KR102218883B1

KR102218883B1 - 생물활성, 나노입자포집된 항산화제의 전달

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Publication number: KR102218883B1
Application number: KR1020177003119A
Authority: KR
Inventors: 크리스티나 엠. 사블리브; 카롤스 이. 아스테테; 에드 보도키; 올리뷰 보스티라루; 오비듀 치프리안 사모이라; 엘레나 딘테
Original assignee: 보드 오브 슈퍼바이저스 오브 루이지애나 스테이트 유니버시티 앤드 애그리컬춰럴 앤드 메카니컬 컬리지 쓰루 더 엘에스유 에이쥐센터; 이울이우 하티에가누 유니버시티 오브 메디신 앤드 파르마시
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2021-02-23
Also published as: US10952974B2; WO2016025394A3; JP6668327B2; WO2016025394A2; CA2992879A1; US20170216221A1; EP3179988A4; US10292943B2; EA035620B1; MX2017001903A; BR112017002580A2; CA2992879C; AP2017009684A0; US20190254987A1; KR20170097601A; AU2015301945B2; EP3179988A2; AU2015301945A1; ZA201700987B; EA201790361A1

Abstract

루테인 또는 다른 항산화제를 분해로부터 상기 항산화제를 보호하면서, 표적 조직, 이를 테면 눈으로 생물활성 형태로 전달하는 방법 및 조성물을 공개한다. 상기 항산화제는 단백질, 이를 테면 제안 또는 폴리머, 이를 테면 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA)이 포함된 나노입자에 포집된다. 바람직하게는 계면활성제가 마찬가리로 나노입자에 결합되어, 항산화제를 보호하는데 추가 도움이 된다. 나노입자를 표적 조직에 투여한 후, 생물활성 항산화제는 시간에 걸쳐 조직으로 방출된다. 임의선택적으로, 항산화제의 지연 방출을 촉진시키기 위하여, 바람직하게는 나노입자는 열민감성, 생물부착성 겔과 혼합된다. 상태, 이를 테면 노화-관련된 황반 변성 또는 백내장의 치료 또는 방지에 상기 방법 및 조성물들이 유용하다.

Description

생물활성, 나노입자포집된 항산화제의 전달{Delivery of Bioactive, Nanoencapsulated Antioxidants}

미국의 35 U.S.C. §　119(e)에 근거하여 2014년 8월 11일자에 제출된 미국 가출원 62/035,683 및 2015년 6월 8일에 제출된 미국 가출원 62/172,455의 출원일에 대한 해택을 요구하며, 모든 국가에서도 적용가능한 조약 및 협정에 의해 청구된다.

본 발명은 National Institute of Food and Agriculture, United States Department of Agriculture에 의해 부여되는 계약 번호 2010-05269에 의해 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 주 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.

기술 분야

본 발명은 생물활성 루테인 또는 다른 항산화제들을 조직으로 전달하는 것을 강화시키는 방법들 및 조성물들, 그리고 생물활성 루테인 또는 다른 항산화제들의 특히, 눈 및 눈의 요소들, 이를 테면 각막과 망막 조직으로 전달 강화에 유용한 조성물들을 만드는 방법들에 관계한다.

배경기술

루테인

루테인은 식물 색소, 엽황소, 디히드록시 카로테노이드이다. 루테인의 IUPAC 이름은 β,ε-카로틴-3,3＇-디올이며; 이의 구조는 다음과 같다:

인간은 생체내에서 카로테노이드를 합성할 수 없기 때문에, 인체 조직의 루테인은 보통 식사로부터 기원된 것이다. 루테인은 예를 들면, 녹색 식물 (가령, 알파파, 밀 풀, 보리 풀, 케일, 시금치, 브로클리, 녹색 콩, 녹색 완두콩, 리마콩, 양배추, 콜라드, 겨잣잎, 및 순무우잎), 일부 꽃들 (가령, 마리골드 꽃의 꽃잎), 일부 황색 과일 및 식물 (가령, 당근, 복숭아, 망고, 파파야,호박 및 오렌지), 난황, 닭 껍질 및 닭 지방에서 발견된다. 옥수수에서 예를 들면, 루테인은 각질 배유에서 주로 볼 수 있다. 마리골드 꽃 꽃잎 (Tagetes erecta)은 옥수수로부터 유도된 루테인보다 비록 더 비싸지만, 우수한 루테인의 원료이다.

루테인은 10개의 접합된 탄소-탄소 이중 결합 연쇄를 갖는다. 이 접합된 구조에 의해 루테인이 라디칼, 이를 테면 페록실 라디칼을 소거함으로써 생물계에서 주요 항산화제로 기능을 하도록 하지만, 그러나, 방대한 접합은 빛, 산소 및 열에 의한 분해에 루테인이 민감하게 만든다. 분해에 대한 민감성은 루테인을 필요로 하는 조직으로 루테인 전달을 함에 있어서 난관이 된다.

상기 히드록실기는 루테인의 변형안된 β-카로틴 유사체보다 루테인을 더 극성으로 만든다. 루테인은 비극성 용매와 극성 용매 모두에 가용성이다. 표 1 참고.

건강 및 질환에서 루테인의 역할

루테인은 특히 눈 질환,이를 테면 노인성 황반 변성 (AMD), 그리고 혈관생성-관련된, 질환 이를 테면 유방암 및 결장암과 같은 특정 질환의 위험을 감소시키고, 특정 질환의 증상을 감소시킨다. AMD는 중심시력을 담당하는 망막의 영역의 퇴행 상태다. AMD는 노인들의 비가역성 시력 상실의 가장 흔한 원인이다. 눈에서 카로테노이드는 황반의 내측 망막 층에 집중되어 있다. 인간의 연구로부터 얻은 증거에서 카로테노이드 식품 섭취로 망막에 이들이 축적되는 것으로 제시되며, 망막 퇴행으로부터 보호하는 것으로 보인다. 그러나, 루테인은 물-불용성이기 때문에 생물활성 루테인을 분해없이 생물활성 형태로 표적 조직, 이를 테면 망막으로 효과적으로 전달하는 것이 어렵다. 생물활성 루테인 또는 다른 항산화제들을 분해없이 생물활성 형태로 표적 조직, 이를 테면 살아있는 유기체의 망막으로 효과적으로 전달하기 위한 방법 및 조성물들이 여전히 필요하다. 발명자가 아는 한, 망막을 포함한 눈의 내부로 루테인을 전달하기 위하여 눈에 국소 투여에 적합한 임의의 조성물을 보고한 선행기술은 없다.

루테인은 광-산화성 손상으로부터 짧은 파장의 청색광, 구체적으로 대략 445 nm를 흡수하는 능력을 통하여 망막 색소 상피 세포(RPE)를 보호한다. 루테인은 또한 염증을 조절할 수 있고, 그리고 RPEs에서 산화성 스트레스와 염증성 반응 사이의 악순환을 최소한 부분적으로 파괴하는 것을 도울 수 있다. 더욱이, 루테인은 단일항(singlet) 산소를 소거할 수 있기 때문에, 루테인은 산화성 스트레스로 인하여 생성된 상태, 이를 테면 심혈관 질환, 뇌졸중, 폐암, 유방암, 및 결장암을 억제하는 것을 도울 수 있다. 루테인은 낮은 물 용해도, 생체내 저조한 흡수 및 낮은 생체이용율을 가진다. 루테인이 항산화제로써의 장점을 취하고, 그리고 가공 및 저장하는 동안 이의 물리화학적 안정성을 개선시키기 위한 개선된 전달 시스템이 여전히 필요하다.

Mitri, K.; Shegokar, R.; Gohla, S.; Anselmi, C.; Muller, R. H., Lipid nanocarriers for dermal delivery of lutein: preparation, characterization, stability and performance. International journal of pharmaceutics 2011, 414 (1-2), 267-75 는 예를 들면, 피부 항-산화제, 항-스트레스 물질, 또는 푸른 빛 필터로써 사용을 위하여 루테인의 피부 전달용 지질 나노전달체의 사용을 공개한다. 테스트된 나노전달체들은 고형 지질 나노입자들, 나노구조의 지질 전달체들, 그리고 나노에멸젼을 포함한다. 돼지의 신선한 귀 피부를 이용한 침투 연구에서 루테인은 전혀 침투되지 않았거나, 또는 매우 적은 양이 침투되었고, 이는 활성 루테인은 피부에 남아있었고, 조직적으로 흡수되지 않는다는 추론을 얻었다.

Tan, C.; Xia, S.; Xue, J.; Xie, J.; Feng, B.; Zhang, X., Liposomes as vehicles for lutein: preparation, stability, liposomal membrane dynamics, and structure. Journal of agricultural and food chemistry 2013, 61 (34), 8175-8184는 약효식품 및 기능 식품에서 나노-포집된 루테인의 잠재적 용도에 대하여 리포좀 막 안정성에 있어서 루테인의 효과 관찰을 보고한다.

Mitri, K.; Shegokar, R.; Gohla, S.; Anselmi, C.; Muller, R. H., Lutein nanocrystals as antioxidant formulation for oral and dermal delivery. International journal of pharmaceutics 2011, 420 (1), 141-6은 루테인 나노현탁액을 준비하기 위한 고압 균질화의 이용을 공개한다. 루테인 나노현탁액은 펠렛으로 전환되었고, 약효식품으로 사용하기 위하여 젤라틴 캡슐에 충전되었다. 동결건조된 현탁액은 크림 또는 겔 안에 통합되었다. 잠재적 피부 사용을 위한 모델로써 돼지 귀 피부에 테스트될 때, 루테인은 피부를 침투하지 못하였다.

Hu, D.; Lin, C.; Liu, L.; Li, S.; Zhao, Y., Preparation, characterization, and in vitro release investigation of lutein/zein nanoparticles via solution enhanced dispersion by supercritical fluids. Journal of Food Engineering 2012, 109 (3), 545-552는 루테인/제인 나노입자 생산에 있어서 용액 분산을 강화시키기 위하여 초임계 유체의 사용을 설명한다.

Elzoghby, A. O.; Samy, W. M.; Elgindy, N. A., Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release 2012, 161 (1), 38-49는 약물 및 유전자 전달을 위한 잠재적 후보물질로써 단백질-기반의 나노전달체 사용에 대한 검토를 제시한다.

Lim, A. S. L.; Griffin, C.; Roos, Y. H., Stability and loss kinetics of lutein and β-carotene encapsulated in freeze-dried emulsions with layered interface and trehalose as glass former. Food Research International 2014, 62 (0), 403-409는 영아 포뮬라, 영양 보충제, 및 의료용 식품에 잠재적 사용에 위하여 카로테노이드, 이를 테면 β-카로틴 및 루테인의 탈수된 에멸젼 형성을 공개한다. 층층 시스템(Layer-by-layer systems)은 단층 에멸젼보다 카로테노이드를 더 잘 유지하는 것으로 밝혀졌지만, 층층 시스템은 이성화를 또한 증가시킨다.

Kamil, A.; Smith, D.E.; Blumberg, J.B.; Astete, C.; Sabliov, C.; Chen, C.-Y. O., Bioavailability and biodistribution of nanodelivered lutein. Food Chemistry 2016, 192, 915-923 (available online 23 July 2015) 은 루테인이 포함된 폴리(락트-코-글리콜산) 나노입자, 그리고 올리브유, 가루 및 물이 또한 포함된 슬러리 안에 나노입자를 위관 영양법으로 투여한 후 선택된 조직에서 루테인의 혈장 약물동력학 및 침착을 공개한다.

제인은 나노전달 시스템을 합성하는데 이용되는 자연-발생적 단백질이다. 제인은 United States Food and Drug Administration (FDA)에 의해 인간이 소비할 수 있는 "일반적으로 안전하다고 인지되었다"(GRAS). 제인은 소수성이기 때문에, 지용성 성분들의 포획, 조절된 방출 및 안정화를 위한 전달체로 이용될 수 있다. 제인 나노입자는 포획된 약물, 항균 물질, 그리고 생물활성 화합물들, 이를 테면 5-플루오르우라실, 티몰, 쿠르쿠민, 필수 오일 및 루테인과 함께 합성되었다.

루테인 또는 다른 항산화제이 눈과 같은 이를 필요로 하는 조직으로 전달되기 전에 분해로부터 보호되면서, 이를 필요로 하는 조직, 이를 테면 눈으로 생물활성 루테인 또는 다른 항산화제들을 전달하는 개선된 조성물 및 방법들이 여전히 필요하다.

발명의 공개

우리는 루테인 또는 다른 항산화제들을 생물활성 형태로 표적 조직, 이를 테면 눈으로 국소 전달 (루테인을 망막으로 전달하는 것을 포함)하면서 동시에 루테인 또는 다른 항산화제를 분해로부터 보호하는 신규한 방법을 발견하였다. 루테인 또는 다른 항산화제는 단백질, 이를 테면 제안 또는 합성 폴리머, 이를 테면 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA)이 포함된 나노입자에 포집된다. 바람직하게는 계면활성제가 마찬가리로 나노입자에 결합되어, 루테인 또는 다른 항산화제를 보호하는데 추가 도움이 된다. 나노입자를 표적 조직에 투여한 후, 생물활성 루테인 또는 다른 항산화제는 시간에 걸쳐 조직으로 방출된다. 루테인 또는 다른 항산화제의 지연 방출을 촉진시키기 위하여, 바람직하게는 나노입자는 열민감성, 생물부착성 겔과 혼합된다.

한 가지 실험 환경에서, 우리는 계면활성제 존재하에 그리고 부재하에서 산화로부터 루테인을 보호하고, 루테인의 방출을 조절하는 제인-기반 나노입자의 능력을 검사하였다. 우리의 가설은 제인 나노입자와 계면활성제 사이의 정전기적 친화력이 좀더 지속적인 루테인의 방출을 만들고, 포집된 생물활성 루테인의 화학적 안정성을 강화시킨다는 것이었다. 루테인-로딩된 제인 나노입자는 계면활성제와 함께, 또는 없이 액체-액체 분산 공정을 이용하여 합성되었다. 인지질 대두 레시틴과 삼중-블록 코폴리머 Pluronic F127의 조합이 계면활성제로 이용되었다. 다른 계면활성제들, 예를 들면 Tween™ 80 및 Tween™ 패밀리의 다른 계면활성제들이 또한 이용될 수 있다. 루테인이 포함된 ＂통상적인(Conventional)＂ 에멀션이 대조로 준비되었다. 동적 광 산란 (DLS) 및 전자 전달 현미경(TEM)을 이용하여 입자 물리적 안정성을 특징화하였다. PBS에 현탁된 나노입자로부터 루테인 방출 및 루테인 분해는 계면활성제 존재 및 부재하에서 모두 측정되었다. 루테인의 열적- 및 광-산화 또한 화학적 안정성의 지표로 측정되었다. 나노입자는 계면활성제 없는 경우 156.1 ± 18 nm로 측정되었고, 계면활성제 있는 경우 216.5 ± 29 nm로 측정되었다. 계면활성제는 다분산 지수(polydispersity index)를 개선시키고, 제타 전위를 감소시키고, 그리고 포집 효과를 개선시켰다. 2개-상 방출 프로파일이 관찰되었다: 24시간에 걸쳐 초기 폭발적 방출, 계면활성제가 존재하는 경우 더 작았으며; 이어서 계면활성제가 있는 경우와 없는 경우 시스템에 있어서 점진적 영차 방출 프로파일. 루테인 분해는 2차 역동학으로 이어졌고, PBS에 현탁된 나노입자와 에멸션화된 대조 사이에 유의적인 차이는 없었다. 나노입자 안으로 루테인을 혼입시키면, 열 및 UV 스트레스에 대항하여 루테인의 안정성이 개선되었는데, 특히 계면활성제가 있을 때 개선되었다. 이들 데이터는 제인-기반 나노입자, 특히 계면활성제가 추가된 나노입자는 효과적으로 소수성 루테인을 포집할 수 있고, 한편 루테인의 생물활성이 유지되고, 분해에 대항하여 루테인을 보호하기 때문에, 생리학적 조건하에 지연 방출이 허용된다.

한 구체예에 있어서, 폴리머 (PLGA) 나노입자를 이용하여 생물활성 루테인을 눈으로 전달하였다. 눈에 투여된 생물활성 루테인은 백내장 또는 황반 변성을 저해를 위한 용도에 유익할 수 있다. 렛 모델에서 얻은 예비 결과는 고무적이었다. 우리의 예비 결과에서 폴리머 나노입자는 루테인을 눈으로 성공적으로 전달하였고, 치료요법적 이익을 제공하였다.

도 1은 제인 나노입자, 계면활성제와 함께, 또는 없이, 제인 나노입자의 루테인의 PBS 용액 (pH 7.4), 37℃, 100 rpm, 7일 동안 방출 역동학을 나타낸다.
도 2는 계면활성제와 함께(LTZN SF), 그리고 계면활성제 없이 (LTZN NSF) 제안 나노입자 그리고 계면활성제 (LTEM SF)에 에멀션화된 루테인의 필적가능한 관찰에서 루테인 유지를 나타낸다. 모든 측정은 PBS 용액 (pH 7.4), 37℃, 100 rpm, 7일 동안 실행되었다.
도 3a-3c는 상이한 온도에서 시간에 대한 함수로써 제인 나노입자에서 루테인 잔류를 나타낸다.
도 4는 UV-유도된 분해에 반응하여 상이한 조성물들에 대한 시간에 대한 함수로써 루테인 잔류를 나타낸다.

본 발명을 실행하기 위한 방식

제인- 포집된 루테인 나노입자.

다양한 공정 및 저장 조건하에 제인 나노입자 안에 포집된 루테인의 안정성, 또는 루테인의 방출 및 안정성에 있어서 계면활성제들의 효과를 기존에 보고한 것은 거의 없었다. 우리는 계면활성제의 부재와 존재 (레시틴 및 Pluronic F127 코-계면활성제) 모두에 있어서, 루테인 열 안정성, 광-안정성 및 제인 나노입자부터 루테인의 방출을 연구하였다. 우리의 가설은 제인 나노입자에 포집된 루테인이 다양한 보관 조건에 더 안정적이며, 제인 나노입자와 계면활성제 사이의 정전기적 친화력이 좀더 지속적인 루테인의 방출을 초래하고, 포집된 생물활성 루테인의 화학적 안전성을 강화시킨다는 것이었다.

재료

실시예 1. 제인, Pluronic F127, 클로로포름, 에탄올, 펩신 및 판크레아틴은 Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis, MO)으로부터 구입하였다. 대두 레시틴, 염산, 및 수산화나트륨은 Fisher Chemical (Fisher Scientific International, Fairlawn, NJ)으로부터 구입하였다. 루테인은 Kemin Foods, L.C. (Iowa, USA)로부터 제공되었다. 나노퓨어 물은 Nanopure Diamond 100kDA Cellulose Ester Biotech membrane tubing (Barnstead international, IA, USA)를 이용하여 구하였고, 봉입물은 Spectrum Laboratories Inc. (CA, USA)로부터 구입하였다. 이용된 다른 모든 시약 및 성분들은 분석용 등급이었다.

방법

실시예 2: 루테인이 포집된 제인 나노입자의 합성

나노입자는 액체-액체 분산에 의해 합성되었다. 10 mg의 제인은 1 ml 에탄올-수성 용액 (70:30, v/v)에 용해되었다. 0.75 mg/ml의 루테인 용액은 100% 에탄올에서 준비되었고, 이는 약한 교반 조건하에 1:1 비율 (v/v)에서 제안 용액에 점적 추가되었다. 그 다음 혼합물은 계면활성제로써 루시틴과 Pluronic F127 0.045%:0.09% (w/v)의 조합이 포함된 7.5ml의 수성 상으로 주사되었다. 그 다음 시료는 미세유동화기(microfluidizer)에서 30,000 PSI, 3 회 (M-110P, Microfluidics, MA, USA) 처리되었다. 후속적으로, 에탄올은 부분적 진공 (대략 500-600 mmHg) 및 로토바퍼(Buchi R-124, Buchi Analytical Inc., DE, USA)에서 질소 주사 (80 mm Hg) 하에 증발되었다. 에탄올의 완전한 증발 후 남아있는 루테인-로딩된 제인 나노입자는 100 kDa Spectra/POR CE 막 (Spectrum Rancho, CA, USA)을 이용한 투석에 의해 씻겨나갔다. 나노입자 현탁액은 막에 두고, 총 24시간 동안 1.5 L 나노퓨어 물에 현탁되었고; 투석 매체 (물)은 자유 계면활성제를 제거하기 위하여 4-6 시간 마다 교체되었다. 현탁액이 수집되었고, 추가 분석을 위하여 실온에서 유지되었다. 계면활성제 없는 제인 나노입자는 그렇지 않으면 동일한 과정에 따라 나란히 준비되었다. 끝으로, 오직 계면활성제만으로 만들어진 루테인 에멀젼 (제인 나노입자 없음)이 대조로 사용되었다.

제인 나노입자의 특징화

실시예 3: 입자 크기, 다분산 지수 ( PDI ), 및 제타 전위

새로-준비된 나노입자 시료는 평균 입자 크기, 그리고 Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, U.K.)를 이용한 동적 광 산란(DLS)에 의한 제타 전위를 측정함으로써 특징화되었다. 측정이 있기 전, 시료는 0.2-0.32 mg/ml 범위의 최종 농도로 희석되었다. 구연산 완충액 pH 7.4 (0.1 M)을 추가하여 시료를 안정화시키고, 입자 응집을 저해하였다. 모든 측정은 3중으로 실행되었다.

실시예 4: 형태학.

새로-만들어진 제인 나노입자의 형태는 전자 전달 현미경 (TEM)에 의해 관찰되었다. 시료의 한 방울을 탄소 필름이 있는 400 메쉬의 구리 격자 상에 두고, 과량의 시료는 필터 페이퍼로 흡수시켰다. 우라닐 아세테이트를 음성 착색으로 이용하여 시료의 대비를 개선시켰다.

실시예 5: 포집 효과 ( EE ).

새로-만들어진, 루테인-로드된 제인 나노입자의 1.0mL 시료는 30,000 rpm에서 75 분간 원심분리되었다. 상청액 및 나노입자-함유된 펠렛이 수집되었다. 두 시료 모두 에탄올에 의해 파괴되었고, 그 다음 루테인은 클로로포름 (1:1 비율)으로 추출되었다. 클로로포름 안에서 루테인의 용해도(6000 mg/L) 는 에탄올에서의 용해도(300 mg/L)보다 20배 더 높았다. 루테인의 농도는 UV/Vis 분광광도계로 유리 셀, 1 cm 통과 길이(path length), 445 nm에서 흡수에서 측정되었다. 흡수도 값은 1:1 에탄올과 클로로포름에서 루테인의 표준 곡선에 근거하여 루테인 농도로 전환되었다. 포집 효과 (%)는 포집에 이용가능한 이론적인 루테인 양에 대하여 펠렛 안의 루테인 양의 비율로 예측되었다. 모든 측정은 3중으로 실행되었다.

실시예 6: 인산염- 완충된 염(PBS)에서 제인 나노입자로부터 루테인 방출

인산염-완충된 염 (PBS) 용액 (pH 7.4, 37℃)에서 제인 나노입자로부터 포집된 루테인 방출을 연구하였고; 0.5% Tween 20은 방출된 루테인의 용해도를 개선시키기 위하여 추가되었다. 간략하게 설명하자면, 10 ml의 새로-준비된 나노입자는 20 ml의 Tween 20-보강된 PBS에 추가되었고, 그리고 철저하게 혼합되었다. 상기 혼합물은 분배되어 1 ml 원심분리 튜브에 넣고, 그 다음 37℃, 100 rpm에서 진탕 배양에 위치시킨다 (C25KC 진탕 배양기, New Brunswick Scientific, NJ, USA). 예정된 시점에, 원심분리 튜브에서 표본 채취되고, 30,000 rpm에서 75 분간 원심분리된다. 상청액을 제거하고, 에탄올과 클로로포름 (2 ml : 2 ml)으로 추출하고, 그 다음 10 분간 볼텍스한다. 포집 효과 부분에서 기술된 바와 같이 445 nm에서 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 흡수도를 측정함으로써 상청액에서 추출된 루테인이 결정되었다. 모든 측정은 3중으로 실행되었다.

실시예 7: PBS에 현탁된 제인 나노입자로부터 루테인 분해

제인 나노입자 (계면활성제와 함께, 또는 없이)에 포집된 루테인과 계면활성제-안정화된 에멀젼에서 루테인의 분해는 펠렛 안에 탐지된 루테인의 양과 동일 조건에서 상청액 안에 루테인의 양을 측정하여 결정되었다.

실시예 8: 포집된 루테인이 있는 제인 나노입자의 물리적 안정성

새로 만든 시료는 3가지 다른 온도에서 어두운 상태로 보관되었다: 한 달 기간 동안 냉장고 안 4℃, 25℃ 실온, 그리고 배양기 안 40℃. 보관 7, 15일 그리고 30일 후 평균 입자 크기, 표면 특징 및 포집된 분획에서의 변화에 대하여 시료를 관찰하였다. 모든 실험은 3중으로 실행되었다.

실시예 9: 제인 나노입자 안에 포집된 루테인의 광-화학적 안정성.

나노입자 및 에멀젼 시료는 차광 캐비넷 안 투명 유리 바이알에 보관되었고, 이는 최대 10시간 동안 365　nm UV 램프 (100　W: Blak-Ray model B 100AP)에 노출되었다. 0.5, 1, 2, 3, 5, 7, 및 10 시간 간격으로, 각 시료로부터 1 ml을 취하여, 추출한 후, 445 nm에서 UV-Vis 분광광도계를 이용하여 루테인 농도를 분석하였다. 모든 실험은 3중으로 실행되었다.

실시예 10: 분해 반응 역학.

루테인 분해 및 방출에 대한 반응 속도의 일반적인 설명은

으로 제시되며: 이때 C는 루테인 농도이며, k는 반응 속도 상수이고, n은 반응 차수이다. 상관 계수 (R²)는 운동 모델의 최상의 적합을 결정하는데 이용된다. UV 노출에 의한 루테인 분해는 일차 역동학에 따랐다:

PBS에서 보관될 때, 루테인 분해은 2차 역동학에 따랐다:

, 이때 C는 시간 t에서 루테인의 농도이며, C ₀ 는 루테인의 최초 농도이며, t는 시간이며, 그리고 k는 선형 회귀 분석 기울리로부터 유도된 반응 속도이다.

실시예 11: 통계학적 분석:

모든 실험은 3중으로 실행되었고, 결과는 평균 ±표준 오차로써 보고되었다. 통계학적 분석은 SAS 소프트웨어 (version 9.4, SAS Institute Inc., NC, USA)로 실행되었다. 변이 분산 (ANOVA)을 이용하여 시스템간의 유의적인 차이를 결정하였다. 유의성 수준 (p)은 0.05에서 설정되었다.

결과 및 토론

실시예 12: 물리화학적 특징.

액체-액체 분산을 성공적으로 이용하여 계면활성제와 함께, 또는 없이, 루테인-로딩된 제인 나노입자를 합성하였다. 원형(prototype) 실험에서 나노입자를 안정화시키는데 이용된 계면활성제는 루시틴과 Pluronic™ F127의 복합이다. 천연 식품 유화제 또는 안정화제인 루시틴은 친수성 머리, 포스파티딜콜린(PC); 그리고 2개의 소수성 꼬리, 포스파티딜에탄올아민 (PE)과 포스파티딜이노시톨 (PI)을 갖고 있다. Pluronic™ F127은 폴리에틸렌 글리콜의 2개 친수성 블럭 사이에 폴리프로필렌의 소수성 블럭과 함께, 친수성, 비-이온성 계면활성제 코폴리머이다. 루시틴의 하나 또는 그 이상의 층이 소수성 제인 나노입자의 표면을 덮고, 루테인은 그 안에 포집된다고 가정하였다. 루시틴의 친수성 머리는 Pluronic™ F127의 소수성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 결합되며; 그리고 소수성 폴리프로필렌 모이어티는 아미도 제인 메트릭스와 결합할 것이다. 그 결과 소수성 루테인이 로딩된 친수성 제인 나노입자가 되며, 이는 수성 환경에서 생물활성 루테인을 분해로부터 보호하면서 루테인을 분산시키는데 이용될 수 있다.

계면활성제가 있던, 또는 없던 루테인-로딩된 제인 나노입자, 그리고 그렇지 않으면 루테인이 없는 유사한 나노입자는 모두 정제후 바로 특징화되었다. 표 2 참고. 평균 입자 크기, PDI, 그리고 새로 만들어진 시료의 제타 전위는 구연산 완충액(pH 7.4)에서 24시간 투석 후 측정되었다. 계면활성제와 함께, 또는 없이 제안 나노입자에 로딩된 루테인의 평균 입자 크기는 각각 217 ± 29 nm 또는 156 ± 18 nm이었다. 계면활성제와 함께, 제인 나노입자는 상대적으로 작은 다분산성 (0.3 미만)을 가졌다. 계면활성제 없는 경우 더 높은 범위의 PDI, 0.33-0.48가 관찰되었다.

결과는 전자 전달 현미경(TEM) (데이터는 나타내지 않음)에 의해 확인되었다. 계면활성제와 함께 입자는 둥근 표면의 구형 모양을 하였고, 일부 입자들은 계면활성제 ＂메쉬＂에 의해 서로 연결되어 있었다. 계면활성제가 없는 나노입자는 크기가 좀더 작았고, 더 구형 형태를 가졌지만, 크기가 다소 균일하지 않았고, 응집하는 경향이 더 있어, 동적 빛 산란에 의해 측정하였을 때 PDI 값이 더 높았다.

제타 전위는 나노입자 안정성의 척도다. 약 +30 mV 이상, 또는 약 -30 mV 미만의 제타 전위에서 더 높은 안정성 수준이 예상된다. 계면활성제와 함께 입자는 계면활성제가 없는 입자(-31.9± 4.3 mV)보다 더 음성적으로 하전됨이 밝혀졌고, 이는 계면활성제-안정화된 입자의 경우 양호한 안정성(-47.6 ± 1.6 mV) 을 나타낸다. 포집된 루테인은 계면활성제가 있는 경우 제타 전위를 -30.9 ± 3.3 mV로 감소시키고, 계면활성제가 없는 경우 -21.0 ± 8.6 mV로 감소시켰다. 루테인과 제인 사이의 소수성 상호작용은 아마도 제인 구조를 재배열시키고, 이로 인하여 관찰된 제타 전위 변화를 초래하였을 것이다.

계면활성제 없는 경우, 포집 효과는 69.1 ± 11.4%이었다. 계면활성제가 있는 경우, 포집 효과는 83 ± 5.8%로 증가되었다.

실시예 13: 방출 및 방출 기전. PBS 안에서 제인 나노입자로부터 루테인 방출

인산염 완충된 염 (PBS)은 약물 방출 테스트에 흔히 이용된다. 도 1은 제인 나노입자, 계면활성제와 함께, 또는 없이, 제인 나노입자의 루테인의 PBS 용액 (pH 7.4), 37℃, 100 rpm, 7일 동안 방출 역동학을 나타낸다. 상기 방출 프로파일은 2-상 패턴을 따르는데, 24시간에 걸쳐 초기-폭발성 방출과, 이어서 24시간 후 0차 방출이다. 표 3 참고. 계면활성제 (LTZN NSF)가 없는 입자의 경우, 루테인의 43%는 초기 폭발성 방출에서 방출되었다. 계면활성제 (LTZN SF)가 있는 입자의 경우, 루테인의 단지 20%만 초기 폭발성 방출에서 방출되었다. 계면활성제는 루테인 방출을 지연시켰다. 24시간 후 루테인 방출은 0-차 역동학을 따랐다. 하기 표 4 참고. 계면활성제 없는 입자의 경우, 168시간 후 52% 루테인이 방출되었지만, 계면활성제가 있는 입자의 경우 단지 43% 만 방출되었다. 계면활성제에 의해 촉진되는 소수성 상호작용은 제인의 가수분해를 저해하였고, 루테인의 방출을 지연시켰다. 계면활성제 없이, 신속한 단백질 팽창으로 수화된 팽창된 제인 매트릭스에서 형성된 수성 채널을 통한 확산에 의해 포집된 생물활성의 방출이 더 신속하게 되었다. 계면활성제는 루테인의 더욱 지속된 방출을 초래하였다.

실시예 14: PBS에서 루테인 분해

루테인은 열과 다른 원인에 의한 분해로부터 많은 다른 카로틴보다 더 민감한 경향이 있는데, 그 이유는 이의 접합된 이중 결합과 이의 2개 히드록실기때문이다. 우리는 계면활성제와 함께(LTZN SF), 그리고 계면활성제 없이 (LTZN NSF) 제안 나노입자 안에 포집된 루테인의 분해를 평가하였고; 이들 관찰은 동일한 계면활성제 (LTEM SF)에 유화된 루테인의 비교가능한 관찰과 비교되었다. 모든 측정은 PBS 용액 (pH 7.4), 37℃, 100 rpm, 7일 동안 실행되었다. 도 2 참고. 루테인 분해 프로파일은 2차-역동학을 따랐고, 연구된 시스템간에 분해 속도 상수 (k)에서 유의적인 차이는 없었다. 하기 표 4 또한 참고.

실시예 15 및 16: 시간에 대한 함수 및 온도에 대한 함수로써 나노입자의 화학적 그리고 물리적 안정성

4℃, 25℃, 및 40℃에서 30 일에 걸쳐 크기, PDI, 및 제타 전위를 측정함으로써, 제인 나노입자의 물리적 안정성을 관찰하였다. 445 nm에서 흡수도를 측정함으로써 포집된 루테인의 화학적 안정성도 나란히 평가되었다. 표 3 참고. 계면활성제와 함께, 또는 없는 제인 나노입자는 모두 4℃에서 30일동안 보관되었을 때, 156.1 ± 18 내지 216.5 ± 29 nm으로 측정됨으로써, 낮은 온도에서 안정적이었다. 나노입자는 더 높은 온도에서 보관될 때, 특히 계면활성제가 없는 경우, 시간 경과에 따라 크기가 커지는 경향이 있었다. 예를 들면, 계면활성제가 있는 나노입자의 크기는 25℃에서 30일 보관 후 380.5 ± 51 nm로 증가되었다. 대조적으로, 계면활성제가 없는 입자의 크기는 25℃에서 30일 보관 후 3103 ± 332 nm로 훨씬 더 많이 증가되었다. 40℃에서, 1 ㎛ 이상의 입자는 계면활성제 없이 보관후 단지 7일 후에만 탐지될 수 있을 것이다. PDI는 일반적으로 온도와 저장 시간과 함께 증가되었다 (0.27에서 0.80로). 계면활성제없는 나노입자의 경우 제타 전위는 -18 mV에서 -25 mV 범위가 되며, 그리고 계면활성제가 있는 입자의 경우 -15 mV 내지 -38 mV 범위가 된다.

계면활성제들은 최소한 30 일 동안 장기 보관 안정성을 위하여 제공되며, 뿐만 아니라 루테인 분해를 지연시켰다. 도 3a 내지 3c 참고. 포집된 루테인 LTZN SF의 단지 26% 만이 25℃에서 30일 후에 분해되었는데, 이는 LTZN NSF의 경우 54%와 비교되었다. 두가지 입자 유형 모두에서 유사한 경향이 40℃에서 볼 수 있는데, 나노입자 계면활성제와 함께, 또는 없이는 경우 루테인의 각각 13.8% 및 7.5%가 남아있었다. 모든 온도에서, 유화된 루테인은 제인 나노입자에 포집된 루테인보다 더 신속하게 분해되었다. 모든 온도에서 루테인 분해는 2차 역동학을 따랐다. 표 4 참고. 각 저장 온도에서, 계면활성제가 있는 루테인-로드된 제인 나노입자의 경우에 최저 분해 속도를 볼 수 있었다. 모든 시스템의 경우 더 높은 온도에서 분해 속도는 증가되었다.

실시예 17: UV 노출에 대한 광-화학적 안정성

제인 나노입자는 UV-유도된 분해에 대항하여 루테인의 광화학적 안정성을 강화시켰고; 계면활성제를 나노입자에 추가시키면, 안정성이 더 강화되었다. 유화된 루테인은 신속한 광화학적 분해를 겪었다. 도 4 참고. 10 h 후, 단지 1.4% 포집된 루테인이 루테인 에멀젼에 남아있는데, 이는 계면활성제 없는 제인 나노입자의 경우 루테인은 15.9%이며, 계면활성제와 함께 제인 나노입자의 경우 루테인은 46.6%와 비교되었다. 표 4 또한 참고. 광화학적 분해는 모든 경우에 1차 분해에 따랐다.

이 이론에 결부되는 것을 바라지는 않지만, 우리는 제인의 UV 광자의 경쟁적 흡수는 제인 나노입자에 포집된 루테인의 광화학적 안정성의 강화를 담당한다고 본다. 제인, 구제적으로 이의 방향족 아미노산, 이를 테면, 페닐알라닌은 UV를 흡수한다. 계면활성제, 이를 테면 제인 나노입자와 결합된 루시틴은 UV에 대항하여 루테인 안정성을 또한 개선시켰다. 이 이론에 결부되는 것을 바라지는 않지만, 우리는 여기된 루테인 종으로부터 루시틴으로의 신속한 에너지 전달이 UV에 대항한 안정성을 촉진시킨다고 본다. 전반적으로, 포집된 루테인은 루시틴과 Pluronic F127 계면활성제가 복합된 제인 나노입자에서 UV 분해에 상당히 더 저항적이었다.

논의

용매-없는, 액체-액체 분산 방법을 이용하여 루시틴 / Pluronic F127 계면활성제 복합에 의해 안정화된 7.5% 루테인이 로딩된 제인 나노입자를 합성하였다. 계면활성제의 추가는 입자 크기를 약간 증가시켰고, 다분산 지수를 개선시켰다. 제타 전위가 약간 변화되었고, 계면활성제와 함께 포집 효과는 상당히 증가되었다. 계면활성제가 없는 시료와 비교하였을 때, 계면활성제를 가진 시료에서 루테인의 초기 신속한 방출이 감소되었고; 초기 "폭발"적 방출의 감소는 지속 방출에 유익하다. 단순히 유화된 루테인과 비교하였을 때, 다양한 저장 조건하에 분해로부터 제인 나노입자를 보호하였다. 루테인-로딩된 계면활성제와 함께 제인 나노입자는 활성의 상실이 거의 없이, 4℃에서 최소한 30 일 동안 저장될 수 있다. 나노입자 / 계면활성제 제형은 최소한 10시간 동안 UV 광에 의한 분해로부터 루테인을 보호하였다.

백내장을 저해하기 위한 루테인 함유 폴리머 ( PLGA ) 나노입자

한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 폴리머 나노입자는 루테인을 눈으로 전달하넨데 이용된다. 눈에 투여된 루테인은 백내장 또는 황반 변성을 저해를 위한 용도에 유익할 수 있다. 렛 모델로부터 우리의 예비 결과는 고무적이다. 우리의 예비 결과에서 폴리머 나노입자는 루테인을 눈으로 성공적으로 전달할 수 있고, 치료요법적 이익을 전달할 수 있을 것임을 보여주었다.

렛에서 셀레나이트-유도된 백재장은 핵 백내장의 신속하고 편리한 모델이다. 젖먹이 렛 새끼에게 셀레나이트의 투여로 백내장이 유도된다. 몇 가지 생물화학적 기전이 관련되는 것으로 보는데, 칼슘 항상성 상질, 칼파인-유도된 단백질 분해, 결정체 침전 및 세포골격 상실이 포함된다. 루테인의 항산화제 성질은 이들 경로중 최소한 일부를 억제하는데 도움을 줄 수 있다. 폴리머 나노입자에 포집된, 특히 생물접학성 제형에 의해 도움을 받을 경우, 루테인의 신규한 국소 제형은 루테인의 안구 생물이용성을 강화시키고, 이의 치료요법적 효과를 증가시켰다.

황반 변성의 동물 모델에서 앞으로의 실험으로 황반 변성의 진행을 억제시키기 위하여 루테인의 신규한 제형의 효과를 확인할 수 있을 것이다. 노화 관련된 황반 변성 (AMD) 모델은 예를 들면, 마우스, 렛, 토끼, 돼지 및 비-인간 영장류에서 개발되어왔다. 예를 들면 Penessi ME, Neuringer M, Courtney RJ. Animal models of age-related macular degeneration. Mol Aspects Med. 2012, 33(4): 487-509 참고. 황반 변성의 최소 4가지 설치류 모델이 있다. 한 가지 모델은 비활성화된 SOD1 유전자 (SOD1-/- 마우스)에 의존한다. Imamura Y, Noda S, Hashizume K, Shinoda K, Yamaguchi M, Uchiyama S, Shimizu T, Mizushima Y, Shirasawa T, Tsubota K. Drusen, choroidal neovascularization, and retinal pigment epithelium dysfunction in SOD1-deficient mice: a model of age-related macular degeneration. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2006; 103(30):11282-11287 참고. 또다른 모델은 비활성화된 ApoE 유전자 (ApoE -/- 마우스)에 의존한다. Dithmar S, Sharara NA, Curcio CA, Le NA, Zhang Y, Brown S, Grossniklaus HE. Murine high-fat diet and laser photochemical model of basal deposits in Bruch membrane. Arch. Ophthalmol. 2001; 119(11):1643-1649 참고. 상이한 유형의 모델은 고지방 식이가 공급된 노화된 마우스(16월령)에 의존한다. Cousins SW, Espinosa-Heidmann DG, Alexandridou A, Sall J, Dubovy S, Csaky K. The role of aging, high fat diet and blue light exposure in an experimental mouse model for basal laminar deposit formation. Exp. Eye Res. 2002; 75(5):543-553 참고. 또다른 모델은 UV에 의한 황반 변성 유도에 의존한다. Pavelic SC et al. UV-induced retinal proteome changes in the rat model of age-related macular degeneration. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 2015, 1852 (9):1833-1845 참고. 처음 두 모델은 잠재적 질환 차도에 있어서 루테인-로딩된 나노입자의 효과 테스트에 더 적합할 수 있다. 나머지 두 모델은 AMD 발병으로부터 보호함에 있어서 루테인-로딩된 나노입자 효과를 테스트하는데 더 적합할 수 있다. 각 경우에서, 루테인은 생물접합성 하이드로겔 안에 루테인-로딩된 폴리머 나노입자로 투여될 수 있고, 각막에 국소적으로 제공된다.

방법

실시예 18.

한 구체예에 있어서, 루테인-포함 폴리(락트산-코-글리콜)산 (PLGA) 나노입자는 변형된 에멀젼/증발 방법에 의해 합성되었다. 간략하게 설명하자면, 100 mg PLGA는 10 ml의 에틸 아세테이트에 용해되었고, 10 mg 루테인이 약한 교반하에 추가되었다. 그 다음 혼합물은 에틸 아세테이트로 포화된 Tween™ 80 (4 mg/ml) 의 80 ml의 수성 용액에 실온에서 점적되었다. 교반 5분 후, 시료는 미세유동화기(microfluidizer)에서 30,000 PSI, 3 회 (M-110P, Microfluidics, MA, USA) 처리되었다. 후속적으로, 용매는 진공 및 로토바퍼(Buchi R-124, Buchi Analytical Inc., DE, USA)에서 질소 주사 하에 증발되었다. 루테인-로딩된 PLGA 나노입자는 24시간 동안 물에 대항하여 100 kDa Spectra/POR CE 막 (Spectrum Rancho, CA, USA)로 투석되었고, 자유 계면활성제를 제거하기 위하여 3번 물이 교환되었다. 끝으로, 트레할로스 (3:1 w/w)가 PLGA 나노입자 현탁액에 추가되었고, 시료는 동결 건조기 (Labconco, Kansas City, MO)로 48 시간 동안 -80℃에서 동결건조되었다. 나노압자 분말은 사용될 때까지 -20℃에서 보관되었다.

실시예 19.

또다른 구체예에서, 루테인-포함 폴리(락트산-코-글리콜)산 (PLGA) 나노입자는 약간 상이한 에멀젼/증발 방법에 의해 합성되었다. 이들 나노입자는 우리의 첫번째 동물 실험 세트 (실시예 25-38)에 이용되었다. 간략하게 설명하자면, 30-60 kDa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 분자량의 400 mg PLGA 50:50 코폴리머는 8 mL 의 에틸 아세테이트에 용해되었고; 그리고 폴리머가 용해된 후 40 mg의 루테인이 추가되어, 유기 상이 생성되었다. 유기상은 60 mL의 2% 폴리비닐 알코올 (PVA)/물과 혼합되었고(수성상), 그 다음 얼음조 안에서 4차례 25,000 psi (~170 MPa)에서 미세유동화되었다(Microfluidics Inc., Westwood, MA). 용매는 N₂ 기체 하에서 Rotovapor Buchi R-124 (Buchi Labortechnik AG, Switzerland) 로 증발되었다. 그 다음 나노입자 현탁액은 100 kDa 분자량 컷오프 (Spectrum Rancho, Dominquez, CA)를 가진 Spectra/Por CE 셀룰로오스를 이용하여 48시간 동안 투석되었다 (매 8시간마다 물 교체). 끝으로, 트레할로스 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 현탁액을 동결시키지 전 추가되었다(1:1 w/w 이론적 비율). 시료는 Freezone 2.5 Plus 동결-건조기 (Labconco, Kansas City, MO)를 이용하여 40h 동안 동결-건조되었다.

실시예 20.

여전히 또다른 구체예에서, 루테인-포함 폴리(락트산-코-글리콜)산 (PLGA) 나노입자는 약간 상이한 에멀젼/증발 방법에 의해 합성되었다. 이들 나노입자는 우리의 두번째 동물 실험 세트 (실시예 39-53)에 이용되었다. 간략하게 설명하자면, 100 mg PLGA는 10 ml의 에틸 아세테이트에 용해되었고, 10 mg 루테인이 그 다음 약한 교반하에 추가되었다. 그 다음 혼합물은 실온에서 에틸 아세테이트로 포화된 Tween™ 80 (4 mg/ml) 의 80 ml의 수성 용액에 점적되었다. 교반 5분 후, 시료는 미세유동화기(microfluidizer)에서 30,000 PSI, 3 회 (M-110P, Microfluidics, MA, USA) 처리되었다. 후속적으로, 용매는 진공 및 로토바퍼(Buchi R-124, Buchi Analytical Inc., DE, USA)에서 질소 주사 하에 증발되었다. 루테인-로딩된 PLGA 나노입자는 24시간 동안 물에 대항하여 100 kDa Spectra/POR CE 막 (Spectrum Rancho, CA, USA)로 투석되었고, 자유 계면활성제를 제거하기 위하여 3번 물이 교환되었다. 끝으로, 트레할로스 (3:1 w/w)가 PLGA 나노입자 현탁액에 추가되었고, 시료는 동결 건조기 (Labconco, Kansas City, MO)로 48 시간 동안 -80℃에서 동결건조되었다. 나노압자 분말은 사용될 때까지 -20℃에서 보관되었다.

실시예 21.

또다른 구체예에서, 제인-루테인 나노입자는 액체-액체 분산에 의해 합성되었다. 간략하게 설명하자면, 500 mg 제인은 15 ml의 아세톤-물 용액 (70:30, v/v)에 용해되었다. 그 다음, 루테인은 약한 교반 조건하에 아세톤-물 용액에 3 mg/ml의 최종 농도로 추가되었다. 혼합물은 그 다음 Tween™ 80 (3 mg/ml)의 110 ml의 수성 용액에 주사되었다. 그 다음 시료는 미세유동화기(microfluidizer)에서 30,000 PSI (~200 MPa), 3 회 (M-110P, Microfluidics, MA, USA) 처리되었다. 후속적으로, 용매는 부분적 진공 (대략 500-600 mmHg) 및 로토바퍼(Buchi R-124, Buchi Analytical Inc., DE, USA)에서 질소 주사 (80 mm Hg) 하에 증발되었다. 끝으로, 트레할로스가 1 : 3 질량비로 루테인-로딩된 제인 나노입자 현탁액에 추가되었고, 시료는 2 일동안 -80℃에서 동결-건조되었다. 생성된 나노압자 분말은 사용될 때까지 -20℃에서 보관되었다.

실시예 22.

실시예 19 및 20의 루테인-함유 폴리(락트-코-글리콜)산(PLGA) 나노입자의 형태를 JEOL 100-CX 시스템 (JEOL USA Inc., Peabody, MA)을 이용하여 전자 전달 현미경 (TEM)에 의해 검사하였다. 간략하게 설명하자면, 시료들은 다음과 같이 준비되었다: 500 μL의 나노입자 현탁액은 조영제 (음성적 착색, 2% 우라닐 아세테이트 용액 한 방울)와 혼합되었다. 혼합물 한 방울을 탄소-피복된 구리 격자, 400 메쉬 상에 배치하였다. 과량의 시료는 필터 페이퍼로 제거되었고, 격자 상의 액체 필름은 현미경에서 격자에 배치되기 전, 15분 동안 실온에서 건조되었다. PLGA 나노입자는 유의적인 응집없이 일반적으로 구형태이며, 균질하게 분포된 것으로 관찰되었다.

실시예 23.

실시예 19의 루테인-함유 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 나노입자의 입자 크기, 다분산 지수(PI) 및 제타 전위는 Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Inc., Southborough, MA)을 이용하여 동적 광 분산 (DLS)에 의해 검사하였다. 재현탁된 PLGA-루테인 나노입자 시료는 0.5 mg/ml로 희석되었다. 나노입자 평균 입자는 124 ± 4 nm로 측정되었다. PI는 0.11 ± 0.09로 측정되었다. 제타 전위는 pH 6.5에서 -5.3 ± 1.9 mV로 측정되었다. 모든 시료는 3중 측정되었다.

실시예 24.

실시예 19의 나노입자의 루테인 포집 효과는 UV-Vis 분광광도법으로 측정되었다. 간략하게 설명하자면, 6 mg PLGA-루테인 나노입자 분말은 초음파처리에 의해 600 μL의 물에 재현탁되었고, 이어서 5.4 mL의 아세토니트릴이 추가되었다. 혼합물은 4 시간 동안 볼텍스되었고, 백색 펠렛을 획득하기 위하여 30,000 x g, 15 분 동안 4℃에서 원심분리되었다. 상청액이 수거되었고, 흡수도는 450 nm에서 UV-vis 분광광도계 (Genesys 6, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 측정하여 루테인 농도를 얻었다. 시료 및 표준 곡선은 3중 측정되었다. 측정된 루테인 포집 효과는 52 ± 3%이었다.

실시예 25.

현탁된 루테인-함유 PLGA 나노입자가 포함된 즉석 생체부착 겔 제형의 준비:

루테인-포집된 나노입자의 비이클로써 이들 실험에서 이용된 즉석 생체부착 겔은 2.7% (w/w) 생체부착 폴리머 (폴리에틸렌 옥사이드, Polyox™ 1105, Dow 화학적, MW ~900,000), 및 16.5% (w/w) Poloxamer P407 (폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 인접된 2개의 친수성 블록을 포함하는 삼중블록 코폴리머; 2개의 PEG 블록의 적절한 길이는 101개의 반복 단위이며, 그리고 프로필렌 글리콜 블록의 적절한 길이는 56개 반복 단위임)의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 옥사이드 - Poloxamer P407 혼합물은 순조롭게 열가역적 겔을 형성한다. 폴리에틸렌 옥사이드 1105 및 Poloxamer P407은 사용될 때까지 멸균 수에 각각 별도로 분산되어 있었다. 폴리에틸렌 옥사이드/Poloxamer 혼합물은 분산물을 혼합함으로써 준비되며, 이 혼합물은 사용전 까지 냉장고 (4℃)에 보관되었다. 루테인-함유 나노입자는 연속적인 부드러운 교반하에 생체부착 즉석 겔 형성 매트릭스에 나중에 추가되었다.

상기 생체부착 매트릭스는 생체부착 성질을 가진 또다른 폴리머, 코폴리머, 또는 폴리머의 혼합물 또는 코폴리머를 임의선택적으로 포함할 수 있는데, 예를 들면 폴리아크릴산 유도물질들, 셀룰로오스 유도물질들, 폴리카르보필, 다른 폴리에틸렌 옥사이드, 히알루론산 유도물질들, 펙틴, 카라기난, 알긴산염 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 매트릭스는 생체부착성이어야 하고, 열민감성이어야 하고 (겔을 형성하고, 체온 또는 더욱 구체적으로 결막낭 온도에서 나노입자를 서서히 방출하거나), 안구 점막에 의해 잘 용인되어야 하고, 나노입자와 필적가능해야 하고, 분산된 생물활성 성분의 제어된 그리고 재생가능한 방출을 실행해야 하고, 그리고 국소 투여 후 연장된 유지를 나타내어야 하는 것이 바람직하다.

폴록사머와 폴리에틸렌 옥사이드의 바람직한 생체부착 매트릭스 조합은 몇 가지 유익한 성질 및 특징을 제공한다: 폴록사머는 안구 점막과 양립가능하다. 폴록사머는 더 높은 농도 및 온도에서 안정적이고, 견고한 겔을 형성하는 열가역적 폴리머이며, 이는 자체적으로 국소적으로 적용하기 곤란할 수 있다. 저온에서 폴리머는 수성 용액-액체에 유지된다. 온도가 상승될 때, 폴리머는 겔을 형성한다. 바람직하게는 상기 조성물은 실온에서 액체이지만, 체온(또는 더 구체적으로 결막낭 온도-이는 체온보다 2-3도 낮다)에서 겔이 되며, 이로써 이 조성물이 각막의 표면 상에 결을 형성한 후 활성 성분의 방출을 허용한다. 폴리에틸렌 옥사이드는 양호한 결합 성질을 갖는다. 폴리에틸렌 옥사이드 1105 (작은 내지 중간 분자량 범위를 가진)는 이의 유동학 특징으로 인하여 바람직한 화합물이다. 폴리에틸렌 옥사이드는 또한 안구 점막과 양립가능하다. 폴록사머와 폴리에틸렌 옥사이드의 혼합물은 각막, 결막낭으로 액체로써 용이하게 적용되는 산물을 제공하고, 그리고 체온에서 결막과 접촉된 후 겔을 형성한다. 상기 혼합물은 국소 투여 후 연장된 유지를 위하여 강화된 생체부착 성질을 가지고, 그리고 따라서 눈과 망막의 내부가 포함된, 눈에 루테인의 개선된 생물이용성을 갖는다. 이들 비이온성 폴리머는 생물활성 성분들과 양립불가능성을 나타내어서는 안된다.

비록 상기에서 설명된 바와 같이 열가역적 겔을 형성할 수 있는 방울로써 나노입자를 투여하는 것이 바람직하지만, 다른 투여 경로가 또한 이용될 수 있다. 상기 폴리머 성분들은 임의선택적으로 생략될 수 있다. 당분야에 공지된 다른 약학 제형은 임의선택적으로 이용될 수 있고 - 가령, 액체 눈 조제물 (점안약, 점안 로션, 겔-형성 용액); 반고형 눈 조제물 (연고, 겔); 고형 눈 조제물 (분말, 안구 삽입물); 또는 에어로졸 (압력 하에 기체와 혼합된 안과 약물)로 이용될 수 있다.

ll 조제물은 라미나 공기 유동 후드 안에서 무균으로 제작되었고, 이미 살균된 용기내 보관되었다. 임의의 조제물에 보존제가 추가되지는 않았다.

다양한 비율을 테스트하기 위한 관례적인 실험을 통하여 다양한 성분들의 비율 및 농도가 최적화되어, 각막 상에 정체 시간을 보강하고, 각막으로의 침투가 강화된다. 현재까지 구체예들에서 테스트된 전형적인 범위는 1.5-3.5% (w/w) 범위의 폴리에틸렌 옥사이드 1105 및 12-19% (w/w) 범위의 Poloxamer P407이 포함되었다.

생체부착 매트릭스는 양호한 나노입자 분산을 만들어야 하며, 보관 동안 균질성을 유지하기 위한 충분한 점성을 보유해야 하며(물리적 안정성), 결막 점막에 용이하게 적용되어야 하며, 나노입자 조제물에 이용된 물질과 양립가능해야 한다.

안약 조제물에서 나노입자의 농도에 따라, 생체부착 / 열민감성 폴리머의 농도는 점성 및 생체 결합 능력을 최적화하기 위하여 조정될 수 있다. 구체화된 루테인-함유 나노입자의 필요한 w/v%는 루테인의 부하에 달려있다. 현재까지, 우리는 주로 1-5% w/v% 범위에서 생체부착 겔에 루테인 부하를 테스트하였다. 더 높은 농도와 더 낮은 농도들이 또한 테스트되거나 또는 이용될 수 있다.

적절한 비율의 적합한 폴리머를 혼합함으로써 다른 생체부착 겔-형성 매트릭스가 준비될 수 있다. 생체부착 폴리머의 예로는 하나 또는 그 이상의 폴리아크릴산, 폴리카르보필, 폴리에틸렌 옥사이드, 셀룰로오스 유도물질들, 히알루론산 유도물질들, 펙틴, 카라기난, 알긴산염, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 수행을 최적화하기 위하여 분자량이 선택될 수 있다.

실시예 26-32: 동물 치료

4마리의 새끼를 밴 Wistar 암컷 알비노 렛을 Laboratory Animal Facility of the Iuliu Hatieganu University of Medicine and Pharmacy in Cluj-Napoca, Romania으로부터 구하였다. 각 암컷 렛과 이의 어린 새끼들은 일정한 온도(22℃) 의 12시간 빛 주기의 플라스틱 우리에 가두었고, 미가공 음식 및 수돗물에는 자유롭게 접근할 수 있었다. 12일령되는 시점에, 렛 새끼는 다음과 같이 7개 군으로 무작위로 나뉘었다:

1 군 (셀레나이트 군, 양성 대조): 루테인에 노출 없음

2 군 (PLGA-NP-1) 매일 위관 영양을 통하여 경구로 30% 올리브유 + 70% 가루 슬러리의 0.5mL 에멀젼에 분산된 2.5 mg/kg PLGA-NP-루테인를 제공받았는데, 이는 일일 체중량 kg 당 2.66 mg 루테인의 양에 상응한다. (가루 슬러리는 1 ml 물에 0.3g 밀가로를 혼합하여 준비되었다.)

3 군 (PLGA-NP-2) 매일 위관 영양을 통하여 경구로 30% 올리브유 + 70% 가루 슬러리의 0.5mL 에멀젼에 분산된 5 mg/kg PLGA-NP-루테인를 제공받았는데, 이는 일일 체중량 kg 당 5.32 mg 루테인의 양에 상응한다. (가루 슬러리: 집단 2에서 이용된 것과 동일

4 군 (루테인) 매일 위관 영양을 통하여 경구로 30% 올리브유 + 70% 가루 슬러리의 0.5mL 에멀젼에 분산된 0.00525 mg 변형안된 루테인을 제공받았는데, 이는 일일 체중량 kg 당 0.125 mg 루테인의 양에 상응한다. (가루 슬러리: 집단 2에서 이용된 것과 동일)

5 군 (HG-PLGA-NP-1) 하루 한번 국소적으로 실시예 19의 생체부착 하이드로겔 안에 1 wt% PLGA-NP-루테인의 각각 제공(각 눈에 한 방울). (30 mg의 동결건조된 루테인-로딩된 PLGA NPs는 3 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 0.9444g/mL.이다)

6 군 (HG-PLGA-NP-2) 하루 한번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 3% PLGA-NP-루테인의 각각 제공(각 눈에 한 방울). (90 mg의 동결건조된 루테인-로딩된 PLGA NPs는 3 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 0.9444g/mL.이다)

7 군 (음성 대조) - 셀레나이트에 노출안됨, 루테인 치료 없음

분만 후 13일차, 30 μmol/kg의 셀레나이트 나트륨(Na₂SeO₃)의 한번의 복막 주사에 의해 1-6군의 모든 동물들로부터 백내장이 유도되었다. 후속적으로 집단 2-6의 동물은 매일 상기에서 설명된 프로토콜에 따라 매일 처리되었다. PLGA-NPs (42.61 μg 루테인/mg PLGA-NP)의 루테인 함량은 외부 표준 교정과 함께 UV-VIS 분광광도법 (450 nm)에 의해 평가되었다. 분만 후 21일차 백내장 발생은 세극등(slit-lamp) 검사에 의해 평가되었다. 눈은 5개 단계중 하나로 등급화된다: 단계 0 (백내장 없음), 단계 1 (약간의 핵 혼탁), 단계 2 (가벼운 핵 혼탁, 핵의 직경 절반 미만으로 중앙부 잠깐의 혼탁), 단계 3 (진한 혼탁, 핵의 직경 절반 이상 중앙부 잠깐의 혼탁) 및 단계 4 (진한 전체 핵에 걸쳐 백색 혼탁). 통계는 SPSS 14.0, Windows 및 Excel에서 실행되었다. Shapiro-Wilk 테스트로 정상적인 분포에 대한 변수를 점검하였다. Wilcoxon 테스트로 군들이 비교되었다. 통계학적 유의성은 P < 0.05에서 설정되었다.

모든 생물학적 실험은 Ethics Commission of the Iuliu Hatieganu University of Medicine and Pharmacy Cluj-Napoca에 의해 승인되었고, 그리고 실험 동물 이용과 관련된 EC directive 86/609/EEC에서 실행되었다.

결과

실시예 33-39

표 5는 다양한 군들에 대한 백내장 중증도의 관찰된 분포를 나타낸다. 음성 대조에서 모든 동물은 백내장 증상을 보이지 않았다 (단계 0). 셀레나이트 양성 대조에서 모든 동물은 양측, 단계 4 백내장이 발생되었다.

2 군에서 62.5 mg/kg PLGA-NP-루테인 (2.66 mg 루테인/kg의 투여분량과 대등)으로 경구로 처리한 후, 3마리 동물에서 단계 4 백내장 발생되었고, 한 마리 동물에서 단계 2 백내장이 발생되었고, 그리고 한 마리 동물에서 단계 1 백내장이 발생되었다. 3 군에서 125 mg/kg PLGA-NP-루테인 (5.32 mg 루테인/kg의 투여분량과 대등)으로 경구로 처리한 후, 3마리 동물에서 단계 4 백내장 발생되었고, 2 마리 동물에서 단계 2 백내장이 발생되었고, 그리고 한 마리 동물에서 단계 2 백내장이 발생되었다. 4 군에서, 0.125 mg/kg 루테인으로 경구 처리 후, 2마리 동물에서 단계 4 백내장이 발생되었고, 두 마리에서 단계 3 백내장이 발생되었고, 한 마리는 단계 2 백내장이 발생되었다. 5 군에서, 생체부착 하이드로겔에서 1% PLGA-NP-루테인으로 국소 처리되었고, 한 마리 동물은 단계 3 백내장이 발생되었고, 다른 4마리 동물은 단계 2 백내장이 발생되었다. 6군에서 생체부착 하이드로겔에서 3% PLGA-NP-루테인으로 국소 처리 후, 한 밀 동물은 단계 4 백내장이 발생되었고, 한 마리 동물은 단계 3 백내장이 발생되었고, 한 동물은 단계 2 백내장이 발생되었고, 그리고 2마리 동물은 오직 단계 1 백내장이 발생되었다.

논의

셀레나이트 단일 주사는 1군에서 양성 대조 동물 100%에서 단계 4 핵 백내장을 유도하였다. 음성 대조 군 7로부터 백내장이 발생된 동물은 없었다. 양성 및 음성 대조 모두 예측된 방식으로 반응하였기 때문에, 환경 영영으로부터 복합 인자들의 가능성은 배제할 수 있다. 오직 루테인으로 경구 치료를 받았거나, 또는 폴리머 나노입자 안에 포집된 루테인으로 경구 치료를 받은 동물에서 백내장 발생의 단지 작은 감소(통계학적으로 유의성이 없는)가 있었다. 그러나, 폴리머 나노입자 안에 포집된 루테인을 가진, 신규한 국소 생체부착 제형의 각막 적용에 의해 국소적으로 처리된 동물에서 백내장 발생에 실질적인 그리고 유의적인 감소가 있었다.

이들 결과에서 신규한 제형은 치료요법적으로 효과적인 농도로 루테인을 눈으로 전달함에 있어서 매우 효과적임을 보여주었다. 신규한 제형에 의해 전달된 루테인은 눈의 모든 구조적 성분에서 아마도 산화성 스트레스를 감소시킴으로써, 셀레나이트-유도된 백내장으로부터 보호하였다. 폴리머 나노입자 안에 포집된 루테인을 가진 국소 생체부착 제형은 루테인의 안구 생물이용성을 증가시켰다.

실시예 40-46: 추가 동물 치료.

9마리의 새끼를 밴 Wistar 암컷 알비노 렛을 Laboratory Animal Facility of the Iuliu Hatieganu University of Medicine and Pharmacy in Cluj-Napoca, Romania으로부터 구하였다. 각 암컷 렛과 이의 어린 새끼들은 일정한 온도(22℃) 의 12시간 빛 주기의 플라스틱 우리에 가두었고, 미가공 음식 및 수돗물에는 자유롭게 접근할 수 있었다. 각 암컷 쥐의 새끼는 다음과 같이 9가지 연구 집단중 하나를 구성하였다:

1 군 (셀레나이트 군, 양성 대조): 루테인에 노출 없음

2 군 (루테인 - 426) 하루 한번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 변형안된 루테인 (426 μg 루테인/ml)의 국막 적용 (각 눈에 한 방울) 3.21 mg 미세하게 갈린 순수 루테인은 7.53 ml의 생체부착 하이드로겔로 분쇄에 의해 분산되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.023 g/mL.이다) 루테인의 최종 농도 (426 μg 루테인/ml)는 하이드로겔 안에 1 wt% 루테인-로딩된 나노입자에 대등하였다. (2, 4, 및 7 군의 각 동물이 대략적으로 동일한 농도의 루테인을 제공받도록 하는 것이 의도이다.)

3 군 (루테인 - 2130) 하루 한번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 변형안된 루테인 (2130 μg 루테인/ml)의 국막 적용 (각 눈에 한 방울) 11.99 mg 미세하게 갈린 순수 루테인은 5.63 ml의 생체부착 하이드로겔로 분쇄에 의해 분산되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.023g/mL.이다) 루테인의 농도 (2130 μg 루테인/ml)는 하이드로겔 안에 5 wt% 루테인-로딩된 나노입자에 대등하였다.

4 군 (PLGA-NP-루테인 426) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 426 μg 루테인/mL (실시예 20, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 375.7 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자는 15.25 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

5 군 (PLGA-NP-1278) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 1278 μg 루테인/mL (실시예 20, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 379.9 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자는 5.14 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

6 군 (PLGA-NP-2130) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 2130 μg 루테인/mL (실시예 20, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 376.7 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 PLGA 나노입자는 3.06 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

7 군 (제인-NP-426) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 426 μg 루테인/mL (루테인-로딩된 제인 나노입자, 실시예 21)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 252.1 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 제인 나노입자는 8.81 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

8 군 (제인-NP-1278) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 1278 μg 루테인/mL (루테인-로딩된 제인 나노입자, 실시예 21)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 345.7 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 제인 나노입자는 4.03 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

9 군 (제인-NP-2130) 하루 한 번 국소적으로 생체부착 하이드로겔 안에 2130 μg 루테인/mL (루테인-로딩된 제인 나노입자, 실시예 21)으로 각막 적용(각 눈에 1 방울) 346.1 mg의 동결건조된, 루테인-로딩된 제인 나노입자는 2.42 ml의 생체부착 하이드로겔에 용해되었다. 한 방울의 하이드로겔 용적은 대략 0.012 mL, 밀도는 1.040g/mL.이다)

분만 후 13일차, 30 μmol/kg의 셀레나이트 나트륨(Na₂SeO₃)의 한번의 복막 주사에 의해 각 1-9군의 모든 동물들로부터 백내장이 유도되었다. 후속적으로 집단 2-9의 동물은 매일 상기에서 설명된 프로토콜에 따라 매일 처리되었다. PLGA-NPs (17.29 μg 루테인/mg PLGA-NP) 및 제인-NPs (14.89 μg 루테인/mg 제인-NP)의 루테인 함량은 외부 표준 교정과 함께 UV-VIS 분광광도법 (445 nm)에 의해 평가되었다. 분만 후 21일차 백내장 발생은 세극등(slit-lamp) 검사에 의해 평가되었다. 눈은 5개 단계중 하나로 등급화된다: 단계 0 (백내장 없음), 단계 1 (약간의 핵 혼탁), 단계 2 (가벼운 핵 혼탁, 핵의 직경 절반 미만으로 중앙부 잠깐의 혼탁), 단계 3 (진한 혼탁, 핵의 직경 절반 이상 중앙부 잠깐의 혼탁) 및 단계 4 (진한 전체 핵에 걸쳐 백색 혼탁). 통계는 SPSS 14.0, Windows 및 Excel에서 실행되었다. Shapiro-Wilk 테스트로 정상적인 분포에 대한 변수를 점검하였다. Wilcoxon 테스트로 군들이 비교되었다. 통계학적 유의성은 P < 0.05에서 설정되었다.

결과

실시예 48-54

표 6은 다양한 군들에 대한 백내장 중증도의 관찰된 분포를 나타낸다.

Saphiro Wilk 테스트에 따라, 데이터 세트중 어느것도 정상적으로 분포되지 않았다. 따라서 Wilcoxon 통계학적 테스트가 적용되었다. 6 군 (PLGA-NP-5)에서 적은 수의 새끼로 인하여, 6 군의 데이터는 통계학적으로 추가 평가에 유효한 것으로 간주되지 않았다. 5 군 (PLGA-NP-1278), 8 군 (제인-NP-1278) 및 9 군 (제인-NP-2130)은 대조(1 군)으로부터 통계학적으로 유의적인 차이를 보였다 (p<0.05).

논의

양성 대조 군 (1 군)과 루테인-처리된 군들(2-9군)의 비교에서, 오직 5, 8 및 9 군 (5 군, p=0.001; 8 군, p=0.05; 및 9 군, p=0.05) 만이 백내장 발달에 있어서 통계학적으로 유의적인 감소를 보였다. 대조적으로, 농도와 무관하게 (426 μg 루테인/ml 또는 2130 μg 루테인/ml) 생체부착 하이드로겔 안에 변형 안된 루테인으로 처리된 렛 새끼의 눈에서 백내장 발생에서 단직 작은, 그리고 통계학적으로 무의미한 감소가 있었다. 대조적으로, 폴리머 나노입자에 로딩된 루테인, 그리고 하이드로겔 안에 통합된 루테인은 치료요법적으로 효과적인 양으로 루테인을 눈으로 성공적으로 전달하였다 (5, 8 및 9 군). 비록 5군 (PLGA-NP-1278)이 더욱 선호적인 결과를 전달한 것으로 보이지만, PLGA 나노입자보다 제인 안에 동일한 루테인 적하를 가진 8군 (제인-NP-1278)과는 통계학적으로 차이가 없었다(p=0.112).

이 점에서 우리 결과는 생체부착 하이드로겔 안에 통합된 나노구조의 폴리머 전달체로 루테인을 눈으로 전달하는데 분명한 유익한 효과를 보여준다. 그러나, 이용된 2개 폴리머 (제인과 PLGA)를 등급화하는 것은 시기상조다. 신규한 제형에 의해 전달된 루테인은 각막에서 산화성 스트레스를 감소시킴으로써, 셀레나이트-유도된 백내장의 영향을 성공적으로 저지하였다. 발명자가 아는 한, 이는 국소 제형에 의해 치료요법적으로 효과적인 양으로 루테인을 눈으로 성공적으로 전달한 첫 보고가 된다.

실시예 55 - 다른 항산화제들

본 발명의 원형(prototype) 구체예는 눈으로 전달하기 위하여 루테인을 이용하였다. 본 발명은 다른 항산화제들, 이를 테면 베타-카로틴, 라이코펜, 레티놀, 및 다른 카로테노이드를 전달하는데 또한 이용될 수 있다. 본 발명은 항산화제들을 필요한 다른 조직, 예를 들면 피부로 전달하는데 이용될 수 있다.

기타

명세서 및 청구범위에서 이용된 바와 같이, 조성물의 "치료요법적 효과량＂은 눈 질환의 증상, 이를 테면 백내장, 건조 황반 변성 또는 습식 황반 변성 (노화 관련된 황반 변성), Stargardt 질환, 또는 색소성 망막염을 방지, 저해, 진행의 지연 또는 치료하는데 치료요법적으로 효과적인 충분한 조성물의 양을 말한다. 내용에서, 조성물의 "치료요법적 효과량＂은 조직에 국소적으로 투여될 때, 조직 또는 이웃 조직에 임상적으로 유의적인 효과를 가지도록 이 조직에 항산화제의 농도를 전달하는데 충분한 양을 또한 지칭할 수 있다.

본 출원에서 언급된 모든 자료의 완전한 명세서는 참고자료에 편입된다. 또한, 2014년 8월 11일자에 제출된 미국 가출원 62/035,683, 및 2015년 6월 8일에 제출된 미국 가출원 62/172,455의 2개 우선원 출원의 완전한 명세서가 참고자료에 편입된다. 양립불가한 충돌이 있는 경우, 본 명세서가 우선할 것이다.

Claims

백내장 또는 황반 변성을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이의 개시를 지연시키기 위한 포유동물 눈에 국소 투여용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 나노입자 및 하이드로겔의 혼합물을 포함하고, 그리고
(a) 상기 나노입자는 (i) 합성 폴리머 또는 단백질 (여기서 상기 폴리머 또는 단백질은 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 제인을 포함한다); (ii) 루테인, 그리고 (iii) 계면활성제를 포함하고; 여기서 상기 폴리머 또는 단백질은 상기 루테인을 포집하고; 여기서 상기 계면활성제는 상기 폴리머 또는 단백질과 결합되고; 여기서 상기 나노입자는 50 nm 내지 250 nm의 직경을 갖고; 여기서 상기 나노입자는 고유 루테인보다 더 친수성이고; 여기서 상기 나노입자 내에 루테인은 산소에 의한 분해, 자외선 (ultraviolet light)에 의한 분해, 또는 둘 모두에 의한 분해에 대해 자유 루테인보다 더 큰 저항성을 갖고;
(b) 상기 하이드로겔은 물, 열가역적 겔-형성 폴록사머 및 생체부착 폴리머의 혼합물을 포함하고; 여기서 상기 조성물은 25℃에서 액체이고; 여기서 상기 열가역적 겔-형성 폴록사머는 상기 조성물이 포유동물의 결막낭 또는 각막 표면의 온도에서 겔이 되도록 하고; 그리고 여기서 상기 생체부착 폴리머는 이러한 생체부착 폴리머가 없을 때 상기 겔이 각막 점막 및 각막에 부착되는 것보다 더 강력하게 상기 겔이 각막 점막 및 각막에 부착되도록 하고; 그리고
(c) 상기 조성물은 액체로서 각막의 표면에 또는 결막낭 내로 제공되도록 적합되고; 여기서 결막낭 또는 각막 표면의 온도는 상기 조성물이 겔을 형성하게 만들고; 여기서 상기 겔은 결막 점막, 각막의 표면, 또는 이둘 모두에 부착되고; 그리고 부착되는 겔은 일정 시간에 걸쳐 루테인을 눈으로 방출시키는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 폴리머 또는 단백질은 제인을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 폴리머 또는 단백질은 폴리(락트-코-글리콜산)을 포함하는, 조성물.
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청구항 1에 있어서, 생체부착 폴리머는 폴리에틸렌 옥사이드를 포함하는, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 노화 관련된 황반 변성을 치료하기 위한, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 노화 관련된 황반 변성의 개시를 예방하거나 또는 지연시키기 위한, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 백내장의 증상을 완화시키기 위한, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 백내장의 개시를 예방하거나 또는 지연시키기 위한, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 루테인을 각막에 전달하도록 적합된, 조성물.
청구항 제 1항에 있어서, 루테인을 망막에 전달하도록 적합된, 조성물.
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