CN102869271A - 用于包封化合物的纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于包封化合物的纳米颗粒，及其制备和应用，该纳米颗粒包括酪蛋白基质，碱性氨基酸以及选自二价金属、三价金属及其组合的金属。所述纳米颗粒可以包封水溶性或者脂溶性的生物活性化合物。本发明可以应用于食物、制药和化妆品领域以及纳米技术领域。

Description

用于包封化合物的纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及食物、制药和化妆品领域以及纳米技术领域，并且包括使用酪蛋白作为涂层剂来包封生物活性化合物。

技术背景

食品工业需要技术上的不断进步从而满足新的消费者需求。纳米技术存在使食品工业彻底地变革巨大的潜力，因为这一技术能够包封生物活性化合物[BAC]，例如香料、维生素、矿物质、精油、抗氧化剂、益生菌等等，从而具有众多优势，举例来说，能够延长制品的保存期限；能够降低BAC的用量；能够控制其释放；能够提高其生物利用度；能够掩盖不需要的味道，等等。

当设计适用于包封BAC的载体时，正确地选择用作涂层剂或者基质的材料是非常重要的；为此，除其他因素外，必须要考虑到剂型、毒性、将要引入制剂的产品（食物、化妆品、药物，等等）等。在食品纳米技术领域中，不推荐使用合成的聚合物，因为它们可能存在毒性问题。天然的聚合物不具有这些缺点；然而，它们的使用必然使得颗粒的制造方法更复杂；此外，在大多数情况中，难以控制获得的粒度（在许多情况中大于100μm），因此消费者可能会注意到这些纳米颗粒，并且其可能会改变目标食品的感官特性。

传统上，在这些材料中，蛋白质被用作BAC涂层剂。使用酪蛋白作为载体包封疏水性的BAC在食品中的应用，已有所描述（CA2649788和EP2011472）。

叶酸（蝶酸单麸胺酸或者维生素B9），包括在叶酸组中的B族水溶性维生素，对于重要的生化过程、例如DNA合成是十分重要的。缺乏叶酸与巨成红细胞性贫血、阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、内分泌失调、某种类型的癌症（结肠癌、宫颈癌、白血病、胰腺癌）、在胎儿发育过程中的神经管缺陷、在怀孕过程中的并发症以及男性不育症相关。然而，叶酸并不能通过有机体来合成；因而其必须通过不同的补充剂或者饮食来供给。

尽管叶酸天然存在于食物中（例如水果和蔬菜），但是其主要是以聚麸胺酸盐的形式，它们的生物利用度并不完全，典型地为50%或更低。因此，摄取添加有叶酸的食物可以形成一种补充性的选择，从而增加在那些叶酸的摄入低于推荐量的情况中所述维生素的摄入。然而，除了其它的因素外，因为基体效应，添加至食物中的叶酸的生物利用度并不完全（叶酸可能与食物组分相连接，由此阻止其吸收），或者存在于食物中的任意组分降低其生物利用度。此外，当叶酸没有在肠内溶解时，其也不能被很好地吸收。通过胶囊、片剂等的方式施用含有叶酸的补充剂或者强化剂具有如下的缺点，当其由于胃酸而在胃中降解时，叶酸会发生沉淀，转化为其较难溶解的形式，由此仅部分所供给的叶酸能够到达肠。

此外，含有叶酸盐或者叶酸的食物的强化是复杂的过程，因为除其他因素外，叶酸盐和它们的衍生物以及叶酸对于温度、光和pH值变化是十分敏感的；因此它们的稳定性受到食物加工条件的影响，并且消费者可利用的维生素的生物活性量可能会极大地降低。由此，当利用所述维生素强化食物时，就需要考虑这些方面，因为最大的损失可能会发生在食物的存储和制备过程中。

已经有文献描述了如何令食物富含叶酸，主要是在乳制品和谷类制品中。富含叶酸或叶酸盐的膳食补充剂（EP2002839）或者食物，例如做香肠用的肉（ES2302571），乳制品（EP1941804），幼（婴）儿食品（US4753926），或者甚至是鸡肉、猪肉或牛肉罐头食品（RU2223672和RU2213493）也已有所描述。然而，在所描述的情况中，均没有考虑维生素与食物基质的可能的相互作用以及其生物利用度。

现有技术还公开了一种用于获得藻酸盐和果胶微胶囊的方法，该微胶囊含有叶酸从而避免叶酸被保护其免导致其降解的环境因素（例如胃部环境）的损害，实现叶酸其在肠内的释放。然而，所获得的微胶囊太大，其影响了目标食物的感官特性。现有技术中还设计了一种用于将叶酸包封在乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米微球中并实现其持续地释放的方法；尽管结果是积极的，但是该设计在食物中的应用受到聚合物使用的损害，因为其在医学和药学领域是禁止使用的。

因此，有必要开发BAC包封系统，优选水溶性的，更优选酸性的水溶性BAC，例如叶酸，其全部地或者部分地克服了上述缺陷。

发明内容

当前，意外地发现利用酪蛋白形成并且进一步包括碱性氨基酸（例如精氨酸或赖氨酸）和适用于食物的金属（例如钙）的纳米颗粒，形成生物活性化合物（BAC）的一种新的包封和稳定系统，该生物活性化合物可以是水溶性和脂溶性的，优选为水溶性的，更优选为酸性的水溶性BAC，其可以应用在食物、化妆品和药物中。

由此，一方面，本发明涉及纳米颗粒，其包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的食品级的金属。所述纳米颗粒可被用为工艺添加剂；它们进一步具有包封BAC、优选水溶性BAC、更优选酸性的水溶性BAC的能力，例如B族维生素或者C族维生素，例如叶酸、泛酸和抗坏血酸，或其它的亲水性化合物，尽管它们还可以包封脂溶性BAC。

所述纳米颗粒是稳定的并且能够保护BAC免于在产品加工（例如食物、药物或者化妆品）和存储过程中被外部因素降解，例如光、pH值变化、氧化等等，并且此外，当它们应用于食物中时，它们保护BAC免受胃部酸性环境的影响，防止其沿着胃道释放，从而避免BAC沉淀，并且由此避免生物利用度降低。此外，据发现所述纳米颗粒能够溶解在（模拟的）肠部介质中，促进BAC在肠内的完全释放，令其正确地吸收，并且进一步避免了任何类型的毒性问题。有利地，所述纳米颗粒在引入的食物中是惰性的，因此避免了BAC与基质的不同组分之间的反应，并避免降低其生物利用度。

另外，本发明提供的该纳米颗粒的几个最重要的特征之一在于使用酪蛋白作为用于保护BAC免受环境条件和胃部条件损害、促进其在肠部内释放并由此改善其生物利用度的天然载体，因为酪蛋白本身已经被证明具有营养特性，从而使得其补充了BAC自身的有益效果。

另一方面，本发明涉及一种制造所述纳米颗粒的方法。所述方法是简单的并且能够工业化大规模应用。有利地，所述方法不包括没有被批准为食品添加剂的合成或者反应性聚合物，最小化包含的表面活性剂或者乳化剂，并且该方法允许获得具有可控的粒度的纳米级的纳米颗粒。

在一种特定的实施方式中，所述方法进一步包括干燥包含所述纳米颗粒的悬浮液从而获得粉末形式的制剂，随着时间的流逝维持BAC的稳定；特别地，这种类型的粉末制剂适用于在固体食物中使用。有利地，所述干燥处理在纳米颗粒保护剂的存在下执行。由此获得的包含BAC的纳米颗粒可以容易地悬浮在水介质中，保护BAC免于在溶液中降解。获得的最终制品是稳定的并且在整个长期的存储过程中保护BAC，并且其还可以应用于不同类型的食物，无论是液体食物（例如饮料等）还是固体食物。

另一方面，本发明涉及一种包括所述纳米颗粒的组合物在食物、药物或者化妆品中的应用。实际上，所述纳米颗粒可以被结合在乳剂、凝胶和水凝胶中，从而获得适用于这一领域的稳定的化妆品制剂。所述纳米颗粒还可以利用适用于通过局部途径施用所述纳米颗粒的赋形剂进行配制。

另一方面，本发明涉及一种食品，包括由本发明提供的基于酪蛋白纳米颗粒的所述组合物。在一种特定的实施方式中，所述食品为液体、半固体或者固体的形式。

附图说明

图1示出了描述本发明方法的一种特定的实施方式的示意图，其用于获得包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒。

图2示出了空的酪蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。位于该图像的下部左侧边缘部分的黑条对应于100nm。

图3示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。位于该图像的下部左侧边缘部分的黑条对应于100nm。

图4示出了包封的叶酸量和加入至该制剂中的每毫克的叶酸的酪蛋白量之间的比例。在所有的制剂中，赖氨酸和该蛋白质的重量比在加入叶酸溶液之前均为1：12。

图5示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒并且在制剂中具有赖氨酸的扫描电子显微镜（SEM）显微图，分别为未进行高压处理（A和B）、在100MPa下处理5分钟（C）、在400MPa下处理5分钟（D）和在800MPa下处理5分钟（E）。

图6示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒并且制剂中具有精氨酸的扫描电子显微镜（SEM）显微图，其在400MPa下处理5分钟。

图7示出了在37±1℃下的模拟胃液（SGF）中（在前2个小时中：0-2小时）以及在模拟肠液（SIF）（2-24小时）中孵育后，不用高压处理时叶酸从酪蛋白纳米颗粒中的释放。该数据示出了平均值±标准偏差（n=6）。

图8示出了37±1℃下在模拟胃液（SGF）中（在前2个小时中：0-2小时）以及在模拟肠液（SIF）（2-8小时）中孵育后，在（A）150MPa下高压处理5分钟和在（B）400MPa下高压处理5分钟时，叶酸从酪蛋白纳米颗粒中的释放。该数据示出了平均值±标准偏差（n=4）。

图9示出了在试验动物中施用不同的维生素制剂后，根据时间的血清叶酸浓度（ng/mL）变化。该结果示出了平均值±标准偏差（n=5）。

A）静脉注射，剂量1mg/kg。

B）口服途径，剂量1mg/kg：溶解在水中的未包封的叶酸（●）；分散在水中的包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸（■）；分散在水中的用高压处理的包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸（▲）。

发明详述

本发明提供酪蛋白纳米颗粒以及包封生物活性化合物（BAC）的方法，从而防止它们由于外部因素而降解，例如光、pH值变化、氧化等等。

定义

出于帮助理解本发明的目的，在本发明内容中所使用的某些术语和表述的含义如下所述。

作为在本文中使用的，“碱性氨基酸”包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

作为在本文中使用的，“酪蛋白”涉及结合蛋白，其形成约80%的全乳蛋白。在球蛋白的定义范围内，酪蛋白为磷蛋白质类型的蛋白质，可溶，具有高保水能力并且于20℃在约4.6的pH值下沉淀。酪蛋白由四个基本部分（αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）形成，其相互之间通过它们的氨基酸成分，它们的电荷分布以及在钙的存在下它们形成凝聚体的趋势而加以区分。在乳液中，酪蛋白形成直径为50至600nm（平均约150nm）的被称为“酪蛋白微胶粒”的大胶体颗粒。这些颗粒通过疏水相互作用并且通过由存在于酪蛋白结构中的磷酸丝氨酸自由基复合的磷酸钙而形成。在乳液中所述微胶粒形成非常稳定的胶体系统，这是形成其颜色、热稳定性以及由于凝乳酶而凝聚的主要原因之一。

作为在本文中使用的，“生物活性化合物”或者“BAC”涉及任意的脂溶性和水溶性的具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性的化合物。根据本发明的BAC的非限制性的说明性的例子包括氨基酸、抗微生物剂、芳化剂、防腐剂、甜味剂、类固醇、药物、激素、脂类、肽、多核苷酸、多醣、蛋白质、蛋白聚糖、芳香剂、维生素等等。

作为在本文中使用的，“水溶性生物活性化合物”或者“水溶BAC”涉及具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性并且可溶于水溶液的（极易溶的、易溶解的、可溶的、难溶的或者微溶的）化合物，其根据西班牙皇家药典的标准来定义：

水溶性BAC的非限制性的说明性例子包括维生素，例如B族维生素或C族维生素及其衍生物、盐或酯；透明质酸、硫酸软骨素、硫辛酸、其盐或酯，等等。在一种特定的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸、泛酸、单磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸盐；聚麸胺酸叶酸盐）、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸（α硫辛酸)、p-香豆酸、咖啡酸，其药学或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组中。

作为在本文中使用的，“脂溶性生物活性化合物”或者“脂溶性BAC”涉及具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性并且可溶于脂和油的（极易溶的、易溶解的、可溶的、难溶的或者微溶的）化合物，其根据西班牙皇家药典的标准来定义。脂溶性BAC的非限制性的说明性例子包括维生素，例如A族、D族、E族、K族维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素（胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄质等），Ω-3脂肪酸（二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）等），植物甾醇和植物固醇（谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等），多酚（槲皮苷、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）及其衍生物。

如果制品用于人和动物的食品中时是安全的，那么根据国家或者组织的食品标准该制品被称为是“食品级”的，例如联合国粮食与农业组织（FAO）或者世界卫生组织（WHO）；因此，“食品级”的制品是“适用于在食物中使用的”无毒制品，并且由此在本说明中使用的两种表述是同义的，并且是没有区分的。

作为在本文中使用的，“二价金属”包括化合价为2的任意金属元素，例如碱土金属，例如钙、镁、锌等，或者如果其具有多个化合价，其中的一个是2时，例如铁等，同时限制其为药学上或者化妆品可接受的，或者适用于在食物中使用的。

作为在本文中使用的，“三价金属”包括化合价为3的任意金属元素，或者如果其具有多个化合价，其中的一个是3时，例如铁等，同时限制其为药学上或者化妆品可接受的，或者适用于在食物中使用的。

作为在本文中使用的，“纳米颗粒”涉及球形或者类似形状的胶体系统，其粒度小于1微米（μm），优选为约10至900纳米（nm）。

作为在本文中使用的，“平均粒度”涉及在水性介质中移动到一起的纳米颗粒群体的平均直径。这些系统的平均直径可以通过本领域技术人员已知的标准方法来测定，并且例如在实验部分中进行描述（参见下文）。本发明的纳米颗粒，其特征在于，具有小于1μm的平均粒度，典型地介于1至999nm，优选10至900nm，更优选50至500nm，依然更优选100至200nm。在一种特定的实施方式中，本发明的纳米颗粒具有的平均粒度为50至200nm，优选为约140nm。

纳米颗粒

一方面，本发明涉及一种纳米颗粒，以下称为本发明的纳米颗粒，包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属。

在一种特定的实施方式中，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组中。

在另一种特定的实施方式中，所述金属优选为食品级的二价金属，其选自由钙、镁、锌、铁（以二价的形式）及其组合组成的组中。

在另一种特定的实施方式中，所述金属为食品级的三价金属，例如三价形式的铁。

本发明的纳米颗粒可被用为工艺添加剂，例如作为脂肪代用品等。本发明的纳米颗粒进一步具有包封生物活性化合物（BAC）的能力。

由此，在另一种特定的实施方式中，本发明的纳米颗粒进一步包括生物活性化合物（BAC）。所述BAC可以是水溶性BAC或者脂溶性BAC；在这种情况中，本发明的纳米颗粒在本说明书中有时会等同于“本发明的负载纳米颗粒”。

在一种特定的实施方式中，所述BAC为水溶性BAC，优选为酸性水溶性BAC。在一种更特别的实施方式中，所述水溶性BAC选自由如下构成的组：

a）B族维生素或者C族维生素；

b）根据a）的维生素衍生物；

c）选自透明质酸、硫酸软骨素和硫辛酸的化合物；

d）任意的前述化合物a）至c）的盐或酯；及

e）其组合。

在一种特定的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸或者维生素B3、泛酸或者维生素B5、单磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸盐；聚麸胺酸叶酸盐）、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸或者α硫辛酸、p-香豆酸、咖啡酸，其药学上或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物组成的组中。

在一种特定的实施方式中，所述BAC为酸性水溶性BAC，例如叶酸、泛酸、抗坏血酸等。

并不希望被任何理论所限制，据信在存在金属、例如二价金属（例如钙）的情况下，当存在于其结构中的磷酸丝氨酸自由基结合至阳离子部分时，它们的亲水性和表面电荷的丧失，α和β酪蛋白聚集。该水溶性BAC，优选酸性的（例如叶酸），还与所述金属静电相互作用，由此其将被捕获在由这些类型的酪蛋白所产生的疏水基质中。反过来，κ酪蛋白并不与金属（例如钙）发生反应，因此通过其疏水部分将其结合至该颗粒，其水溶性部分与外部水性介质相接触。除了高比例的羰基（氨基酸、例如谷氨酸或天冬氨酸的酸基）之外，所述水溶性部分还具有极性基团，其对应于结合至三糖和四糖的丝氨酰和苏氨酰残基。由此认为在形成该纳米颗粒之后，由于其与所述部分的羧基的静电相互作用[例如，在它们穿过喷雾干燥器（适当的话）的过程中对其进行加热之后，它们可能会共价键接]，存在于溶液中的碱性氨基酸（例如赖氨酸）将附着至这些纳米颗粒的表面。图1示出了描述本发明的负载纳米颗粒的示意图，该负载纳米颗粒包括酪蛋白基质，赖氨酸（碱性氨基酸）以及钙（二价金属）。

在另一种特定的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC，尽管在这种情况中将需要优选形成在水性介质中的BAC均匀悬浮液，或者更优选将BAC溶解在有机溶液中，缓慢地将所述水性悬浮液或者所述有机溶液加入至包含酪蛋白的溶液中（例如酪蛋白盐），并孵育该混合物。

该捕获机制将与所描述的水溶性BAC有所不同，因为脂溶性BAC将会被捕获在纳米颗粒的内部疏水性部分中，原因在于这两个部分之间的亲和力，而不考虑它们是否具有与该（二价或者三价）金属相互作用的能力。

在一种特定的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC，其选自维生素，例如A族、D族、E族、K族维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素（胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄质等），Ω-3脂肪酸（例如DHA、EPA等），氨基酸（例如异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸），植物甾醇和植物固醇（例如谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等），多酚（例如槲皮苷、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）及其衍生物。

本发明的负载纳米颗粒的BAC：酪蛋白的重量比可以具有宽泛的范围；在一种非限制性的说明性的方式中，本发明的负载纳米颗粒的BAC：酪蛋白的重量比可以是1：1至1：200，优选为1：10至1：80，更优选约1：15至1：35。在一种特定的实施方式中，该BAC是水溶性BAC，并且本发明的负载纳米颗粒的（水溶性）BAC：酪蛋白的重量比为1：1至1：50，优选1：10至1：30，更优选约1：15至1：20。在另一种特定的实施方式中，该BAC为脂溶性BAC，并且本发明的负载纳米颗粒的（脂溶性）BAC：酪蛋白的重量比为1：1至1：200，优选1：10至1：80，更优选为约1：20至1：35。

另外，如果需要的话，本发明的纳米颗粒，包括负载有BAC的那些以及未负载BAC的那些，均可以在它们的制剂中引入抗氧剂，例如抗坏血酸（维生素C）等，用于增加它们对温度和氧化的稳定性。在一种特定的实施方式中，该BAC为叶酸并且该抗氧剂为抗坏血酸，其似乎是通过保护叶酸免于由紫外线辐射、pH值变化、热、氧气等引起的降解而起作用，并且进一步提供抗坏血酸的营养支持。所述抗氧剂可以与BAC一起被共包封或者被引入至本发明纳米颗粒的涂层中。

获得纳米颗粒的方法

另一方面，本发明涉及一种制造纳米颗粒的方法，该纳米颗粒包括酪蛋白基质、碱性氨基酸以及选自二价金属、三价金属及其组合的金属（本发明的纳米颗粒），以下称为“本发明的方法[1]”，其包括：

a）制备包含酪蛋白原料和碱性氨基酸的水溶液；和

b）在步骤a）的溶液中加入选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液。

另一方面，本发明还涉及一种制造纳米颗粒的方法，该纳米颗粒包括酪蛋白基质，碱性氨基酸，选自二价金属、三价金属及其组合的金属，以及生物活性化合物（本发明的负载纳米颗粒），以下称为“本发明的方法[2]”，其包括：

a）混合（i）包含酪蛋白原料和第一碱性氨基酸的水溶液和（ii）包含生物活性化合物的溶液；和

b）在步骤a）所获得的混合物中加入选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液。

在本发明方法[1]的步骤a）中，包含酪蛋白原料和碱性氨基酸的水溶液通过本领域技术人员已知的常规方法来制备，例如通过将所述酪蛋白原料和碱性氨基酸加入至水性介质中的方式。

在本发明方法[2]的步骤a）中，将包含酪蛋白原料和碱性氨基酸的水溶液（i）与包含BAC的溶液（ii）相混合。包含BAC的所述溶液（ii）的性质和组分基于BAC的类型和性质而有所不同。由此，在一种特定的实施方式中，当BAC为水溶性BAC时，包含BAC的所述溶液（ii）为水溶液；在另一种特定的实施方式中，当该BAC为酸性水溶性BAC时，包含BAC的所述溶液（ii）为进一步包括第二碱性氨基酸的水溶液；并且在另一种特定的实施方式中，当BAC为脂溶性BAC时，包含BAC的所述溶液（ii）为在水性介质中的悬浮液或者优选为有机溶液，更优选为水易混溶剂的有机溶液，例如醇，例如乙醇。

可被用于实施这两种方法[本发明的方法[1]和[2]]的酪蛋白实际上可以是来自于任何来源的酪蛋白，例如牛奶，豆类等。存在于所述溶液中的酪蛋白可以是酸性酪蛋白或者酪蛋白盐的形式。在一种特定的实施方式中，所述酪蛋白原料包括酪蛋白盐形式的酪蛋白，优选酪蛋白酸钠。尽管也可以使用酪蛋白酸钙和磷酸钙（phosphocalcium），但是它们在实践中具有较少的优点，因为在将酪蛋白盐与该活性组分相混合之后钙被用来形成纳米颗粒，因此，如果在介质中酪蛋白盐溶液已经有钙的话，那么所述方法的实施可能会大打折扣。

在本发明方法[1]的步骤a）中形成的水溶液中以及在本发明方法[2]的步骤a）中使用的水溶液（i）[包含酪蛋白原料和第一碱性氨基酸]中所包含的酪蛋白的用量可以具有宽泛的范围；然而，在一种特定的实施方式中，包含在所述水溶液中的酪蛋白的用量为0.1%至10%（w/v），优选为0.5%至5%，更优选为1%至3%。

碱性氨基酸促成酪蛋白的溶解并且，适当的话，促成BAC、特别是酸性水溶性BAC的溶解，因此其在本发明负载BAC的纳米颗粒以及那些未负载BAC的纳米颗粒的制造中扮演着非常重要的角色。事实上，似乎增加溶液的pH值，该碱性氨基酸允许在不需要使用无机盐的情况下溶解该酪蛋白盐，并且其进一步作为维持该酪蛋白的κ部分的亲水性末端处于阴离子形式的碱基，以使得该具有负表面电荷的颗粒被保持在悬浮液中并且由于静电排斥而不发生凝聚。

可用于实施这两个方法[本发明的方法[1]和[2]]的碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组中，优选选自由精氨酸、赖氨酸及其混合物组成的组中。该碱性氨基酸可以位于本发明纳米颗粒的内部或者外部，其扮演着重要的工艺角色，因为在形成纳米颗粒之前其促使组分溶解，并且在获得纳米颗粒之后其在纳米颗粒的两侧（内部和外部）均维持了适当的pH值。举例说明，叶酸微溶于水中并且易溶于微碱性的水溶液中，因此碱性氨基酸的存在帮助叶酸的溶解。

在本发明方法[2]的一种特别的实施方式中，当BAC为酸性水溶性BAC时，包含BAC的所述溶液（ii）为水溶液，其进一步包括第二碱性氨基酸（为了预防BAC沉淀）。尽管在那种情况中可能考虑使用两种不同的碱性氨基酸，但是在一种特定的实施方式中，用于制备包含酪蛋白原料（第一碱性氨基酸）的水溶液以及用于制备包含BAC（第二碱性氨基酸）的水溶液的碱性氨基酸是相同的，并且其选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组中，优选选自由精氨酸、赖氨酸及其混合物组成的组中。

在本发明方法[1]的步骤a）中形成的溶液中以及在本发明方法[2]的步骤a）的溶液（i）中所包含的碱性氨基酸的量可以具有广泛的范围并且通常取决于所使用的碱性氨基酸。因此，尽管该碱性氨基酸：酪蛋白的重量比可能差异很大，但是在一种特定的实施方式中，在本发明方法[1]的步骤a）中形成的溶液中或者在本发明方法[2]的溶液（i）中的该碱性氨基酸：酪蛋白的重量比为1：1至1：50，优选为1：10至1：40，更优选当所使用的碱性氨基酸为赖氨酸时，重量比为约1：12或者当所使用的碱性氨基酸为精氨酸时，重量比为约1：25。

当BAC为酸性水溶性BAC时，包含所述BAC的本发明方法[2]的步骤a）的溶液（ii）进一步包括上述第二碱性氨基酸，其可以与所述第一碱性氨基酸相同或不同；在这种情况中，本发明方法[2]中、即在所述方法的步骤a）的溶液（i）和（ii）混合之后的碱性氨基酸：酪蛋白的比例为1：1至1：50，优选为1：5至1：20，更优选当所使用的碱性氨基酸为赖氨酸时，比例为约1：6，或者当所使用的碱性氨基酸为精氨酸时，比例为约1：9。

本发明的方法[1]以及本发明的方法[2]均包括将a）选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液[步骤b)]加入至该步骤的溶液中的步骤。不希望被任何理论所限制，据信所述金属，例如二价金属（例如钙），允许在本发明的负载纳米颗粒的内部形成桥接，其帮助稳定该BAC，特别是当BAC为水溶性BAC时，优选为酸性水溶性BAC，或者能够与所述金属（例如钙）相互作用的水溶性BAC，例如叶酸、泛酸或者B族或C族维生素或其衍生物；在这种情况中，所述金属，例如所述二价金属（例如钙）似乎通过酪蛋白（以酪蛋白盐的形式）和BAC、优选为水溶性BAC、更优选为酸性水溶性BAC、或者能够与所述金属相互作用的水溶性BAC之间的桥接而起作用，使所述BAC被本发明的负载纳米颗粒的疏水部分所捕获。

在一种特定的实施方式中，所述金属为二价金属，选自钙、镁、锌、二价铁及其组合，优选为钙。在另一种特定的实施方式中，所述金属为三价金属，例如三价铁。

尽管实际上任意的钙的水溶液、有利地食品级的溶液[参见“CodexGeneral Standard for Food Additives”GSFA在线，在食物微胶囊中使用的钙盐比例]可被用于实施本发明所述方法[1]和[2]，但是在一种特定的实施方式中，所述钙盐的水溶液选自由氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、山梨酸钙、抗坏血酸钙、柠檬酸钙、丙酸钙、硫酸钙及其混合物组成的组中，优选为氯化钙。实践中，不推荐碳酸钙或者藻酸钙，因为它们是在水中不溶性的盐或者极微溶的盐。类似地，任何镁、锌或者二价或三价铁的食品级水溶液可用于实施本发明所述方法[1]和[2]。

金属：酪蛋白的重量比，其中“金属”涉及为选自二价金属、三价金属及其组合的所述金属，可以具有宽泛的范围；然而，在一种特定的实施方式中，该金属：酪蛋白的重量比为1：5至1：15，优选为1：7至1：10，更优选为1：8.5。在一种特定的实施方式中，所述金属为二价金属。

本发明的方法[2]获得本发明的负载纳米颗粒，为此，步骤a）包括将（i）包含酪蛋白原料和第一碱性氨基酸的水溶液与（ii）包含BAC的溶液相混合。所述BAC的特征已经在上文提及。在一种特定的实施方式中，所述BAC为水溶性BAC，优选为酸性水溶性BAC，例如叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸或维生素B3、泛酸或维生素B5、单磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸盐；聚麸胺酸叶酸盐）、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸、p-香豆酸、咖啡酸，其药学上或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物。在另一种特定的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC，例如A族、D族、E族、K族维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素（例如胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄质等），Ω-3脂肪酸（例如DHA、EPA等），氨基酸（例如异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸），植物甾醇或植物固醇（例如谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等），多酚（槲皮苷、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）或其衍生物。

本发明的负载纳米颗粒的BAC：酪蛋白的重量比可以具有宽泛的范围；在一种非限制性的说明性方式中，本发明的负载纳米颗粒的BAC：酪蛋白的重量比可以是1：1至1：200，优选为1：10至1：80，更优选约1：15至1：35。在一种特定的实施方式中，该BAC是水溶性BAC，并且本发明的负载纳米颗粒的（水溶性）BAC：酪蛋白的重量比为1：1至1：50，优选1：10至1：30，更优选为约1：15至1：20。在另一种特定的实施方式中，该BAC为脂溶性BAC，并且本发明的负载纳米颗粒的（脂溶性）BAC：酪蛋白的重量比为1：1至1：200，优选1：10至1：80，更优选约1：20至1：35。

同样地，该碱性氨基酸：BAC的重量比（对应于包含酸性水溶性BAC和本发明方法[2]的步骤a）中所使用的第二碱性氨基酸的水溶液（ii））可以具有宽泛的范围；然而，在一种特定的实施方式中，在所述溶液（ii）中的该碱性氨基酸：（酸性水溶性）BAC的重量比为1：0.1至1：3，优选为1：0.5至1：1，更优选为约1：0.75。

如上所述，本发明的纳米颗粒，负载有BAC的那些以及未负载BAC的那些，均可以在它们的制剂中结合抗氧剂，例如抗坏血酸（维生素C）等，用于增加它们对温度和氧化的稳定性。在这种情况中，所述抗氧剂可以与BAC（适当的话）一起被共包封或者被引入至本发明纳米颗粒的涂层中；为此，本发明所述方法[1]和[2]将被适当地调整以在该纳米颗粒的制剂中结合该抗氧剂，例如通过将抗氧剂加入至包含所述BAC和碱性氨基酸的水溶液中。

在一种特定的实施方式中，该BAC为叶酸并且该抗氧剂为抗坏血酸，其似乎是通过保护叶酸免于由紫外线辐射、pH值变化、热、氧气等引起的降解而起作用，并且进一步提供抗坏血酸的营养支持。所述抗氧剂可以与BAC一起被共包封或者被引入至本发明纳米颗粒的涂层中。

另外，如果需要的话，本发明的方法[1]以及方法[2]均可以包括一个或多个额外的通过使用不同的处理方法来稳定所获得的纳米颗粒的步骤。

在一种特定的实施方式中，所述稳定处理包括令包含本发明形成的纳米颗粒、负载有BAC的那些或者未负载的那些纳米颗粒的悬浮液进行高压处理，例如100至800MPa的压力，典型地为350至600MPa。在一种特定的实施方式中，所述处理包括使纳米颗粒的悬浮液在100MPa至800MPa的压力下，优选为350至600MPa，经历3至5分钟的时间周期，；实际上，400MPa的压力提供良好的结果。

在另一种特定的实施方式中，所述稳定处理包括令包含本发明形成的纳米颗粒、负载有BAC的那些或者未负载的那些纳米颗粒的悬浮液进行UHT（超高温度）处理，例如在130℃至140℃的温度下持续2至5秒，接下来快速冷却。

同样地，如果需要的话，本发明的方法[1]和本发明的方法[2]均可以包括干燥步骤，其用于干燥包含所形成的纳米颗粒的悬浮液，从而获得粉末形式的本发明的纳米颗粒，包括负载有BAC的那些以及未负载BAC的那些纳米颗粒。所述纳米颗粒的这一形式的出现促进了它们的稳定性并且对于它们在固体食物，例如面粉、面包、蛋糕类制品、谷类、奶粉中以及在化妆品和/或药物制品中的可能应用也是特别有利的。

事实上，任意适用于干燥包含纳米颗粒的悬浮液的常规技术或者方法都可以用于执行该干燥步骤；然而，在一种特定的实施方式中，通过喷雾干燥法或者通过冻干法来干燥包含纳米颗粒的悬浮液。这一处理通常通过将合适的所述纳米颗粒的保护剂，例如糖类、例如乳糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糊精、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糖等及其混合物，加入至该纳米颗粒的悬浮液中来实施。所述保护剂保护本发明的纳米颗粒抵御在干燥过程中的热降解以及氧化。

该酪蛋白：糖的重量比可以具有宽泛的范围；然而，在一种特定的实施方式中，该酪蛋白：糖的重量比为1：1至1：4，优选为约1：2。

同样地，在一种特定的实施方式中，包含糖类的溶液可以进一步包含抗氧剂，例如抗坏血酸（维生素C）等；在这种情况中，该酪蛋白：糖：抗氧剂（例如维生素C）的重量比可以是1：0.75-2.5：0.01-1.5，优选为1：2.0：0.10。

根据本发明的方法[1]获得的本发明的纳米颗粒，即包括酪蛋白基质、碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属的纳米颗粒，通过包括如下步骤的方法来制备：a）制备包含酪蛋白原料和碱性氨基酸的水溶液；和b）将选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液加入至步骤a）的溶液中，形成本发明的另一个方面。

同样地，根据本发明的方法[2]获得的本发明的负载纳米颗粒，即包括酪蛋白基质、碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属以及BAC的纳米颗粒，通过包括如下步骤的方法来制备：a）混合（i）包含酪蛋白原料和第一碱性氨基酸的水溶液和（ii）包含BAC的溶液；和b）在步骤a）所获得的混合物中加入选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液，形成本发明的另一个方面。

应用

本发明的纳米颗粒可被用为工艺添加剂，例如脂肪替代品等。它们还具有包封BAC的能力，例如水溶性BAC或者脂溶性BAC。

在一种特定的实施方式中，本发明的纳米颗粒能够包封BAC，优选为水溶性BAC，更优选为酸性水溶性BAC，并且其能结合在药物、化妆品和食物组合物中，因为其它的组分为非天然的聚合物（避免与合成聚合物相关的毒性），并且非食品级的不会用于本发明的制备以及最终制品中（纳米颗粒）。所述纳米颗粒避免BAC由于外部因素（光、pH值变化、氧化等）而降解。

有利地，本发明的纳米颗粒具有的平均粒度小于1μm，优选为50至200nm，更优选为约140nm，从而防止感官特性的改变（味觉特征）。

同样地，本发明的纳米颗粒改善了肠内的BAC的生物利用度，保护所述BAC免于胃部酸性条件的损害并且促使BAC在肠内溶解和释放。

本发明的纳米颗粒可以悬浮在水性介质中从而使BAC避免在溶解中降解。它们还可以以干燥粉末的形式存在，维持BAC处于稳定的条件并且使其能够长时间地存储（特别地，将其结合在固体食物制品中）。

另外，本发明的纳米颗粒还适用于制备用于局部施用的化妆品和药物组合物。

因此，另一方面，本发明涉及一种组合物，以下称为“本发明的组合物”，包括至少一种本发明的纳米颗粒；在一种特定的实施方式中，本发明的纳米颗粒为包括酪蛋白基质、碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属的纳米颗粒；在另一种特定的实施方式中，本发明的纳米颗粒为本发明的负载纳米颗粒，即包括酪蛋白基质，碱性氨基酸，选自二价金属、三价金属及其组合的金属和具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性BAC，和药学上或化妆品可接受的载体或者适用于食物的载体的纳米颗粒。

在一种特定的实施方式中，所述BAC选自由氨基酸、抗微生物剂、芳化剂、防腐剂、甜味剂、类固醇、药物、激素、脂类、肽、多核苷酸、多醣、蛋白质、蛋白聚糖、芳香剂、维生素及其混合物组成的组中。

在一种特定的实施方式中，所述BAC为水溶性BAC，优选为酸性水溶性BAC。水溶性BAC的非限制性的说明性的例子包括维生素，例如B族维生素或C族维生素及其衍生物、盐或酯；透明质酸，硫酸软骨素，硫辛酸，其盐或酯，等等。在一种特定的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸、泛酸、单磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸盐；聚麸胺酸叶酸盐）、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸、p-香豆酸、咖啡酸，其药学上或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物组成的组中。

在另一种特定的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC。脂溶性BAC的非限制性的说明性的例子包括维生素，例如A族、D族、E族、K族维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素（胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄质等），Ω-3脂肪酸（例如DHA、EPA等），氨基酸（例如异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸），植物甾醇和植物固醇（例如谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等），多酚（例如槲皮苷、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）及其衍生物。

在一种特定的实施方式中，本发明的组合物为一种适用于以局部途径施用的药物组合物；为此，所述组合物包括药学上可接受的载体，其包括一种或多种适用于以局部途径施用的赋形剂，例如以凝胶、药膏、乳剂等的形式。关于适用于旨在以局部途径施用的药物组合物制剂的赋形剂以及所述药物组合物的制造的信息可参见书籍“Tratado de FarmaciaGalénica”,C.Faulíi Trillo,第10版,1993,Luzán 5,S.A.de Ediciones。本发明的纳米颗粒的施用剂量可以具有宽泛的范围，例如包含0.1%至30%、优选0.5%至5%的本发明纳米颗粒的本发明的组合物为约0.5（待处理的面积，g/cm²）至约2（待处理的面积，g/cm²）。

在另一种特定的实施方式中，本发明的组合物为适用于以局部途径施用的化妆品组合物；为此，所述组合物包括化妆品用可接受的载体，其包括一种或多种适用于以局部途径施用的赋形剂，例如以凝胶、乳剂、洗发剂、洗液等的形式。关于适用于旨在以局部途径施用的化妆品组合物制剂的赋形剂以及所述化妆品组合物的制造的信息参见书籍“Manualde Cosmetología”,Octavio Díez Sales,第1版,1998,Editorial Videocinco,S.A.。

在另一种特定的实施方式中，本发明的组合物为食品组合物，例如固体、液体或者半固体食品制品。

在一种特定的实施方式中，本发明的组合物包括：

酪蛋白，10wt%至50wt%；

叶酸，0.9wt%至2.5wt%；

钙，1wt%至6wt%；和

碱性氨基酸，1wt%至7wt%；和

糖类，30wt%至80wt%，

其中所有的重量百分比均以该组合物的总重量计。

在另一种特定的实施方式中，本发明的组合物包括：

酪蛋白，10wt%至50wt%；

叶酸，0.9wt%至2.5wt%；

钙，1wt%至6wt%；和

碱性氨基酸，1wt%至7wt%；

糖类，20wt%至55wt%；以及

抗坏血酸，1wt%至25wt%，

其中所有的重量百分比均以该组合物的总重量计。

可替换地，本发明的组合物可以结合在食品中；因此，另一方面，本发明涉及一种包括本发明组合物的食品。所述食品可以液体、半固体或固体的形式存在。有利地，为了避免或者最小化本发明纳米颗粒的全部或者部分溶解并由此提高它们的稳定性，所述食品具有酸性pH值，即小于7，优选小于或等于6，更优选小于或等于5。富含本发明组合物或者利用本发明组合物强化的食品的说明性的例子包括牛奶及其衍生物（酸乳酪、干酪、凝乳等）、果汁、果酱、焙烤制品和蛋糕类制品、发酵肉、调味料等。类似的，本发明的组合物可以结合进动物食物中，例如在饲料中。

具体实施例

下述的实施例描述了酪蛋白颗粒的制造，该酪蛋白颗粒可以在其中结合生物活性化合物，特别是叶酸。酪蛋白颗粒能够保护化合物免于可能会在食物中经历取决于上文提及的多种因素的降解。所述实施例还示出这些纳米颗粒在其被吸收之后保护叶酸免于胃部环境影响并且将其释放至肠部介质内的能力。

制造空的酪蛋白纳米颗粒的基本方法

制造酪蛋白纳米颗粒的方法包括将酪蛋白酸钠（ANVISA，Madrid，西班牙）和预定量的碱性氨基酸一起溶解在水性介质中，接下来在磁力搅拌和连续流的条件下加入预定量的钙溶液，形成具有乳白色悬浮液外观的纳米颗粒。

纳米颗粒的物理化学表征

获得该纳米颗粒的全部物理化学表征所需的各种研究如下所述。

纳米颗粒的粒度和表面电荷由物理化学检测来测定，后者通过电动电位的测量来确定。第一个参数通过光子相关谱法来获得，其使用Zetasizer nano Z-S（Malvern Instruments/Optilas,西班牙），其中该电动电位使用Zeta电位分析仪(Brookhaven Instruments Corporation,纽约,美国)来测定。

该方法形成纳米颗粒的产率通过获得纳米颗粒之后剩余的游离酪蛋白的定量来计算，其收集在对该制剂进行离心而获得的上清液中（17,000x g，20分钟）。由此，估计在制剂中形成颗粒的酪蛋白的量是，初始添加量以及在纯化步骤中收集的上清液中的量的差值。所述定量通过在282nm的紫外线（UV）光谱测定法（Agilent 8453，紫外光可见的光谱测定系统）来进行。产率估算如下：

产率（%）=[（酪蛋白盐的总毫克数-在上层清液中的酪蛋白盐毫克数）/酪蛋白盐的总毫克数]×100

[等式1]

为了进行不同的计算，使用了在150至1,500μg/mL之间的标准曲线（R²=0.9992；LD=36μg/mL；LQ=119μg/mL）。

此外，定量研究离心后获得的小球，以确定所获得的总酪蛋白和包含在上清液中的酪蛋白之间的差值的结果。在这种情况中，使用0.05M的NaOH来降解该颗粒，这是与用于制备该标准曲线相同的介质。因此，在这种情况中，产率估算如下：

产率（%）=[（小球中的酪蛋白盐的毫克数）/酪蛋白盐的总毫克数]×100

[等式2]

在所述介质中制备的酪蛋白盐的最大吸收位于300nm。用于构建标准线的浓度范围还可以是150至1,500μg/mL(R²=0.9996；LD=26μg/mL；LQ=85μg/mL)。

该纳米颗粒的形态通过扫描电子显微镜（Zeiss,DSM 940A Germany）来观察。为此，该冻干的纳米颗粒涂覆有9nm的金分子层（Emitech K550Team,Sputter-Coater,英国），并且利用Zeiss DMS 940A显微镜（美国）对其进行照相。

制造包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的基本方法

包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的制造方法包括将酪蛋白酸钠与预定量的碱性氨基酸一起溶解在水性介质中，接下来在磁力搅拌下将之前制备的预定量的叶酸溶液以及预定量的碱性氨基酸加入至水性介质中。在孵育该混合物几分钟之后，最后的步骤包括加入钙盐，产生具有微黄色乳状悬浮液外观的纳米颗粒。

任选地，所形成的纳米颗粒可以进行静水高压处理（Stansted FluidPower,ISOLAB Model FPG11500B110;Series No.：7844），在1至5分钟的时间周期内在100至800MPa的压力下，从而使它们稳定。

之后，并且在通过搅拌对其进行3分钟的均质化之后，在不停止搅拌的情况下加入预定量的糖溶液（乳糖、海藻糖、甘露糖醇、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糊精或者麦芽糖）。最后，该悬浮液进行冻干或者在喷雾干燥器（Büchi Mini Spray Drier B-191,Büchi Labortechnik AG，瑞士）内在下述的条件下喷雾：

-进气口温度：60-100℃

-出气口温度：30-90℃

-空气压力：2-10bar[2-10x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：2-9mL/min

-吸入：30-100%

-空气流速：200-900L/h

任选地，可以在加入糖之后利用冻干的方式而不是喷雾干燥的方式对该制剂进行干燥。

与酪蛋白颗粒相关的叶酸含量的测定

与该纳米颗粒相关的叶酸含量根据Faye[Faye Russell,L.,Quantitative Determination of Water-Soluble Vitamins.In Food Analysis byHPLC,Nollet,L.M.L.(Ed.),Marcel Dekker,Inc.,New York,第2版,第10章(2000)页码444-445]描述的方法通过高效液相色谱（HPLC）来确定。该分析在连接至二极管阵列UV检测系统的型号1100LC系列色谱仪（Agilent,Waldbornn,Germany）中执行。在Hewlett-Packard计算机中利用Chem-Station G2171软件进行数据分析。为了分离叶酸，加热至40°C的Alltech C18Alltima^TM柱(5μm,150mm x 2.1mm)与兼容的

C18AJO-7596柱一起使用。流动相由H₃PO₄(33mM,pH 2.3)/乙腈的梯度混合物（表1）组成，并且其在0.25mL/min的速率下泵入。在290nm下实施检测。样品进样体积为10μL。叶酸保留时间为22.6±0.5分钟。

表1

流动相的梯度条件（A：H₃PO₄33mM,B：乙腈）

在定量分析该样品之前，制备介于2至400μg/mL的不同浓度的标准线，获得大于95%的精确且准确的结果，并确认溶液中的酪蛋白和/或氨基酸的存在不会干扰叶酸正确的定量分析。

对于新鲜样品的分析（在干燥它们之前），在过滤预定体积的制剂之后获得的上清液通过

300,000MWCO渗析管（VIVASPIN 2,Sartorius stedim Biotech,德国）来定量分析。然后小球溶解在0.05M的NaOH中从而降解颗粒，并维持酪蛋白和叶酸以及氨基酸在溶液中并且由此对其进行定量分析。在两个部分（上清液和小球）中的叶酸的总含量总是与初始加入的总量相一致。此外，也可能通过在1mL的0.05MNaOH中溶解1mL的制剂来定量分析叶酸总量。该研究确定了在所有的情况中，添加的叶酸的量与利用所描述的色谱法来定量分析从而获得的叶酸的量之间的差值均在10%以上。

此外，使用10mg的纳米颗粒来对该粉末样品进行定量分析；它们被重新悬浮在2mL的水中并离心，之后以相同的方法获得新鲜的样品。

在模拟胃肠道介质中从该纳米颗粒中释放叶酸的释放动力学研究

从该纳米颗粒中释放叶酸的释放动力学通过在2mL的模拟胃部介质中分散约10mL(0至2h)(USP XXIII)纳米颗粒，在37±1℃下测定。对该纳米颗粒悬浮液离心一定时间(17,000x g,20分钟)，并且通过前述的HPLC方法进行定量分析上清液中的叶酸含量。在从胃部介质中移除该上清液之后，在37±1℃下加入模拟的肠部介质(2至24h)(USP XXIII)，之后以与上文的情况相同的方式继续进行。

计算出所有的时间段释放的叶酸的百分含量，每项研究均考虑到存在于该制剂中的维生素总量。

药代动学研究-包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸的生物利用度

根据医疗机构伦理委员会（Institution Ethics Committee）的规定以及关于实验动物的欧洲法律（86/609/EU）进行药代动学研究。为此，平均重量为200g的25只雄性大白鼠经历正常的明-暗条件（12小时-12小时），并且在研究之前的一周时间内，按需喂养叶酸不足的饮食（Folic AcidDeficient Diet.TD.95247.Harlan,USA）和水。施用该制剂的前12小时，大鼠被隔离在代谢笼中，不对其进行喂禁食，但是可以自由饮水。

这些动物被分成5个处理组（每组5只大鼠）。第一组，仅通过口服途径施用1mL的PBS（磷酸盐缓冲溶液，pH为7.4）。接下来的三组仅利用1mg/kg（200μg每鼠）的结合在任意下述制剂中的叶酸的口服剂量进行处理：（i）游离叶酸（未包封）（Aditio，Panreac Química，巴塞罗那，西班牙）；（ii）包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒；（iii）用高压处理的包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒。分散在水中的1mL的每种不同的制剂通过胃食管插管来施用。最后，溶解在生理盐水血清（0.5mL）中的相同剂量的游离叶酸（1mg/kg）被施用于第五组，其通过静脉注射进入隐静脉。

在施用该制剂之前，从尾部的隐静脉抽取血液从而检查每只大鼠的基础维生素水平。施用后，利用血清分离管（SARSTEDT Microtube 1.1mLZ-Gel）在不同的时间抽取约500μL体积的血液。在所有的情况中，利用吸入式麻醉（异氟烷：氧气）使动物睡眠之后再抽取血液，以防止大鼠感受到疼痛，随时检查大鼠的状态。

接下来，血液体积由向腹膜内施用的500μL生理盐水血清替代，其之前被加热至动物的温度。在这期间，检查该动物的情况（可动性、攻击性、变态反应和体温），没有观察到显著的变化。

血清样品的叶酸预处理和定量分析

在离心具有血液的试管（6,000rpm,20min,20°C）之后获得的血清样品中的叶酸的定量分析通过酶免疫分析技术的方法来执行。为此，使用由FDA批准的用于定量测定食物中叶酸的酶联免疫检测试剂盒(Diagnostic automation,INC.Calabasas,加利福尼亚，美国)。没有事先处理该血清样品按照生产商的说明书进行定量分析。

因为该试剂盒为用于食物而设计的，所以进行一系列的在先分析，从而确认其能够用于血清样品中维生素的定量分析。所述分析包括实施对于通过该试剂盒获得的结果与在上文中描述的通过高效液相色谱法获得的那些结果之间进行详尽的比较，具有如下的前期准备过程：不同量（0-300μL）的叶酸溶解在50mM的在1%(w/v)抗坏血酸钠中制备的四硼酸钠溶液中，将其加入至50μL的血清中。获得的溶液与该50mM的四硼酸钠溶液形成350μL的最终体积（血清稀释1：7）。每种混合物均被加热至沸腾并持续30分钟，并且接下来冷却至2°C并在所述温度下保存过夜。

使获得的样品在20,000rpm下离心20分钟并通过20μm过滤器进行过滤之后，通过使用前述的高效液相色谱法来定量分析叶酸含量。在这种情况中，并且由于血清的维生素浓度低，使用标准加入技术来最小化在定量分析中的误差并去除任意的基质干扰。

在所有研究的情况中，这两种方法的血清叶酸浓度的差别小于10%。因此，选择酶免疫分析技术定量分析全部的样品，因为其需要少量用于分析的血清并且其是一项更为简便和更为快捷的技术，检测限（2ng/mL）比色谱技术小得多。

制造包含脂溶性活性物质槲皮苷的酪蛋白纳米颗粒的基本方法

包含槲皮苷的酪蛋白纳米颗粒的制造方法包括将酪蛋白酸钠和预定量的碱性氨基酸一起溶解在水性介质中，接下来在磁力搅拌下加入预定量的抗坏血酸溶液以及随后加入事先溶解在乙醇中的槲皮苷。在孵育该混合物几分钟之后，最后的步骤包括加入钙盐，形成具有淡黄色乳状悬浮液外观的纳米颗粒。

任选地，该形成的纳米颗粒可以进行静水高压处理（Stansted FluidPower,ISOLAB Model FPG11500B110;Series No.：7844），在1至5分钟的时间周期内在100至800MPa的压力下，从而使它们稳定。

之后，并且在通过搅拌对其进行3分钟的均质化之后，在不停止搅拌的情况下加入预定量的糖溶液（乳糖、海藻糖、甘露糖醇、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糊精或者麦芽糖）。最后，该悬浮液被冻干或者在喷雾干燥器（Büchi Mini Spray Drier B-191,Büchi Labortechnik AG，Switzerland）内在下述的条件下喷雾：

-进气口温度：60-100℃

-出气口温度：30-90℃

-空气压力：2-10bar[2-10x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：2-9mL/min

-吸入：30-100%

-空气流速：200-900L/h

任选地，可以在加入糖之后利用冻干的方式而不是喷雾干燥的方式对该制剂进行干燥。

与酪蛋白颗粒相关的槲皮苷含量的测定

与该纳米颗粒相关的槲皮苷含量根据Lacopini(Lacopini et al.,JFood Comp Anal 2008;21：589-598)描述的方法通过高效液相色谱（HPLC）来定量分析，尽管具有一些不同。该分析在连接至二极管阵列UV检测系统的型号1100LC系列色谱仪（Agilent,Waldbornn,德国）中执行。在Hewlett-Packard计算机中利用Chem-Station G2171软件进行分析数据。为了分离叶酸，加热至40°C的Alltech C18Alltima^TM柱(5μm,150mm x 2.1mm)与兼容的

C18AJO-7596柱以及水/甲醇/冰醋酸的梯度混合物（参见表2）一起使用，混合物作为流动相在0.25mL/min的速率下泵入。在260nm下进行检测，样品进样体积为10μL并且槲皮苷保留时间为24.2±0.2分钟。

表2

流动相的梯度条件（A：水，B：甲醇，C：冰醋酸）

定量分析该样品之前，在水醇介质中（75%乙醇）制备介于1至100μg/mL的不同浓度的标准线，获得大于95%的精确且准确的结果。

对于新鲜样品的分析（在干燥它们之前），在通过过滤(17000rpm,20min)提纯该纳米颗粒的过程之后稀释获得的上清液，直至获得50%（w/v）乙醇含量的水溶液。

最后，与该纳米颗粒相关的槲皮苷含量[包封率（E.E.）]通过初始添加的槲皮苷量（Q）和在上清液中定量分析的量之间的差值根据下列等式来来计算：

实施例1

空的酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定：获得它们的方法的产率，所使 用的氨基酸的类型对于纳米颗粒的稳定性和物理化学特性的影响

将1g的酪蛋白酸钠和90mg的赖氨酸一起溶解在75mL的水中。接下来，在磁力搅拌和连续流下将40mL 0.8%的CaCl₂加入至该溶液中。该过程重复三次。

图2（A和B）示出通过该方法获得的酪蛋白颗粒的透射电子显微镜图像。

此外，在不存在氨基酸，或者通过使用50mg的精氨酸来代替赖氨酸的情况下进行相同的研究，从而理解氨基酸的类型对于颗粒的物理化学特性的影响。

表3概括了获得的纳米颗粒的主要物理化学特性。

表3

酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=10）：氨基酸，赖氨酸或者

精氨酸与该蛋白质的重量比分别为1：11和1：20

^aPDI：多分散性；

^b产率：转化成纳米颗粒的蛋白质的百分含量。

所执行的统计学研究（非参数独立样本检验：秩和检验）显示在统计学意义上没有显著的证据证明在该制剂的物理化学参数之间存在差异。因此，可以得出结论，氨基酸的类型并不会影响空的纳米颗粒的所述特性。

通过改变氨基酸加入至该制剂的比例来执行这一相同的分析，可以得出类似的结论，即氨基酸的比例和类型均不会影响该空的颗粒的最终特性。

为了认识该制剂的稳定性，测定了该三种类型的纳米颗粒随着时间的流逝的物理化学参数。所获得的结果包括在表4中。

表4

随着时间的流逝的酪蛋白纳米颗粒（平均值±标准偏差，n=6）的物理化学特性：氨基酸，赖氨酸或者精氨酸与该蛋白质的重量比分别为1：11和1：20

PDI：多分散性。

在获得它们的时刻，该三种类型的纳米颗粒具有同阶的粒度以及相对低的多分散性（考虑到PDI值小于0.3，该粒度分布是均匀的）。在利用氨基酸配制纳米颗粒的情况中，贯穿该整个研究这些粒度和分散值没有显示出显著的变化。然而，在获得它们两个小时之后，没有使用氨基酸配制的纳米颗粒在它们的平均粒度和它们的多分散性中均出现了不可忽视的增加（对于大于0.3的多分散数值，该粒度数值是不具有代表性的，其仅作为一种指标，表示其直径极为不均匀），在该分析结束之后达到非常高的多分散性数值。所述增加为在颗粒之间存在聚集现象的指示。这些现象甚至可在宏观尺度上可以被确认，因为当随时间对这三种制剂进行观察时，已确认不包含由氨基酸的纳米颗粒发生沉淀，导致乳状层的形成，而利用氨基酸配制的纳米颗粒形成均匀的悬浮液。鉴于这些结果，认为氨基酸的存在对于获得随着时间稳定的颗粒是至关重要的。

此外，该三种类型的制剂被再次制备并且在通过喷雾干燥技术的方法对其进行干燥之后对它们的物理化学特性进行分析。该方法的条件为：

-进气口温度：90℃

-出气口温度：49℃

-空气压力：6bar[6x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-吸入：100%

-空气流速：600L/h

出于理解氨基酸的影响的目的，当该纳米颗粒在获得它们的时候即被干燥时执行这一分析，因为在那一时刻制剂不存在聚集的现象。所获得的结果包括在表5中。

表5

通过喷雾干燥方式干燥的酪蛋白纳米颗粒（平均值±标准偏差，n=3）的物理化学特性：氨基酸，赖氨酸或者精氨酸与蛋白质的重量比分别为1：11和1：20

将干燥为粉末的包含有氨基酸的纳米颗粒再次悬浮于水性介质中时，观察到粒径分布继续为单分散性的并且它们的粒径稍微大于它们在通过喷雾干燥而被干燥之前所对应的粒径。然而，不利用氨基酸配制的纳米颗粒具有更大的粒径并且多分散性数值显示它们在干燥的过程中可能会经历聚集现象。由此，当通过喷雾干燥的方式来干燥该颗粒时，氨基酸的存在也是必需的。

鉴于此，可以得出结论，包含有氨基酸的纳米颗粒的物理化学特性与不包含氨基酸的纳米颗粒不同；它们具有低的聚集倾向并且由此该制剂被选择为用于包封生物活性化合物。

实施例2

包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定：赖氨酸和叶酸含量对包 封率的影响

在终体积为7.5mL的水中制备包含100mg的酪蛋白酸钠和不同量赖氨酸（0-8.5mg）的不同溶液。

此外，将300mg的叶酸和400mg的赖氨酸一起溶解在50mL的水中。

接下来，将1mL的叶酸溶液加入至该酪蛋白盐溶液。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将4mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物。对于每种类型的制剂，重复三次该过程。

图3示出了通过这一方法获得的包封有叶酸的酪蛋白颗粒的透射电子显微镜图像。

在每种情况中获得的物理化学特性包括在表6中：

表6

包含有叶酸和不同量的赖氨酸的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏

差，n=6）：该叶酸与蛋白质的重量比为1：17

^a在加入叶酸溶液之前

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

所执行的统计学研究（非参数独立样本检验：秩和检验）显示在统计学意义上没有显著的证据认为该最终的包括在表中的三个制剂（赖氨酸含量为3.9、4.5和8.5mg）的物理化学特性存在差异。在第一种情况中，确认尽管该叶酸溶液具有赖氨酸，但是在初始酪蛋白盐溶液中缺乏氨基酸促使包含有钙的叶酸部分沉淀，这导致了在维生素定量分析中的误差，因为并不是所有的小球中的叶酸均在离心之后被包封。

当维生素溶液包含有氨基酸但是酪蛋白盐溶液不包含氨基酸时，另外的研究确定可被结合在该制剂中的不发生沉淀的叶酸的最大量为4mg，类似于表6中获得的结果（25.5±1μgFA/mg NP和包封率：68.7±0.5）。因此，确认氨基酸的存在并不会影响被包封的维生素的量。然而，因为未利用氨基酸配制的纳米颗粒较不稳定并且具有更大的聚集倾向（参见实施例1），所以在存在这些氨基酸的情况下进行配制。

为了弄清楚加入至该制剂中的叶酸量对于该颗粒的物理化学特性的影响，通过仅改变叶酸溶液的添加量进行相同的研究，在所有的情况中，在初始酪蛋白溶液中的氨基酸含量恒为：8.5mg。

图4示出了包封的叶酸量相对于加入至该制剂中的维生素量的函数。

在研究的制剂的所有情况中，粒径范围介于132至140nm之间，多分散性小于0.2。在该实施例中，该包封率的数值无法进行比较，因为加入至每个制剂中的叶酸量是不同的。对于酪蛋白：叶酸的重量比为13.5：1的情况，最大值为73.1±7.5。

根据这一研究的结果，可以得出结论，随着制剂中的毫克酪蛋白/毫克FA比值的降低（即随着加入至该制剂中的叶酸的初始用量的增加），包封在该纳米颗粒内部的叶酸的量就会增加。然而，当存在于该制剂中的酪蛋白的量（以mg表示）相对于每mg的叶酸低于实验值时，就会观察到例如在不存在赖氨酸的情况下所发生的沉淀以及不稳定的制剂。

实施例3

通过喷雾干燥来干燥的包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定： 干燥过程对最终制剂的影响

在最终体积为75mL的水中制备包含1,000mg的酪蛋白酸钠以及90mg的赖氨酸的两种溶液。

此外，将600mg的叶酸和800mg的赖氨酸一起溶解在100mL的水中。

随后，将7.5mL的叶酸溶液加入至每个酪蛋白盐溶液中。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将40mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。

最后，离心该制剂之一以定量分析在上清液和小球中的叶酸，同时在使用喷雾干燥器干燥之前，将1,900mg的乳糖加入至另一个制剂中。该过程的条件为：

-进气口温度：90℃

-出气口温度：45℃

-空气压力：6bar[6x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-吸入：95%

-空气流速：600L/h

在两种情况中所观察到的物理化学特性包括在表7中。

表7

在新鲜的纳米颗粒中或者在通过喷雾干燥器对其进行干燥之后定量分析的具有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=6）：在最终制剂中的赖氨酸与

蛋白质的重量比为1：7，并且该叶酸与酪蛋白的比例为1：22

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

所执行的统计学研究（非参数独立样本检验：秩和检验）表明两种制剂所获得的包封率之间存在统计学意义上显著的差异（p<0.05）。这一差别可能是由于通过喷雾干燥在所指定的温度下干燥该制剂的方法所导致的该酪蛋白纳米颗粒的部分降解，从而导致事先包封的叶酸的部分释放。

这些结果说明需要实施一种方法来交联该颗粒，因为这样做的话，可以改善它们的稳定性，并且可以阻止前述的离心或者干燥该制剂的过程中包封率的降低。

实施例4

通过高压稳定的并且通过喷雾干燥技术的方法进行干燥的，具有赖 氨酸，包含叶酸酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定：该处理对于纳米颗粒物 理化学特性的影响

制备在最终体积为75mL的水中不同的溶液，所有的溶液均包含1,000mg的酪蛋白酸钠和90mg的赖氨酸。

此外，将600mg的叶酸和800mg的赖氨酸一起溶解在100mL的水中。

接下来将7.5mL的叶酸溶液加入至酪蛋白盐溶液中。在孵育5分钟之后，在磁力搅拌和连续流下将40mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。

一旦该颗粒形成，就将该制剂转移至密封的塑料袋中并进行静水高压处理(0MPa;100MPa,5分钟;200MPa,5分钟;400MPa,5分钟;600MPa,5分钟,或者800MPa,5分钟)。

一旦该过程终止，就将溶解在水中的1,900mg的乳糖加入至每个制剂中并在下述的条件下使用喷雾干燥技术执行对制剂的干燥：

-进气口温度：85℃

-出气口温度：45℃

-空气压力：6bar[6x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-吸入：95%

-空气流速：600L/h

表8概括了所获得的纳米颗粒的主要物理化学特性。

表8

包含有叶酸并进行不同的高压处理的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=6）：赖氨酸和酪蛋白之间的最终重量比为1：7，并且叶酸和酪蛋白之间的重量比为1：22

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

如在表8中可以观察到的，不考虑施加至该制剂的处理的类型，该纳米颗粒具有近似的表面电荷。然而，该数据检测到随着所施加的处理压力增加，获得的粒度变得更小，达到最大7%的缩减。然而，所包封的维生素的量（以及由此的包封率）随着施加压力的增加达到更大的数值，相对于未进行处理的制剂获得65%的增加（在使用800MPa进行处理的样品中）。

此外，图5示出了未进行高压处理的制剂以及利用100、400和800MPa的压力进行处理的制剂所获得的扫面电子显微镜的显微图。它们显示出未进行静水高压处理的纳米颗粒是如何被不同的过程改变的，这些过程在是获得它们之后经历的过程（通过喷雾干燥进行干燥、离心、在高温进行显微照相），而经历不同高压处理的纳米颗粒更加稳定。

这些结果说明所施加的静水高压处理交联了该纳米颗粒，使得它们更加稳定，并且由此阻止了它们在离心、干燥和照相之后降解。所有的这些解释了为什么在进行了处理的样品中获得了更大的包封率，因为在某些使用干燥或者离心的方法中的纳米颗粒的部分降解将会引发叶酸的释放并且由此获得较低的包封率。

实施例5

使用高压，通过喷雾干燥进行干燥的，具有精氨酸，包含有叶酸的 酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定：所使用的氨基酸对最终结果的影响

在最终体积为210mL的水中制备包含3,065mg的酪蛋白酸钠和123mg的精氨酸的溶液。

此外，将605mg的叶酸和800mg的精氨酸一起溶解在100mL的水中。

接下来将27mL的叶酸溶液加入至酪蛋白盐溶液中。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将120mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。

一旦形成颗粒，就将该制剂转移至密封的塑料袋中并进行由5分钟的周期时间和400MPa的压力构成的静水高压处理。

一旦该过程终止，就将溶解在水中的5,880mg的甘露醇加入至300mL通过高压处理的制剂并在下述的条件下使用喷雾干燥技术执行对其的干燥：

-进气口温度：85℃

-出气口温度：45℃

-空气压力：6bar[6x 10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-吸入：95%

-空气流速：600L/h

在表9中概括了获得的制剂的主要物理化学特性。

表9

包含有精氨酸和叶酸，通过高压处理并通过喷雾干燥的方法进行干燥的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=6）：精氨酸和蛋白质之间的最终重量比为1：9，

并且叶酸和酪蛋白之间的重量比为1：19

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

图6示出在400MPa下处理5分钟的包含有叶酸并在它们的制剂中具有精氨酸的酪蛋白纳米颗粒的扫描电子显微镜（SEM）显微图。

从中可以看出，获得的制剂具有类似于使用赖氨酸替代精氨酸所获得的纳米颗粒的特性。

实施例6

在模拟胃肠道介质中从该纳米颗粒中释放叶酸的释放动力学研究： 高压处理对于释放动力学的影响

为了进行该释放研究，使用在实施例4中描述的粉末制剂（未用高压处理，在100MPa和400MPa下进行处理）。

图7示出了未通过高压处理的样品的情况中所获得释放动力学。在其中，可以看出在胃部介质中孵育两个小时之后，达到4%的最大叶酸释放值。然而，在肠部环境中，溶解的酪蛋白颗粒释放的维生素的百分含量提高增加（在该研究的第24小时达到90%）。而且，在该介质中，孵育之后离心的样品实质上不具有酪蛋白小球，酪蛋白小球在样品的溶解状态是很明显的，并且由此释放该维生素。因此，可以看出所设计的制剂致使被包封的叶酸通过胃部，防止胃部环境降低其生物利用度。此外，该纳米颗粒在肠内溶解，促使维生素的释放并消除任何可能由于纳米颗粒的存在引起的毒性问题。

在通过高压处理该样品的情况中，图8（A和B）示出了样品的释放动力学。其中，可以看出其曲线与未进行高压处理的样品非常地类似，在模拟肠部介质中6小时之后的最大释放百分含量（70%）稍低于未进行处理样品在这一时刻的含量（80%）。

由此，对该酪蛋白纳米颗粒施加静水高压用于它们的交联并没有显著地改变从该酪蛋白纳米颗粒的释放出的组分的曲线，尽管在6小时之后释放的维生素的总量降低了10%。

实施例7

包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸的药代动学研究

表10概括了在药代动学研究中测试的纳米颗粒的主要物理化学特性：两种类型的纳米颗粒（利用或者未利用高压处理）根据在实施例5中描述的方法获得。

表10

在药代动学研究中使用的包含有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=6）

FA：叶酸；NP：纳米颗粒；Cas NP FA：包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒；Cas NP FA HP：高压处理（400MPa，5分钟）的包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒。

该药代动学研究被分为三个阶段。第一阶段包括静脉注射施用1mg/kg的溶解在磷酸盐缓冲溶液中的叶酸；第二阶段包括对5只雄性大鼠组口服施用1mL的磷酸盐缓冲溶液（在这组大鼠中，研究随着时间的基础维生素水平）。最后，第三阶段包括对由5只动物组成的大鼠组口服施用1mg/kg的（i）溶解在水中的叶酸，（ii）包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸，和（iii）利用高压处理的包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸。

给药后，在不同的时间（0、1、2、3、8和24小时）抽取约500μL体积的血液并收集在血清分离管中，接下来用等同于通过腹腔注射的盐水血清的体积恢复该动物的血液体积。施用叶酸之后获得的数据的药代动学分析利用WiNNonlin 1.5药代动学平差程序的非房室平差的方法来实施（Pharsight Corporation,Mountain View,美国）。

图9中示出获得的结果（在减去该基础水平之后）。正如可被观察到的，叶酸的静脉施用（图9A）示出在第一个样品中吸收的血清药物浓度峰值，接下来血清药物水平的急剧降低。当维生素为通过口服施用时获得的曲线（图9B）是不同的，因为该浓度最大值显著较低；它们出现的时间更长并且以更加渐进的方式降低。然而，对在口服施用以游离形式（未被包封）或者包封在酪蛋白纳米颗粒中（进行或者未进行高压处理）的叶酸之后进行的维生素水平的比较，建立在相似时间点的浓度曲线，但是当施用包封的维生素时，该最大值更大。

在执行本研究的实验数据的非房室分析之后所获得的药代动学参数的数值包括在表11中。

表11

不同待测试的制剂的药代动力学参数（平均值±标准偏差，n=5）

^*p<0.05vs.未包封叶酸。曼惠特尼U检验。

^**p<0.01vs.未包封叶酸。曼惠特尼U检验。

AUC：血清浓度曲线下面积

C_max：最大浓度

T_max：达到C_max的时间

MRT：平均停留时间

F_R：以百分含量表示的相对生物利用度。

可以观察到，AUC值根据所使用的制剂类型而具有显著的变化。当维生素被包封在酪蛋白纳米颗粒中时，该AUC值显著地大于在施用游离叶酸之后并且在施用之后进一步维持总时间达到24小时的AUC值。可以观察到血浆中叶酸的平均停留时间（MRT）在这两种纳米颗粒制剂中是类似的，并且如果与游离形式（口服和静脉注射）相比，平均停留时间更成。

根据这些结果，计算在两种制剂中包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的口服生物利用度均为52%，其大于通过口服施用游离叶酸后获得的值的45%。

实施例8

利用包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的化妆品制剂[1]

在最终体积为15mL的水中制备包含200mg的酪蛋白酸钠和18mg的赖氨酸的溶液。

此外，将600mg的叶酸和800mg的赖氨酸一起溶解在100mL的水中。

随后，将1.5mL的该叶酸溶液加入至该酪蛋白盐溶液中。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将8mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。

最后，在17,000x g下离心该制剂20分钟。弃上清，并将该小球重悬于25mL的水中。

此外，在42mL的水中制备包含7g丙三醇和0.2g尼泊金酯钠的溶液。将该溶液在水浴中加热至50℃，并随后加入包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的水溶液，该化妆品制剂将利用获得的最终的水溶液来制备。

此外，25g的Neo PCL O/W也在70℃被加热，直至其完全熔化。一旦这一油相被熔化，就在恒定的搅拌下加入该前述的水溶液直至获得O/W乳液，其随着时间是恰当并且是稳定的。所获得的乳剂的感官评价是积极的，其具有均质的外观并且不会结块。

这一相同的研究还利用通过高压处理（400MPa，5分钟）并且通过如在实施例4中所述喷雾干燥器来进行干燥的纳米颗粒制剂来执行。量取600mg的该制剂并将其重悬于25mL的水中，在这之后继续以与上述相同的方法进行。

所获得的乳剂也具有均质的外观并且不会结块。

实施例9

利用包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的化妆品制剂[2]

制备在最终体积为15mL的水中包含200mg的酪蛋白酸钠和18mg的赖氨酸的溶液。

此外，将600mg的叶酸和800mg的赖氨酸一起溶解在100mL的水中。

随后，将1.5mL的该叶酸溶液加入至每个酪蛋白盐溶液中。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将8mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。

最后，在17,000x g下离心该制剂20分钟。弃上清，并将该小球重悬于25mL的水中。

此外，将0.5g的Carbopol Ultrez 10溶解在75mL的水中。将该纳米颗粒的悬浮液加入至该溶液中。一旦该混合物均质化，就加入充足量的三甲胺直至获得的pH值为10。该混合物被均质化直至获得均匀且稳定的，微微发黄的卡伯波凝胶。

这一相同的试验还利用通过高压处理（400MPa，5分钟）并且通过如在实施例4中所述喷雾干燥器来进行干燥的纳米颗粒制剂来执行。量取600mg的该制剂并将其重悬于25mL的水中，在这之后继续以上文述相同的方法进行。所获得的凝胶也具有微微发黄的颜色以及均质且稳定的外观。

实施例10

利用包封有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的化妆品制剂[3]

将3g的单硬脂酸甘油酯与5g的肉豆蔻酸异丙酯和2g的鲸蜡醇混合。在70℃的水浴中加热该混合物。

此外，87g的如在实施例8中描述的包含有具有叶酸的酪蛋白纳米颗粒的卡伯波凝胶在水浴中与3g的山梨(糖)醇液体一起被加热至50℃。将这一溶液加入至该前述液体中，缓缓地搅拌直至获得均匀的乳液。

实施例11

包含槲皮苷的酪蛋白纳米颗粒的制备和鉴定

在7.5mL的水中制备包含100mg的酪蛋白酸钠和8.5mg的赖氨酸（或者5.5mg的精氨酸）的溶液。

此外，在水中制备浓度为12mg/mL的抗坏血酸钠溶液，将0.5mL的该溶液加入至该酪蛋白盐和赖氨酸混合物中。使用酪蛋白酸钠的原因是防止槲皮苷在获得该纳米颗粒过程中的氧化。

此外，将50mg的槲皮苷溶解在5mL的乙醇中。

接下来，将0.15mL的槲皮苷溶液加入至该酪蛋白盐溶液。孵育5分钟后，在磁力搅拌和连续流下将4mL 0.8%的CaCl₂加入至该混合物中。对于每种类型的制剂该过程均重复三次。

表12中包括在每种情况中所获得的物理化学特性。

表12

具有槲皮苷、氨基酸和抗坏血酸的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=3）：槲皮苷和蛋白质的重量比为1：67；槲皮苷和抗坏血酸的重量比为1：34

Q：槲皮苷；NP：纳米颗粒

所获得的结果显示本发明的纳米颗粒还适用于包封具有脂溶性特性的生物活性化合物并且可获得高包封率百分比。

此外，该结果确认一种或另一种氨基酸的存在并不会影响所获得的纳米颗粒的生物化学特性。

为了增加包封的槲皮苷含量，使用赖氨酸作为该氨基酸以及不同量的槲皮苷（0.05至0.50mL的乙醇槲皮苷溶液）重复执行该研究。在表13中包括所获得结果。

表13

具有赖氨酸、抗坏血酸和不同量槲皮苷的酪蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±标准偏差，n=3）：抗坏血酸和蛋白质（酪蛋白）的重量比为1：17

Q：槲皮苷；NP：纳米颗粒

所获得的结果显示随着槲皮苷含量在该制剂中的增加，该包封的槲皮苷含量以相同的比例增加，同时该包封率维持恒定。

另外，进行按照上文描述的方法的试验，但是在将槲皮素加入至该酪蛋白盐溶液中之前，将槲皮素分散在水中（替代在乙醇中溶解）。获得的结果显示部分槲皮素被包封在该酪蛋白纳米颗粒中，尽管该包封率低于在将槲皮素加入至该酪蛋白盐溶液中之前将其溶解在乙醇中的前述情况中的包封率。

Claims (31)

1.一种纳米颗粒，包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组中。

3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述二价金属选自由钙、镁、锌、二价铁及其组合组成的组中，优选钙。

4.根据权利要求1至3任一项所述的纳米颗粒，进一步包括生物活性化合物。

5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述生物活性化合物选自水溶性生物活性化合物和脂溶性生物活性化合物。

6.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述水溶性生物活性化合物选自由如下组成的组中：

a）  B族维生素或者C族维生素；

b）  根据a）的维生素衍生物；

c）  选自透明质酸、硫酸软骨素和硫辛酸的化合物；

d）  任意的前述化合物a）到c）的盐或酯；及

e）  其组合。

7.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述水溶性生物活性化合物选自由叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸、泛酸、单磷酸硫胺素磷酸、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸、p-香豆酸、咖啡酸、其药学上或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物组成的组中。

8.一种制造纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属，所述方法包括：

a）制备包含酪蛋白原料和碱性氨基酸的水溶液；和

b）将选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液加入至步骤a）的溶液中。

9.一种制造纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括酪蛋白基质，碱性氨基酸，选自二价金属、三价金属及其组合的金属和生物活性化合物，所述方法包括：

a）混合（i）含有酪蛋白原料和第一碱性氨基酸的水溶液和（ii）含有生物活性化合物的溶液；和

b）在步骤a）获得的混合物中加入选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述酪蛋白原料包括酪蛋白酸钠。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其组合组成的组中。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述金属为二价金属，其选自由钙、镁、锌、二价铁及其组合组成的组中，优选钙。

13.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述选自二价金属、三价金属及其组合的金属的水溶液为钙盐的水溶液，该钙盐选自由氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、山梨酸钙、抗坏血酸钙、柠檬酸钙、丙酸钙、硫酸钙及其混合物组成的组中。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物活性化合物选自水溶性生物活性化合物和脂溶性生物活性化合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水溶性生物活性化合物选自由如下构成的组：

a）  B族维生素或者C族维生素；

b）  根据a）的维生素衍生物；

c）  选自透明质酸、硫酸软骨素和硫辛酸的化合物；

d）  任意的前述化合物a）到c）的盐或酯；及

e）  其组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述水溶性生物活性化合物选自由叶酸、4-氨基苯甲酸、烟酸、泛酸、单磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰多聚谷氨酸、叶酸、烟酸、透明质酸、硫辛酸、p-香豆酸、咖啡酸、其药学上或者化妆品可接受的或者食品级的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组。

17.根据权利要求8或9所述的方法，进一步包括使包含所形成纳米颗粒的悬浮液经历至少一个静水压力循环，所述压力为100至800MPa。

18.根据权利要求8或9所述的方法，进一步包括干燥所述包含所形成纳米颗粒的悬浮液。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述包含纳米颗粒的悬浮液的干燥在保护剂的存在下、并且任选地在抗氧剂的存在下来执行。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述保护剂为糖类。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗氧剂包括维生素C。

22.一种纳米颗粒，包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自二价金属、三价金属及其组合的金属，其通过根据权利要求8的方法来获得。

23.一种纳米颗粒，包括酪蛋白基质，碱性氨基酸，选自二价金属、三价金属及其组合的金属和生物活性化合物，其通过根据权利要求9所述的方法来获得。

24.一种组合物，包括至少一种根据权利要求1至7任一项所述的纳米颗粒，或者至少一种根据权利要求8至21任一项的方法获得的纳米颗粒，以及在食品、药物或者化妆品中可接受的载体。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述纳米颗粒的平均粒径为50至200nm，优选约140nm。

26.根据权利要求24或25所述的组合物，包括：

酪蛋白，10wt%至50wt%；

叶酸，0.9wt%至2.5wt%；

钙，1wt%至6wt%；

碱性氨基酸，1wt%至7wt%；和

糖类，30wt%至80wt%，

其中所有的重量百分含量均以该组合物的总重量计。

27.根据权利要求24或25所述的组合物，包括：

酪蛋白，10wt%至50wt%；

叶酸，0.9wt%至2.5wt%；

钙，1wt%至6wt%；和

碱性氨基酸，1wt%至7wt%； 

糖类，20wt%至55wt%；和

抗坏血酸，1%至25%，

其中所有的重量百分含量均以该组合物的总重量计。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述载体包括药物或者化妆品赋形剂，使得其能够通过局部途径施用是可接受的。

29.根据权利要求24至28任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒为干燥粉末的形式。

30.一种食品，包括根据权利要求24至27或29任一项所述的组合物。

31.根据权利要求30所述的食品，其为液体、半固体或者固体的形式。

Images