthesis[谷胱甘肽合成]".Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects[生物化学与生物物理学报(BBA)——一般问题](2013年5月)1830(5):3143–53)。在健康细胞和组织中，总谷胱甘肽库的90％以上呈还原形式(GSH)，其余呈二硫化物形式(GSSG)；(K.M.Halprin,A.Ohkawara"The measurement of glutathionein human epidermis using glutathione reductase[使用谷胱甘肽还原酶测量人表皮中的谷胱甘肽]".The Journal of Investigative Dermatology[皮肤病研究杂志](1967)48(2):149–52)。
GSH通过中和(即还原)活性氧物质来保护细胞。过氧化物的还原说明了这种转化：
2GSH+R2O2→GSSG+2ROH(R＝H、烷基)
此外，自由基可在体内被淬灭：
GSH+R·→0.5GSSG+RH
另外，谷胱甘肽在细胞调节和代谢中起着关键作用。关于这些关键的代谢和细胞作用，以稳定且生物可利用的组合物提供谷胱甘肽将是有利的。
谷胱甘肽在消化道中缺乏口服生物利用度。已经开发了先前的包封技术，这些技术主要使用脂质包封(如卵磷脂)与合成化学品(如聚山梨醇酯80)的结合以增加难以吸收的化合物的吸收，但是直到现在，乳清蛋白或聚合乳清蛋白的应用还没有以这种方式应用。因此，需要一种安全、无合成化学品的选择来提高生物利用度。
如果能够找到一种方式来改善用于递送给哺乳动物、特别是人受试者的组合物中谷胱甘肽的稳定性并减少其降解，这将为本领域作出有用的贡献。此外，如果能够找到一种方式来优化谷胱甘肽的吸收和身体对其的利用，例如提高生物利用度，这将为本领域作出进一步有用的贡献。
关于营养物的包封，某些成膜化合物和表面活性剂是有用的，例如，聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯硬脂酸酯、胆酸钠、脱氧胆酸盐和牛磺胆酸磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基乙基纤维素，这些中的一种或多种可与卵磷脂共混。
3,3’-二吲哚甲烷(“DIM”)是源自十字花科蔬菜的吲哚-3-甲醇的活性代谢物，并展现出广谱的抗癌特性。DIM的稳定性是制药工业中的重大挑战。此外，DIM由于其低溶解性和高亲脂性而具有较差的口服生物利用度。已知通过乳清蛋白进行包封以开发具有可控尺寸和特性的纳米颗粒，该方法可提供对敏感化合物(如芳香族化合物或保健营养品)的保护、保存和递送。
已知使用超声包封3,3’-二吲哚甲烷(“DIM”)和类似物质的某些方法。参见，A.Khan,等人,“Physicochemical and Microstructural Properties of PolymerizedWhey Protein Encapsulated 3,3’-Diindolylmethane Nanoparticles[聚合乳清蛋白包封的3,3’-二吲哚甲烷纳米颗粒的物理化学和微观结构特性],”Molecules[分子](2019)24:702。
如果能够找到一种方式来改善包封方法以提供例如具有更好的稳定性、溶解性和其他改善的特性(如口服生物利用度)的聚合乳清蛋白包封的DIM，则这将为化学品和配制品领域作出贡献。
发明概述
描述了一种组合物，所述组合物包括包封谷胱甘肽的聚合乳清蛋白。
描述了一种制备聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：将乳清蛋白浓缩物粉末以约8％-12％w/v溶解在水中以提供水溶液；将乳清蛋白浓缩物溶液加热至至少80℃，持续约15-25分钟，以提供聚合乳清蛋白溶液；在冷却过程期间向该聚合乳清蛋白溶液中添加抗氧化化合物；用匀浆器或剪切混合器搅拌以提供澄清的均匀溶液；以及例如通过冷冻干燥或喷雾干燥分离聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物以提供粉末。
此外，描述了一种制备聚合乳清蛋白微囊化DIM(PWP-DIM)的方法，该方法包括以下步骤：(a)将乳清蛋白浓缩物粉末以10％w/v溶解在水中以提供水溶液；(b)将该乳清蛋白浓缩物溶液加热至至少约70℃-80℃，以提供聚合乳清蛋白溶液；(c)向该聚合乳清蛋白溶液中添加DIM；(d)将pH调节在约6.5至约9.0的范围内；(e)冷却该聚合乳清蛋白溶液；(f)在从约80℃至约45℃的冷却期间搅拌以提供澄清的均匀溶液；以及(g)分离聚合乳清蛋白微囊化DIM。
一个目的是制备PWP-DIM，其具有明显更好的封装以更好地保护其通过消化道(即胃肠道)。
另一个目的是制备在消化道中具有改善的吸收的PWP-DIM。
此外，描述了一种制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)将乳清蛋白浓缩物粉末以10％w/v溶解在水中以提供水溶液；(b)将该乳清蛋白浓缩物溶液加热至约70℃-80℃，持续约15分钟，以提供聚合乳清蛋白溶液；(c)向该聚合乳清蛋白溶液中添加谷胱甘肽；(d)搅拌以提供澄清的均匀溶液；以及(e)例如通过冷冻干燥分离聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽以提供粉末。
在一个实施例中，制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法用于制备聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽(PWP-GSH)。
在另一个实施例中，制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法用于制备聚合乳清蛋白微囊化辅酶-Q10(PWP-CoQ10)。
附图说明
图1描绘了使用HPLC确定还原型谷胱甘肽(GSH)的标准曲线。将标准曲线绘制为浓度与峰面积的函数。
图2描绘了使用测定试剂盒确定还原型谷胱甘肽(GSH)的标准曲线。将标准溶液绘制为绝对OD值相比于GSH浓度(μM)。
图3描述了小鼠口服施用测试样品后，还原型谷胱甘肽(GSH)血浆浓度(μmol/L)作为时间的函数。
图4描绘了用于确定血浆的抗氧化活性的标准曲线。通过确定0.1、0.2、0.4、0.8和1.0mM的不同标准样品的OD值绘制标准曲线。
图5描绘了在实施例中，如通过测定试剂盒(ABTS法)所测量的，口服施用游离GSH、基于WPC/PWPC的GSH、WPC/PWPC后小鼠血浆的体内抗氧化活性。单个时间点处的竖条从左到右的顺序：对照、WPC、PWP、GSH、WPC-GSH和PWP-GSH。
图6A-6F描绘了在另一个实施例中，口服施用游离GSH、基于WPC/PWPC的GSH、WPC/PWPC后测量的小鼠组织中的GSH浓度(μM)。单个时间点处的竖条从左到右的顺序：对照、WPC、PWP、GSH、WPC-GSH和PWP-GSH。图A-F显示了脑(A)、心脏(B)、肺(C)、肾脏(D)、肝脏(E)和肠(F)的测量值。
图7描绘了在另一个实施例中，在饲料中掺入PWP-GSH的28天喂养测试中以克计的大鼠的体重曲线。
图8描绘了在另一个实施例中，在饲料中掺入PWP-GSH的28天喂养测试中以克/鼠/天计的大鼠的食物消耗量曲线。
图9描绘了在另一个实施例中，在饲料中掺入PWP-GSH的28天喂养测试中大鼠的食物效率曲线。
图10A描绘了在实施例中，在饲料中掺入按重量计4％的PWP-GSH相比于对照的28天喂养测试中，雄性大鼠的几个器官组织的染色切片的显微镜图像。
图10B描绘了在实施例中，在饲料中掺入按重量计4％的PWP-GSH相比于对照的28天喂养测试中，雌性大鼠的几个器官组织的染色切片的显微镜图像。
图11描绘了使用还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)确定固体样品中还原型GSH含量的标准曲线。
图12描绘了使用标准技术确定的PWPC和PWPC-GSH的TEM图像。底部处的刻度为1.0微米。
图13A描绘了基于WPC的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPC-GSH)的粒径分布。
图13B描绘了基于WPI的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的粒径分布。
图14描绘了基于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的多分散性指数(PDI)。字母a-c意指显著(P≤0.05)。
图15描绘了基于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的ζ电势(mV)。字母a-d意指显著(P≤0.05)。
图16A描绘了基于WPC的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPC-GSH)的表观黏度(mPa-sec)相比于剪切速率(1/s)。
图16B描绘了基于WPI的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的表观黏度(mPa-sec)相比于剪切速率(1/s)。
图17A描绘了基于WPC的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPC-GSH)的圆二色性[Θ]x 103deg cm2 dmol-1相比于波长(nm)。
图17B描绘了基于WPI的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的圆二色性[Θ]x 103deg cm2 dmol-1相比于波长(nm)。
图18A描绘了使用标准技术获得的基于WPC的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPC-GSH)的FT-IR光谱。
图18B描绘了使用标准技术获得的基于WPI的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如，PWPI-GSH)的FT-IR光谱。
图19描绘了通过标准方法以100:1、80:1、60:1、40:1和20:1(PWPI:CoQ10)的比率测量的PWPI标准品、PWPI-CoQ10样品的平均粒径(nm)。
图20描绘了通过标准方法以100:1、80:1、60:1、40:1和20:1(PWPI:CoQ10)的比率测量的PWPI标准品、PWPI-CoQ10样品的多分散性指数(PDI)。
图21描绘了通过标准方法以100:1、80:1、60:1、40:1和20:1(PWPI:CoQ10)的比率测量的PWPI标准品、PWPI-CoQ10样品的ζ电势(mV)。
具体描述
在一个方面，本发明涉及用聚合乳清蛋白使脂肪和水溶性抗氧化剂两者微囊化，其明确的目的是保护营养物免受降解并优化在体内的吸收和利用。例如，本发明诸位发明人在以下中对本发明制备聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽(PWP-GSH)的方法作出了贡献并对该方法进行了描述：S.Zhang,等人,“Polymerized Whey Protein Concentrate-BasedGlutathione Delivery System:Physicochemical Characterization,Bioavailabilityand Sub-Chronic Toxicity Evaluation[基于聚合乳清蛋白浓缩物的谷胱甘肽递送系统：物理化学表征、生物利用度和亚慢性毒性评价],”Molecules[分子](2021)26:1824，将其特此通过援引以其全文并入。
在另外的方面，本发明涉及一种通过调节温度和pH来操纵乳清蛋白的新方法，以允许蛋白质包封在营养物(特别是抗氧化剂)周围，用于保护以及最佳吸收和利用。已经使用本发明方法成功包封的抗氧化剂是谷胱甘肽、二吲哚甲烷和辅酶Q10。目前正在进行的研究为将该技术应用于膳食补充剂中(例如，将经压片、包封、掺入到即饮粉末中)，并允许将抗氧化剂成功地掺入到多种食物和饮料中以增加食物或饮料的健康益处。
目前的方法的优点是实现了技术上简化且更自然的方法，而不使用天然食物或膳食补充剂公司典型地不希望的某些化学试剂。
在主要的实施例中，抗氧化化合物和其他衍生物的封装更均匀一致，这允许在消化道中更好地保护活性组分。此外，当例如使用SEM或TEM从显微镜观察时，该方法实施例提供了更好的封装。
当与游离GSH相比时，本文所述的PWP-GSH组合物和配制品显示了改善的体内吸收、更好的药物代谢动力学、更好的生物利用度和更高的抗氧化能力。当与比较物GSH产品相比时，本文所述的PWP-GSH组合物和配制品还显示了改善的体内吸收、更好的药物代谢动力学和更好的生物利用度。
微囊化
微囊化是一种用于保护多种生物分子的技术。参见，Whey Protein Production,Chemistry,Functionality,and Applications[乳清蛋白生产、化学、功能和应用],编辑.Mingruo Guo(本发明诸位发明人之一)第7章,“Whey Protein Functional Propertiesand Applications in Food Formulation[乳清蛋白功能性特性和在食品配制品中的应用],”第157-204页(及其中引用的参考文献),(威利出版社(Wiley)：霍博肯市(Hoboken),新泽西州,2019)，将其通过援引并入本文。
配制品可以制备成适合用于人类个体的任何产品形式，包括可重构粉末、即食液体、肠胃外(静脉内)配制品和可稀释液体浓缩物，这些产品形式在营养配方领域中都是众所周知的。如在本申请中使用的，配制品或组合物中存在的组分的量是指当配制品或组合物准备好供人类个体消耗时的量。
配制品或组合物可以任选地进行灭菌，并随后以即食为基础使用，或者可以作为浓缩物储存。可以通过对如上制备的液体配制品进行喷雾干燥来制备浓缩物，并且可以通过对浓缩物进行再水合来重构配制品。配制品浓缩物是稳定的液体并具有适合的保质期。
对于本发明方法中使用的包含GSH、乳清蛋白包封的GSH(WP-GSH)或聚合乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH)的配制品或组合物的粉末实施例，可以用合适的水性液体、优选水进行粉末的重构。可重构粉末典型地为可流动或基本上可流动的颗粒组合物的形式，或至少是可用勺子或相似的其他装置容易地舀取和测量的特定组合物，其中这些组合物可以由预期的使用者用合适的水性流体(典型地是水)容易地重构以形成液体配制品或组合物。在此情形下，“立即”使用一般意指在约48小时内，最典型地在约24小时内，优选在重构后立刻使用。这些粉末实施例包括喷雾干燥、附聚、干混或其他已知或其他有效的颗粒形式。产生适合于一份食用量的体积所需的营养粉末的量可以变化。
用于本发明的方法的营养配方可以包装并密封在单次或多次使用的容器中，然后在环境条件下储存长达约36个月或更长，更典型地从约12至约24个月。对于多次使用的容器，这些包装可以由最终使用者打开然后覆盖以重复使用，其条件是然后将所覆盖的包装在环境条件(例如，避免极端温度)下储存并且在约一个月左右的时间内使用内容物。
用于递送膳食补充剂组合物(包含GSH、乳清蛋白包封的GSH(WP-GSH)或聚合乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH))的口服配制品的组合物可以例如与惰性稀释剂一起或者与可吸收的可食用载体一起口服施用，或者可以将其封装在硬壳或软壳明胶或羟丙基甲基纤维素(即羟丙甲纤维素)胶囊中，或者可以将其压缩成片剂，或者可以将其直接掺入饮食的食物中。对于口服施用，可将包含GSH、乳清蛋白包封的GSH(WP-GSH)或聚合乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH)的膳食组合物与赋形剂一起掺入，并以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片等的形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有以下各项：粘合剂，如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙、微晶纤维素等；崩解剂，如马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；并且可以添加甜味剂(如蔗糖、乳糖或糖精)或调味剂(如薄荷、冬青油或樱桃调味剂)。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶、糖或两者包覆片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料以及如樱桃或橙风味的调味剂。水包油乳液对于婴儿口服使用可能更好，因为它们是水混溶性的，因此它们的油性被掩盖。这样的乳液在制药科学中是熟知的。
使用HPLC确定GSH
HPLC分析的最佳条件：
柱：symmetry C18
流动相：水:乙腈＝90:10
流速：0.5ml/min
波长：218nm(UV检测器)
注射体积：0.5μL
将GSH粉末溶解在超纯水中以制备10mg/ml的储备溶液。通过使用超纯水稀释储备溶液获得一系列标准溶液(0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml)。使用HPLC确定GSH。如图1所示，将标准曲线绘制为浓度与峰面积的函数。
可以与以下实例相联系来进一步理解以上实施例中描述的组合物和方法。另外，提供以下非限制性实例来说明本发明。然而，本领域技术人员将理解，可能需要改变用于本发明的任何给定实施例的程序，例如，改变方法的顺序或步骤。
实例1
乳清蛋白–GSH混合物(WP-GSH)
通过在室温下将乳清蛋白浓缩物粉末溶解在去离子水中，然后搅拌(700rpm)2h，制备乳清蛋白浓缩物(WPC)溶液(10％蛋白质，w/v)。将储备溶液在4℃下储存过夜以完全水合。将乳清蛋白溶液升温至环境温度，然后以WPC(粉末):GSH＝1:1、1:1.5和1:2的重量比与还原型GSH混合。将混合物搅拌20min以实现完全溶解。
聚合乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH)
通过在室温下将乳清蛋白浓缩物粉末溶解在去离子水中，然后搅拌(700rpm)2h，制备乳清蛋白浓缩物(WPC)溶液(10％蛋白质，w/v)。将溶液在4℃下储存过夜以完全水合。使乳清蛋白溶液恢复至环境温度，并将pH调节至7或8，然后在80℃下加热15min。通过将加热的乳清蛋白溶液在混合的水-冰中快速冷却至室温(25℃±1℃)，获得聚合乳清蛋白(PWPC)溶液。然后将PWPC溶液与GSH粉末以PWPC:GSH＝1:1、1:1.5和1:2的重量比混合。将混合物混合20min以实现完全溶解。
稳定性实验
在室温下观察所有基于乳清蛋白的GSH溶液的稳定性，持续20h。下表1列出了基于乳清蛋白的谷胱甘肽溶液(包括聚合实施例)的稳定性。
表1
Figure BDA0004149223340000111
如表1中所示，PWP-GSH样品稳定至至少4小时。
实例2
药物代谢动力学研究
ICR小鼠(雄性，SPF，3周，体重18至22g)由北京华阜康生物科技股份有限公司(Beijing HFK Bioscience Co.,Ltd)(中国北京)提供。还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)、总抗氧化能力测量试剂盒(ABTS法)(A015-2-1)购自南京建成生物工程研究所(Nanjing Jiancheng bioengineering institute)(中国江苏南京)。
所有小鼠都被关在通风房间的塑料实验动物笼子里。房间维持在20℃±2℃以及60％±10％的相对湿度，使用12h光/暗循环。水和小鼠的商业实验室完全食物可以自由获得。处理前，使它们在该环境中适应了7天。所有动物实验均由吉林大学动物福利和研究伦理委员会(Animal Welfare and Research Ethics Committee)批准(批准编号：SY201905018)。
采血。采血前，将30μL的肝素溶液添加到1.5mL离心管中并涡旋。通过去除小鼠的一只眼睛来采集血液样品(约0.5mL)。将血液在室温下以6000rpm离心2min。将上层血浆转移到新的离心管中。使用GSH测定试剂盒分析血浆GSH浓度。
将GSH储备溶液(1mmol/L)稀释成浓度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和100μmol/L的一系列标准溶液。将标准溶液绘制为绝对OD值相比于GSH浓度(图2)。
A.在每组6只小鼠中在几个时间点(0、15min、30min、1h、2h和4h)通过灌胃口服施用游离GSH、基于乳清蛋白的GSH、乳清蛋白、基于聚合乳清蛋白的GSH和聚合乳清蛋白后，采集血液样品。将基于乳清蛋白的GSH的剂量调节为具有100mg/kg的GSH的当量。通过测定试剂盒确定血液样品中的GSH浓度。
表2显示了测试组和灌胃体积。
表2
Figure BDA0004149223340000131
如图3中所示，口服施用后，PWP-GSH测试材料提供了血浆中GSH浓度的出色且显著的增长。
B.体内抗氧化活性
将Trolox储备溶液(10mM)稀释至0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mM。通过确定不同标准样品的OD值绘制标准曲线(图4)。将血浆的抗氧化活性表示为相对Trolox的能力的倍数，其中Trolox的TAOC(总抗氧化能力)为1。
还使用测定试剂盒测量了所有样品的总抗氧化能力，并且结果如图5所示。通过测定试剂盒(ABTS法)测量小鼠口服施用游离GSH、基于WPC/PWPC的GSH、WPC/PWPC后血浆的体内抗氧化活性。
如图5中所示，PWP-GSH样品随着时间的推移显示出最稳健的抗氧化活性。
C.GSH的组织分布
为了评价GSH向器官的递送效率，在每组6只小鼠口服施用后0、1、2、4和6h时采集脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和肠的组织样品。将组织匀浆、沉淀蛋白质、离心，然后使用测定试剂盒分析GSH含量(图6A–6F)。
如图6A-6F所示，游离GSH在各种组织中的分布显著大于对照。此外，PWP-GSH组的GSH在各种组织中的分布显著大于对照。
D.基于聚合乳清蛋白的GSH(PWP-GSH)的毒性研究
乳清蛋白浓缩物由恒天然合作集团(Fonterra Co-operative Group)(新西兰奥克兰(Auckland))提供。戊巴比妥钠、福尔马林和无水乙醇由北京工厂(Beijing Works)(中国北京)提供。3周的SD大鼠由北京华阜康生物科技股份有限公司(中国北京)提供。
饮食配制品
根据实例1制备基于聚合乳清蛋白浓缩物的GSH(PWP-GSH)，其中聚合乳清蛋白浓度为10％，并且乳清蛋白与GSH的比率为1:1。然后使用冷冻干燥机(德国Alpha 1-4LDplus)对制备的聚合乳清蛋白GSH进行干燥。然后将基于粉状聚合乳清蛋白的GSH以0.5％、1％和4％(w/w)的百分比(对应于0.25％、1％和2％的GSH百分比)掺入正常饲料中。这些饮食由北京华阜康生物科技股份有限公司(中国北京)制备。基于健康人的每日摄入量(100mg/天)设定剂量。以60Kg的平均重量计算，人的剂量为1.6mg/kg。根据转换公式，这相当于大鼠的10mg/kg。将剂量设定为0.5％、1％和4％，这对应于人每日摄入量的25、50和200倍。
实验设计
从北京华阜康生物科技股份有限公司(中国北京)购得八十只3周龄大鼠(雌雄各半)。所有大鼠都被关在通风房间的塑料实验动物笼子里。房间维持在20℃±2℃以及60％±10％的相对湿度，使用12h光/暗循环。可以自由获得水。处理前，使受试大鼠适应该环境7天，其中一般状态没有明显变化。适应后，基于体重平均值将大鼠随机分至四组(10只/性别/组)。随机化时，组中的个体体重在总体平均值的±20％以内。与对照组中的动物相比，低、中和高剂量组动物在其饮食中分别接受0.5％、1％和4％的基于乳清蛋白的GSH。所有动物实验均由吉林大学动物福利和研究伦理委员会批准(批准编号：SY201905018)。
临床观察
在整个研究中，观察了每只大鼠的毛发状况、皮肤、黏膜、分泌物和排泄物的发生、自主神经系统活动、步态和姿势的变化。
体重和食物摄入量
对个体体重以及间隔4天的体重进行称重并记录，总共持续28天的时间段。在计划的尸检之前记录最终体重(禁食)。还测量了饲料摄入量，并表示为针对对应的时间间隔计算的平均食物消耗量(表示为g/大鼠/天)。
采血
实验结束时，使所有动物在采血前禁食12h，但确实可以饮水。以0.2ml/100g的水平向大鼠注射2％戊巴比妥钠溶液。然后，经由心脏采集用于血液学和血清化学的两个单独的血液样品。对于血液学分析，通过经EDTA-2K涂覆的管采集血液样品，然后使用Exigo动物血液学分析仪确定白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、血小板计数(PLT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布(RDW)、平均血小板体积(MPV)、淋巴细胞(LYM)、嗜中性粒细胞(GRAN)、单核细胞(MONO)、淋巴细胞(LYM％)、粒细胞(GRA)、单核细胞百分比(MON％)。
对于血清化学分析，将血液样品在室温下以10000rpm离心3min。将上层血清转移到新的离心管中，然后使用Smt-120v自动生化分析仪确定白蛋白(ALB)、钙(Ca)、肌酐(Crea)、总胆红素(TB)、总蛋白质(TP)、无机磷(PHOS)、尿素(UREA)、淀粉酶(AMY)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、BUN与CR的比率(U/C)、肌酸激酶(CK)、球蛋白(GLOB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)。
器官重量、肉眼尸检和组织病理学
在结束时，所有大鼠均由戊巴比妥钠麻醉，并通过横切胸腔来放血。然后在尸检期间通过目视检验进行完整的肉眼病理学检查。切除所有动物的脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、附睾和精囊并称重。每个器官(或成对器官)的相对重量是基于结束当天测量的最终个体体重计算的。除了将睾丸用Bouin溶液固定外，将这些器官的组织切片用10％缓冲甲醛固定，包埋在石蜡中，以2-5μm切片，封固在玻璃显微镜载玻片上，用标准苏木精-伊红染色，并使用光学显微镜检查。所有组织病理学程序均在吉林大学动物科学与兽医学院(College of Animal Science and Veterinary Medicine,JilinUniversity)进行。
结果
在实验过程期间，与对照组相比，实验组没有观察到不良效应。
在实验过程期间，未观察到与处理相关的动物临床外观的不良效应迹象。随着处理时间段的进展，体重逐渐增加(图7)。雌性组之间的体重无统计学显著差异。对于雄性组，从16天开始，1％雄性组显著不同于对照的那些。仅在雄性组中观察到体重变化，并且没有剂量依赖性效应。
图8和图9中显示了大鼠的食物消耗量和食物效率的28天的结果。实验组中未观察到PWPC-GSH相关的毒性作用，尽管在一些时间点时实验组与对照之间存在一些显著差异。在第8天，0.5％和4％雌性组的食物效率与对照相比显示出显著差异(p<0.05)。
表3显示了28天毒性研究中雄性大鼠的血清生化。
表3
Figure BDA0004149223340000161
Figure BDA0004149223340000171
注释：*意指与对照组相比0.05的显著水平，**意指与对照组相比0.01的显著水平
雄性大鼠的血清生化结果在上表3中显示。4％雄性组中的白蛋白显示出33.01±1.34g/L的值，显著低于对照组的值(p<0.05)。血清中的白蛋白含量低可能是由于合成缺陷所致。该变化可能有两个原因。由于肝炎，肝脏对白蛋白的吸收可能降低。另一个原因可能是低肾原性引起的肾排泄功能失调，这可能导致大量白蛋白与尿一起排泄。4％雄性中的球蛋白为28.1±2.77g/L，显著低于对照组的值(p<0.05)。然而，该值在正常范围(15-28g/L)内。4％雄性中的天冬氨酸氨基转移酶为91.17±8.13U/L，显著低于对照组的值(p<0.05)。然而，该值也在正常范围(39-111U/L)内。4％雄性中的丙氨酸氨基转移酶为39±7.73U/L，显著低于对照组的值(p<0.05)。然而，该值在正常范围(20-61U/L)内。天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶是肝功能的指标。这两个参数的增加可能表明肝脏的一些病理变化，而降低可能不具有临床意义。与对照相比，所有实验组的淀粉酶值均显著降低(p<0.05)，这是一个益处。实验组中的肌酸激酶值显著低于对照组的值(p<0.05)，这是一个益处。4％雄性中的葡萄糖显著低于对照组的葡萄糖，并且在正常范围(2.78-7.50μmol/L)内。1％和4％雄性组中的钙水平显著低于对照组中的钙水平(p<0.05)。钙水平的降低可能是由于(1)甲状旁腺激素缺乏；(2)维生素D缺乏或代谢异常；(3)慢性肾病。
综上所述，主要在4％雄性组中观察到血清生化的显著变化，并且这些变化主要与肝脏或肾脏的功能有关。
表4显示了28天毒性研究(n＝10)中雌性大鼠的血清生化。
表4
Figure BDA0004149223340000181
Figure BDA0004149223340000191
注释：*意指与对照组相比显著水平为0.05，**意指与对照组相比显著水平为0.01
雌性大鼠的血清生化结果在表4中显示。1％雌性组中的总蛋白质为68.02±4.31g/L，显著高于对照组的值(p<0.05)。然而，它在正常的范围(53-69g/L)内。总蛋白质水平升高可能是由于慢性肝病所致。1％和4％雌性中的淀粉酶和葡萄糖显著低于对照组的淀粉酶和葡萄糖(p<0.05)。1％和4％雌性组中的无机磷水平显著高于对照组。然而，它们在正常的范围(1.87-3.6μmol/L)内。
血液学
表5显示了28天毒性研究(动物的数目＝10)中雄性大鼠的血液学。
表5
Figure BDA0004149223340000192
Figure BDA0004149223340000201
注释：*意指与对照组相比显著水平为0.05，**意指与对照组相比显著水平为0.01
PWPC-GSH粉末对雄性大鼠的血液学参数无处理相关的不良效应。然而，对照与处理组之间出现了一些统计学显著差异。4％组中的PLT、MPV显著不同于对照的那些(p<0.05)。0.5％组中的MPV和LYM也显著不同于对照的那些(p<0.05)。
表6显示了28天毒性研究(动物的数目＝10)中雌性大鼠的血液学。
表6
Figure BDA0004149223340000202
Figure BDA0004149223340000211
注释：*意指与对照组相比显著水平为0.05，**意指与对照组相比显著水平为0.01
PWPC-GSH粉末对雌性大鼠的血液学参数无处理相关的不良效应。然而，对照与处理组之间出现了一些统计学显著差异。与对照相比，1％组中的RBC显示出6.76±0.56×1012/L的显著更高的值(p<0.05)。该变化可能是由缺水造成的，并且不应被考虑为与测试物质有关。1％雌性组中的HGB(14.46±0.88g/dL)和4％雌性组中的HGB(14.10±0.36g/dL)显著高于对照(p<0.05)。然而，这些值在正常的范围(13.2-16.4g/dL)内，并且不应被考虑为不良效应。
相对器官重量
相对器官重量的结果在表7和8中显示。使用PWPC-GSH粉末的雄性大鼠的最终体重显著低于对照组的最终体重(p<0.05)。与对照相比，除4％雄性组中的肝脏和肾脏外，所有用PWPC-GSH粉末喂养的大鼠的器官的相对重量没有显著差异。
表7显示了28天毒性研究(动物的数目＝10)中雄性大鼠的相对器官重量。
表7
Figure BDA0004149223340000221
注释：*意指与对照组相比显著水平为0.05，**意指与对照组相比显著水平为0.01
对于雌性大鼠，4％组中的大鼠的最终体重显著降低(p<0.05)。用PWPC-GSH粉末喂养的大鼠与对照组之间的相对器官重量没有显著差异。
表8显示了28天毒性研究(动物的数目＝10)中雌性大鼠的相对器官重量。
表8
Figure BDA0004149223340000231
注释：*意指与对照组相比显著水平为0.05，**意指与对照组相比显著水平为0.01
病理学和组织病理学
图10A和10B显示了4％喂养组相比于对照中雄性和雌性大鼠的几种组织的染色切片。组织样品通过常规方法制备和染色，并通过标准显微镜方法观察。
结论
PK研究的结果表明聚合乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH)的血清摄入量比Kyowa’sSetria GSH的血清摄入量高三倍。在施用3-4小时后，与用商业GSH饮食喂养的组相比，用聚合乳清蛋白包封的GSH喂养的大鼠的脑和肝组织中的GSH水平显著更高。与对照相比，4％喂养雄性组中的体重、血清生化和相对器官重量的参数有一些变化。因此，可以得出结论，对于雄性大鼠，未观察到不良效应的水平(NOAEL)估计至少为1％，并且对于雌性大鼠，该水平为4％，对应于人每日摄入量值的约50和200倍。
总之，与标准对照相比，乳清蛋白包封的GSH(WP-GSH、PWP-GSH)的生物利用度大大改善，并且它是一种安全的递送系统形式。
实例3
聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽(PWP-GSH)的制备
将乳清蛋白浓缩物(5Kg)以10％(w/v)的浓度溶解在蒸馏水中，并在4℃下储存过夜。然后将乳清蛋白浓缩物溶液在80℃下加热15分钟。冷却至室温后，然后将PWPC溶液与GSH粉末(5Kg)以PWPC:GSH＝1:1的重量比混合。将混合物搅拌20min以完全溶解。共混后，然后将混合物冷冻干燥以提供PWP-GSH粉末产品。
还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)、总抗氧化能力测量试剂盒(ABTS法)(A015-2-1)可从南京建成生物工程研究所(中国江苏南京)获得。可使用几种方法测定GSH含量。以下程序提供了未消化的GSH含量的确定。
将基于PWPC的GSH粉末(2g)溶解在20mL PBS缓冲液中，然后超声20min以进行完全提取。超声后，取1mL上清液并将其稀释800倍。然后，将1mL稀释溶液与1mL蛋白质去除剂混合，然后以3500rpm离心10min。然后使用GSH测定试剂盒测定上清液的GSH含量。
可替代地，在胰蛋白酶消化后确定GSH含量。
将酶活性为1:250的释放溶液:胰蛋白酶(10g)溶解在1LNaCl溶液(0.5％，w/v)中，然后使用0.1M NaOH溶液调节至pH 8。将基于PWPC的GSH粉末(0.3g)置于30mL释放溶液中，并在37℃下以100rpm振荡6h的同时孵育。然后将混合物以5,000×g离心20min，然后将上清液稀释100倍。然后将稀释的悬浮液与蛋白质去除溶液以1:1(v/v)的比率混合，然后离心。然后使用GSH测定试剂盒测定上清液的GSH含量。
参考图11标准曲线，未消化的情况下，两个样品的OD值分别为0.2883和0.2862，对应于PWPC-GSH产品中43.2％和42.9％(w/w)的GSH含量。胰蛋白酶消化后，两个样品的OD值分别为0.2654和0.2627，对应于PWPC-GSH产品中49.8％和49.2％(w/w)的GSH。
因此，已建立了乳清蛋白包封的GSH(PWP-GSH)制造的加工技术，并且基质中谷胱甘肽的回收率为99.2％，表明该热敏化合物在整个过程中的损失仅为0.8％。
实例4
PWP-GSH样品的化学表征。得到充分理解的是，根据本披露的原理制备的样品可以通过本领域熟知的各种手段表征，包括但不限于黏度测量和其他流变测量、FT-IR、TEM/SEM显微摄影、微观结构和形态学研究、稳定性研究(固相、溶液相、湿度、热)、粒径、ζ电势等。预期所述化学分析将进一步显示本文所述的组合物的独特品质和特性。参见Khan,等人,2019。
实例4A
1.使用乳清蛋白浓缩物(PWC)制备PWPC-GSH
与基于聚氰基丙烯酸异丁酯、Eudragit RS 100/环糊精和蒙脱石的其他载体相比，制备的PWPC-GSH系统具有简单、温和以及无有机溶剂的优点。在根据Zhang等人(2021)测量的一项表征测试中，PWPC显示出双峰模式，在594nm和4580nm处具有两个峰，具有宽的粒径分布(9.22的跨度)，这与先前的研究一致。与GSH(287.83±6.18nm)的组合使粒径(D50)从1085±35.35nm略微增加到1115±7.07nm，跨度从9.22±0.22减小到6.86±0.19。发现PWPC-GSH的ζ电势为30.37±0.75mV。高表面电荷赋予PWPC-GSH系统高稳定性，因为分子之间的强静电排斥防止聚合、沉淀和絮凝。另外，由于细胞膜携带负电荷，PWPC-GSH的正表面电荷有利于体内吸收。PWPC-GSH系统在1–300s-1范围内表现出剪切稀化行为，表明微滴之间的相互作用在较高的剪切速率下减弱。
GSH的DSC热谱图在198℃处显示出放热峰并且该熔化峰在PWPC-GSH系统中消失，表明GSH以分子分散在PWPC颗粒中。FTIR光谱分析表明，PWPC在1654.39cm-1处显示酰胺I(C＝O振动)光谱峰，并且在与GSH结合后发生红移，表明PWPC在结构上发生变化，并且形成了分子间氢键。该PWPC-GSH系统显示出蠕虫状聚集体的形态，其中大多数聚集体的尺寸大致为200nm，向上测量到一些较大的聚集体为大约400nm，这是由标准TEM成像技术确定的(图12)。
2.PWPC-GSH的体内药物代谢动力学和抗氧化活性
乳清蛋白因其对胃蛋白酶消化的抗性、无毒性质、来源广泛可得以及生物相容性广而作为有效的营养物递送手段被广泛研究。对PWPC-GSH递送系统和游离GSH进行了药物代谢动力学研究，并确定了所有组的血浆GSH浓度-时间曲线。观察到PWPC-GSH组的血浆中GSH浓度最高，其次是游离GSH、PWPC和对照组。用PWPC-GSH灌胃的小鼠血浆中的值高于游离GSH组的值，这可能是由于高黏性PWPC通过将GSH嵌入内部并防止对胃肠道酶和酸性环境的损害而产生保护作用。这些结果与先前的研究一致，即通过乳清蛋白包封改善了槲皮素和维生素D的生物利用度。
使用小鼠模型计算药物代谢动力学参数。与游离GSH(最大浓度(C最大)为7.37mg/L，并且浓度-时间曲线下面积(AUC)为19.23hx mg/L)相比，观察到更高的C最大(19.41mg/L)和AUC(48.63h x mg/L)值，表明小鼠在施用PWP-GSH后血液循环中GSH吸收的速率和程度更大。PWPC-GSH组的C最大和AUC高出2.5倍和2.6倍，这表明相比于单独的纯的形式的GSH，PWPC-GSH递送系统可以有效地改善GSH的体内生物利用度。在吸收到肠道期间，乳清蛋白作为载体似乎也对GSH具有保护作用，这可能是由于对胃蛋白酶消化的抗性。除了GSH本身的递送外，补充乳清蛋白还可借助于乳清蛋白固有的大量半胱氨酸残基而促成体内GSH水平的增加，其作为速率限制性氨基酸具有促进的GSH的生物合成的能力。与游离GSH中达到最大浓度的时间(2h)相比，PWPC-GSH组达到最大浓度的时间(T最大)(1h)较低，表明施用后达到最大浓度所需的时间较短。GSH组中的血浆GSH浓度在1.5至2h后达到最高水平，这与早期文献中相对于口服施用游离GSH报告的数据相一致。
使用测定试剂盒测量不同时间点时样品的总抗氧化能力。在整个时间段期间，用PWPC-GSH灌胃的小鼠中血浆的抗氧化能力显著高于游离GSH灌胃的小鼠中血浆的抗氧化能力(p<0.05)。小鼠灌胃PWPC-GSH后血浆的抗氧化能力增加的第一个原因是使用PWPC作为递送载体改善了血浆中的GSH浓度。第二个原因可能是由于乳清蛋白的抗氧化特性。如通过T-AOC(mM)测量的，用PWPC灌胃后小鼠的血浆抗氧化能力也略有改善，其程度可以与累加效应一致或不一致。
实例4B
根据实例3、4和4A，与乳清蛋白浓缩物(WPC)和乳清蛋白分离物(WPI)标准相比，测量了PWPC-GSH和PWPI-GSC的各种参数。
图13A和13B分别显示了针对WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的粒径分布。
图14显示了针对WPC和WPI起始材料两者的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的多分散性指数(PDI)。
图15显示了针对WPC和WPI起始材料两者的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的测量的ζ电势(mV)。
图16A和16B分别显示了针对WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的表观黏度与剪切速率的关系。
图17A和17B分别显示了针对WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的圆二色性。
图18A和18B分别显示了针对WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的FT-IR光谱。
实例5
PWP-DIM的制备。将Khan，等人(2019)的程序修改如下。
将组分添加到连续刮擦类型搅拌的、温度和pH控制的罐或等同的连续搅拌类型反应器(CSTR)系统中。特别地，该罐是夹套的，并连接到蒸汽源。该温度由热电偶控制。其他部分包括侧面的pH探针和底部的温度计、以及机械搅拌系统。
在添加DIM之前，使乳清蛋白在罐中分散并聚合。
温度的范围为70℃至95℃，并且pH的范围为6.5-9.0。
聚合前及之后的材料的混合物的黏度测量值分别为100-300mPas至3000mPas。
结果与讨论。
DIM和乳清蛋白浓缩物在疏水性/水合特性方面相反。该方法设计为在连续相中用聚合乳清蛋白聚合物包封分散相(DIM)。在搅拌和加热时，当系统的黏度达到所需的范围时，使分散相悬浮并由聚合物包裹。材料的两相形成为连续且一致的微凝胶或聚集体。
最后，使用标准方法对反应产物进行喷雾干燥，并作为包封的粉末收集。
实例6
PWP-DIM样品的化学表征。得到充分理解的是，根据本披露的原理制备的样品可以通过本领域熟知的各种手段表征，包括但不限于黏度测量和其他流变测量、FT-IR、TEM/SEM显微摄影、微观结构和形态学研究、稳定性研究(固相、溶液相、湿度、热)、粒径、ζ电势等。预期所述化学分析将进一步显示本文所述的组合物的独特品质和特性。参见Khan,等人,2019。
实例7
以类似的方式，通过上述方法使用乳清蛋白分离物(WPI)制备聚合乳清蛋白包封的辅酶-Q10(PWP-CoQ10)，并将其表征为橙色薄片状粉末。测定(HPLC)：按重量计20.69％。
如图19、20和21所示，将具有范围从20:1(PWPI:CoQ10)到100:1 1(PWPI:CoQ10)的各种比率的PWP-CoQ10分别通过粒径(nm)、多分散性指数(PDI)和ζ电势(mV)表征。
在描述当前要求保护的发明的上下文中(尤其是权利要求的上下文中)，术语“一个/一种(a、an)”、“该/所述(the)”以及类似的指代词的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾。除非本文另有说明，否则本文对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入说明书中，就如同在本文单独地陈述该值一般。术语“约”的使用旨在描述在大约±10％的范围内高于或低于所述值的值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±5％的范围内高于或低于所述值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±2％的范围内高于或低于所述值；在其他实施例中，这些值的范围可以在大约±1％的范围内高于或低于所述值。上述范围旨在根据上下文确定，并且未隐含进一步限制。本文描述的所有方法能以任何适合的顺序进行，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
尽管在前述说明书中，已经就本发明的某些实施例对其进行了描述，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对本领域普通技术人员显而易见的是本发明易受另外的实施例的影响并且本文所描述的某些细节可以在不偏离本发明的基本原理下进行相当大的改变。
本文所引用的所有参考文献均通过援引以其全文并入。在不偏离本发明的精神或基本属性的情况下，可以将本发明以其他特定形式呈现，并且因此应该参考指明本发明的范围的所附权利要求书，而非参考前述说明书。

Claims (13)

1.一种包含聚合乳清蛋白的组合物，所述聚合乳清蛋白包封选自由3,3’-二吲哚甲烷(DIM)、谷胱甘肽(GSH)和辅酶-Q10(CoQ10)组成的组的抗氧化化合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚合乳清蛋白是聚合乳清蛋白浓缩物。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述聚合乳清浓缩物和所述抗氧化化合物的比率在约2:1(wt/wt)至约10:1(wt/wt)的范围内。
4.一种制备聚合乳清蛋白微囊化3,3’-二吲哚甲烷(DIM)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将乳清蛋白浓缩物粉末以10％w/v溶解在水中以提供水溶液；
(b)将所述乳清蛋白浓缩物溶液加热至至少约70℃-80℃，以提供聚合乳清蛋白溶液；
(c)向所述聚合乳清蛋白溶液中添加DIM；
(d)将pH调节在约6.5至约9.0的范围内；
(e)冷却所述聚合乳清蛋白溶液；
(f)在从约80℃至约45℃的冷却期间搅拌以提供澄清的均匀溶液；以及
(g)分离聚合乳清蛋白微囊化DIM。
5.如权利要求4所述的方法，其中乳清蛋白浓缩物和DIM以按重量计等同的量使用。
6.如权利要求4所述的方法，其中乳清蛋白浓缩物与DIM的重量比为约1:1至20:1。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述分离步骤是喷雾干燥。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述分离步骤是冷冻干燥。
9.一种制备聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将乳清蛋白浓缩物粉末以10％w/v溶解在水中以提供水溶液；
(b)将所述乳清蛋白浓缩物溶液加热至约70℃-80℃，持续约15分钟，以提供聚合乳清蛋白溶液；
(c)向所述聚合乳清蛋白溶液中添加谷胱甘肽；
(d)搅拌以提供澄清的均匀溶液；以及
(e)分离聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽。
10.如权利要求9所述的方法，其中乳清蛋白浓缩物和谷胱甘肽以按重量计等同的量使用。
11.如权利要求9所述的方法，其中乳清蛋白浓缩物与谷胱甘肽的重量比为约1:1至1:2。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述分离步骤是喷雾干燥。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述分离步骤是冷冻干燥。
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