KR101933024B1 - 화합물의 캡슐화를 위한 나노입자, 그 제조 및 이용 - Google Patents

화합물의 캡슐화를 위한 나노입자, 그 제조 및 이용 Download PDF

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Abstract

나노입자는 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산을 포함한다. 상기 나노입자는 수용성 또는 지용성인 생물학적 활성 화합물들을 캡슐화할 수 있다. 본 발명은 식품, 제약 및 화장품 분야 및 나노기술분야에 응용할 수 있다.

Description

화합물의 캡슐화를 위한 나노입자, 그 제조 및 이용{NANOPARTICLES FOR ENCAPSULATION OF COMPOUNDS, THE PRODUCTION AND USES THEREOF}
본 발명은 식품, 제약 및 화장품 분야와 나노기술 분야로 구성되어 있으며, 피막제로써 제인(zein)을 이용하는 생물학적 활성 화합물들의 캡슐화에 관한 것이다. 본 발명은 특히 생물학적 활성 화합물 수득 및 그것의 응용뿐만 아니라 캡슐화에 유용한 제인 매트릭스(zein matrix) 및 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자에 관한 것이다.
산업(특히 식품, 화장품 및 제약 산업)은 새로운 소비자 수요를 충족시키기 위한 기술적 진화가 필요하다. 나노기술은 상기 산업들에게 흥미로운 해결책을 제공할 수 있다.
특히, 나노기술은 다양한 혜택들, 예를 들어 제품의 유효 수명을 증가시키는 것, 사용된 BACs(생물학적 활성 화합물)의 양을 감소시키는 것, 그것의 방출을 컨트롤하는 것, 그것의 생물학적 이용 가능성을 증가시키는 것, 원치않는 맛을 숨기는 것 등을 얻기 위한 목적을 위해 생물학적 활성 화합물[BACs], 예를 들어 정유, 산화방지제, 미네랄, 프리바이오틱스(prebiotics), 조미료, 비타민 등의 캡슐화가 가능하도록 하기 때문에 식품, 화장품 및 제약 산업에서 대변혁을 위한 엄청난 잠재력을 지니고 있다.
소비자 건강의 혜택을 증진시킬 수 있는 물질인 산화방지제는 점점 그 사용이 더 큰 관심을 불러일으키는 BACs 그룹을 형성한다. 특별한 시스템 (예를 들어 극미립자 또는 나노입자) 하에서, 상기 산화방지제, 예를 들어 퀘르세틴 또는 레스베라트롤의 캡슐화는 그들을 보호하고 저장 동안 안정하게 유지하기 위한 목적을 위해 매우 흥미로운 선택이다.
지금까지, 캡슐화된 산화방지제 화합물의 응용은 일반적으로 화장품과 제약 분야로 제한되어 있었다. 예로써, 퀘르세틴의 캡슐화는 (i) 폴리-락틱-코-글리코릭산(PLGA) 및 에틸 아세테이트에 의해 형성된 나노캡슐들 (Ghosh et al., Life Sciences 2009;84:75-80), (ii) Eudragit®[폴리(메트)아크릴산염] 및 폴리비닐 알콜에 의해 형성된 나노입자들 (Wu et al., Int J Pharm 2008;346:160-168), 및 (iii) 포스파티딜콜린 및 트리스테아린과 함께 형성된 지질 극미립자 (Sccalia and Mezzena, J Pharm Biomed Anal 2009;49:90-94) 내에 기술되어 있다. 또한, 레스베라트롤의 캡슐화는 (i) 폴리카프로락톤 나노입자들(Lu et al., Int J Pharm 2009; 375:89-96), (ii) 펙틴 극미립자들(Das and Ng, Int J Pharm 2010;385:20-28), (iii) 리포좀들(Caddeo et al., Int J Pharm 2008;363:183-191), (iv) 키토산 마이크로스피어들(Peng et al., Food Chem 2010;121(1):23-28) 및 (v) 폴리스티렌 마이크로스피어들(Nam et al., Polymer 2005;46:8956-8963) 내에 기술되어 있다.
그러나, 식품 분야에서 캡슐화된 산화방지제 화합물들의 응용은 상기 화합물들을 캡슐화하는데 사용되는 물질들이 유독성 문제를 가지고 있거나 혹은 식품으로서의 사용이 승인되지 않았기 때문에 매우 제한되어 있다. 또한 다른 이유들 중에서, 산화방지제의 짧은 반감기, 높은 법적 책임 및 낮은 경구적 생체이용률 때문에, 기능성 식품들의 설계를 위한 산화방지제 화합물의 이용은 매우 제한적이다. 음식 안에서 산화방지제 화합물을 보호하고, 전체 저장 기간 동안 그들을 안정하게 유지시키고, 나아가 유기체 내에서의 생물학적 이용 가능성을 증가시키도록 컨트롤된 방출을 가능하게 하는 퀘르세틴 또는 레스베라트롤 같은 산화방지제 화합물들의 캡슐화는 매우 바람직할 것이다.
알려진 바와 같이, BAC을 캡슐화하는데 적합한 담체(carrier)를 설계할 때, 매트릭스의 피막제처럼 사용되는 물질을 정확하게 선택하는 것이 매우 중요하다; 그 목적을 달성하기 위해서, 제형(劑形), 그것의 유독성, 제제(製劑)가 함유되어 있는 제품 등은 다른 요인들 사이에서 고려되어야만 한다.
식품 나노기술 분야에서, 합성고분자를 이용하는 것은 유독성 문제를 가질 수 있기 때문에 추천되지 않는다. 비록 천연고분자가 결점을 가지고 있진 않지만, 천연고분자는 입자들을 생산해 내기 위해 더 복잡한 방법의 개발을 필요로 하며, 나아가, 대개의 경우, 수득된 입자 크기(보통 100μm 보다 큼)는 컨트롤하기 어려우므로, 각각의 극미립자들은 소비자(consumer)에 의해 감지될 수 있으며 타겟 음식의 관능적 특성을 바꿀 수 있다.
BAC 코팅제로서의 동물기원 단백질, 예를 들어, 카세인, 알부민 등 및 식물기원 단백질, 예를 들어 프롤라민 등과 같은 단백질들의 사용은 기술되어 왔다(ES 2269715, US 2004/86595, US 5679377).
제인(zein)은 옥수수 알갱이 안에 존재하는 주요 저장 단백질이다. 그것은 다수의 프롤린과 글루타민 아미노산을 갖는 경향이 있으며, 물에 대해 높은 불용성을 보이는 것으로 특징지어지기 때문에 프롤라민 그룹에 속하는 구형 단백질이다. 최근에, 이 단백질은 양친매성 특징을 가지고, 매질내에 존재하는 친수성-친유성 화합물들에 따라 다른 자가조립된 구조들을 형성할 수 있기 때문에, 그것의 특별한 물리화학적 특성과 분자구조로 인해 과학 및 산업분야에서 매우 중요하게 되었다.(Wang et al., Food Biophysics 2008;3:174-181). 그러므로, 제인은 뛰어난 유연성과 더욱이 세균 공격에 대해 저항성을 가진 압축성 특징들을 가진 단단하고 소수성인 막(coating)을 형성할 수 있기 때문에 얇은 막들(films)의 원료로서 많은 잠재적 이득을 제공한다.
이러한 특성의 결과로, 접착제, 생분해 플라스틱, 껌, 식품용 코팅, 섬유, 화장용 파우더, 살충제와 잉크 등을 위한 마이크로인캡슐레이터(microencapsulator)가 제인의 새로운 응용으로 발견되었다. (Muthuselvi and Dhathathreyan, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2006;51:39-43). 이 단백질은 또한 컨트롤된 방법으로 방출하고, 원치않는 맛과 향기를 숨기고, 보호하는 목적으로 캡슐을 코팅하는 제약 산업에 사용된다. (Shukla and Cheryan, Industrial Crops and Products 2001;13:171-192). 나아가, 인슐린, 헤파린, 이버멕틴(ivermectin) 및 지톡신(gitoxin)의 미세캡슐형성(microencapsulation)이 추천된다. 다습 및 고열 하에서도 안정되고 더욱이 세균 공격에 저항성을 가지는 극미립자/마이크로스피어가 일반적으로 달성된다(US5679377).
그러나, 캡슐화된 성분들을 가진 기능성 식품을 설계하기 위한 식품 분야의 캡슐화제로서 제인의 사용은 여전히 초기단계이다. 관심있는 음식들에 도입될 때 그들을 산화로부터 보호하고, 음의 관능적 특성을 숨기기 위해 유동상(fluid bed)기술을 적용함으로써, 상기 단백질 내에의 오메가-3 지방산의 캡슐화 (MX2008003213) 뿐만 아니라 상분리 기술을 이용한 필수적인 기름의 캡슐화 (Parris et al., J Agric Food Chem 2005;53:4788-4792)를 위한 제인 나노분자의 수득이 기술되어 있다. 나아가, 전기방사 기술에 의한 제인 섬유 내의 리코펜 및 폴리페놀 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)의 캡슐화 (Fernandez et al., Food Hydrocolloids 2009;23:1427-1432 and Li et al. J Food Sci 2009;74(3): C233-C240 각각), SAS(supercritical anti-solvent) 방법에 의한 리소좀의 캡슐화 (Zhong et al. Food chemistry 2009;115(2):697-700) 및 액체-액체 분산 방법에 의한 어유(fish oil)의 캡슐화 (Zhong et al., J Food Process Pres 2009;33(2):255-270)가 최근 달성되었다. 기술된 이들 제조 기법의 이러한 작업들은 상대적으로 복잡하고 산업에의 적용을 위한 규모 조정이 어려우며 또한 오직 친유성 화합물들의 캡슐화만으로 제한적이고 친수성 화합물들의 캡슐화에는 적합하지 않다.
그러므로, 앞서 언급한 결점들의 전체 또는 일부분을 극복하는 생물학적 활성 화합물을 캡슐화하는 다용도의 시스템을 개발하는 것이 필수적이다. 여기서의 다용도의 시스템은 수용성과 지용성 화합물 모두를 운반하고, 특히, 산화방지제 화합물의 경우처럼, 다른 방법들이 어려움을 수반하는 화합물들의 투입에 적합하다. 게다가, 상기 시스템은 또한 간단한 방식으로 얻을 수 있고, 저장하는 동안 및 투여 후에 적절한 안전성을 가질 수 있기 때문에 매우 바람직하며, 이것은 식품, 제약 및 화장품 분야와 같은 다른 기술 분야에서 그들의 응용을 가능하게 한다.
발명의 개요
놀랍게도 제인 매트릭스와 염기성 아미노산으로 수용성 및 지용성 생물학적 활성 화합물(BACs)을 코팅하는 것은 식품, 화장품, 및 제약에 응용하기 위해 상기 BACs를 캡슐화하고 안정화시키는 새로운 시스템을 형성하는 나노입자를 제공한다는 것이 이제 발견되었다.
본 발명에 의해 수행된 여러가지 실험들은 제인과 함께 염기성 아미노산의 추가가 제인을 용해시키기 위해 상대적으로 낮은 백분율의 알콜을 갖는 하이드로알콜 용액을 사용할 수 있고 결과적으로 지용성과 수용성 BACs 둘 다를 캡슐화할 수 있다는 사실 때문에 제인 매트릭스와 염기성 아미노산을 포함하는 상기 나노입자의 제조방법을 용이하게 한다는 것을 보여줘 왔다. 뿐만 아니라, 유독성 문제들을 일으킬 수 있는 염기성 첨가제 또는 용매의 사용이 방지됨으로써, 나노입자의 영양적 특성들이 향상되었다. 또한, 입자의 표면전하가 증가하여 입자의 응집을 예방하기 때문에 염기성 아미노산은 나노입자에 안전성을 부여한다.
그러므로 한가지 측면에서, 본 발명은 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자는 수용성 또는 지용성 BACs를 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, BAC는 산화방지제 화합물이다. 더욱이 상기 나노입자는 기술적인 첨가제로써 사용될 수 있다[캡슐화된 첨가제는 매질 내에서 균일 분산이 순조로운, 용해되지 않는 매트릭스 안에 함유될 수 있다; 예로써, 본 발명에 따르면, 상기 나노입자에서 캡슐화된 지용성 BAC는 수용성 매트릭스 내에서 분산될 수 있으며 이 방법은 만약 BAC가 (캡슐화 없이) 자유 형태 (free form)라면 복잡했을 것이다].
상기 나노입자는 안정적이며 제품(예를 들어, 식품, 제약 또는 화장품)제조 및 저장 동안 외부 요인들, 예를 들어, 빛, pH 변화, 산화 등에 의한 저하로부터 BAC를 보호할 수 있다. 또한, 상기 나노입자가 경구투약(예를 들어, 음식)될 경우, 이것은 위(stomach)의 산성 환경으로부터 BAC를 보호하고 예컨대 장(intestine)과 같은 바람직한 장소에 BAC를 방출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BACs가 없는 상기의 빈 나노입자의 제조방법과 관련된 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 지용성 BAC 또는 수용성 BAC 같이 BAC를 함유하고 있는 상기 나노입자의 제조방법과 관련된 것이다.
상기 방법은 산업 규모에서 간단하고 응용할 수 있으며 유리하게도 식품첨가제로서 승인되지 않은 합성고분자와 시약들의 사용이 포함되지 않았고, 계면활성제 또는 유화제의 함유가 최소화되도록 하였으며 더욱이 입자 크기를 조절할 수 있는 나노미터 규모의 나노입자를 얻는 것이 가능하게 되었다.
특정한 구체예에서, 상기 방법은 시간이 흐르면서 BAC를 안정하게 유지시키는 파우더 형태의 제제를 얻기 위한 목적으로 상기 나노입자를 함유하는 현탁액을 건조시키는 단계를 추가로 포함한다; 파우더 형태의 제제는 고체음식에서의 사용에 특히 적합하다. 상기 나노입자의 건조는 나노입자를 위한 보호제 존재 하에 유리하게 수행된다. 따라서, 이와 같이 얻어진 BAC를 함유하는 나노입자는 수용성 매질 내에서 쉽게 재현탁(resuspend)될 수 있으며, 이는 용액 내에서의 저하로부터 BAC를 보호한다. 얻어진 최종 제품은 안정적이고 긴 저장기간 동안 BAC를 보호하며, 나아가 액체 음식(예를 들어, 음료) 및 고체 음식과 같은 다른 종류의 음식에도 응용이 가능하다.
다른 측면에서, 본 발명은 식품, 제약 또는 화장품 분야에서 사용되는 상기 나노입자를 함유하는 조성물에 관련된 것이다. 사실, 상기 나노입자는 이들 분야에서 사용하기에 적합한 안정된 화장품 또는 조제 약품용 물질을 얻기 위한 목적으로 크림, 겔, 히드로겔에 함유될 수 있다. 상기 나노입자는 국소 투여에 적합한 첨가제와 함께 이와 같이 형성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이 발명에 의해 제공된 제인 나노입자에 기초한 상기 조성물을 함유하는 식료품에 관련된 것이다. 특정한 구체예에서, 상기 식료품은 액체, 반고체 또는 고체 형태이다.
도 1은 빈(empty) 제인 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 보여준다. A) 8,000x(이미지의 왼쪽 여백 바닥에 위치한 검정 막대는 200nm의 기준에 대응된다). B) 15,750x(이미지의 왼쪽 여백 바닥에 위치한 검정 막대는 100nm의 기준에 대응된다).
도 2는 레스베라트롤을 함유하는 제인 매트릭스와 리신으로 구성된 나노입자의 전자주사현미경(SEM) 이미지를 보여준다. 이 이미지는 보호용 당류를 제거하기 위한 세척 후의 분말제제(powder formulation)에 해당되는 사진이다.
도 3은 퀘르세틴을 함유하는 제인 매트릭스와 리신으로 구성된 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 보여준다. A) 25,000x(이미지의 왼쪽 여백 바닥에 위치한 검정 막대는 150nm의 기준에 대응된다). B) 10,000x(이미지의 왼쪽 여백 바닥에 위치한 검정 막대는 150nm의 기준에 대응된다).
도 4는 초반에 제제에 함유된 퀘르세틴량의 함수로서, 제인 매트릭스와 리신을 함유하는 나노입자(NP) 내에서 캡슐화된 퀘르세틴의 양을 보여준다.
도 5는 퀘르세틴을 함유하는 제인 매트릭스와 리신을 함유하는 나노입자의 전자주사현미경(SEM) 이미지를 보여준다. 이 이미지는 보호용 당류를 제거하기 위한 세척 후의 분말제제에 해당된다.
도 6은 실험실 동물에게 다른 비타민 제제 투여 후 시간 함수로서 혈청 엽산 농도(ng/mL)를 보여준다. 결과물은 평균 ± 표준편차를 나타낸다 (n=5). (A) 정맥루트 (정맥 내), 투여량(dose) 1mg/kg. (B) 구강 루트, 투여량(dose) 1mg/kg : 물에 용해되는 비캡슐화된 엽산(■); 물에 분산되는 제인 나노입자에 캡슐화된 엽산(●).
본 발명은 제인 매트릭스와 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자와, 외부 요인들(예를 들어, 빛, pH, 산화 등)에 의한 저하로부터 보존을 목적으로 생물학적 활성 화합물(BACs)을 캡슐화하는 방법을 제공한다. 상기 나노입자는 그들의 생물학적 이용 가능성을 증가시키기 위한 목적으로 BAC의 방출이 컨트롤되도록 설계될 수 있다; 생물학적 이용 가능성은 두가지 루트에 의해 증가될 수 있다 : 장 내에서 캡슐화된 BAC의 완전한 방출에 의하여 (그 저하는 기원(origin)에서, 음식 매트릭스에서 및/또는 위의 산성 환경에 대항하여 제공된 보호물에 의해서 뿐만 아니라 저장에 의해서 최소화됨), 그리고 컨트롤된 방식 또는 지속된 시간 동안 BAC의 방출에 따른 영향에 의하여.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본 서술에서 사용된 여러가지 용어와 표현들의 의미를 아래에 나타내었다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "염기성 아미노산"은 아미노기(-NH2) 및 카르복실기(-COOH) 및 양전하를 함유하는 유기 분자를 나타낸다; 상기 염기성 아미노산은 바람직하게는 리신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 알파-아미노산이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "대략(approximately)"은 예를 들어 명시된 값의 ±10% 처럼, 명시된 값에 근접한 범위의 값을 나타낸다. 예를 들어, "대략 20"은 20에서 ±10% 즉 18에서 22까지를 함유한다. 또한, 용어 "대략"의 명시 유무와 관계없이, 당업자는 본 명세서에 표현된 임의의 수치는 근접한 범위의 값을 함유한다는 것을 이해한다. 명시된 값의 그러한 변화는 해당 측정 동안 실험적 오류의 결과로 여겨질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "생물학적 활성 화합물" 또는 "BAC"는 영양, 치료 및/또는 화장품 활성을 가진 화합물을 나타낸다; 상기 화합물은 지용성 또는 수용성이 될 수 있다. 본 발명에 따른 BACs의 비제한적인 구체적 예시들은 아미노산, 항미생물제, 방향제, 방부제, 감미료, 스테로이드, 약물, 호르몬, 지질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 단백질, 프로테오글리칸, 조미료, 비타민 등을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "수용성 생물학적 활성 화합물" 또는 "수용성 BAC"는 영양, 치료 및/또는 화장품 활성을 가진 화합물 및 로열 스페인 약전에 의한 표준 정의에 따른 수용액 내의 용해성이 있는(매우 많이 용해됨, 자유 용해됨, 용해됨, 거의 용해됨 또는 조금 용해됨) 화합물을 나타낸다:
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수용성 BAC의 비제한적인 구체적 예시들은 비타민, 예를 들어 비타민 B 또는 C군 및 그들의 유도체, 염 또는 에스테르; 히알루론산, 황산 콘드로이틴, 티옥산, 그들의 염 또는 에스테르 등을 함유한다. 특정한 구체예에서 상기 수용성 BAC는 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신, 판토텐산, 티아민 1인산, 티아민피로인산, 티아민 3인산, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산(엽산 유도체 : 엽산 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 엽산), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산(알파-리포산), p-쿠마르산, 커피산, 식품등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체, 에스테르 또는 염 및 그의 혼합물들을 함유하는 있는 그룹으로부터 선택된다.
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본 명세서에서 사용된 것과 같은, "지용성 생물학적 활성 화합물" 또는 "지용성 BAC"는 영양, 치료 및/또는 화장품 활성을 가진 화합물과 로열 스페인 약전에 의한 표준 정의에 따른 지방 및 기름 내의 용해성이 있는(매우 많이 용해됨, 자유 용해됨, 용해됨, 거의 용해됨 또는 조금 용해됨) 화합물을 나타낸다. 지용성 BACs의 비제한적인 구체적 예시들은 비타민, 예를 들어 비타민 A, D, E, K군과 그들의 유도체, 인지질, 카로티노이드(카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아산틴 등), 오메가-3 지방산(도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA), 등), 피토스타놀 및 피토스테롤(시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 등), 폴리페놀(퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캠페롤, 미리세틴, 이소람네틴 등) 및 그의 유도체들을 함유한다.
제품은 한 국가 또는 기관, 예를 들어 유엔식량농업기구(FAO) 또는 세계 보건 기구(WHO)의 국제식품규격에 따라 인간 혹은 동물을 위한 음식에 사용해도 안전할 경우에 "식품 등급" 제품이라고 불려진다; 따라서, "식품 등급" 제품은 "음식으로 사용되기에 적합한" 무독성 제품이며, 두 표현은 동의어이고 본 서술에서 구분 없이 사용된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "수성 매질"은 물을 함유하는 매질을 나타낸다. 특정한 구체예에서, 수성 매질은 근본적으로 물을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "하이드로알콜 매질"은 가변적으로 상대적인 비율에서 물과 알콜로 구성되어 있는 매질을 나타낸다. 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 매질은 상기 화합물들 사이에서 임의의 상대적 비율의 물 내의 에탄올 용액을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "나노입자"는 1 마이크로미터(μm) 미만, 바람직하게는 대략 10에서 900 나노미터(nm) 크기의 구 또는 유사한 형태 타입의 콜로이드 시스템을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "평균 크기"는 수성 매질 내에서 함께 이동하는 나노입자 집단의 평균 지름을 나타낸다. 이 시스템의 평균 크기는 당업자들에 의해 알려진 표준절차에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들어 실험적 부분에서 기술된다(하기 참조).
본 명세서에서 사용된 것과 같은, 용어 "제인"은 프롤라민 그룹에 속하는 임의의 구형 단백질을 함유한다; 상기 단백질은 일반적으로 배젖(씨앗 식물의 배낭에서 형성된 영양분을 제공하는 조직이며, 보통 다양한 속씨식물 씨앗의 배아를 위해 식량 저장고를 형성함)의 성장 동안 합성된다. 비록 제인은 곡물로부터 바람직하게 얻어지지만 임의의 적합한 원천으로부터 얻어질 수도 있다. 곡물 배젖으로부터 제인을 추출하는 다양한 방법과 기술이 알려져 있다; 상업적 제인은 일반적으로 곡물 글루텐 밀로부터 추출된다(US 2009-0258050).
그러므로, 제인에 대한 연구는 유전적 레벨에서 극단적인 가변성 및, 따라서 제인으로 알려진 단백질 그룹의 일부분을 형성하는 다른 단백질들 사이에서 복잡한 상태를 드러낸다. 천연 제인은 실제로 그들의 분자 크기, 용해성 및 전하가 다른 여러가지 단백질 그룹의 크고 이질적인 집단이다. 20개 이상의 다른 제인이 존재하는 것으로 추정되어 왔다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이온교환 크로마토그래피, 겔 제외 크로마토그래피, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 등전점 전기영동(IEF), 아미노산 분석 및 DNA 클로닝 기술을 이용한 제인 추출 분석은 제인 단백질의 더 많은 이해를 이끈다.
제인 아미노산의 구성물 분석은 많은 양의 류신, 알라닌, 글루타민 및 페닐알라닌을 나타낸다; 하지만, 리신 및 트립토판은 존재하지 않거나 그 대신에 매우 소량으로 존재한다. 무극성 아미노산 잔기의 높은 비율및 이온 그룹의 예외적인 부족은 그것의 소수성 성질 및 특별한 용해성을 책임지고 있다.
제인의 단백질 몸체는 구조적으로 다른 단백질들의 세가지 타입에 의해 형성된다: 알파-제인(α-제인), 감마-제인(γ-제인) [베타 제인(β-제인)을 함유하는], 및 델타-제인(δ-제인). 상기의 단백질들은 용해성과 시퀀스의 차이를 토대로 하여 네가지 종류(α-제인, β-제인, γ-제인 및 δ-제인)로 분류될 수 있다.
환원제 없이 추출된 제인은 α-제인으로 언급된 폴리펩티드의 거대한 다유전자군을 형성한다. 일반적으로 천연 제인 중에서 가장 풍부한 조각인 α-제인은 20개의 아미노산 중 일련의 9 또는 10개의 반복된 펩티드들보다 앞선 아미노 말단의 약 40개의 아미노산들을 함유한다. 이러한 반복은 α-나선인 것으로 믿어지며 단백질을 막대 형태로 된 분자 모양으로 감는다.
제인의 다른 조각들(β-, γ- 및 δ-제인)은 이황화결합을 끊는 환원제를 함유하는 알콜의 알콜용액을 이용하여 추출해야만 한다. 예로써, 메르캅토에탄올은 실험실 추출로 사용된다. β-, γ- 및 δ-제인은 α-제인과의 상동관계 시퀀스가 없다.
γ-제인은 환원적 조건에서 수용액 및 알콜성 용액 모두에 용해성이 있다. γ-제인 각각은 특별한 N-말단 시퀀스를 가지고 있다. 예로써, 50kDa γ-제인 내에서, 이 구간은 136개의 아미노산 길이이고 히스티딘이 매우 풍부하다. 27 kDa γ-제인은 아미노 말단 이후에 11개의 아미노산을 생산하는 헥사펩티드의 일련의 8탠덤(tandem) 반복을 가지고 있다. 16 kDa γ-제인 단백질의 첫번째 8개 아미노산들은 27 kDa γ-제인의 것들과 동일하지만, 16kDa γ-제인은 프롤린-풍부 반복의 세가지 악화 형태를 가지고 있다. γ-제인은 일반적으로 전체 제인 중 10에서 15%가 나타난다.
γ-제인과 관련된 β-제인은 메티오닌-풍부 17 kDa 폴리펩티드를 함유하며 전체 제인의 10%까지 구성하고 있다. β-제인 및 γ-제인의 마지막 대략 140개의 아미노산들은 85%가 동일하다. β-제인은 반복되는 펩티드를 가지지 않고 주로 β-시트를 구성하며 형태를 변형한다.
δ-제인은 10 kDa 단백질이며 제인의 작은 조각이다. δ-제인은 대부분 소수성 그룹이고 반복적인 펩티드를 함유하지 않으며, 특히 메티오닌- 및 시스테인-풍부이다.
제인은 1985년 이래로 미국 식품 의약국(FDA)의 합격증(GRAS)으로 간주되어 왔다[CAS(화학 초록 서비스) 번호 : 9010-66-6].
사실, 본 발명에서 제인의 근원과 등급은 하나의 제인으로 제한되지 않고, 임의의 제인이 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 예로써, 본 발명에서 사용될 수 있는 상업적 제인은, Sigma-Aldrich(제품 번호 Z 3625); Wako Puras Chemical Industries(제품 번호 261-00015, 264-01281 및 260-01283); Spectrum Chemical(제품 번호 Z1131 및 ZE105); ScienceLab units SLZ1150; SJZ Chem-Pharma Company(제품 이름 ZEIN (GLIDZIN); Arco Organics(카달로그 번호 17931-0000, 17931-1000 및 17931-5000); 및 Freeman Industries, 제인 표준 등급 F4000, 제인 표준 등급 F4400, 제인 특별 등급 F6000 등을 함유하지만 제한되지는 않는다. 특별한 구체예에서, 곡물로부터 얻어진 Sigma-Aldrich(제품 번호 Z 3625)에 의해 공급된 상업적 제인이 사용된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, 용어 "제인"은 천연제인과 변형된 제인 모두를 함유한다. 용어 "변형된 제인"은 보통 자연적으로 발생하진 않지만 진정 제인과 유사한 거동을 보이고 알콜에 용해되는 아미노산 시퀀스를 가진 모든 제인을 함유한다. 실질적으로 소수성이 변하지 않는 아미노산 치환이 소개될 수 있다. 예로써, 아미노산 치환은 반복된 구간 내에서 작동될 수 있거나 혹은 단일 아미노산이 치환될 수 있으며, 치환은 반복된 시퀀스의 도메인을 연결하는 부분에서 또한 수행될 수 있다. 삽입과 치환은 카르복실 말단 및 제인 분자의 아미노 말단에서 또한 도입될 수 있다. 게다가, 결과적으로 얻어진 단백질이 기능적으로 제인과 동등하다면, 즉, 그것의 특성을 유지한다면, 결실(deletion)은 제공된 아미노산 시퀀스에서 수행될 수 있다.
발명의 나노입자
한가지 측면에서, 본 발명은 제인 매트릭스와 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자, 이하 본 발명의 나노입자에 관한 것이다.
사실상 임의의 제인은 본 발명의 나노입자의 매트릭스를 형성할 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서 상기 제인은 Sigma-Aldrich(제품 번호 Z 3625)에 의해 공급된 제인과 같은 곡물로부터의 제인이다.
특정한 구체예에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그의 혼합물을 함유하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 나노입자는 생물학적 활성 화합물(BAC)을 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 또한 기술적 첨가제로서 사용될 수 있으며, 예컨대 수용성 매트릭스 등에서 지용성 BAC의 혼합을 용이하게 한다.
그러므로, 또다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 나노입자는 더 나아가 BAC를 구성한다. 상기 BAC는 수용성 BAC 혹은 지용성 BAC가 될 수 있다; 이런 경우에, 본 발명의 나노입자는 BACs를 함유하지 않는 본 발명의 다른 나노입자들로부터 그것을 구별하기 위해서 "본 발명의 나노입자를 지닌"으로 본 서술에서 때때로 확인된다(때때로 "본 발명의 빈 나노입자"로 확인됨).
특정한 구체예에서, 상기 BAC는 지용성 BAC이다. 더 많은 특정한 구체예에서, 상기 지용성 BAC는 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다 :
a) 폴리페놀;
b) 비타민 A, D, E 또는 K 군의 비타민
c) b)에 따른 비타민의 전구물질 혹은 유도체;
d) 인지질;
e) 카로티노이드;
f) 지방산;
g) 피토스타놀(phytostanol) 또는 피토스테롤(phytosterol);
h) 이전 화합물 a)-g)의 염 또는 에스테르; 및
i) 그것의 혼합물들.
더 많은 특정한 구체예에서, 상기 지용성 BAC는 :
i) 예를 들어 플라보놀(예를 들어, 카테킨, 에피카테킨, 이소람네틴, 캠페롤, 미리세틴, 퀘르세틴 등)과 같은 폴리페놀; 안토시아닌(예를 들어, 시아니딘, 델피니딘, 말비딘, 페오니딘, 페튜니딘 등); 파이토알렉신(예를 들어, 레스베라트롤 등); 하이드록시타이로솔 등;
ii) 예를 들어 비타민 A 및 그의 유도체들(예를 들어, 레티노산, 레티날, 레티놀 등)과 같은 지용성 비타민; 비타민 E 및 그의 유도체들(예를 들어, 토코페놀, 예를 들어, 알파-토코페놀 등, 토코트리에놀 등); 비타민 D 및 그의 유도체들(예를 들어, 비타민 D1, 비타민 D2(에르고칼시페롤), 비타민 D3(콜레칼시페롤), 비타민 D4(22-디하이드로에르고칼시페롤), 비타민 D5(시토칼시페롤) 등); 비타민 K 또는 피토메나디온 및 그의 유도체들(예를 들어, 비타민 K1(필로퀴논), 비타민 K2(메나퀴논), 메나디온 등);
iii) 예를 들어 카로틴(예를 들어, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 크립토크산틴, 리코펜 등)과 같은 카로티노이드; 크산토필(예를 들어, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 캅산틴, 크립토크산틴, 플라보크산틴, 루테인, 로도크산틴, 루비크산틴, 비올라크산틴, 제아크산틴 등);
iv) 예를 들어 오메가-3 지방산(예를 들어, α-리놀렌산(ALA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 등)과 같은 지방산; 오메가-6 지방산(예를 들어, γ-리놀렌산 등); 또는
v) 피토스테롤 또는 파이토스탄올(예를 들어, 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, 시토스탄올, 시토스테롤 등).
특정한 구체예에서, 상기 지용성 BAC는 플라보놀(예를 들어, 퀘르세틴 등), 안토시아닌, 파이토알렉신(예를 들어, 레스베라트롤 등), 하이드록시타이로솔, 레티노산, 레티날, 레티놀, 칼시페롤(에르고칼시페롤 및 콜레칼시페롤), 알파-토코페롤, 토코트리에놀, 피토메나디온, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 리코펜, 캅산틴, 루테인, 제아크산틴, 크산토필, EPA, DHA, 리놀렌산, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 그들의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체들, 에스테르 또는 염 및 그들의 혼합물들을 함유하는 그룹으로부터 선택된다.
더 많은 특정한 구체예에서, 상기 지용성 BAC는 퀘르세틴, 레스베라트롤, 그들의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체들, 에스테르 또는 염 및 그들의 혼합물들을 함유하는 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 특정한 구체예에서 상기 BAC는 수용성 BAC이다. 더 많은 특정한 구체예에서, 상기 수용성 BAC는 :
a) 비타민 B 또는 C 군의 비타민;
b) a)에 따른 비타민의 유도체;
c) 히알루론산, 황산 콘드로이틴 및 티옥산으로부터 선택된 화합물;
d) 이전 화합물 a)-c)의 염 또는 에스테르; 및
e) 그것의 혼합물들.
특정한 구체예에서, 상기 수용성 BAC는 엽산, 그것의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 에스테르 또는 염 및 그의 혼합물들을 구성하는 그룹으로부터 선택된다.
산화방지제 화합물을 캡슐화하기 위한 시스템으로써 본 발명의 나노입자의 사용은 특정하고 바람직한 구체예이다.
본 발명의 나노입자를 얻기 위한 방법
또 다른 관점에서, 본 발명은 제인 매트릭스와 염기성 아미노산(본 발명의 나노입자)을 함유하는 나노입자 제조방법에 관한 것이며, 이하 "본 발명의 방법[1]"은 다음으로 구성되어 있다:
a) 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액을 준비; 및
b) a)단계의 용액에 물을 추가.
본 발명의 방법[1] 단계 a)에서 사용된 하이드로알콜 용액은 물과 알콜, 일반적으로 에탄올을 함유하고 있다; 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액은 25%에서 75% (w/v) 사이, 바람직하게는 30%에서 60% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 50%의 알콜로 구성되어 있다.
본 발명의 방법[1]의 단계 a)에서 형성된 하이드로알콜 용액이 함유할 수 있는 제인의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액에 함유된 제인의 양은 0.1%에서 10%(w/v) 사이, 바람직하게는 0.2%에서 2.5% 사이, 더욱 바람직하게는 0.5%에서 1% 사이이다.
본 발명의 방법[1]의 단계 a)에서 형성된 상기 하이드로알콜 용액이 함유할 수 있는 염기성 아미노산의 양은 넓은 범위 안에 있다. 일반적으로, 상기 양은 보통 용해된 제인의 양에 따라 표현된다. 따라서, 비록 상기 하이드로알콜 용액 내에 존재하는 염기성 아미노산 및 제인[염기상 아미노산 : 제인] 사이의 무게 비율이 일반적으로 캡슐화된 BAC의 종류에 달려있고 매우 광범위할 수 있지만, 특정한 구체예에서, 상기 염기성 아미노산 : 제인의 무게비율은 1:0.01 에서 1:50 사이, 일반적으로는 1:0.5 에서 1:25 사이, 바람직하게는 1:1 에서 1:20 사이, 더욱 바람직하게는 1:5 에서 1:15 사이이다; 특정한 구체예에서, 염기성 아미노산 : 제인 무게비율은 대략 1:6이다.
본 발명의 방법[1] 단계 b)에서, 물은 본 발명의 나노입자를 형성하기 위해 충분한 양이 추가된다. 비록 추가될 수 있는 물의 양이 넓은 범위 내에 있을 수 있지만, 특정한 구체예에서, 물은 10%에서 60%(w/v) 사이, 바람직하게는 15%에서 30% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 25%를 함유하는 매질 내 알콜의 최종 비율을 위해 충분한 양이 추가된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 제인 매트릭스, 염기성 아미노산 및 지용성 BAC(지용성 BAC를 지닌 본 발명의 나노입자)를 함유하는 나노입자 제조방법에 관한 것이며, 이하 "본 발명의 방법[2]"은 다음으로 구성되어 있다:
a) 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i) 준비;
b) 지용성 BAC를 함유하는 알콜 용액 준비 및 지용성 BAC를 함유하는 하이드로알콜 용액 (ii)를 얻기 위해 알콜 용액을 물에 희석;
c) 지용성 BAC를 함유하는 상기 하이드로알콜 용액(ii)과 함께 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액(i)을 혼합; 및
d) 단계 c)로부터 얻어진 혼합물에 물을 추가.
본 발명의 방법[2]의 단계 a)에서 사용된 제인과 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i)은 물과 알콜, 일반적으로 에탄올을 포함한다; 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액은 25%에서 75%(w/v) 알콜, 바람직하게는 30%에서 60% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 50%를 함유한다. 상기 하이드로알콜 용액 (i)은 적절한 양 하에서 그것의 구성물을 혼합함으로써 준비된다.
본 발명의 방법[2]의 단계 a)에서 사용된 제인과 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)이 포함할 수 있는 제인의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (i)에 포함된 제인의 양은 0.1%에서 10% (w/v)사이, 바람직하게는 0.2%에서 2.5% 사이, 더욱 바람직하게는 0.5%에서 1% 사이로 구성되어 있다.
본 발명의 방법[2]의 단계 a)에서 사용된 제인과 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)이 함유할 수 있는 염기성 아미노산의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다. 상기 양은 일반적으로 용해된 제인의 양에 따라 표현될 수 있을 것이다. 따라서, 비록 상기 하이드로알콜 용액 (i) 내에 존재하는 염기성 아미노산과 제인 [염기성 아미노산 : 제인] 사이의 무게 비율이 매우 광범위할 수 있지만, 특정한 구체예에서, 상기 염기성 아미노산 : 제인 무게비율은 1:0.01 에서 1:50 사이, 일반적으로는 1:0.5 에서 1:25 사이, 바람직하게는 1:1에서 1:20 사이, 더욱 바람직하게는 1:5에서 1:15 사이로 구성되어 있다; 특별한 구체예에서, 염기성 아미노산 : 제인 무게비율은 대략적으로 1: 6(BAC가 레스베라트롤일 경우) 및 1:11(BAC가 퀘르세틴일 경우)이다.
본 발명의 방법[2]의 단계 b)에서 생성된 지용성 BAC를 포함하는 하이드로알콜 용액(ii)은 알콜(예를 들어, 에탄올) 내의 상기 지용성 BAC를 용해하거나 용해도를 높인 다음, 얻어진 알콜 용액을 물에 희석시킴으로써 얻어질 수 있다. 그러므로, 발명의 방법[2]의 단계 b)에서 생성된 지용성 BAC를 구성하는 상기 하이드로알콜 용액 (ii)은 물과 알콜, 일반적으로 에탄올을 함유할 수 있다; 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (ii)은 25%에서 75% (w/v) 알콜 사이, 바람직하게는 30% 에서 65% 사이, 더욱 바람직하게는 50% 에서 60% 사이를 포함한다.
상기 하이드로알콜 용액 (ii)을 포함할 수 있는 지용성 BAC의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (ii)에 포함된 지용성 BAC의 양은 0.05%에서 10% (w/v)사이, 바람직하게는 0.1% 에서 1% 사이, 더욱 바람직하게는 0.2%에서 0.3% 사이를 함유한다.
본 발명의 방법[2]의 단계 c)에 따르면, 제인과 염기성 아미노산을 포함하는 하이드로알콜 용액 (i)은 지용성 BAC를 포함하는 하이드로알콜 용액 (ii)와 함께 혼합된다; 따라서 제인, 염기성 아미노산 및 지용성 BAC를 구성하는 혼합물은 하이드로알콜 매질에서 형성된다. 상기 단계 c)에서 형성된 혼합물 내에 존재하는 지용성 BAC:제인 무게비율은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 지용성 BAC와 제인 [지용성 BAC : 제인] 사이의 무게 비율은 1: 0.5에서 1: 70 사이, 바람직하게는 1:5에서 1:50 사이, 더욱 바람직하게는 1:10 에서 1:30 사이를 함유한다.
본 발명의 방법[2]의 단계 d)에서, 물은 본 발명의 나노입자 형성을 위해 충분한 양이 단계 c)에서 형성된 혼합물에 추가된다. 비록 추가된 물의 양이 넓은 범위 내에 있을 수 있지만, 특정한 구체예에서, 물은 10%에서 60%(w/v) 사이, 바람직하게는 15%에서 30% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 25%를 함유하는 매질 내 알콜의 최종 비율을 위해 충분한 양이 추가된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제인 매트릭스 염기성 아미노산 및 수용성 생물학적 활성 화합물(수용성 BAC를 지닌 본 발명의 나노입자)로 구성되어 있는 나노입자 제조방법에 관한 것이며, 이하 "본 발명의 방법[3]"는 다음으로 구성되어 있다:
a) 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i) 준비;
b) 수용성 BAC 및 임의로 제 2 염기성 아미노산을 포함하는 수용액을 준비하고, 수용성 BAC 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (ii)을 얻기 위해 수용액을 알콜과 함께 희석;
c) 수용성 BAC 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 포함하는 상기 하이드로알콜 용액 (ii)과 함께 제인 및 염기성 아미노산을 포함하는 상기 하이드로알콜 용액 (i) 혼합;
d) 단계 c)로부터 얻어진 혼합물에 계면활성제를 선택적으로 추가; 및
e) 단계 c) 또는 단계 d)로부터 얻어진 혼합물에 물을 추가.
본 발명의 방법 [3]의 단계 a)에서 사용된 제인 및 염기성 아미노산을 포함하는 하이드로알콜 용액 (i)은 물과 알콜, 일반적으로 에탄올을 포함한다; 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액은 25%에서 75% (w/v) 알콜 사이, 바람직하게는 30% 에서 60% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 50%를 함유한다. 상기 하이드로알콜 용액 (i)은 적절한 양 하에서 그것의 조성물을 혼합함으로써 준비된다.
본 발명의 방법[3]의 단계 a)에서 사용된 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)이 포함할 수 있는 제인의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (i)에 포함된 제인의 양은 0.1%에서 10% (w/v)사이, 바람직하게는 0.2%에서 2.5% 사이, 더욱 바람직하게는 0.5%에서 1% 사이로 구성되어 있다.
본 발명의 방법[3]의 단계 a)에서 사용된 제인 및 염기성 아미노산을 포함하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)이 포함할 수 있는 염기성 아미노산의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다. 상기 양은 일반적으로 용해된 제인의 양에 따라 표현될 수 있을 것이다. 따라서, 비록 상기 하이드로알콜 용액 (i) 내에 존재하는 염기성 아미노산과 제인 [염기성 아미노산 : 제인] 사이의 무게 비율이 매우 광범위할 수 있지만, 특정한 구체예에서, 상기 염기성 아미노산 : 제인 무게비율은 1:0.01 에서 1:50 사이, 일반적으로 1:0.5 에서 1:25 사이, 바람직하게는 1:1 에서 1:20 사이, 더욱 바람직하게는 1:5 에서 1:15 사이로 구성되어 있다; 특별한 구체예에서, 염기성 아미노산 : 제인 무게비율은 대략 1: 6.7이다.
본 발명의 방법[3]의 단계 b)에서 생성된 수용성 BAC를 포함하는 하이드로알콜 용액 (ii)은 선택적으로 제 2 염기성 아미노산의 존재 하에 있는 물 내의 상기 수용성 BAC를 용해하거나 용해도를 높인 다음, 알콜(예를 들어, 에탄올)과 함께 수득된 수용액을 희석시킴으로써 얻어질 수 있다. 그러므로, 발명의 방법[3]의 단계 b)에서 생성된 수용성 BAC 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (ii)은 물과 알콜, 일반적으로 에탄올을 함유한다; 특별한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (ii)은 25%에서 75% (w/v) 알콜 사이, 바람직하게는 30%에서 60% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 50%를 함유한다.
특별한 구체예에서, 물과 선택적으로 상기 제 2 염기성 아미노산의 존재 하에서 수용성 BAC를 용해함으로써 수득된 수용액은 상기 수용성 BAC 및 물을 함유한다; 그리고 또 다른 구체예에서, 수용액은 수용성 BAC, 염기성 아미노산 및 물을 함유한다. 몇몇 수용성 BACs, 예컨대 엽산의 가용화는 상기 염기성 아미노산과 함께 염기성화된 수용액을 사용함으로써 용이하게 할 수 있기 때문에, 그것의 존재가 수용성 BAC를 용해하는데 필수적일 때, 상기 수용액[그리고, 결과적으로 상기 하이드로알콜 용액 (ii)] 내에 일반적으로 상기 제 2 염기성 아미노산이 존재하게 될 것이다; 그러한 경우에서, 상기 염기화된 수용액 내의 상기 수용성 BAC 및 제 2 염기성 아미노산 사이의 무게 비율은 1:0.25 에서 1:5 사이, 바람직하게는 1: 0.5 에서 1:2 사이, 더욱 바람직하게는 1:0.8 에서 1:1.8 사이로 구성될 수 있다; 그 뒤에, 상기에서 언급됐던 것처럼, 이 수용액은 상기 하이드로알콜 용액(ii)은 얻기 위하여 하이드로알콜 매질(예를 들어, 에탄올)에 희석되고, 상기에서 언급됐던 것처럼, 하이드로알콜 용액 (ii)는 25% 에서 75% (w/v) 알콜 사이, 바람직하게는 30% 에서 60% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 50%를 함유한다.
본 발명의 방법[3]은 2가지 다른 염기성 아미노산의 이용 가능성을 고려한다. 따라서, 특정한 구체예에서, 제인 및 염기성 아미노산(제 1 염기성 아미노산)을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i)의 제조에 사용된 염기성 아미노산 및 수용성 BAC 및 (이 경우에 있어) 제 2 염기성 아미노산(제 2 염기성 아미노산)을 포함하는 하이드로알콜 용액 (ii)의 제조에 사용된 것은 동일하며 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그의 혼합물들, 바람직하게는 리신을 함유하는 그룹으로부터 선택된다.
상기 하이드로알콜 용액(ii)이 함유할 수 있는 수용성 BAC의 양은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 하이드로알콜 용액 (ii)에 함유된 수용성 BAC의 양은 0.01%에서 10% (w/v) 사이, 바람직하게는 0.05%에서 5% 사이, 더욱 바람직하게는 0.1%에서 1% 사이를 함유한다.
본 발명의 방법[3]의 단계 c)에 따르면, 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i)은 수용성 BAC와 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (ii)과 혼합된다; 따라서, 제인, 염기성 아미노산, 수용성 BAC 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산(상기에서 언급됐던 것처럼, 상기 하이드로알콜 용액 (i)이 함유된 염기성 아미노산과 동일하게 될 수 있는)으로 이루어진 혼합물이 형성된다. 단계 c)에서 형성된 혼합물 내에 존재하는 수용성 BAC : 제인 무게비율은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 단계 c)에서 형성된 상기 혼합물 내의 수용성 BAC와 제인 [수용성 BAC : 제인]의 무게비율은 1:0.2 에서 1:50 사이, 바람직하게는 1:1 에서 1:15 사이, 더 바람직하게는 1:6 에서 1:12 사이를 함유한다.
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본 발명의 방법[3]의 단계 d)에서 선택적으로, 계면활성제는 단계 c)로부터 수득된 혼합물에 추가된다. 어떤 이론에도 한정되는 것 없이, 계면활성제는 친유성 폴리머 매트릭스(제인)에 근접한 친수성 BAC를 이동시켜 코아세르베이션을 유도할 때 그것이 잘 포획되도록 하기 때문에 나노입자 내의 수용성 BAC의 캡슐화를 용이하게 하는 것으로 믿어져 왔다. 특정한 구체예에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트, 예를 들어, 지방산(예를 들어, 올레산) 및 이름 Tween® 80으로 공급된 폴리에틸옥실레이티드 소르비탄으로부터 유래된 에스테르와 같은 비이온 계면활성제이다. 단계 d)에서 형성된 혼합물에서, 적절한 경우 계면활성제 : 수용성 BAC의 적절한 무게 비율은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 계면활성제와 수용성 BAC [계면활성제 : 수용성 BAC] 간의 무게 비율은 1:10 에서 1:50 사이, 바람직하게는 1: 15 에서 1: 45 사이, 더욱 바람직하게는 1:20 에서 1:30 사이를 함유한다.
마지막으로, 본 발명의 방법[3]의 단계 e)에서 물은 본 발명의 나노입자 형성을 위해 충분한 양으로 단계 c) 또는 단계 d)에서 형성된 혼합물에 추가된다. 비록 추가된 물의 양이 넓은 범위 내에 있을 수 있지만, 특정한 구체예에서, 물은 10%에서 60% (w/v) 사이, 바람직하게는 15%에서 30% 사이, 더욱 바람직하게는 대략 25%를 함유하는 매질 내 알콜의 최종 비율을 위해 충분한 양이 추가된다.
사실상 모든 제인이 본 발명의 공정 [1], [2], [3]에서 실습용으로 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특별한 구체예에서, 상기 제인은 Sigma-Aldrich(제품 번호 Z 3625)에 의해 공급된 제인과 같이 곡물로부터의 제인이다.
비록 매우 다양한 성질의 알콜이 사용될 수 있지만, 본 발명의 특정하고 바람직한 구체예에서, 발명의 방법 [1], [2], [3]에서 사용된 하이드로알콜 용액은 에탄올이다.
사실상 모든 염기성 아미노산이 본 발명의 공정 [1], [2], [3]에서 실습용으로 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 그의 혼합물들, 바람직하게는 리신으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 나노입자들 내부 혹은 외부에 위치하게 될 수 있는 상기 염기성 아미노산은 본질적으로 다음과 같은 이유 때문에 기술적 역할을 한다 :
- 나노입자의 형성 전에 조성물의 용해를 용이하게 한다; 염기성 아미노산의 존재 하에 후자는 상기 아미노산의 부재로 인한 용해에 관해서 낮은 비율의 알콜(예를 들면, 50%)과 함께 하이드로알콜 용액에서 용해될 수 있기 때문에, 제인의 용해에 특별히 기여한다. 그리고 나아가 BACs, 특히 몇몇 수용성 BACs, 구체적으로는 산성 수용성 BACs(예를 들어, 엽산)의 용해를 용이하게 한다;
- 나노입자의 양측(안쪽 및 바깥쪽) 모두에서 상기 나노입자의 제조 이후에 적절한 pH가 유지된다; 및
- 음성이고 ± 10mV에서 멀리 떨어져 있으며, 그것의 집합을 저해하는 표면 전하를 지닌 나노입자들이 얻어지는 것을 허용한다.
그러므로, BACs를 함유하든 혹은 함유하지 않든 염기성 아미노산은 본 발명의 나노입자의 제조에서 매우 중요한 역할을 하고 있다.
본 발명의 나노입자들은 평균 입자 크기 1㎛ 미만, 일반적으로 1 에서 999nm 사이로 구성되며, 바람직하게는 10 에서 900nm, 더욱 바람직하게는 50 에서 500nm, 더욱더 바람직하게는 100 에서 450nm, 가장 바람직하게는 140 에서 400nm 크기인 것이 특징이다. 유리하게 본 발명의 나노입자들은 식품 분야에서 그들이 사용될 때 특히 적합한 관능적 특성(입 안에서의 질감)의 변화를 방지하는 목적을 위해 대략 200nm 입자 크기를 가지고 있다.
BAC를 함유하든 혹은 함유하지 않든(빈 나노입자) 본 발명의 나노입자는 온도와 산화에 대해 그들의 안정성을 증가시키기 위한 목적으로 산화방지제, 예컨데 아스코르브산(비타민 C)등을 그 제제에 혼입시킬 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기 산화방지제는 BAC(에서 적절한) 혹은 본 발명의 나노입자의 외피 내에서 공동-캡슐화(co-encapsulated)되어 소개될 수 있다; 그러한 목적을 위해서, 상기 본 발명의 방법 [1], [2] 및 [3]은 나노입자들의 제제에 산화방지제가 적절하게 함유될 수 있도록, 예를 들면, 상기 BAC 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 함유하는 수용액에 산화방지제를 추가함으로써 조정될 것이다.
특정한 구체예에서, BAC는 엽산이며 산화방지제는 아스코르브산이다. 아스코르브산은 자외복사선, pH 변화, 열, 산소 등에 의한 저하로부터 엽산을 보호하기 위한 역할, 나아가 아스코르브산 자체의 영양상 기여를 제공하는 역할을 하는 것처럼 보인다. 상기 산화방지제는 BAC 혹은 본 발명의 나노입자의 외피 내에서 공동-캡슐화되어 소개될 수 있다.
추가적으로 필요하다면, 본 발명의 방법 [2] 및 [3] 뿐만 아니라 본 발명의 방법[1]은 다른 처리법을 사용하에 얻어진 나노입자들을 안정시키기 위한 추가적인 안정화 단계를 한가지 혹은 그 이상 포함시킬 수 있다.
특정한 구체예에서, 상기 안정화 처리는 예를 들어, 100 내지 800MPa 사이, 일반적으로 350 내지 600MPa 사이를 함유하는 압력에서의 고압처리를 위해 BAC를 함유하든 혹은 함유하지 않든, 본 발명에서 형성된 나노입자를 함유하는 현탁액을 처리하는 것을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 처리는 100 내지 800MPa, 일반적으로는 350 내지 600MPa 사이의 압력에서 3에서 5분의 사이클로 나노입자의 현탁액을 처리하는 것을 포함한다; 사실, 400MPa의 압력이 좋은 결과를 제공한다.
또 다른 특정한 구체예에서, 상기 안정화 처리는 BAC를 함유하든 혹은 함유하지 않든, 본 발명에서 형성된 나노입자들을 함유하는 현탁액을 예를 들어, 130℃에서 140℃의 온도로 2에서 5초간 처리 후 빠르게 냉각하는 UHT(초고온)처리하는 것을 포함한다.
마찬가지로 필요하다면, 본 발명의 방법 [2] 및 [3] 뿐만 아니라 본 발명의 방법 [1]은 BAC를 함유하든 혹은 함유하지 않든, 본 발명의 나노입자를 얻는 목적을 위해 형성된 나노입자를 함유하는 현탁액을 분말 형태로 건조하는 건조단계를 함유할 수 있다. 상기 나노입자의 제시형식은 그들의 안정성에 기여하고, 또한 화장품 및/또는 제약 제품들 뿐만 아니라 고체식품, 예컨데 밀가루, 빵, 페이스트리 제품, 시리얼, 분유 등의 가능한 응용에 특별히 유용하다. 사실상 나노입자를 함유하는 현탁액을 건조하기 위한 모든 전통적 방식 또는 적합한 기술은 이러한 건조 단계를 수행하기 위하여 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 나노입자를 함유하는 현탁액은 흡입 또는 분무(분무 건조) 또는 동결건조로 건조될 수 있다. 이러한 처리는 나노입자들의 현탁액에 상기 나노입자를 위한 적절한 보호제를 추가함으로써 일반적으로 수행되는데, 상기 나노입자의 적합한 보호제는 예컨데, 당류 예를 들어 락토오스, 트레할로스, 마니톨, 수크로오스, 말토덱스트린, 글루코오스, 소르비톨, 말토오스 등 및 그의 혼합물들이다. 상기 보호제는 본 발명의 나노입자들을 건조공정 동안에 열적 성능저하 및 산화로부터 보호한다.
제인 : 당류 무게 비율은 넓은 범위 내에 있을 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정한 구체예에서, 제인 : 당류 무게비율은 1:1 에서 1:4, 바람직하게는 약 1:2 사이를 함유한다.
마찬가지로, 특정한 구체예에서, 당류를 함유하는 용액은 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 (비타민 C) 등을 또한 함유할 수 있다; 이 경우에 있어서, 제인:당류:보호제, 예를 들어 비타민 C의 무게 비율은 1:0.75-2.5:0.25-1.5, 바람직하게는 1:1.5:0.5가 될 수 있다.
본 발명의 방법 [1]에 따라 얻어진 본 발명의 나노입자들, 즉 본 발명의 방법 [1]에 의해 제조된 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자들은 본 발명의 추가적인 측면이다.
마찬가지로, 본 발명의 방법 [2] 및 [3] 따라 얻어진 본 발명의 수득된 나노입자들, 즉 지용성 또는 수용성 BAC를 지닌 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자들은 본 발명의 추가적인 측면이다.
응용
본 발명의 나노입자들은 BAC, 예를 들어 수용성 BAC 또는 지용성 BAC를 캡슐화할 수 있는 수용력을 갖고 있다. 그들은 또한 기술적 첨가물, 예를 들어 용해될 수 없는 매질 내에서 BAC의 균일 분산을 순조롭게 하는 첨가물 등으로서 사용될 수 있다.
특정한 구체예에서, (합성폴리머와 연관된 독성을 보호하는) 천연 폴리머가 아닌 다른 구성요소 및 식품 등급의 구성요소가 그들의 조제용 물질 및 최종산물(나노입자들)에서 사용되지 않기 때문에, 본 발명의 나노입자는 BAC의 캡슐화 및 제약, 화장품 및 식품 조성물들 내에서 혼합을 가능하게 한다. 상기 나노입자는 외부요인(빛, pH 변화, 산화 등)으로 인한 저하로부터 BAC를 보호한다.
본 발명의 나노입자는 수용성 매질에서 재현탁되어 용액에서의 저하로부터 BAC를 보호할 수 있다. 나아가, BAC의 안정화를 유지하고 오랜 기간동안 그것의 저장을 가능하게 하는 건조 파우더의 형성이 제시될 수 있다(특히 고체식품 조제용 물질에서 그것의 혼합을 위해).
추가로, 본 발명의 나노입자는 또한 국소적 사용을 위한 화장품 및 약학적 조성물의 제조를 위해 적합하다.
그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 본 발명의 하나의 나노입자 및 식품, 제약 또는 화장품에 적용가능한 담체(carrier)를 함유하는 조성물, 이하 "본 발명의 조성물",에 관한 것이다; 특정한 구체예에서, 상기 본 발명의 조성물은 본 발명의 수 많은 나노입자들을 함유한다. 특정한 구체예에서, 상기 본 발명의 나노입자는 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산을 함유하는 나노입자이다; 또 다른 특정한 구체예에서, 상기 본 발명의 나노입자는 본 발명의 나노입자들, 즉, 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산, 및 영양상, 치료상 및/또는 화장품 활성을 위한 BAC, 및 약학적으로 또는 화장용으로 적용가능한 담체 혹은 식품에 적용가능한 담체로 구성된 나노입자를 지니고 있다.
상기 본 발명의 나노입자는 평균입자크기 1㎛ 미만, 일반적으로 1 에서 999nm 사이, 바람직하게는 10 에서 900nm, 더욱 바람직하게는 50 에서 500nm, 더욱더 바람직하게는 100 에서 450nm, 가장 바람직하게는 140 에서 400nm크기이다. 유리하게 본 발명의 나노입자들은 식품 분야에서 그들이 사용될 때 특히 적합한 관능적 특성들(입 안에서의 질감)의 변화를 방지하는 목적을 위해 대략 200nm 입자 크기를 가지고 있다.
특정한 구체예에서, 상기 BAC는 아미노산, 항미생물제, 방향제, 방부제, 감미료, 스테로이드, 약물, 호르몬, 지질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 단백질, 프로테오글리칸, 조미료, 비타민 및 그의 혼합물들을 함유하는 군으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 BAC는 지용성 BAC이다. 지용성 BACs의 비제한적인 구체적 예시들은 비타민, 예를 들어 A, D, E, K 군들 및 그들의 유도체들, 인지질, 카로티노이드(카로틴, 리코펜, 루테인, 캅산틴, 제아크산틴 등), 오메가-3 지방산(예를 들어, DHA, EPA 등), 아미노산(예를 들어, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐아닌, 트립토판 및 발린), 파이토스탄올 및 피토스테롤(예를 들어, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 등), 폴리페놀(예를 들어, 퀘르세틴, 루틴, 레스베라트롤, 캠페롤, 미리세틴, 이소람네틴 등) 및 그들의 유도체들을 함유한다.
또 다른 특정한 구체예에서, 상기 BAC는 수용성 BAC, 바람직하게는 수용성 BAC 산(acid)이다. 수용성 BACs의 비제한적인 구체적 예시들은 비타민, 예를 들어 B 또는 C 군들 및 그들의 유도체들, 염 또는 에스테르; 히알루론산, 황산 콘드로이틴, 티옥산, 염 또는 그의 에스테르들 등을 함유한다. 특정한 구체예에서, 상기 수용성 BAC는 엽산, 4-아미노벤조산, 니아신, 판토텐산, 티아민 1인산, 티아민 피로인산, 티아민 3인산, 아스코르브산, 프테로일폴리글루탐산(엽산 유도체 : 엽산 폴리글루타메이트; 폴리글루타메이트 엽산), 폴린산, 니코틴산, 히알루론산, 티옥산, p-쿠마르산, 커피산, 그들의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체들, 에스테르 또는 염들 및 그의 혼합물들을 함유하는 그룹으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 국소적인 투여에 적합한 약학적 조성물이다; 그 목적을 달성하기 위하여, 상기 조성물은 그것의 국소적인 투여에 적합한 하나 또는 그 이상의 첨가제, 예로써 겔, 연고, 크림 등의 형태를 함유하는 약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 상기 약학적 조성물의 제조에 대한 것뿐만 아니라 그것의 국소적인 투여를 위해 만들어진 약학적 조성물의 제제를 위해 적합한 첨가제에 대한 정보는 책 "Tratado de Farmacia Galenica", by C. Faulii Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones에서 찾을 수 있다. 본 발명의 나노입자가 투여되기 위한 투여량은 본 발명의 나노입자의 0.1% 에서 30% 사이, 바람직하게는 0.5% 에서 5% 사이를 함유하는 본 발명의 조성물에서 넓은 범위 내에 있을 수 있으며, 예를 들면, 대략 0.5(치료면적의 g/cm2) 에서 대략 2(치료면적의 g/cm2) 사이이다.
또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 국소적 투여에 적합한 화장품 조성물이다; 그 목적을 달성하기 위하여, 상기 조성물은 그것의 국소적인 투여에 적합한 하나 또는 그 이상의 첨가제를 함유하는 화장품적으로 적용가능한 담체를 함유하며 예로써, 겔, 크림, 샴푸, 로션 등의 형태가 있다. 상기 화장품 조성물의 제조에 대한 것뿐만 아니라 그것의 국소적인 투여를 위해 만들어진 화장품 조성물의 제제에 적합한 첨가제에 대한 정보는 책 Octavio Diez Sales의 "Manual de Cosmetologia", 1판, 1998, Editorial Videocinco, S.A.에서 찾을 수 있다.
또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 식품 조성물이며, 예를 들면 고체, 액체 또는 반-고체 식품 조제용 물질이 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다음을 포함한다.
- 15 내지 45 중량%의 제인 ;
- 1 내지 4 중량%의 염기성 아미노산;
- 0.5 내지 5 중량%의 퀘르세틴 또는 레스베라트롤; 및
- 45 내지 80 중량%의 당류, 이 중 모든 비율은 조성물 전체 중량에 대한 중량이다.
또 다른 특정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 다음을 포함한다.
- 15 내지 45 중량%의 제인;
- 4 내지 10 중량%의 염기성 아미노산;
- 선택적으로, 0.05 내지 0.5 중량%의 폴리소르베이트(예를 들어, tween 80);
- 0.5 내지 5 중량%의 엽산;
- 45 내지 80 중량%의 당류, 이 중 모든 비율은 조성물 전체 중량에 대한 중량이다.
대안으로써, 본 발명의 조성물은 식품 제조에서 혼합될 수 있다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 함유하는 식품 제조에 관한 것이다. 상기 식품생산은 액체, 반-고체 또는 고체형태로 될 수 있다. 유리하게, 본 발명의 나노입자의 전체 혹은 부분적 용해를 방지하거나 혹은 최소화하고 따라서 그들의 안정성에 기여하기 위한 목적으로, 상기 식품은 산성 pH, 즉, 7 미만, 바람직하게는 6 미만 또는 6과 같은, 더욱 바람직하게는 5 미만 또는 5와 같은 pH를 갖는다. 본 발명의 조성물과 함께 풍부해지거나 강화된 식품의 구체적인 예시들은 우유 및 그것의 유도체들(요거트, 치즈, 응유 등), 주스, 잼, 빵 및 패스트리 제품, 발효 고기, 소스 등을 함유한다. 마찬가지로 본 발명의 조성물은 동물 식품, 예를 들면 사료제조에 함유될 수 있다.
실시예들
다음의 실시예들은 그 안에서 생물학적 활성 화합물 [BAC], 특히 레스베라트롤, 퀘르세틴 또는 엽산을 함유할 수 있는 리신과 같은 염기성 아미노산 및 나노제인입자의 제조를 기술한다. 상기 나노입자들은 pH, 빛, 산화 등의 변화로 인하여 음식 내에서 겪을 수 있는 저하들로부터 상기 BAC를 보호할 수 있다.
빈 제인 나노입자의 일반적인 제조방법
제인 나노입자의 일반적인 제조방법은 예를 들면 특정한 리신의 양(Sigma-Aldrich)과 함께 50% (w/v)에탄올 용액과 같은 하이드로알콜 용액에서의 상기 단백질, 제인(Sigma-Aldrich - 제품 번호 Z 3625)의 용해와, 그 뒤에 자석교반 및 일정 유속 하에서, 노르스름한 우유 현택액의 출현과 함께 나노입자의 형성을 일으키기 위한 특정한 부피의 물을 추가하는 것을 함유한다.
나노입자의 물리화학적 특성
나노입자의 물리화학적 특성을 완전히 달성하기 위해 필요한 다른 연구들은 아래에 설명되어 있다.
나노입자의 크기와 표면 전하는 물리화학적 실험에서 결정되었다. 첫번째 파라미터들(크기)은 Zetasizer Nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, 스페인)를 이용한 광자상관분광법에 의해 얻어졌다. 두번째 파리미터들(표면 전하)은 Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, 뉴욕, USA)를 이용한 제타전위 측정을 통해 결정되었다.
나노입자 형성방법의 수율은 제제를 원심분리(17,000x g, 20분)하여 얻어진 상청액에서 선별된 나노입자를 수득한 후에 남아있는 자유제인의 양을 통하여 계산되었다. 정량화하기 위해, 상청액은 75% (w/v) 농도의 알콜을 얻을 때까지 에탄올에 희석되었으며, 후자는 보정곡선의 기준이 준비된 동일한 매질이었다.
제제하는데 있어 입자를 형성하는 단백질(제인)의 양은 초반에 추가된 양과 정제단계 동안 수집된 상청액의 정량된 양의 차이로 계산되었다. 수율은 다음과 같이 계산되었다 :
Figure 112018003863913-pct00033
[식.1]
게다가, 상청액의 전체 및 제인함량의 차이에 의해 얻어진 결과를 확인하기 위하여, 원심분리 이후에 얻어진 펠릿(pellet)의 정량화 연구가 행해졌다. 이 경우에 있어서, 75% (w/v) 에탄올의 하이드로알콜 용액은 입자를 분해하기 위해 사용되었으며, 후자는 보정곡선을 준비하는 데 사용된 동일한 매질이었다. 따라서, 이 경우에 있어서 수율은 다음과 같이 계산되었다 :
Figure 112018003863913-pct00034
[식.2]
뿐만 아니라, 정량 방법의 타당성(validity)을 확인하고 매트릭스 효과가 없음을 입증하기 위하여, 원심분리하지 않는 알려진 부피의 제제가 취해졌으며, 농도 75% 에탄올을 수득할 때까지 희석되었다. 따라서, 제제 내에 존재하는 전체 제인의 양을 나타내고, 그것을 초반에 첨가된 제인의 양과 비교하는 것이 가능하게 되었고, 모든 경우에 있어서 5% 미만의 편차를 나타내었다.
다른 계산을 하기 위하여, 90 에서 1,200㎍/mL 사이의 보정곡선이 사용되었다(R2 = 0.999; LOD = 43㎍/mL; LOQ = 143㎍/mL).
모든 정량은 278nm에서 자외선 분광 광도법을 이용하여 수행되었다(Agilent 8453, 자외선 및 가시광선 분광법 시스템).
나노입자의 형태학은 주사 전자 현미경법에 의해 관찰되었다(Zeiss, DSM 940A 독일). 이를 위하여, 나노입자는 약 9nm의 금 분자 층(Emitech K550 Equipment, Sputter-Coater, 영국)에 씌워졌으며, 사진은 Zeiss DMS 940A 현미경(미국)으로 촬영됐다.
퀘르세틴 또는 레스베라트롤을 함유하는 제인 나노입자의 일반적인 제조방법
퀘르세틴 또는 레스베라트롤을 지닌 제인 나노입자의 일반적인 제조공정은 리신의 특정한 양과 함께 하이드로알콜 매질(50% 에탄올(w/v))에서의 단백질(제인)의 용해와, 그 뒤에 자석교반 하에서, 미리 준비된 상기 산화방지제(퀘르세틴 또는 레스베라트롤)의 알콜 용액을 물로 희석한 특정한 부피를 추가하는 것을 함유한다. 몇 분 동안 혼합물을 배양한 후에, 마지막 단계는 노르스름한 우유 현탁액의 출현과 함께 나노입자의 형성을 일으키기 위해 특정한 부피의 물을 추가하는 것으로 구성된다.
그 다음 필요하다면, 교반 하에서 3분의 균질화 후에 특정한 부피의 당류 용액(락토오스, 트레할로스, 마니톨, 글루코오스, 소르비톨, 말토덱스트린, 밀토오스 등)이 교반을 멈추지 않고 추가된다. 마지막으로, 현탁액은 아래의 조건들 하에서 분무건조기(Buchi Mini Spray Drier B-191, Buchi Labortechnik AG, 스위스)로 살포된다:
- 공기 흡입구 온도 : 70-110℃
- 공기 배출구 온도 : 30-90℃
- 공기압 : 2-10 bar [2x105 - 10x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 2-9 mL/min
- 흡입(흡인기) : 30-100%
- 공기 흐름 : 200-900 L/h
선택적으로, 당류를 추가한 이후에, 제제는 흡입 또는 살포(분무 건조) 대신에 동결건조에 의해 건조될 수 있다.
제인 입자와 연관된 퀘르세틴 또는 레스베라트롤의 양 결정
나노입자와 연관된 퀘르세틴 또는 레스베라트롤의 양은 여러가지 변형들이 있지만 Lacopini(Lacopini et al, J Food Comp Anal 2008; 21:589-598)에 의해 기술된 방법에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량화되었다. 분석은 다이오드-배열 자외선 검출 시스템과 연결된 크로마토그래피 모델 1100 시리즈 LC(Agilent, Waldbornn, Germany)에 의해 수행되었다.
새로운 샘플(건조 전)들의 분석을 위해, 나노입자 정제공정[Vivaspin® 300,000 MWCO 투석 튜브(VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 특정한 양의 제제를 필터링함으로써] 후에 수득된 상청액은 75% (w/v) 함량의 에탄올과 함께 하이드로알콜 용액이 얻어질 때까지 희석되었다. 펠릿은 입자를 분해하기 위하여 75% (w/v) 에탄올에 교대로 용해되며, 용액 내의 BAC(퀘르세틴 또는 레스베라트롤) 및 아미노산 뿐만 아니라 제인을 유지하여 그것의 정량화를 수행했다. BAC 함량의 합은 전체 시간에 걸쳐서 초반에 추가된 모든 양과 일치되는 두 부분들(상청액 및 펠릿)에 기반을 둔다. 뿐만 아니라, 75% 에탄올 (w/v)에서 특정한 부피의 제제를 용해함으로써 전체 BAC의 양을 정량화하는 것 또한 가능했다. 본 연구는 추가된 BAC의 양과 기술된 크로마토그래피 방식으로 정량화하여 얻어진 양 사이의 차이가 모든 경우에 있어서 10% 미만으로 확인되는 것을 보여주었다.
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추가로, 파우더 샘플(건조된 제제)의 준비를 위하여, 나노입자의 제제 대략 15mg이 사용됐으며, 에탄올 상에 재현탁되었다. Vivaspin® 300,000 MWCO 투석 튜브(VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 특정한 부피의 현탁액을 여과한 후에 얻어진 현탁액은 75% (w/v) 농도의 에탄올에 증류된 물과 함께 희석되었다. 펠릿은 특정한 부피의 75% 에탄올(w/v) 안에서 용해되었다. 뿐만 아니라, 15mg의 파우더 안에 함유된 전체 BAC도 또한 75% (w/v) 에탄올 안에서 그들을 직접 용해시킴으로써 정량화되었다.
샘플은 호환 가능한 Gemini® C18 AJ0-7596 프리칼럼(precolumn)과 함께 40℃에서 가열된 Alltech C18 Alltima™ 칼럼(5 ㎛, 150nm x 2.1mm)과 0.25 mL/min의 흐름(flow)에서 퍼올려진 이동상으로서의 변화도(Table 1 참조) 내에서 물/메탄올/빙초산의 혼합물을 이용하여 분석되었다.
검출은 퀘르세틴 360nm 및 레스베라트롤 306nm에서 수행되었다. 샘플 주입 부피는 10μL이었다. 상기 화합물들의 유지 시간은 퀘르세틴의 경우 24.2 ± 0.2 분이고 레스베라트롤의 경우 22.8 ± 0.5 분이다.
[표 1]
이동상에서의 변화도 상태
(A : 물, B :메탄올, C: 빙초산)
Figure 112018003863913-pct00035
샘플을 정량화하기 전에, 하이드로알콜 매질(75% 에탄올) 내에서 1 에서 100㎍/mL 사이의 농도에서 다른 보정선이 준비되었는데 이것은 5% 미만의 정확하고 정밀한 결과를 가져왔다.
마지막으로, 나노입자[캡슐화 효율(E.E.)]와 연관된 퀘르세틴 또는 레스베라트롤의 양은 초반에 추가된 BAC의 양과 상청액 안에서 정량화된 양의 차이로 계산되었다.
Figure 112018003863913-pct00036
엽산을 함유하는 제인 나노입자의 일반적인 제조방법
엽산을 지닌 제인 나노입자의 일반적인 제조방법은 특정한 리신의 양과 함께 하이드로알콜 매질(50% (w/v) 에탄올)에서의 단백질(제인)의 용해와, 그 뒤에 자석교반 하에서 미리 준비된 상기 비타민 수용액에 대한 정해진 부피의 알콜 희석을 추가하는 것을 함유한다. 몇 분 동안 혼합물을 배양한 후에, 마지막 단계는 노르스름한 우유 현탁액의 출현과 함께 나노입자의 형성을 일으키기 위해 특정한 부피의 물을 추가하는 것을 함유한다.
그 다음, 필요하다면, 교반 하에서 3분의 균질화 후에 특정한 부피의 당류(락토오스, 트레할로스, 마니톨, 글루코오스, 소르비톨, 말토덱스트린, 말토오스 등)용액이 교반을 멈추지 않고 추가된다. 마지막으로, 현탁액은 아래의 조건들 하에서 분무건조기(Buchi Mini Spray Drier B-191, Buchi Labortechnik AG, Switzerland)로 살포된다:
- 공기 흡입구 온도 : 70-130℃
- 공기 배출구 온도 : 30-90℃
- 공기압 : 2-10 bar [2x105 - 10x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 2-9 mL/min
- 흡입(흡인기) : 30-100%
- 공기 흐름 : 200-900 L/h
선택적으로, 당류를 추가한 이후에, 제제는 흡입 또는 살포(분무 건조) 대신에 동결건조에 의해 건조될 수 있다.
제인 입자와 연관된 엽산의 양 결정
나노입자와 연관된 엽산의 양은 Faye[Faye Russell, L., Quantitative Determination of Water-Soluble Vitamins. In Food Analysis By HPLC, Nollet, L.M.L (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, Second Edition, Chapter 10(2000) pp.444-445]에 의해 기술된 방법에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량화되었다. 분석은 다이오드-배열 자외선 검출 시스템과 연결된 크로마토그래피 모델 1100 시리즈 LC(Agilent, Waldbornn, Germany)에 의해 수행되었다. 데이터는 Chem-Station G2171 소프트웨어를 이용한 Hewlett-Packard 컴퓨터로 분석되었다. 엽산의 분리를 위하여, 호환가능한 Gemini® C18 AJ0-7596 프리칼럼과 함께 40℃에서 가열된 Alltech C18 Alltima™ 칼럼(5㎛, 150nm x 2.1mm)이 사용되었다. 이동상은 변화도(표 2) 내에서 H3PO4(33 mM, pH 2.3)/아세토니트릴의 혼합물에 의해 형성되며 0.25 mL/min의 흐름에서 퍼올려졌다. 검출은 290nm에서 수행되었다. 샘플 주입부피는 10μL이었다. 엽산의 유지 시간은 22.6 ± 0.5분이다.
[표 2]
이동상에서의 변화도 상태(A : H3PO4 33 mM, B : 아세트니트릴)
Figure 112018003863913-pct00037
샘플을 정량화 하기 전에, 2에서 400㎍/mL 사이의 농도에서 다른 보정선이 준비되었는데, 이것은 용액 내의 제인 및/또는 아미노산의 존재가 엽산의 정확한 정량화를 간섭하지 않는다는 사실을 확인함과 함께 95% 이상의 정확하고 정밀한 결과를 가져왔다.
새로운 샘플(건조 전)들의 분석을 위해, Vivaspin® 300,000 MWCO 투석 튜브(VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 특정한 양의 제제를 필터링한 후에 얻어진 상청액이 정량화되었다. 펠릿은 입자를 분해하기 위하여 0.05M NaOH에 교대로 용해되며, 용액 내의 엽산과 아미노산 뿐만 아니라 제인을 유지하여 그것의 정량화를 수행하였다. 엽산함량의 합은 전체 시간에 걸쳐서 초반에 추가된 모든 양과 일치되는 두 부분들(상청액 및 펠릿)에 기반을 둔다. 뿐만 아니라, 0.05M NaOH 1mL에서 1mL 제제를 용해함으로써 엽산의 전체 양을 정량화하는 것 또한 가능했다. 본 연구는 추가된 엽산의 양과 기술된 크로마토그래피 방식으로 정량화하여 얻어진 양 사이의 차이가 모든 경우에 있어서 10% 미만으로 확인되는 것을 보여주었다.
추가로, 파우더 샘플을 정량화하기 위하여, 15mg의 나노입자가 사용되었고, 이것은 2mL 물에 재현탁되어 원심분리된 후 새로운 샘플과 같은 방식으로 진행되었다.
약물동력학 연구. 제인 나노입자에서 캡슐화된 엽산의 생물학적 이용 가능성
약물동력학 연구는 실험동물에 관한 유럽 법률(86/609/EU) 뿐만 아니라 윤리 위원회 기관의 법률에 따라 수행되었다. 그 목적을 달성하기 위하여, 평균 몸무게 200g인 수컷 위스타 쥐 20마리는 명-암(12시간-12시간)의 일반적인 상태 하에 있었으며, 연구 전 일주일동안 쥐들은 엽산이 부족한 먹이(Folic Acid Deficient Diet. TD. 95247. Harlan, USA) 및 물을 공급받았다. 제제의 투입 12시간 전에, 쥐들은 음식으로의 접근은 없지만 마실 물로의 접근은 자유로운 대사사육상자(metabolic cage)에 고립되었다.
동물들은 4개의 처리 그룹으로 나뉘어졌다(그룹당 쥐 5마리). 오직 1mL의 PBS(인산 완충액, pH 7.4)이 첫번째 그룹에 경구투여되었다. 뒤이어 두번째 그룹은 제인 나노입자에 함유되어 있거나 물에 용해되어 자유형성된(캡슐화되지 않은) 엽산 (Aditio, Panreac Quimica, Barcelona, Spain) 1mg/kg(200㎍/rat)이 단일 경구 투여 처리되었다. 물에서 분산된 다른 제제 각 1mL는 위식도 캐뉼라를 통해 투여되었다. 마지막으로, 인산 완충액(PBS) (0.5mL)에서 용해된 자유 엽산(1mg/kg)의 동일한 투여량은 복재정맥으로 네번째 그룹에 정맥주사로 투여되었다. 제제를 투여하기 전에, 혈액은 각 쥐의 비타민 기준치를 체크하기 위해 꼬리 복재정맥에서 채혈되었다. 투여 후에, 대략 500μL의 혈액부피가 혈청분리튜브(SARSTEDT Microtube 1.1mL Z-Gel)를 이용하여 각 시간마다 채혈되었다. 모든 경우에 있어서, 쥐의 통증을 방지하기 위하여, 채혈은 항상 쥐의 바이탈 사인을 체크하면서 흡입마취(이소푸루란 : 산소)한 후에 수행되었다.
혈액부피는 동물의 체온까지 미리 데워진 생리식염수 500μL을 복강내로 나중에 투입함으로써 대체되었다. 이 기간동안, 동물들의 상태(이동성, 공격성, 알레르기 반응 및 체온)가 검사되었으며, 중요한 변화는 관찰되지 않았다.
혈청 샘플 중 엽산의 사전처리 및 정량화
혈액을 튜브에 원심분리(6,000 rpm, 20분, 20℃)한 후에 얻어지는 혈청 샘플 중 엽산의 정량화는 효소면역검정 기기를 이용하여 수행되었다. 그 목적을 달성하기 위하여, 음식 내의 엽산의 정량화 측정을 위해 FDA의 승인을 받은 Elisa 키트(Diagnostic automation, INC. Calabasas, California USA)가 사용되었다. 혈청샘플은 사전처리 없이 정량화 되었으며, 제조사의 설명서에 따랐다.
키트는 음식에 사용되도록 설계되었다는 사실을 고려하여, 일련의 사전 연구들은 혈청샘플 내의 비타민을 정량화하는 능력을 확인하는 목적으로 진행되었다. 상기 연구들은 키트에 의해 얻어진 결과들과 이전 부분에서 기술된 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 얻어진 결과들 사이의 완벽한 비교로 만들어졌으며, 다음 사전준비 방법에 따랐다: 1% (w/v) 아스코르브산나트륨에 준비된 나트륨 테트라보레이트 용액 50mM에 용해된 가변적인 양(0-300μL)의 엽산이 혈청 50μL에 추가되었다. 상기 결과로 초래된 용액은 나트륨 테트라보레이트 용액 50mM와 함께 최종 부피 350μL(1:7 혈청 희석)이 취해졌다. 각각의 혼합물은 30분 동안 끓여졌으며, 그 다음에 2℃까지 냉각되고 상기 온도에서 하룻밤 동안 보존되었다.
상기 결과로 초래된 샘플을 20,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고 20㎛ 필터를 통해 여과한 후에, 엽산 함량은 상기에서 기술한 방법을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정량화되었다. 이런 경우에 있어서, 비타민의 낮은 혈청 농도 때문에, 표준 추가 기술은 정량화의 에러를 최소화하고 매트릭스의 간섭을 제거하기 위해 사용되었다. HPLC에 의한 이러한 추출 및 정량화 방법은 FDA에 의해 설립된 기준에 따라 인증되었다.
모든 연구된 경우에 있어서, 두 방법들에 의해 만들어진 혈청 엽산 농도의 차이는 10% 미만이다. 그러므로 효소 면역측정 기술은 샘플을 분석하는데 더 작은 양의 혈청이 필요하며 더 간단하고 빠른 기술이고 크로마토그래피 기술보다 검출의 제한이 훨씬 더 적기(2ng/mL) 때문에 모든 샘플을 정량화할 때 선택되었다.
실시예 1
빈 제인 나노입자의 조제 및 특성. 수득된 방법의 수율. 나노입자의 물리화학적 특성에 기반한 제제에 함유된 리신의 양의 영향
리신 10mg(Sigma-Aldrich)와 함께 제인 60mg(Sigma-Aldrich)는 50%(w/v) 에탄올 용액 8.8mL에 용해되었다. 그 다음에, 물 8.8mL가 나노입자를 형성하기 위해 자석교반 및 일정 유속 하에서 이 용액에 추가되었다. 이 방법은 3번 수행되었다.
도 1(A 및 B)은 이 방법으로 얻어진 제인 입자의 투과전자현미경 이미지를 나타낸다.
나노입자의 물리화학적 특성에 초기 하이드로알콜 용액의 리신과 에탄올 비율의 영향을 알기 위한 목적으로, 3가지 새로운 제제는 이들 파라미터들을 변화시켜 준비되었다 : (i) 리신이 없는 것들 중 하나, (ii) 50% (w/v) 대신 75% (w/w) 에탄올에 준비된 리신과 초기 하이드로알콜 용액을 가진 또 하나 및 (iii) 또한 리신 없이 75% (w/v)에탄올에 준비된 세번째.
표 3은 결과로 초래된 나노입자의 주요 물리화학적 파라미터를 요약한다.
[표 3]
다른 양들의 리신 존재 및 제인이 나노입자의 형성 전에 용해된 에탄올 백분율 하에서 제인 나노입자(평균 ± SD, n=6)의 물리화학적 특성
Figure 112018003863913-pct00038
(*) 부분적 용해
aPDI : 다중 분산
b수율 : 나노입자로 변형된 제인의 비율 [식.1]
행해진 통계적 연구(독립된 샘플의 비모수 검정법 : Kruskal-Wallis)는 리신의 존재가 그것의 표면전하 증가로 이어진다는 것을 확인하기 위한 통계학적으로 충분한 증거의 존재임을 드러낸다. 에탄올(75% (w/v))의 큰 초반량으로 준비된 제제는 초기 50% (w/v) 에탄올 용액으로부터 얻어진 것들에 관하여 더 큰 크기와 수율을 보여주며, 그것의 표면전하에 있어서는 중요한 차이점이 없다.
리신을 함유하지 않은 샘플에서 만들어진 표면전하는 0에 매우 가까우며, 이것은 상기 입자가 응집하는 경향이 더 크다는 것을 의미한다. 하지만, 리신의 존재 하에서, 표면전하는 상기 현상을 방지하는데 충분하다.
따라서, BAC의 캡슐화를 위하여 이것은 나노입자의 응집을 방지하기 때문에, 50% (w/v) 에탄올 및 리신의 존재 하에 있는 하이드로알콜 용액으로부터 얻어진 제제가 선택되며, 그것은 지용성 및 수용성 BACs 모두를 캡슐화하기 위해 다용도로 쓰이게 되고, 나아가 시약이 충분히 절약되었다.
실시예 2
레스베라트롤을 함유하는 제인 나노입자의 조제 및 특성. 캡슐화 효율성에 대한 리신 및 레스베라트롤 함량의 영향
다른 하이드로알콜 용액이 준비되며, 이들 모두는 50% 에탄올 최종 부피 8.8mL에 제인 60mg 및 가변적인 리신의 양(0,5,10 또는 20mg)을 모두 함유했다.
추가로, 레스베라트롤 47mg은 에탄올 15mL에 용해되며 그 다음 물 24mL와 함께 희석되었다.
레스베라트롤 용액의 가변적인 부피(1,2 또는 3mL)는 준비된 다른 제인 용액 상에 나중에 추가되었다. 5분 배양 후에, 물 8.8mL가 자석 교반 및 일정 유속 하에서 혼합물에 추가되었다. 이 방법은 각 제제 타입에 3번씩 수행되었다.
표 4는 각각의 경우에서 얻어진 나노입자의 물리화학적 특성을 보여준다.
[표 4]
캡슐화된 레스베라트롤과 가변적인 리신의 양(평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자(50% 에탄올 (w/v)에 초반 용해됨)의 물리화학적 특성. 레스베라트롤 및 제인의 무게비율은 1:16.
Figure 112018003863913-pct00039
R : 레스베라트롤; NP : 나노입자
얻어진 결과는 리신의 존재가 캡슐화 효율성에 충분한 영향을 미치지 못한다는 것을 보여준다. 따라서, 상기 아미노산이 입자의 표면전하를 변화시키고 그들의 응집가능성을 감소시키며 나아가 그것은 입자형성의 수율을 증가시킨다는 것을 고려하여, 그 안에 함유된 아미노산을 함유하는 제제는 연구를 계속하기 위해 선택되었다.
표 5는 리신의 양이 일정할 때, 레스베라트롤 함량에 변화를 줌으로써 얻어진 나노입자의 물리화학적 특성을 보여준다.
[표 5]
가변적인 양의 레스베라트롤(평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자(50% 에탄올 (w/v)에 초반 용해됨)의 물리화학적 특성. 리신 및 제인의 무게비율은 1:6.
Figure 112018003863913-pct00040
R : 레스베라트롤; NP : 나노입자
얻어진 결과들은 제제에 추가된 레스베라트롤의 양이 증가함에 따라 캡슐화 효율이 감소했지만, 입자 안에서 캡슐화된 생리활성물질의 양은 증가했다는 것을 드러낸다.
실시예 3
흡입(분무 건조)에 의해 건조된 레스베라트롤을 함유하는 제인 나노입자의 조제용 물질 및 특성
제인 126mg은 50% (w/v) 에탄올 14mL에 리신 21mg과 함께 용해되었다.
추가로, 레스베라트롤 60mg은 에탄올 10mL에 용해되며, 그 용액 중 1.4mL는 나중에 수집되어 최종 부피 2.8mL에 물과 함께 취해졌다.
희석된 레스베라트롤 용액 1.1mL는 그 다음 제인 용액에 추가되며 그 혼합물은 5분 동안 배양을 위해 남겨진다. 5분 후에, 물 15mL가 자석교반 및 일정 유속 하에서 혼합물에 추가되었다.
마침내, 말토덱스트린 260mg은 분무건조에 의하여 건조되기 전에 혼합물에 추가되었다. 상기 방법의 조건은 다음과 같다 :
- 공기 흡입구 온도 : 110℃
- 공기 배출구 온도 : 70℃
- 공기압 : 6 bar [6x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 4.5 mL/min
- 흡입(흡인기) : 94%
- 공기 흐름 : 700 L/h
표 6은 결과로써 얻어진 제제의 물리화학적 특성에 대한 요약이다.
[표 6]
상기 방법의 보조제로써 말토덱스트린을 사용하는 분무 건조 기술에 의해 건조된, 리신과 레스베라트롤(R) (평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성. 리신 및 제인의 무게비율은 1:6. 당류(말토덱스트린) 및 제인의 무게비율은 2:1.
Figure 112018003863913-pct00041
캡슐화된 mg당 나노입자의 양과 캡슐화 효율은 분무 건조에 의해 변화되지 않는다.
도 2는 레스베라트롤을 함유하는 제인 입자의 전자주사현미경에 의해 얻어진 이미지를 나타낸다.
추가로, 동일한 실험들은 분무건조를 통해 그들이 처리되기 전에 나노입자의 형성 이후에 고압기술(5분의 사이클 동안 150MPa 및 5분의 사이클 동안 400MPa)을 응용하여 실행되었다. 결과로서 얻어진 캡슐화는 상기 처리 없이 얻어진 결과들과 비슷했다.
실시예 4
퀘르세틴을 함유하는 제인 나노입자의 조제 및 특성. 캡슐화 효율성에 대한 리신 및 퀘르세틴 함량의 영향
다른 용액들이 준비되며, 이들 모두는 50% 에탄올 최종 부피 8.8mL에서 제인 60mg 및 리신 10mg을 함유했다.
추가로, 퀘르세틴 150mg는 에탄올 50mL에 용해되고 이전 용액 31mL를 취함으로써 나중에 희석되며 물과 함께 최종 부피 50mL가 취해졌다.
가변적인 부피의 퀘르세틴 용액(0.5-3 mL)은 준비된 다른 제인 용액에 나중에 추가되었다. 5분 배양 후에, 물 8.8mL가 자석교반 및 일정 유속 하에서 혼합물에 가해졌다. 이 방법은 각 타입의 제제에 3번씩 수행된다.
도 3은 이 방법에 의해 얻어진 캡슐화된 퀘르세틴과 제인 입자의 투과전자현미경에 의해 얻어진 이미지이다. 표 7은 각 경우에서 얻어진 물리화학적 특성들을 보여준다.
[표 7]
리신 및 가변적인 양의 퀘르세틴(Q) (평균 ± SD, n=6)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성. 리신 및 제인의 무게비율은 1:5.5.
Figure 112018003863913-pct00042
NP : 나노입자
행해진 통계적 연구들(독립된 샘플의 비모수 검정법 : Kruskal-Wallis)은 다른 제제들의 물리화학적 특성들에 차이점이 있다는 것을 고려하기 위한 통계학적으로 충분한 근거의 존재를 나타낸다. 얻어진 결과의 관점에서, 제제가 추가된 퀘르세틴의 양이 증가함에 따라 캡슐화 효율은 감소하며 캡슐화된 BAC(퀘르세틴)의 양은 잠재적으로 증가한다는 것이 고려될 수 있으며(도 4), 다음 수학적 수식을 감안한다 :
y = 369.92 · x -0.7526 ; R2 = 0.9955 [식. 3]
식 중
y : 캡슐화된 퀘르세틴의 양(㎍ Q/mg NP)에 대응되고,
x : 퀘르세틴 및 제인의 초기 비율(mg 제인/mg 퀘르세틴)에 대응됨.
크기와 퍼텐셜에 대하여, 분석된 다른 샘플들 사이에서 통계학적으로 중요한 차이점은 발견되지 않았다.
추가로, 나노입자의 물리화학적 특성에 대한 제형 내의 더 크거나 혹은 더 작은 리신의 존재에 대한 영향을 알고자 하는 시도가 행해져 왔다. 그러므로 초기 퀘르세틴의 양을 유지하고 이번 경우에서 추가된 리신의 양을 변화시키면서 동일한 연구가 수행됐다.
따라서, 가변적인 양의 리신(0 - 20 mg)을 함유하는 다른 제인 용액이 준비되었다. 제제에 추가되어 상기에 기술된 퀘르세틴 용액의 양은 모든 경우에서 3mL가 되며, 퀘르세틴 : 제인 무게비율은 1:11이었다.
표 8은 각각의 경우에서 얻어진 물리화학적 특성에 따른 결과를 보여준다.
[표 8]
퀘르세틴과 가변적인 리신의 양(평균 ± SD, n=6)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성. 퀘르세틴과 제인의 무게비율은 1:11.
Figure 112018003863913-pct00043
퀘르세틴의 경우에, 10mg보다 훨씬 더 많은 양이 초기 제인 용액에 추가됐을때, 캡슐화 효율은 더 작은 양의 리신을 함유하는 제형에 대해 대략 20% 감소된다는 것을 얻어진 결과에서 볼 수 있는데, 이것은 아마도 상기 아미노산의 양이 활성성분들의 부분적 산화를 유도한다는 사실 때문이다. 하지만, 리신이 함유되지 않은 샘플의 캡슐화 효율 및 제형 내에서 약 5mg의 후자가 함유된 캡슐화 효율 사이에서 통계학적으로 중요한 차이점은 발견되지 않았다. 그러므로 이것은 건조 연구가 계속하기로 선택된 제제였다.
실시예 5
분무 건조에 의해 건조된 퀘르세틴을 함유하는 제인 나노입자의 조제 및 특성
리신 51mg과 함께 제인 602mg이 50% (w/v) 에탄올 80mL가 용해되었다.
추가로, 퀘르세틴 250mg은 에탄올 50mL에 용해되며, 용액 20mL는 나중에 수집되고 물과 함께 최종 부피 32mL가 취해졌다.
희석된 퀘르세틴 용액 20mL는 그 다음 제인 용액에 추가되며 혼합물은 5분 동안 배양을 위해 남겨졌다. 5분 후에, 물 80mL가 자석교반 및 일정 유속 하에서 혼합물에 첨가되었다.
마침내, 마니톨 1,209mg이 분무건조를 사용하여 건조되기 전에 혼합물에 추가되었다. 상기 방법의 상태는 다음과 같다 :
- 공기 흡입구 온도 : 90℃
- 공기 배출구 온도 : 45℃
- 공기압 : 6 bar [6x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 4.5 mL/min
- 흡인 : 100%
- 공기 흐름 : 600 L/h
표 9는 결과로 얻어진 제제의 물리화학적 특성들을 요약한 것이다.
[표 9]
상기 방법의 보조제로써 마니톨을 사용하여 분무-건조 기술에 의해 건조된 리신 및 퀘르세틴(Q) (평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성들. 리신 및 제인의 무게 비율은 1:11. 당류(마니톨) 및 단백질의 무게 비율은 2:1.
Figure 112018003863913-pct00044
나노입자의 mg 당 캡슐화된 양과 캡슐화 효율은 분무 건조에 의해 변화되지 않는다.
도 5는 퀘르세틴을 함유한 제인 나노입자의 전자주사현미경 이미지를 보여준다.
또한, 말토덱스트린은 나노입자를 코팅하고 그들 외부에 남아있는 퀘르세틴의 일부를 캡슐화함으로써 작용하기 때문에 더 큰 캡슐화효율을 얻기 위해 보조제로서 마니톨 대신 말토덱스트린을 이용하여 동일한 연구가 수행되었다.
추가로, 동일한 실험들은 분무 건조를 통해 그들이 처리되기 전에 입자의 형성 이후에 고압기술(5분의 사이클 동안 150MPa, 5분의 사이클 동안 400MPa 및 5분의 사이클 동안 800MPa)을 응용하여 수행되었다. 결과로써 얻어진 캡슐화는 상기 처리 없이 얻어진 결과들과 비슷하다.
실시예 6
엽산을 함유하는 제인 나노입자의 조제 및 특성
리신 18mg과 함께 제인 121mg이 50% (w/v) 에탄올 14mL에 용해되었다.
추가로, 리신 402mg과 함께 엽산 303mg이 물 50mL에 용해되고 그 이후에 에탄올에 절반이 희석되었다.
희석된 엽산용액 5mL는 제인용액에 추가되고 혼합물은 5분동안 배양을 위해 남겨졌다. 5분 후에, Tween® 80(폴리소르베이트) 0.6mL가 혼합물에 추가되며, 혼합물은 또다시 5분 동안 배양을 위해 남겨졌다. 물 15mL가 나노입자의 형성을 위해 그 다음에 자석교반 및 일정 유속 하에서 추가되었다.
마지막으로, 락토오스 253mg이 분무 건조를 사용하여 건조되기 전에 혼합물에 추가되었다. 상기 방법의 상태는 다음과 같다 :
- 공기 흡입구 온도 : 125℃
- 공기 배출구 온도 : 90℃
- 공기압 : 6 bar [6x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 4.5 mL/min
- 흡입 : 90%
- 공기 흐름 : 750 L/h
표 10은 결과로 얻어진 제제의 물리화학적 특성을 요약한 것이다.
[표 10]
상기 방법의 보조제로써 락토오스를 사용하여 분무-건조 기술로 건조된 리신 및 엽산(FA) (평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성. 리신 및 제인의 최종 무게비율은 1:3. 당류(락토오스) 및 제인의 무게 비율은 2:1.
Figure 112018003863913-pct00045
FA : 엽산 ; NP : 나노입자
추가로, 엽산을 함유하는 제인 나노입자의 새로운 제형이 준비되며, 이 경우에 계면활성제를 추가하는 단계를 생략했다. 그 목적을 달성하기 위하여, 리신 200mg과 함께 제인 1,270mg이 50% (w/v) 에탄올 140mL에 용해되었다. 뿐만 아니라, 물 25mL에 엽산 121mg과 리신 200mg이 함유된 또 다른 용액이 준비되는데 이것은 나중에 에탄올에 절반 희석되었다.
그 다음에, 희석된 엽산 용액 43mL이 제인 용액에 추가되는데 이 혼합물은 5분 동안 배양을 위해 남겨졌다. 5분 후에, 물 150mL가 나노입자를 얻기 위해 자석교반 및 일정 유속 하에서 추가되었다.
삭제
마지막으로, 마니톨 2,415mg이 분무 건조 기술에 의해 건조되기 전에 혼합물에 추가되었다. 상기 방법의 상태는 다음과 같다 :
- 공기 흡입구 온도 : 120℃
- 공기 배출구 온도 : 80℃
- 공기압 6 bar [6x105 Pa]
- 샘플 펌프 속도 : 4.5 mL/min
- 흡입 : 90%
- 공기 흐름 : 750 L/h
표 11은 결과로 얻어진 제제의 물리화학적 특성들을 요약한 것이다.
[표 11]
상기 방법의 보조제로써 마니톨을 사용하여 분무-건조 기술에 의해 건조된 리신 및 엽산(FA) (평균 ± SD, n=3)과 제인 나노입자들의 물리화학적 특성. 리신 및 제인의 최종 무게비율은 1:3.5. 당류(마니톨) 및 제인의 무게 비율은 2:1.
Figure 112018003863913-pct00046
FA : 엽산; NP : 나노입자
결과로 얻어진 나노입자들은 쉽게 재현탁되며 계면활성제가 사용될 때 얻어진 것보다 더 적은 크기가 되었다.
실시예 7
제인 나노입자에서 캡슐화된 엽산의 약물동력학 연구
표 12는 약물동력학 연구에서 실험된 나노입자의 주요 물리화학적 특성들을 요약한 것이다. 상기 나노입자는 실시예 6의 두번째 부분에서 기술된 방법에서 얻어졌다(계면활성제 제외).
[표 12]
약물동력학 연구에서 사용된 엽산 (평균 ± SD, n=6)과 제인 나노입자의 물리화학적 특성
Figure 112018003863913-pct00047
FA : 엽산; NP : 나노입자
약물동력학 연구는 세가지 단계로 나눠진다. 첫번째는 인산 완충액에 용해된 엽산 1mg/kg을 정맥 투여하는 것을 함유한다; 두번째는 5마리의 수컷 위스타 쥐 중 한 그룹에게 인산 완충액(PBS) 1mL를 경구투여하는 것으로 구성된다(시간에 따른 비타민의 기준선이 이 그룹의 쥐들에게서 연구된다). 마지막으로, 세번째는 5마리 동물로 형성된 쥐 그룹에게 (i) 물에 용해된 엽산, (ii) 제인 나노입자에 캡슐화된 엽산 1mg/kg을 경구투여하는 것으로 구성된다.
투여 후에, 대략 500μL의 혈액부피가 다른 시간(0, 1, 2, 3, 8 및 24 시간)마다 채혈되어 혈청-분리 튜브에 수집되며, 이것은 나중에 복강내 루트를 통해 동일한 부피의 식염수로 동물의 혈액 부피를 보충했다. 엽산의 투여 후에 얻어진 데이터의 약물동력학 분석은 약물동력학 적합 프로그램 WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, United States)의 비구획 적합 방법을 사용하여 수행되었다.
얻어진 결과들(기준치 값을 뺀 후)은 도 6에 보여진다. 상기에서 관찰된 것처럼, 엽산의 정맥내 투여(도 6A)는 첫번째 샘플에서 약물의 혈청농도가 정점에 달하는 것을 보여주며, 잇달아 혈청 수치가 급격히 감소하는 것을 볼 수 있다. 충분히 낮은 농도가 더 많은 시간에서 나타나고 더 점진적인 양상으로 줄어들기 때문에, 비타민이 경구투여될 때(도 6B) 얻어진 개요가 달라진다. 하지만, 자유형태(캡슐화 없이) 혹은 제인 나노입자에서 캡슐화된 형태로 엽산의 경구투여 후에 발견된 비타민 수치를 비교했을 때, 시간이 흐르면서 비슷한 농도 개요가 발견되었지만 최대값과 곡선(curve) 하의 면적들 모두 비타민이 캡슐화된 형태로 투여될 때 더 커졌다.
표 13은 현재 연구의 실험적 데이타의 비구획적 분석을 수행한 후에 얻어진 약물동력학 파라미터들의 값을 보여준다.
[표 13]
실험된 다른 제제들의 약물동력학 파라미터들 (평균 ± SD, n=5)
Figure 112018003863913-pct00048
* p<0.05 vs. 비캡슐화 엽산. 만-휘트니 U검증.
** p< 0.01 vs. 비캡슐화 엽산. 만-휘트니 U검증.
AUC : 혈청농도곡선 아래 면적
Cmax : 농도 최대값
Tmax : Cmax가 도달한 시간
MRT : 평균 체류시간
FR : 상대적 생물학적 이용가능성의 백분율
FA : 엽산
NP : 나노입자
IV : 정맥 루트
상기에서 관찰된 것처럼, AUC 값은 투여된 샘플의 유형에 따라 상당한 차이를 보인다. 제인 나노입자에서 비타민이 캡슐화됐을 때, AUC 값은 자유 엽산을 투여한 이후에 발견된 것보다 상당히 더 크며, 나아가, 그들은 투여 후 24시간까지 유지된다. 또한, 혈장 내 엽산의 평균 체류시간(MRT) 또한 자유 비타민이 투여됐을 때 얻어진 것보다 상당히 더 컸다.
이러한 결과에 따라, 캡슐화된 엽산과 함께 제인 나노입자의 경구적 생체이용률이 계산되며, 이것은 자유 엽산의 경구투여 이후에 얻어진 값보다 70% 에서 95% 더 컸다.

Claims (26)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 다음을 포함하는 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산 및 지용성 생물학적 활성 화합물을 함유하는 나노입자의 제조방법 :
    a) 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i) 준비;
    b) 지용성 생물학적 활성 화합물을 포함하는 알콜 용액을 준비하고, 그것을 지용성 생물학적 활성 화합물을 포함하는 하이드로알콜 용액 (ii)를 얻기 위해 물로 희석;
    c) 지용성 생물학적 활성 화합물을 포함하는 상기 하이드로알콜 용액 (ii)과, 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)를 혼합; 및
    d) 단계 c)로부터 얻어진 혼합물에 물을 추가.
  10. 다음을 포함하는 제인 매트릭스 및 염기성 아미노산 및 수용성 생물학적 활성 화합물을 포함하는 나노입자의 제조방법 :
    a) 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 하이드로알콜 용액 (i) 준비;
    b) 수용성 생물학적 활성 화합물 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 포함하는 수용액을 준비하고, 그것을 수용성 생물학적 활성 화합물 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 포함하는 하이드로알콜 용액 (ii)을 얻기 위해 알콜로 희석;
    c) 수용성 생물학적 활성 화합물 및 선택적으로 제 2 염기성 아미노산을 포함하는 상기 하이드로알콜 용액 (ii)과, 제인 및 염기성 아미노산을 함유하는 상기 하이드로알콜 용액 (i)을 혼합;
    d) 단계 c)로부터 얻어진 혼합물에 계면활성제를 선택적으로 추가; 및
    e) 단계 c) 또는 단계 d)로부터 얻어진 혼합물에 물을 추가.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 하이드로알콜 용액은 에탄올의 수용액인 방법.
  12. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    추가로 다음을 포함하는 방법 :
    형성된 제인 나노입자를 함유하는 현탁액을 100 내지 800MPa의 압력에서 적어도 하나의 유체정압 사이클에 둠.
  13. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    추가로 다음을 포함하는 방법 :
    형성된 나노입자를 함유하는 현탁액을 건조시키되, 상기 건조는 선택적으로 보호제 및/또는 산화방지제 존재 하에서 수행됨.
  14. 제 9항에 따른 방법에 의해 얻어진 나노입자.
  15. 제 10항에 따른 방법에 의해 얻어진 나노입자.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 따른 적어도 하나의 나노입자, 및 식품, 제약 또는 화장품에서 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    나노입자의 평균 크기는 100 내지 450nm인 조성물.
  18. 제 16항에 있어서,
    나노입자의 평균 크기는 약 200nm인 조성물.
  19. 제 16항에 있어서,
    다음을 포함하는 조성물:
    - 15 내지 45% 중량%의 제인;
    - 1 내지 4% 중량%의 염기성 아미노산;
    - 0.5 내지 5% 중량%의 퀘르세틴 또는 레스베라트롤; 및
    - 45% 내지 80% 중량%의 당류,
    이 중 모든 비율은 조성물 전체 중량에 대한 중량임.
  20. 제 16항에 있어서,
    다음을 포함하는 조성물:
    - 15 내지 45% 중량%의 제인;
    - 4 내지 10% 중량%의 염기성 아미노산;
    - 선택적으로, 0.05 내지 0.5% 중량%의 폴리소르베이트;
    - 0.5 내지 5% 중량%의 엽산; 및
    - 45 내지 80% 중량%의 당류,
    이 중 모든 비율은 조성물 전체 중량에 대한 중량임.
  21. 제 16항에 따른 조성물을 포함하는 식품.
  22. 제 9항에 있어서,
    상기 지용성 생물학적 활성 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법 :
    a) 폴리페놀;
    b) 비타민 A, D, E 또는 K군의 비타민;
    c) b)에 따른 비타민의 전구체 또는 유도체;
    d) 인지질;
    e) 카로티노이드;
    f) 지방산;
    g) 피토스타놀(phytostanol) 또는 피토스테롤(phytosterol);
    h) 임의의 상기 화합물들 a)-g)의 염 또는 에스테르; 및
    i) 그것의 혼합물들.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 지용성 생물학적 활성 화합물은 플라보놀, 안토시아닌, 피토알렉신, 하이드록시타이로솔, 레티노산, 레티날, 레티놀, 칼시페롤, 알파-토코페롤, 토코트리에놀, 피토메나디온, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 리코펜, 캅산틴, 루테인, 제아크산틴, 크산토필, EPA, DHA, 리톨레산, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 그들의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체들, 에스테르 또는 염 및 그들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 지용성 생물학적 활성 화합물은 퀘르세틴, 레스베라트롤, 그들의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 유도체들, 에스테르 또는 염 및 그의 혼합물들로부터 선택되는 방법.
  25. 제 10항에 있어서,
    상기 수용성 생물학적 활성 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 :
    a) 비타민 B 또는 C군의 비타민;
    b) a)에 따른 비타민의 유도체;
    c) 히알루론산, 황산 콘드로이틴 및 티옥산으로부터 선택된 화합물;
    d) 임의의 상기 화합물 a)-c)의 염 또는 에스테르; 및
    e) 그것의 혼합물들.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 수용성 생물학적 활성 화합물은 엽산, 그것의 식품 등급 또는 약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 에스테르 또는 염 및 그의 혼합물들로부터 선택되는 방법.
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