BR112013000675B1

BR112013000675B1 - Nanopartícula, processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico, composição e produto alimentar

Info

Publication number: BR112013000675B1
Application number: BR112013000675-7A
Authority: BR
Inventors: Maite Agüeros Bazo; Irene Esparza Catalán; Carolina González Ferrero; Carlos Javier González Navarro; Juan Manuel Irache Garreta; Ana Romo Hualde
Original assignee: Universidad De Navarra; Centro Nacional De Tecnología Y Seguridad Alimentaria, Laboratorio D
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2021-07-20
Also published as: JP2013532630A; PT2594140T; KR101933024B1; JP6046615B2; CN103037707A; AU2011278186B2; US9381252B2; WO2012007628A1; EP2594140A1; MX2013000636A; EP2594140B1; US20130116261A1; CA2805581A1; BR112013000675A2; AU2011278186A1; CN103037707B; KR20130045358A; ES2724176T3; MX338891B; DK2594140T3

Abstract

nanopartícula, processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico, processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína, um aminoácido básico e um composto biologicamente ativo solúvel em gordura, composição e produto alimentar. a presente invenção se refere às nanopartículas para a encapsulação de compostos, à obtenção e ao uso destas. as nanopartículas compreendem uma matriz de zeína e um aminoácido básico. as refereidas nanopartículas podem encapsular um composto biologicamente ativo solúvel em gordura ou solúvel em água. isso é aplicável no setor de cosméticos, farmacêutico e alimentar e no setor da nanotecnologia.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção está compreendida no setor de cosméticos, farmacêutico e alimentar e na área da nanotecnologia, e se refere à encapsulação de compostos biologicamente ativos que usam zeína como um agente de revestimento. A invenção se refere, particularmente, às nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico, úteis para encapsulação de compostos biologicamente ativos, assim como para obtenção e aplicação destes.

Fundamentos da Invenção

Indústrias, especialmente a de alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos precisam evoluir tecnologicamente a fim de atender às demandas dos novos consumidores. A nanotecnologia pode prover soluções interessantes para tais indústrias.

Particularmente, a nanotecnologia tem um grande potencial para revolucionar as indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de alimentos, uma vez que ela permite o encapsulamento de compostos biologicamente ativos [BACs], isto é, óleos essenciais, antioxidantes, minerais, probióticos, aromatizantes, vitaminas, etc., com o propósito de obter vários benefícios, por exemplo, aumentar a vida útil do produto, reduzir a quantidade de BACs a ser usado, controlar a liberação destes, aumentar a sua biodispoinibilidade, disfarçar sabores indesejáveis etc.

Antioxidantes, substâncias capazes de gerar benefício à saúde do consumidor, formam um grupo de BACs cujo uso suscita um interesse cada vez maior. A encapsulação de tais compostos antioxidantes, ou seja, da quercetina ou do resveratrol, em sistemas específicos (por exemplo, micropartículas ou nanopartículas), com o propósito de protegê-los e mantê-los estáveis durante a estocagem, é uma opção bastante interessante.

Até a data, a aplicação de compostos antioxidantes encapsulados está, de modo geral, limitada ao campo dos cosméticos e dos produtos farmacêuticos. A fim de ilustração, a encapsulação de quercetina em (i) nanocápsulas formadas

por ácido polilático co-glicólico (PLGA) e acetato etílico (Ghosh et aí., Life Sciences 2009;84:75-80), (ii) nanopartículas formadas por Eudragit® [polimetacrilato] e álcool polivinílico (Wu et al., Int J of Pharm 2008;346:160-168), e (iii) em micropartículas de lipídio formadas com fosfatidilcolina e tristearina (Sccalia and Mezzena, J Pharm Biomed Anal 2009;49:90-94) foram descritas. Da mesma forma, a encapsulação do resveratrol em (i) nanopartículas de policaprolactona (Lu et al., Int J of Pharm 2009; 375:89-96), (ii) micropartículas de pectina (Das and Ng, Int J of Pharm 2010;385:20-28), (iii) lipossomas (Caddeo et al., Int J of Pharm 2008;363:183-191), (iv) microesferas de quitosano (Peng et al., Food Chem 2010;121(1):23-28) e (v) microesferas de poliestireno (Nam et al., Polymer2005;46:8956-8963) tem sido descrita.

No entanto, a aplicação de compostos antioxidantes encapsulados no setor alimentício é muito limitada, uma vez que os materiais usados para encapsular tais compostos têm problemas quanto à toxidade ou não são aprovados para o uso em alimentos. Da mesma forma, o uso de compostos antioxidantes na projeção de alimentos funcionais é bastante limitado, entre outros fatores, devido à sua meia-vida curta, alta responsabilidade e baixa biodisponibilidade oral. A encapsulação de compostos antioxidantes, tais como a quercetina ou o resveratrol, para protegê-los no alimento e para mantê-los estáveis durante todo o seu período de armazenamento, permitindo, além disso, uma liberação controlada que aumenta a sua biodispoinibilidade no organismo, seria bastante desejável.

Conforme é conhecido, ao projetar um veículo adequado para encapsular um BAC, é muito importante selecionar corretamente o material usado como o agente de revestimento da matriz; para esse fim, a forma de dosagem, sua toxicidade, o produto no qual a formulação deve ser incorporada etc., devem ser levados em consideração, entre outros fatores.

No setor da nanotecnologia alimentar não é recomendável usar polímeros sintéticos, uma vez que eles podem causar problemas quanto à toxicidade. Embora polímeros naturais não tenham essas desvantagens, o seu uso requer o desenvolvimento de métodos mais complicados para produzir partículas, e, além disso, na maioria dos casos, o tamanho da partícula obtida (geralmente maior do que 100 μm) é difícil de ser controlado, portanto, tais micropartículas podem ser percebidas pelo consumidor e alterar as características organolépticas do alimento alvo.

O uso de proteínas, tanto as de origem animal, por exemplo, caseína, albumina etc., e de origem vegetal, por exemplo, prolaminas etc. (ES 2269715, US 2004/86595, US 5679377) como agentes de revestimento de BAC, tem sido descrito.

A zeína é a principal proteína de armazenamento presente na semente de grão de milho. Ela é uma proteína globular que pertence ao grupo prolamina, uma vez que ela tende a ter um grande número de aminoácidos de prolina e glutamina e é caracterizada por sua alta insolubilidade na água. Em anos recentes essa proteína vem se tornando muito importante no campo científico e industrial devido às suas propriedades físico-químicas particulares e à sua estrutura molecular, uma vez que possui características anfifílicas e pode formar diferentes estruturas de automontagem de acordo com os compostos hidrofílicos-lipofílicos presentes no meio (Wang et al., Food Biophysics2008;3:174-181). Portanto, a zeína oferece um número potencial de vantagens, tais como matéria-prima de películas, uma vez que é capaz de formar revestimentos duros e hidrofóbicos com excelente flexibilidade e características de compressibilidade que são principalmente resistentes ao ataque de micróbios.

Como resultado dessas propriedades, novas aplicações têm sido encontradas para a zeína, tais como um adesivo, plástico biodegradável, goma de mascar, revestimento para produtos alimentares, fibras, pós cosméticos, microencapsuladores para pesticidas e tintas etc. Muthuselvi and Dhathathreyan, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces2006; 51: 39-43). Essa proteína também é usada pela indústria farmacêutica para revestir cápsulas com o intuito de protegê- las, liberá-las de forma controlada e disfarçar sabores e aromas indesejados (Shukla and Cheryan, Industrial Crops and Products 2001;13:171-192). Além disso, tem sido proposto a microencapsulação de insulina, heparina, ivermectina e gitoxina. Microesferas/micropartículas estáveis, mesmo com alta umidade e calor, as quais ainda são resistentes ao ataque de bactérias, são geralmente alcançadas (US5679377).

No entanto, o uso da zeína como um agente encapsulador no setor alimentício para a elaboração de alimentos funcionais com ingredientes encapsulados ainda é incipiente. Obter nanopartículas de zeína para encapsular óleos essenciais usando a técnica de separação de fase (Parris et a!., J Agric Food Chem 2005;53:4788-4792), como também a encapsulação de ácidos graxos de ômega 3 em tal proteína, por meio da aplicação da técnica de leito fluidizado para protegê-los da oxidação e para disfarçar suas características organoplásticas negativas quando eles são introduzidos em alimentos de interesse (MX2008003213), têm sido descritos. Além disso, a encapsulação de licopeno e do gaiato de polifenol epigalocatequina (EGCG) em fibras de zeina por meio da técnica de electrospinning (Fernandez et al., Food Hydrocolloids 2009;23:1427- 1432 and Li et al. J Food Sci 2009;74(3):C233-C240 respectivamente), lisozima por meio do processo SAS (anti-solvente supercritico) (Zhong et al. Food 5 Chemistry 2009;115(2):697-700) e oleo de peixe por meio do método de dispersão líquido-líquido (Zhong et al., J Food Process Pres 2009;33(2):255-270) foi alcançado recentemente. Esses trabalhos de técnicas de fabricação descritas são relativamente complexos e difíceis de dimensionar para aplicação na indústria, ou são exclusivamente limitados à encapsulação de compostos 10 lipofílicos e não são adequados para a encapsulação de compostos hidrofílicos.

Portanto, é necessário desenvolver sistemas versáteis para a encapsulação de compostos biologicamente ativos, os quais superam no todo ou em parte as vantagens mencionadas anteriormente, sendo adequados para transportar tanto os compostos solúveis em água como aqueles solúveis em 15 gordura, e, em particular, compostos cuja administração acarreta dificuldades, tal como é o caso dos compostos antioxidantes. Adicionalmente, também seria bastante desejável para tais sistemas poder ser obtido de maneira simples e ter a estabilidade adequada durante o seu armazenamento e após sua administração, o que facilitaria sua aplicação em diferentes setores tecnológicos, por exemplo, no 20 setor de cosmético, farmacêutico e alimentício.

Resumo da invenção

Descobriu-se que revestir tanto os compostos biologicamente ativos (BACs) solúveis em gordura quanto os solúveis em água com uma matriz de zeína e um aminoácido básico provê nanopartículas que formam um novo sistema 25 para encapsular e estabilizar tais BACs para a aplicação destes em alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos.

Vários testes realizados pelos inventores mostraram que a adição de um aminoácido básico juntamente com zeína facilita o processo para produzir tais nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico 30 devido ao fato de que isso permite usar soluções hidroalcoólicas com um percentual relativamente baixo de álcool para dissolver a zeína, o que, por sua vez, permite encapsular tanto os BACs solúveis em água como também os solúveis em gordura. Além disso, o uso de aditivos básicos ou solventes, os quais podem causar problemas de toxicidade, é prevenido, portanto, as propriedades 35 nutricionais das nanopartículas são melhoradas. Semelhantemente, o aminoácido básico confere estabilidade às nanopartículas, uma vez que a carga de superfície das partículas é aumentada, prevenindo esta última contra agregação.

Portanto, em um aspecto, a invenção se refere a nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico. Tais 5 nanopartículas podem ser usadas para encapsular BACs solúveis em gordura ou solúveis em água. Em uma modalidade particularmente preferencial, o BAC é um composto antioxidante. Além disso, tais nanopartículas podem ser usadas como aditivos tecnológicos [o aditivo encapsulado pode ser incorporado em matrizes nas quais ele não é solúvel, favorecendo uma dispersão uniforme no meio; a título 10 de ilustração, de acordo com a invenção, um BAC solúvel em água, encapsulado em tais nanopartículas, pode ser disperso em uma matriz aquosa, um processo que teria sido complexo, caso o BAC estivesse em sua forma livre (sem ser encapsulado)].

Tais nanopartículas são estáveis e capazes de proteger o BAC contra sua 15 degradação por meio de agentes externos, por exemplo, luz, mudanças no pH, oxidação etc., tanto durante o processamento do produto (por exemplo, produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos) como também durante seu armazenamento. Além disso, quando tais nanopartículas são administradas oralmente (por exemplo, alimento), elas protegem o BAC contra condições ácidas 20 do estômago e liberam o BAC no local desejado, por exemplo, no intestino.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para produzir tais nanopartículas vazias, isto é, sem BACs.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para produzir tais nanopartículas carregadas com um BAC, tal como um BAC solúvel em gordura ou 25 um BAC solúvel em água.

Tais processos são simples, aplicáveis em escala industrial e vantajosamente não incluem o uso de polímeros sintéticos ou reagentes que não são aprovados como aditivos alimentares, eles permitem minimizar a inclusão de surfactantes ou emulsificantes e ainda permitem obter nanopartículas de escala 30 nanométrica, com um tamanho de partícula controlável.

Em uma modalidade particular, tais processos compreendem, ainda, uma etapa adicional de secar a suspensão contendo tais nanopartículas com o propósito de obter uma formulação em forma de pó, o qual permite manter o BAC estável por mai tempo; as formulações em forma de pó são particularmente 35 adequadas para o uso em alimentos sólidos. A secagem de tais nanopartículas é vantajosamente realizada na presença de um agente protetor para as nanopartículas. As nanopartículas contendo um BAC obtido dessa maneira podem ser facilmente ressuspensas em um meio aquoso, protegendo o BAC de sua degradação em solução. O produto final obtido é estável e protege o BAC durante períodos de longo armazenamento e é, ainda, aplicável em diferentes tipos de alimentos, tanto líquidos (por exemplo, bebidas) como sólidos.

Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição compreendendo tais nanopartículas para uso no setor de alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos. De fato, tais nanopartículas podem ser incorporadas em cremes, géis e hidrogéis com o propósito de obter cosméticos estáveis ou preparações farmacêuticas adequadas para uso naqueles setores. Tais nanopartículas podem, igualmente, ser formuladas com excipientes adequados para sua administração tópica.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um produto alimentar compreendendo tal composição baseada em nanopartículas de zeína providas por esta invenção. Em uma modalidade particular, tal produto alimentar está na forma líquida, semi-líquida ou sólida.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 mostra imagens do microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de nanopartículas de zeína vazias. A) 8,000 x (a barra preta situada na margem inferior esquerda das imagens corresponde a uma referência de 200 nm). B) 15,750 x (a barra preta situada na margem inferior esquerda das imagens corresponde a uma referência de 100 nm).

Figura 2 mostra micrografias do microscópio eletrônico de varredura (SEM) de nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e lisina contendo resveratrol. As imagens correspondem a uma formulação em pó após ser lavada para remoção do sacarídeo protetor.

Figura 3 mostra imagens do microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e lisina contendo quercetina. A) 25,000 x (a barra preta situada na margem inferior esquerda das imagens corresponde a uma referência de 150 nm). B) 10,000 x (a barra preta situada na margem inferior esquerda das imagens corresponde a uma referência de 150 nm).

Figura 4 mostra a quantidade de quercetina encapsulada em nanopartículas (NP) compreendendo uma matriz de zeína e lisina, como uma função da quantidade de quercetina inicialmente incorporada na formulação.

Figura 5 mostra as micrografias do microscópio eletrônico de varredura (SEM) de nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e lisina contendo quercetina. As imagens correspondem à formulação em pó após ser lavada para remover o sacarídeo protetor.

Figura 6 mostra a concentração sérica de ácido fólico (ng/mL) como uma função de tempo, após a administração de diferentes formulações da vitamina em animais de laboratório. Os resultados mostram o desvio padrão ± principal (n = 5). (A) Via intravenosa (i.v.), dose de 1 mg/kg. (B) Via oral, dose de 1 mg/kg: ácido fólico não-encapsulado dissolvido em água (■); ácido fólico encapsulado em 10 nanopartículas de zeína dispersas em água (•).

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico e métodos para encapsulação de compostos biologicamente ativos (BACs) para o propósito de preservá-los contra a 15 degradação por agentes externos (por exemplo, luz, pH, oxidação etc.). Tais nanopartículas podem ser projetadas para permitir uma liberação controlada do BAC para o propósito de aumentar sua biodisponibilidade; a biodisponibilidade pode ser melhorada por meio de duas vias: por meio da liberação integral do BAC encapsulado no intestino (sua degradação minimizada na origem, na matriz 20 alimentar e/ou por meio do armazenamento como também por meio da proteção oferecida contra as condições acidificantes do estômago) e através de um efeito de liberação do BAC, de maneira controlada ou sustentada ao longo do tempo.

Definições

A fim de facilitar a compreensão a respeito da presente invenção, o 25 significado de vários termos e expressões, conforme eles são usados nessa descrição, é indicado abaixo.

Conforme usado aqui, um “aminoácido básico” se refere a uma molécula orgânica contendo um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxila (-COOH) e carga positiva; tal aminoácido básico é preferencialmente um aminoácido alfa básico tal 30 como lisina, arginina e histidina.

Conforme utilizado aqui, “aproximadamente" se refere a uma série de valores próximos a um valor específico, tal como ± 10% de um valor específico. Por exemplo, “aproximadamente 20” inclui ± 10% de 20, ou a partir de 18 a 22. Além disso, independentemente de o termo “aproximadamente" ser ou não 35 especificado, a pessoa versada na técnica entende que qualquer valor numérico expresso aqui abrange uma série limitada de valores. Tais variações de um valor específico podem resultar de erros experimentais durante a medição correspondente.

Conforme usado aqui, um “composto biologicamente ativo” ou “BAC” se refere a um composto que tem uma atividade cosmética, terapêutica e/ou nutricional; tal composto pode ser solúvel em gordura ou solúvel em água. Exemplos ilustrativos não limitados de BACs de acordo com a presente invenção incluem aminoácidos, agentes antimicrobianos, agentes aromatizantes, conservantes, edulcorantes, esteróides, drogas, hormônios, lipídios, peptídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos, proteínas, proteoglicanos, aromatizantes, vitaminas etc.

Conforme utilizado aqui, um “composto biologicamente ativo solúvel em água” ou “BAC solúvel em água” se refere a um composto que possui uma atividade cosmética, terapêutica e/ou nutricional e que é solúvel (muito solúvel, livremente solúvel, solúvel, pouco solúvel ou ligeiramente solúvel) em uma solução aquosa de acordo com os critérios definidos pela Royal Spanish Pharmacopoeia:

Exemplos ilustrativos não limitados de BACs solúveis em água incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias B ou C e seus derivados, sais ou ésteres; ácido hialurônico, sulfato de condroitina, ácido tióctico, sais e ésteres destes etc. Em uma modalidade particular, tal BAC solúvel em água é selecionado a partir do grupo consistindo de ácido fólico, ácido aminobenzóico 4, niacina, ácido pantotênico, monofosfato de tiamina, pirofosfato de tiamina, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutamínico (derivados de ácido fólico: poliglutamatos de folato; folatos de poliglutamato), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialúrico, ácido tióctico (ácido alfa-lipóico), ácido p- cumárico, ácido caféico, seus derivados farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

Conforme utilizado aqui, um “composto biologicamente ativo solúvel em gordura" ou “BAC solúvel em gordura” se refere a um composto que possui uma atividade cosmética, terapêutica e/ou nutricional e que é solúvel (muito solúvel, livremente solúvel, solúvel, pouco solúvel ou ligeiramente solúvel) em gorduras e óleos, de acordo com os critérios definidos pela Royal Spanish Pharmacopoeia. Exemplos ilustrativos nâo limitados dos BACs solúveis em gordura incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias A, D, E, K e seus derivados, fosfolipídios, carotenóides (carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), ácidos graxos de ômega 3 (ácido docosahexanóico (DHA), ácido eicosapentanóico (EPA), etc.), fitoestanóis e fitoesteróis (sitoesterol, campesterol, estigmasterol, etc.) polifenóis (quercetina, rutina, resveratrol, campferol, miricetina, isoramnetina, etc.) e derivados destes.

Um produto é tido como sendo produto de “grau alimentar" quando ele é seguro para o uso como alimento animal ou humano, de acordo com o Codex Alimentarieisde um país ou de uma organização, por exemplo, da Organização para Agricultura e Alimentos das Nações Unidas (FAO) ou da Organização Mundial da Saúde (WHO); consequentemente, um produto de “grau alimentar” é um produto não tóxico “adequado para o uso na alimentação”, portanto, ambas as expressões são sinônimos e são usadas sem distinção nessa descrição.

Conforme utilizado aqui, “meio aquoso” se refere a um meio compreendendo água. Em uma modalidade particular, o meio aquoso consiste, essencialmente, de água.

Conforme utilizado aqui, “meio hidroalcoólico" se refere a um meio compreendendo água e um álcool, em proporções relativamente variáveis. Em uma modalidade particular, tal meio hidroalcoólico compreende uma solução de etanol em água, em qualquer proporção relativa entre tais compostos.

Conforme utilizado aqui, “nanopartícula" se refere a sistemas coloidais do tipo esferas ou formas similares com um tamanho inferior a 1 micrômetro (μm), preferencialmente da ordem de 10 a 900 nanômetros (nm).

Conforme utilizado, “tamanho médio” se refere ao diâmetro médio da população de nanopartículas que se movem conjuntamente em um meio aquoso. O tamanho médio desses sistemas pode ser medido por meio de processos padrão conhecidos pela pessoa versada na técnica, os quais são descritos abaixo, por exemplo, na parte experimental (vide abaixo).

Conforme utilizado aqui, o termo “zeína” inclui qualquer proteína globular que pertence ao grupo das prolaminas; tal proteína é geralmente sintetizada durante o desenvolvimento do endosperma (tecido nutritivo formado no saco embrionário de semente de plantas e que normalmente forma um depósito alimentar para o embrião das sementes de várias plantas angiospermas). Zeína pode ser obtida a partir de qualquer fonte adequada, embora seja preferencialmente obtida a partir do milho. Vários métodos e técnicas para extração da zeína a partir do endosperma do milho são conhecidos; zeína comercial é geralmente extraída a partir da farinha de glúten de milho (US 2009/0258050).

O estudo acerca da zeína revela uma variabilidade extrema no nível genético e, portanto, uma situação complexa entre as diferentes proteínas que formam parte do grupo de proteínas conhecidas como zeínas. Zeína nativa é atualmente uma família grande e heterogênea de vários grupos de proteínas que diferem em seu tamanho molecular, solubilidade e carga. Estima-se que existem mais de vinte zeínas diferentes. A análise de extratos de zeína por meio da cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de troca de íon, cromatografia de exclusão de gel, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), focagem isoelétrica (IEF), análise de aminoácido e técnicas de clonagem de DNA têm levado a uma melhora compreensão acerca das proteínas de zeína.

A análise da composição dos aminoácidos de zeína revela uma grande quantidade de leucina, alanina, glutamina e fenilalanina; no entanto, lisina e triptofano estão ausentes ou, alternativamente, estão presentes em quantidades muito pequenas. A alta proporção de resíduos de aminoácido não polar e a ausência excepcional de grupos iônicos são responsáveis pela natureza hidrofóbica destes e pela sua particular solubilidade.

Os corpos de proteína de zeína são formados por três tipos de proteínas com estruturas diferentes: alfa-zeína (a-zeína), gama-zeína (y-zeína) [a qual inclui beta-zeína (β-zeina)], e delta-zeína (õ-zeína). Tais proteínas podem ser classificadas em quatro classes (a-zeína, β-zeina, y-zeína e õ-zeína), baseado nas diferenças em solubilidade e sequência. Zeína extraída sem agentes de redução formam uma grande família multigênica de polipeptídeos referidos como a-zeína, a-zeínas, geralmente a mais abundante fração de zeína nativa, contém cerca de 40 aminoácidos no terminal amino, o qual precede uma série de 9 ou 10 peptídeos repetidos de 20 aminoácidos. Acredita-se que essas repetições sejam a-hélices que enrolam a proteína em uma molécula em forma de bastão.

As outras frações de zeína (β-, y-, e õ-zeína) devem ser extraídas usando- se soluções alcoólicas de alcoóis contendo agentes de redução para quebrar as ligações de dissulfeto. A título de ilustração, mercaptoetanol é usado para extração em laboratório, β-, y-, e õ-zeínas não mostram sequência homóloga com a-zeína. y-zeína é solúvel tanto em solventes aquosos como em alcoólicos em condições de redução. Cada uma das y-zeínas tem uma sequência única de terminal N. A título de exemplo, na y-zeína de 50 kDa, essa região tem 136 aminoácidos de comprimento e é bastante rica em histidina. A y-zeína de 27 kDa tem uma série de oito repetições em par de um hexapeptídeo que produz 11 aminoácidos após o terminal amino. Os oito primeiros aminoácidos da proteína y- zeína de 16 kDa são idênticos àqueles da y-zeína de 27 kDa, porém a y-zeina de 16 kDa tem três versões degeneradas de repetições ricas em prolina. y-zeína normalmente representa entre 10 e 15% do total das zeínas. β-zeina, a qual é relacionada à y-zeína, inclui um polipeptídeo de 17 kDa rico em metionina e constitui até 10% da zeína total. Aproximadamente os últimos 140 aminoácidos de β- e y-zeínas são 85% idênticos, β-zeina não tem peptídeos repetitivos e parece ser constituída, em sua maioria, de β-camadas e conformação de transformação. õ-zeína é uma proteína de 10 kDa e é uma fração menor de zeína. õ- zeínas são as mais hidrofóbicas do grupo, não contêm peptídeos repetitivos e são excepcionalmente ricas em cisteína e metionina.

A zeína tem sido considerada como um produto “Geralmente Reconhecido como Seguro” (GRAS) pela Administração de Medicamentos e Alimentos (Estados Unidos) desde 1985 [CAS (Chemical Abstract Service) número 9010-66- 6).

Na presente invenção, a fonte ou o grau de zeína não está limitada a uma zeína individual e, de fato, qualquer zeína pode ser usada para colocar em prática a presente invenção. A título de ilustração, as zeínas comerciais que podem ser usadas na presente invenção incluem, sem que estejam limitadas a isso, a zeína fornecida pela Sigma-Aldrich (número do produto Z 3625); Wako Puras Chemical Industries (números dos produtos 261-00015, 264-01281 e 260-01283); Spectrum

Chemical (números dos produtos Z1131 e ZE105); unidades ScienceLab SLZ1150; SJZ Chem-Pharma Company (nome do produto ZEIN (GLIDZIN); Arco Organics (números de catálogo 17931-0000, 17931-1000, e 17931-5000); e Freeman Industries, grau regular de zeína F4000, grau regular de zeína F4400, 5 grau especial de zeína F6000, etc. Em uma modalidade particular, a zeína comercial fornecida pela Sigma-Aldrich (número do produto Z 3625), obtida a partir do milho, é usada.

Conforme utilizado aqui, o termo “zeína” inclui tanto a zeína nativa como a zeína modificada. O termo “zeína modificada” inclui qualquer zeína que tem uma 10 sequência de aminoácido que normalmente não ocorre naturalmente, mas que se comporta de modo similar às zeínas autênticas e que são solúveis em álcool. Substituições de aminoácido, especialmente aquelas que não modificam substancialmente a hidrofobicidade, podem ser introduzidas. A título de ilustração, substituições de aminoácido podem ser realizadas dentro das seções repetidas, 15 ou um aminoácido individual pode ser substituído e substituições também podem ser realizadas nos segmentos contendo os domínios das sequências repetidas. Inserções e substituições também podem ser introduzidas no terminal carboxila e no terminal amino da molécula de zeína. Adicionalmente, deleções podem ser realizadas na sequência de aminoácido, contanto que a proteína resultante seja 20 funcionalmente equivalente à zeína, ou seja, que mantenha suas propriedades.

Nanopartículas da Invenção

Em um aspecto, a invenção se refere a uma nanopartícula, doravante nanopartícula da invenção, compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico.

Virtualmente, qualquer zeína pode formar a matriz da nanopartícula da invenção; no entanto, em uma modalidade particular, tal zeína é uma zeína a partir do milho, tal como a zeína fornecida pela Sigma-Aldrich (número do produto Z 3625).

Em uma modalidade particular, tal aminoácido básico é selecionado a partir 30 do grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e misturas destes.

As nanopartículas da invenção podem ser usadas para encapsular um composto biologicamente ativo (BAC). As nanopartículas da invenção podem, ainda, ser usadas como aditivos tecnológicos, por exemplo, facilitando a incorporação de um BAC solúvel em gordura em uma matriz aquosa etc.

Portanto, em outra modalidade particular, a nanopartícula da invenção compreende, adicionalmente, um BAC. Tal BAC pode ser um BAC solúvel em água ou um BAC solúvel em gordura; nesse caso, a nanopartícula da invenção é ocasionalmente identificada nessa descrição como “nanopartícula carregada da invenção", a fim de diferenciá-la de outras nanopartículas da invenção, as quais não contêm BACs (ocasionalmente identificadas como “nanopartículas vazias” da invenção").

Em uma modalidade particular, tal BAC é um BAC solúvel em gordura. Em uma modalidade particular, tal BAC solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo consistindo de: a) um polifenol; b) uma vitamina da família das vitaminas A, D, E ou K; c) um precursor ou um derivado de uma vitamina de acordo com b); d) um fosfolipídio; e) carotenóide; f) um ácido graxo; g) um fitostanol ou um fitosterol; h) um sal ou um éster de qualquer um dos compostos anteriores a) - g);e i) combinações destes.

Em uma modalidade particular, tal BAC solúvel em gordura é: i) um polifenol, tal como, por exemplo, um flavonol (por exemplo, uma catequina, uma epicatequina, isorhamnetina, kaempferol,miricetina, quercetina etc.); uma antocianina (por exemplo, cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina, petunidina etc.); uma fitoalexina (por exemplo, resveratrol etc.); hidroxitirosol etc.; ii) uma vitamina solúvel em gordura, tal como, por exemplo, vitamina A e seus derivados (por exemplo, ácido retinóico, retinal, retinol etc.); vitamina E e seus derivados (por exemplo, um tocoferol, por exemplo, alfa-tocoferol, etc., um tocotrienol etc.); vitamina D e seus derivados (por exemplo, vitamina DÍ, vitamina D2 (ergocalciferol), vitamina D3 (colecalciferol), vitamina D4 (22- dihidroergocalciferol), vitamina D5 (sitocalciferol), etc.); vitamina K ou fitomenadiona e seus derivados (por exemplo, vitamina K1 (filoquinona), vitamina K2 (menaquinona), menadiona etc.); iii) um carotenóide, tal como, por exemplo, um caroteno (por exemplo, alfa-caroteno, beta-caroteno, criptoxantina, licopeno, etc.); uma xantofila (por exemplo, astaxantina, cantahaxantina, capsantina, criptoxantina, flavoxantina, luteína, rodoxantina, rubixantina, violaxantina, zeaxantina etc.); iv) um ácido graxo, tal como, por exemplo, um ácido graxo ômega 3 (por exemplo, um ácido a-linolênico (ALA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosahexanóico (DHA) etc.; uma ácido graxo ômega 6 (por exemplo, ácido y- linoléico etc.); ou v) um fitosterol ou um fitostanol (por exemplo, brassicasterol, campesterol, ergosterol, stigmasterol, sitostanol, sitosterol etc.).

Em uma modalidade específica, tal BAC solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo consistindo de um flavonol (por exemplo, quercetina etc.), uma antocianina, uma fitoalexina (por exemplo, resveratrol etc.), hidroxitirosol, ácido retinóico, retinal, retinol, calciferol (ergocalciferol e colecalciferol), alfa-tocoferol, tocotrienol, fitomenadiona, alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno, capsantina, luteina, zeaxantina, xantofila, EPA, DHA, ácido linoléico, campesterol, stigmasterol, sitosterol, seus derivados farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

Em uma modalidade mais especifica, tal BAC solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo consistindo de quercetina, resveratrol, seus derivados farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

Em uma modalidade mais específica, tal BAC solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo consistindo de quercetina, resveratrol, seus derivados farmacêutica e cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

Em outra modalidade particular, tal BAC é um BAC solúvel em água. Em uma modalidade mais particular, tal BAC solúvel em água é: a) uma vitamina da família B ou C; b) um derivado de uma vitamina de acordo com a); c) um composto selecionado a partir do ácido hialurônico, sulfato de condroitina e ácido tióctico; d) um sal ou um éster de qualquer um dos compostos anteriores a) - c); e e) combinações destes.

Em uma modalidade específica, tal BAC solúvel em água é selecionado a partir do grupo consistindo de ácido fólico, seus ésteres ou sais farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar e misturas destes.

O uso de nanopartículas da invenção como sistemas para encapsulamento de compostos antioxidantes é uma modalidade particular e preferencial.

Processo para obtenção das nanopartículas da invenção

Em outro aspecto, a invenção ser refere a um processo para produzir nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico (nanopartículas da invenção), doravante “processo [1] da invenção”, o qual compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica contendo uma zeína e um aminoácido básico; e b) adicionar água à solução da etapa a). A solução hidroalcoólica usada na etapa a) do processo [1] da invenção contém água e um álcool, tipicamente etanol; em uma modalidade particular, tal solução hidroalcoólica compreende entre 25% e 75% (w/v) de álcool, preferencialmente entre 30% e 60%, mais preferencialmente aproximadamente 50%. A quantidade de zeína que a solução hidroalcoólica formada na etapa a) do processo [1] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a quantidade de zeína contida em tal solução hidroalcoólica está compreendida entre 0,1% e 10% (w/v), preferencialmente entre 0,2% e 2,5%, mais preferencialmente entre 0,5% e 1%. A quantidade de aminoácido básico que tal solução hidroalcoólica formada na etapa a) do processo [1] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série. De modo geral, tal quantidade é normalmente expressa contendo a quantidade de zeína a ser dissolvida. Assim, embora a proporção em peso entre o aminoácido básico e a zeína [aminoácido básico : zeína] presente em tal solução hidroalcoólica geralmente depende do tipo de BAC a ser encapsulado e pode variar extensivamente, em uma modalidade particular, tal proporção aminoácido básico : zeína em peso está compreendida entre 1 : 0.01 e 1 : 50, tipicamente entre 1 : 0.5 e 1 : 25, preferencialmente entre 1 : 1 e 1 : 20, mais preferencialmente entre 1 : 5 e 1 : 15; em uma modalidade específica, a proporção de aminoácido básico : zeína em peso é aproximadamente 1 : 6.

Na etapa b) do processo [1] da invenção, água é adicionada em uma quantidade suficiente para a formação das nanopartículas da invenção. Embora a quantidade de água a ser adicionada possa variar dentre de uma ampla série, em uma modalidade particular, água é adicionada em uma quantidade suficiente para a proporção final de álcool no meio a ser compreendido entre 10% e 60% (w/v), preferencialmente entre 15% e 30%, mais preferencialmente entre 25%.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para produção de nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína, um aminoácido básico e um BAC solúvel em gordura (nanopartículas da invenção carregadas com um BAC solúvel em gordura), doravante “processo [2] da invenção”, o qual compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico; b) preparar uma solução alcoólica compreendendo um BAC solúvel em gordura e diluí-la com água para obter uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura; c) misturar tal solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico com tal solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura; e d) adicionar água à mistura resultante da etapa c).

A solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico 15 usado na etapa a) do processo [2] da invenção contém água e um álcool, tipicamente etanol; em uma modalidade particular, tal solução hidroalcoólica compreende entre 25% e 75% (w/v) de álcool, preferencialmente entre 30% e 60%, mais preferencialmente 50%. Tal solução hidroalcoólica (i) é preparada ao se misturar seus componentes nas quantidades adequadas. 20 A quantidade de zeína que tal solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico usado na etapa a) do processo [2] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a quantidade de zeína contida em tal solução hidroalcoólica (i) é compreendida entre 0,1% e 10% (w/v), preferencialmente entre 25 0,2% e 2,5%, mais preferencialmente entre 0,5% e 1%.

A quantidade de aminoácido básico que tal solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico usados na etapa a) do processo [2] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série. Tal quantidade será geralmente expressa de acordo com a quantidade de zeína a ser dissolvida. 30 Assim, embora a proporção em peso entre o aminoácido básico e a zeína [aminoácido básico : zeína] presente em tal solução hidroalcoólica (i) pode variar extensivamente, em uma modalidade particular, tal proporção de aminoácido básico : zeína em peso está compreendida entre 1 : 0.01 e 1 : 50, tipicamente entre 1 : 0.5 e 1 : 25, preferencialmente entre 1 : 1 e 1 : 20, mais 35 preferencialmente entre 1 : 5 e 1 : 15; em uma modalidade específica, a proporção de aminoácido básico : zeína em peso é de 1 : 6 (quando o BAC é resveratrol) e 1 :11 (quando o BAC é quercetina) aproximadamente.

A solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura gerado na etapa b) do processo [2] da invenção pode ser obtida ao se dissolver 5 ou solubilizar tal BAC solúvel em gordura em um álcool (por exemplo, etanol) e então diluir com água a solução alcoólica obtida. Portanto, tal solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura gerado na etapa b) do processo [2] da invenção contém água e um álcool, tipicamente etanol; em uma modalidade particular, tal solução hidroalcoólica (ii) compreende entre 25% e 10 75% (w/v) de álcool, preferencialmente entre 30% e 65%, mais preferencialmente entre 50% e 60%.

A quantidade de BAC solúvel em gordura que tal solução hidroalcoólica (ii) pode conter pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a quantidade de BAC solúvel em gordura contida em tal 15 solução hidroalcoólica (ii) está compreendida entre 0,05% e 10% (w/v), preferencialmente entre 0,1% e 1%, mais preferencialmente entre 0,2% e 0,3%.

De acordo com a etapa c) do processo [2] da invenção, uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico é misturada com uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura; uma 20 mistura compreendendo uma zeína, um aminoácido básico e um BAC solúvel em gordura é então formada em um meio hidroalcoólico. A proporção de BAC solúvel em gordura : zeína em peso presente na mistura formada em tal etapa c) pode variar dentre de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a proporção em peso entre o BAC solúvel em gordura e zeína [BAC solúvel em 25 gordura : zeína] está compreendida entre 1 : 0,5 e 1 : 70, preferencialmente entre 1 : 5 e 1 : 50, mais preferencialmente entre 1 :10 e 1 : 30.

Na etapa d) do processo [2] da invenção, água é adicionada na mistura formada na etapa c) em uma quantidade suficiente para a formação das nanopartículas da invenção. Embora a quantidade de água a ser adicionada 30 possa variar dentro de uma ampla série, em uma modalidade particular, água é adicionada em uma quantidade suficiente para a proporção final de álcool no meio a ser compreendido entre 10% e 60% (w/v), preferencialmente entre 15% e 30%, mais preferencialmente aproximadamente 25%.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um processo para produzir 35 nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína, um aminoácido básico e um composto biologicamente ativo solúvel em água (nanopartículas da invenção carregadas com um BAC solúvel em água), doravante “processo [3] da invenção”, o qual compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico; b) preparar uma solução aquosa compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico, e diluí-lo com um álcool para obter uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico; c) misturar a referida solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico com a referida solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico; d) adicionar, opcionalmente, um surfactante à mistura resultante da etapa c); e e) adicionar água à mistura resultante da etapa c) ou da etapa d).

A solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico usados na etapa a) do processo [3] da invenção contém água e um álcool, tipicamente etanol; em uma modalidade particular, tal solução hidroalcoólica compreende entre 25% e 75% (w/v) de álcool, preferencialmente entre 30% e 60%, mais preferencialmente aproximadamente 50%. Tal solução hidroalcoólica (i) é preparada ao se misturar seus componentes nas quantidades adequadas.

A quantidade de zeína que tal solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico usado na etapa a) do processo [3] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a quantidade de zeína contida em tal solução hidroalcoólica (i) está compreendida entre 0,1% e 10% (w/v), preferencialmente entre 0,2% e 2,5%, mais preferencialmente entre 0,5% e 1%.

A quantidade de aminoácido básico que tal solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico usado na etapa a) do processo [3] da invenção pode conter pode variar dentro de uma ampla série. Tal quantidade será geralmente expressa de acordo com a quantidade de zeína a ser dissolvida. Assim, embora a proporção em peso entre o aminoácido básico e a zeína [aminoácido básico : zeína] presente em tal solução hidroalcoólica (i) possa variar extensivamente, em uma modalidade particular, tal proporção de aminoácido básico : zeína em peso está compreendida entre 1 : 0,01 e 1 : 50, tipicamente entre 1 : 0,5 e 1 : 25, preferencialmente, entre 1 : 1 e 1 ; 20, mais preferencialmente entre 1 : 5 e 1 : 15; em uma modalidade específica, a proporção de aminoácido básico : zeína em peso é de aproximadamente 1 : 6,7.

A solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água gerado na etapa b) do processo [3] da invenção pode ser obtida ao se dissolver ou solubilizar tal BAC solúvel em água em água, opcionalmente na presença de um segundo aminoácido básico, e então diluir a solução aquosa obtida com um álcool (por exemplo, etanol). Portanto, tal solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico gerado na etapa b) do processo [3] da invenção contém água e um álcool, tipicamente etanol; em uma modalidade particular, tal solução hidroalcoólica (ii) compreende entre 25% e 75% (w/v) álcool, preferencialmente entre 30% e 60%, mais preferencialmente aproximadamente 50%.

A solução aquosa que resulta da dissolução do BAC solúvel em água em água e, opcionalmente, na presença de tal segundo aminoácido básico, contém, em uma modalidade particular, tal BAC solúvel em água e água; e, em outra modalidade particular, tal BAC solúvel em água, tal aminoácido básico e água. Tal segundo aminoácido básico geralmente estará presente em tal solução aquosa [e, consequentemente, em tal solução hidroalcoólica (ii)], quando sua presença é necessária para dissolver o BAC solúvel em água, desde que a solubilização de tais BACs solúveis em água, por exemplo, ácido fólico, possa ser facilitada ao se usar uma solução aquosa basificada com tal aminoácido básico; em tais casos, a proporção em peso entre tal BAC solúvel em água e tal segundo aminoácido básico em tal solução aquosa basificada pode ser compreendida entre 1 : 0,25 e 1 ; 5, preferencialmente entre 1 : 0,5 e 1 : 2, mais preferencialmente entre 1 : 0,8 e 1 : 1,8; subsequentemente, conforme mencionado acima, essa solução aquosa é diluída em um meio hidroalcoólico (por exemplo, em etanol) para obter tal solução hidroalcoólica (ii), conforme mencionado acima, a qual compreende entre 25% e 75% (w/v) de álcool, preferencialmente entre 30% e 60%, mais preferencialmente aproximadamente 50%.

Processo [3] da invenção contempla a possibilidade de usar 2 aminoácidos básicos diferentes. Assim, em uma modalidade particular, o aminoácido básico usado na preparação da solução hidroalcoólica (i) contendo zeina e um aminoácido básico (primeiro aminoácido básico) e o um usado na preparação da solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e (nesse caso) um segundo aminoácido básico (segundo aminoácido básico) é o mesmo e é selecionado a partir do grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e misturas destes, preferencialmente lisina.

A quantidade de BAC solúvel em água que tal solução hidroalcoólica (ii) pode conter pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a quantidade de BAC solúvel em água contida em tal solução hidroalcoólica (ii) está compreendida entre 0,01% e 10% (w/v), preferencialmente entre 0,05% e 5%, mais preferencialmente entre 0,1% e 1%.

De acordo com a etapa c) do processo [3] da invenção, uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico é misturada com uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico; uma mistura compreendendo uma zeína, um aminoácido básico, um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico (o qual foi mencionado acima, pode ser o mesmo que o aminoácido básico contido em tal solução hidroalcoólica (i)) é então formado. A proporção BAC solúvel em água : zeína em peso presente na mistura formada na etapa c) pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a proporção em peso entre o BAC solúvel em água e a zeína (BAC solúvel em água : zeína] em tal mistura formada na etapa c) está compreendida entre 1 : 0,2 e 1 : 50, preferencialmente entre 1 : 1 e 1 : 15, mais preferencialmente entre 1 : 6 e 1 : 12.

Na etapa opcional d) do processo [3] da invenção, um surfactante é adicionado à mistura resultante da etapa c). Sem desejar estar preso a qualquer teoria, acredita-se que o surfactante facilite a encapsulação do BAC solúvel em água nas nanopartículas, uma vez que ele permite mover o BAC solúvel em água junto da matriz de polímero lipofílico (zeína), facilitando, assim, sua retenção no período de indução da coacervação. Em uma modalidade particular, tal surfactante é um surfactante não-iônico, tal como um polisorbato, por exemplo, um éster derivado de um ácido graxo (por exemplo, ácido oléico) e de um sorbitano polietióxilado, tal como um marcado com o nome Tween® 80. A proporção em peso de surfactante : BAC solúvel em água presente, onde apropriada, na mistura formada na etapa d), pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a proporção em peso entre o surfactante e o BAC solúvel em água [surfactante : BAC solúvel em água] está compreendida entre 1 : 10 e 1 ; 50, preferencialmente entre 1 : 15 e 1 ; 45, mais preferencialmente entre 1 : 20 e 1 : 30.

Finalmente, na etapa e) do processo [3] da invenção água é adicionada à mistura formada na etapa c) ou na etapa d) em uma quantidade suficiente para a formação das nanopartículas da invenção. Embora a quantidade de água a ser adicionada possa variar dentro de uma ampla série, em uma modalidade particular, água é adicionada em uma quantidade suficiente para a proporção final de álcool no meio a ser compreendido entre 10% e 60% (w/v), preferencialmente entre 15% e 30%, mais preferencialmente aproximadamente 25%.

Virtualmente, qualquer zeína pode ser usada para colocar em prática tais processos [1], [2] e [3] da invenção; no entanto, em uma modalidade particular, tal zeína é uma zeína oriunda do milho, tal como a zeína fornecida pela Sigma- Aldrich (número do produto Z 3625).

Embora alcoóis de natureza bastante diversa possam ser usados, em uma modalidade particular e preferencial dessa invenção, a solução hidroalcoólica usada nos processos [1], [2] e [3] da invenção é etanol.

Virtualmente, qualquer aminoácido básico pode ser usado para colocar em prática tais processos [1], [2] e [3] da invenção; no entanto, em uma modalidade particular, tal aminoácido básico é selecionado a partir do grupo consistindo de arginina, lisina, histidina e misturas destes, preferencialmente, lisina. Tal aminoácido básico, o qual pode estar dentro ou fora das nanopartículas da invenção, desempenha um papel fundamentalmente tecnológico, uma vez que; ele facilita a dissolução dos componentes antes da formação das nanopartículas; ele contribui especificamente para a dissolução da zeína, uma vez que esta, na presença do aminoácido básico, pode ser dissolvida em uma solução hidroalcoólica com uma baixa proporção de álcool (por exemplo, 50%), com relação à sua dissolução na ausência de tal aminoácido, e ele ainda facilita a dissolução dos BACs, particularmente de alguns BACs solúveis em água, especificamente dos BACs ácidos solúveis em água (por exemplo, ácido fólico); ele mantém o pH adequado após a produção de tais nanopartículas em ambos os lados das nanopartículas (dentro e fora); e ele permite obter nanopartículas com uma carga de superfície que é negativa e distante de ± 10 mV, o que dificulta a sua agregação.

Portanto, o aminoácido básico desempenha um papel muito importante na produção das nanopartículas da invenção, ambas carregadas com BACs e não carregadas.

As nanopartículas da invenção são caracterizadas pelo fato de terem uma tamanho médio de partícula inferior a 1 μm, tipicamente compreendido entre 1 e 999 nm, preferencialmente entre 10 e 900 nm, mais preferencialmente entre 50 e 500 nm, ainda mais preferencialmente entre 100 e 450 nm, e ainda muito mais preferencialmente entre 140 e 400 nm. As nanopartículas da invenção têm, vantajosamente, um tamanho de partícula de cerca de nm aproximadamente, para o propósito de prevenir a alteração de propriedades organolépticas (textura no palato), as quais são particularmente adequadas quando usadas no campo da alimentação.

As nanopartículas da invenção, as quais são carregadas com um BAC e aquelas que não são (nanopartículas vazias), podem incorporar em suas formulações um antioxidante, por exemplo, ácido ascórbico (vitamina C), etc., para o fim de melhorar a sua estabilidade contra temperatura e oxidação. Nesse caso, tal antioxidante pode ser introduzido co-encapsulado com o BAC (onde apropriado) ou no envelope das nanopartículas da invenção; para este fim, tais processos [1], [2] e [3] da invenção serão adequadamente adaptados para incorporar o antioxidante na formulação das nanopartículas, por exemplo, ao adicionar o antioxidante à solução aquosa contendo tal BAC e, opcionalmente, tal segundo aminoácido básico.

Em uma modalidade particular, o BAC é ácido fólico e o antioxidante é ácido ascórbico, o qual parece agir ao proteger o ácido fólico da degradação por meio da radiação ultravioleta, mudança de pH, calor, oxigênio etc., provendo, ainda, a contribuição nutricional do próprio ácido ascórbico. Tal antioxidante pode ser introduzido co-encapsulado com o BAC ou no envelope das nanopartículas da invenção.

Adicionalmente, se desejado, processo [1] da invenção, assim como processos [2] e [3] da invenção, pode incluir uma ou mais etapas de estabilização adicionais para estabilizar as nanopartículas obtidas ao se usar tratamentos diferentes.

Em uma modalidade particular, tal tratamento de estabilização compreende submeter a suspensão contendo as nanopartículas formadas da invenção, tanto aquelas que são carregadas com um BAC como aquelas que não são, a um tratamento de alta pressão, por exemplo, a uma pressão compreendida entre 100 e 800 MPa, tipicamente entre 350 e 600 MPa. Em uma modalidade particular, tal tratamento compreende submeter a suspensão de nanopartículas a ciclos de 3 a 5 minutos a uma pressão de 100 MPa a 800 MPa, tipicamente entre 350 e 600 MPa; de fato, uma pressão de 400 MPa provê bons resultados.

Em outra modalidade particular, tal tratamento de estabilização compreende submeter a suspensão contendo as nanopartículas formadas da invenção, tanto aquelas que são carregadas com um BAC, como aquelas que não são, a um tratamento UHT (Ultra High Temperatura), por exemplo, a uma temperatura compreendida entre 130°C e 140°C por 2 a 5 segundos, seguido de um rápido resfriamento.

Semelhantemente, se desejado, processo [1] da invenção, assim como os processos [2] e [3] da invenção podem incluir uma etapa de secagem para secar a suspensão contendo as nanopartículas formadas para o fim de obter as nanopartículas da invenção, tanto aquelas que são carregadas com um BAC como aquelas que não são, na forma de um pó. Essa forma de apresentação de tais nanopartículas contribui para sua estabilidade e é, além disso, particularmente útil para sua possível aplicação em alimentos sólidos, tais como farinha, pão, produtos de pastelaria, cereais, leite em pó, etc., assim como em produtos farmacêuticos e/ou cosméticos. Virtualmente, qualquer método convencional ou técnica adequada para secar suspensões contendo nanopartículas pode ser usado para realizar essa etapa de secagem; no entanto, em uma modalidade particular, a suspensão contendo nanopartículas é seca por meio de secagem por aspiração ou pulverização (secagem por pulverização) ou por meio de liofilização. Esse tratamento é normalmente realizado ao se adicionar à suspensão de nanopartículas um agente protetor adequado para tais nanopartículas, tais como um sacarídeo, por exemplo, lactose, trehalose, manitol, sacarose, maltodextrina, glicose, sorbitol, maltose etc., e misturas destes. Tal agente protetor protege as nanopartículas da invenção tanto contra degradação térmica como contra oxidação durante o processo de secagem.

A zeína: a proporção de sacarídeo em peso pode variar dentro de uma ampla série; no entanto, em uma modalidade particular, a zeína: proporção em peso de sacarídeo está compreendida entre 1 : 1 e 1 : 4, preferencialmente em cerca de 1: 2.

De modo semelhante, em uma modalidade particular, a solução contendo o sacarídeo pode compreender, ainda, um agente antioxidante, tal como ácido ascórbico (vitamina C), etc.; nesse caso, a zeína: sacarídeo: agente protetor, por exemplo, vitamina C, proporção em peso pode ser 1 : 0,75-2,5 : 0,25-1,5, preferencialmente 1 : 1,5 : 0,5.

As nanopartículas da invenção obtidas de acordo com o processo [1] da invenção, isto é, as nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico produzido por meio do processo [1] são um aspecto adicional da invenção.

Do mesmo modo, as nanopartículas carregadas da invenção obtidas de acordo com o processo [2] ou [3] da invenção, isto é, as nanopartículas compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico carregado com um BAC solúvel em gordura ou solúvel em água são um aspecto adicional da presente invenção.

Aplicações

As nanopartículas da invenção têm a capacidade de encapsular um BAC, por exemplo, um BAC solúvel em água ou um BAC solúvel em gordura. Elas podem, ainda, ser usadas como aditivos tecnológicos, por exemplo, favorecendo uma dispersão uniforme do BAC em um meio no qual este não é solúvel, etc.

Em uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção permitem a encapsulação de um BAC e sua incorporação em composições alimentares, cosméticas e farmacêuticas, desde que outros ingredientes que não são polímeros naturais (prevenindo a toxicidade associada aos polímeros sintéticos) e ingredientes de grau alimentar não sejam usados em sua preparação e no produto final (nanopartículas). Tais nanopartículas protegem o BAC de sua degradação a partir de agentes externos (luz, mudanças de pH, oxidação etc.).

As nanopartículas da invenção podem ser ressuspensas em um meio aquoso, protegendo o BAC da degradação em solução. Podem estar presentes, ainda, na forma de um pó seco, mantendo o BAC estável e permitindo seu armazenamento por longos períodos (particularmente para a incorporação deste em preparações alimentares sólidas).

Adicionalmente, as nanopartículas da invenção também são adequadas para a preparação de composições farmacêuticas e cosméticas de uso tópico.

Portanto, em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição, doravante “composição da invenção”, compreendendo pelo menos uma nanopartícula da invenção e um veículo aceitável em alimentos, produtos farmacêuticos ou cosméticos; em uma modalidade particular, tal composição da invenção compreende uma pluralidade de nanopartículas da invenção. Em uma modalidade particular, tal nanopartícula da invenção é uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico; em outra modalidade particular, tal nanopartícula da invenção é uma nanopartícula carregada da invenção, isto é, uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico, e um BAC com atividade nutricional, terapêutica e/ou cosmética, e um veículo farmacêutica ou cosmeticamente aceitável ou um veículo adequado para alimentos.

Tais nanopartículas da invenção têm um tamanho médio de partícula inferior a 1 μm, tipicamente compreendido entre 1 e 999 nm, preferencialmente entre 10 e 900 nm, mais preferencialmente entre 50 e 500 nm, ainda mais preferencialmente entre 100 e 450 nm, e muito mais preferencialmente entre 140 e 400 nm. As nanopartículas da invenção têm, vantajosamente, um tamanho de partícula de cerca de 200 nm, aproximadamente, para o propósito de prevenir a alteração de propriedades organolépticas (textura no palato), as quais são particularmente adequadas quando utilizadas no campo da alimentação.

Em uma modalidade particular, tal BAC é selecionado a partir do grupo consistindo de aminoácidos, agentes antimicrobianos, agentes aromatizantes, conservantes, edulcorantes, esteróides, drogas, hormônios, lipídios, peptídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos, proteínas, proteoglicanos, aromatizantes, vitaminas e misturas destes.

Em uma modalidade particular, tal BAC é um BAC solúvel em gordura. Exemplos ilustrativos não limitados dos BACs solúveis em gordura incluem vitaminas, por exemplo, das famílias A, D, E, K e seus derivados, fosfolipídeos, carotenóides (carotenos, licopeno, luteína, capsantina, zeaxantina etc.), ácidos graxos de ômega 3 )por exemplo, DHA, EPA, etc.), aminoácidos (por exemplo, ISO-leucina, leucina, metionina, fenilanina, triptofano e valina), fitostanóis e fitosteróis (por exemplo, sitosterol, campesterol, stigmasterol, etc.), polifenóis (por exemplo, quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol,miricetina, isorhamnetina etc.) e seus derivados.

Em outra modalidade particular, tal BAC é um BAC solúvel em água, preferencialmente, um ácido de BAC solúvel em água. Exemplos ilustrativos não limitados de BACs solúveis em água incluem vitaminas, por exemplo, vitaminas das famílias B ou C e seus derivados, sais e ésteres; ácido hialurônico, sulfato de condroitina, ácido tióctico, os sais ou ésteres destes, etc. Em uma modalidade particular, tal BAC solúvel em água é selecionado a partir do grupo consistindo de ácido fólico, ácido 4-aminobenzóico, niacina, ácido pantotênico, monofosfato de tiamina, pirofosfato de tiamina, trifosfato de tiamina, ácido ascórbico, ácidos pteroilpoliglutâmico (derivados de ácido fólico: poliglutamatos de folato; folatos de poliglutamato), ácido folínico, ácido nicotínico, ácido hialurônico, ácido tióctico, ácido p-cumárico, ácido caféico, seus derivados cosmética ou farmaceuticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

Em uma modalidade particular, a composição da invenção é uma composição farmacêutica adequada para sua administração tópica; para este fim, tal composição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável compreendendo um ou mais excipientes adequados para sua administração tópica, por exemplo, na forma de gel, pomada, creme etc. Informação a respeito de excipientes adequados para a formulação de composições farmacêuticas destinadas à administração tópica, assim como acerca da produção de tais composições farmacêuticas podem ser encontradas no livro “Tratado de Farmacia Galénica”, de C. Faulí i Trillo, 10 Edição, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones. A dose a ser administrada de nanopartículas da invenção pode variar dentro de uma ampla série, por exemplo, entre aproximadamente 0,5 (g/cm2 da área a ser tratada) e aproximadamente 2 (g/cm2 da área a ser tratada), de uma composição da invenção contendo entre 0,1% e 30% de nanopartículas da invenção, preferencialmente entre 0,5% e 5%.

Em outra modalidade particular, a composição da invenção é uma composição cosmética adequada para sua administração tópica; para este fim, tal composição compreende um veículo cosmeticamente aceitável compreendendo um ou mais excipientes adequados para a sua administração tópica, por exemplo, na forma de gel, creme, xampu, loção etc. Informação a respeito de excipientes adequados para a formulação de composições cosméticas destinadas à administração tópica, assim como acerca da produção de tais composições cosméticas podem ser encontradas no livro “Manual de Cosmetología”, de Octavio Diez Sales, 1a Edição, 1998, Editorial Videocinco, S.A.

Em outra modalidade particular, a composição da invenção é uma composição alimentar, tal como uma preparação alimentar sólida, líquida ou semi- sólida.

Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende: zeína entre 15% e 45% em peso; um aminoácido básico entre 1% e 4% em peso; quercetina ou resveratrol entre 0,5% e 5% em peso; e um sacarídeo entre 45% e 80% em peso, em que todas as proporções estão em peso com relação ao peso total da composição.

Em outra modalidade particular, a composição da invenção compreende: zeína entre 15% e 45% em peso; um aminoácido básico entre 4% e 10% em peso; - opcionalmente, polisorbato (por exemplo, tween80) entre 0,05% e 0,5% em peso; - ácido fólico entre 0,5% e 5% em peso; - um sacarídeo entre 45% e 80% em peso; e em que todas as proporções estão em peso com respeito ao peso total da composição.

Alternativamente, a composição da invenção pode ser incorporada em um produto alimentar. Portanto, em outro aspecto, a invenção se refere a um produto alimentar compreendendo uma composição da invenção. Tal produto alimentar pode estar na forma líquida, semi-sólida ou sólida. Vantajosamente, para o fim de prevenir ou minimizar a dissolução total ou parcial das nanopartículas da invenção e contribuir, assim, para sua estabilidade, tal produto alimentar tem um pH acídico, isto é, inferior a 7, preferencialmente igual ou inferior a 6, mais preferencialmente igual ou inferior a 5. Exemplos Ilustrativos de produtos alimentares que podem ser enriquecidos ou fortificados com a composição da invenção incluem leites e seus derivados (iogurtes, queijos, coalhadas, etc.), sucos, geléias, pães e massas, carnes fermentadas, molhos etc. Do mesmo modo, a composição da invenção pode ser incorporada a um produto para alimento animal, por exemplo, em rações.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir descrevem a produção de partículas de nanozeína e um aminoácido básico, tal como lisina, os quais podem incorporar um composto biologicamente ativo [BAC], especificamente resveratrol, quercetina ou ácido fólico. Tais nanopartículas são capazes de proteger tal BAC de degradações que este pode sofrer no alimento devido às mudanças no pH, luz, oxidação etc.

Processo geral para produção de nanopartículas de zeína vazias

O processo geral para produzir nanopartículas de zeína compreende a dissolução de tal proteína, zeína (Sigma-Aldrich - número do produto z 3625), em uma solução hidroalcoólica, tal como, por exemplo, uma solução de etanol de 50% (w/v) junto com uma quantidade particular de lisina (Sigma-Aldrich), seguido pela adição, mediante agitação magnética e fluxo constante, de um volume particular de água para dar origem à formação de nanopartículas com a aparência de uma suspensão leitosa amarelada.

Caracterização físico-química das nanopartículas

Os diferentes estudos necessários para alcançar uma caracterização físico- química completa das nanopartículas são descritas abaixo.

O tamanho e a mudança de superfície das nanopartículas foram determinados com testes físico-químicos. O primeiro de tal parâmetro (tamanho) foi obtido por meio de espectroscopia de correlação de fóton usando um Zetasizer Nano Z-S (Instrumentos Malvem/Optilas, Espanha). O segundo de tal parâmetro 5 (mudança de superfície) foi determinado através da medição do potencial zeta ao se usar um Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA).

O campo do processo da formação de nanopartículas foi calculado através da qualificação da zeína livre remanescente após obtenção das nanopartículas, 10 coletado nos sobrenadantes obtidos por meio de centrifugação da formulação (17,000 x g, 20 minutos). Para a quantificação, os sobrenadantes foram diluídos em etanol até a obtenção de uma concentração de álcool de 75% (w/v), este último sendo o mesmo meio no qual os padrões da curva de calibração foram preparados. 15 A quantidade de proteína (zeína) que forma partículas na formulação foi estimada como a diferença entre a quantidade inicial adicionada e a quantidade quantificada nos sobrenadantes coletados durante a etapa de purificação. O rendimento foi estimado como:

Adicionalmente, a fim de confirmar os resultados obtidos por meio da diferença entre o total e o conteúdo de zeína do sobrenadante, foi realizado um 25 estudo de quantificação do pellet obtido após a centrifugação. Nesse caso, uma solução hidroalcoólica de 75% (w/v) de etanol foi usada para quebrar as partículas, sendo esta solução o mesmo meio usado para preparar a curva de calibração. Assim, nesse caso o rendimento foi estimado como:

Além disso, a fim de confirmar a validade do método de quantificação e 30 verificar que não existe efeito na matriz, volumes conhecidos de formulação sem centrifugação foram tomados e diluídos até a obtenção de uma concentração de etanol de 75%. Assim, foi possível quantificar o total de zeína presente na formulação e comparar isso com a quantidade de zeína inicialmente adicionada, encontrando em todos os casos desvios inferiores a 5%.

A fim de realizar os diferentes cálculos foi usada uma curva de calibração entre 90 e 1,200 μg/mL (R2 = 0,999; LOD = 43 μg/mL; LOQ = 143 μg/mL).

Todas as quantificações foram realizadas por meio da espectometria UV a 278 nm (Agilent 8453, Sistema de espectroscopia de UV visível).

A morfologia das nanopartículas foi observada por meio de microscopia eletrônica de varredura (Zeiss, DSM 940A, Alemanha). Para esse fim, as nanopartículas foram cobertas com uma camada de ouro molecular de cerca de 9 nm (Equipamento Emitech k550, Sputter-Coater, Reino Unido) e as fotografias foram tiradas com um microscópio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos).

Processo geral para produção de nanopartículas de zeína contendo quercetina e resveratrol

O processo geral para produção de nanopartículas de zeína carregadas com quercetina ou resveratrol compreende a dissolução da proteína (zeína) em um meio hidroalcoólico (50% de etanol (w/v)) conjuntamente com uma quantidade particular de lisina seguido pela adição, mediante agitação magnética, de um volume particular de uma diluição com água de uma solução alcoólica previamente preparada de tal antioxidante (quercetina ou resveratrol). Após incubar a mistura por alguns minutos, a última etapa consiste da adição de um volume particular de água para dar início à formação das nanopartículas com a aparência de uma suspensão leitosa amarelada.

Então, se desejado, após a homogeneização de 3 minutos por meio de agitação, um volume particular de uma solução de um sacarídeo (lactose, trehalose, manitol, glicose, sorbitol, maltodextrina, maltose, etc.) é adicionado sem que se interrompa a agitação. Finalmente, a suspensão é espalhada em um secador por pulverização (Büchi Mini Spray Drier B-191, Büchi Labortechnik AG, Suíça) sob as seguintes condições: Temperatura de entrada de ar: 70-110°C Temperatura de saída de ar: 30-90°C Pressão do ar: 2-10 bar [2x105 - 10x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 2-9 mL/min Aspiração (Aspirador): 30-100% Fluxo de ar: 200-900 L/h

Opcionalmente, após adicionar o sacarídeo, as formulações podem ser secas por meio de liofilização em vez de aspiração ou espalhamento (secagem por pulverização).

Determinação da quantidade de quercetina ou resveratrol associada às partículas de zeína

A quantidade de quercetina ou resveratrol associada às nanopartículas foi quantificada por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), de acordo com o processo descrito por Lacopini (Lacopini et al.,J Food Comp Anal 2008;21:589-598), embora com diversas variações. A análise foi realizada em um modelo de cromatografia 1100 da série LC (Agilent, Waldbornn, Alemanha), acoplado a um sistema de detecção UV de arranjo de diodo.

Para a análise de amostras frescas (antes de sua secagem), os sobrenadantes obtidos após o processo de purificação de nanopartícula [ao se filtrar um volume particular da formulação através de tubos de diálise Vivaspin® 300,00 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha)], foram diluídos até a obtenção de uma solução hidroalcoólica com um conteúdo de etanol de 75% (w/v). O pellet, por sua vez, também foi dissolvido em 75% (w/v) de etanol para quebrar as partículas e manter a zeína, assim como o BAC (quercetina ou resveratrol) e o aminoácido em solução, e então foi realizada a quantificação destes. A soma do conteúdo de BAC encontrada em ambas as frações (sobrenadante e pellet) coincidiu em todas as oportunidades com o total adicionado inicialmente. Além disso, também foi possível quantificar a quantidade total de BAC ao se dissolver um volume particular da formulação em 75% de etanol (w/v). Esse estudo permitiu confirmar que as diferenças entre a quantidade de BAC adicionada e a obtida por meio de quantificação através do método de cromatografia descrito foram inferiores a 10% em todos os casos.

Adicionalmente, para a preparação das amostras de pó (formulações secas), aproximadamente 15 mg da formulação de nanopartículas foram retiradas e ressuspensas em etanol. O sobrenadante obtido após filtragem de um volume particular da suspensão, por meio de tubos de diálise Vivaspin® 300,00 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha) foi diluído com água destilada para uma concentração de etanol de 75% (w/v). O pellet foi dissolvido em um volume particular de 75% de etanol (w/v). Além disso, o total de BAC contido nas 15 mg de pó também foi quantificada ao se dissolvê-lo em 75% (w/v) de etanol.

As amostras foram analisadas usando-se uma coluna Alltech C18 Alltima™ (5 μm, 150 mm x 2.1 mm) aquecida a 40°C com uma pré-coluna Gemini® C18 AJO-7596 compatível e uma mistura de água/metanol/ácido acético glacial em um gradiente (vide tabela 1) como uma fase móvel bombeada em um fluxo de 0,25 mL/min.

A detecção foi realizada a 360 nm para quercetina e a 306 nm para resveratrol. O volume de injeção de amostra foi de 10 μl_. O tempo de retenção de tais compostos é de 24,2 ± 0,2 minutos, no caso da quercetina, e 22,8 ± 0,5 minutos, no caso do resveratrol. Tabela 1

Condições de gradiente para a fase móvel (A: água, B: metanol, C: ácido acético glacial)

Antes de quantificar as amostras, linhas de calibração diferentes de concentrações entre 1 e 100 μg/mL foram preparadas em um meio hidroalcoólico (75% de etanol), obtendo-se resultados de precisão e exatidão inferiores a 5%.

Finalmente, a quantidade de quercetina ou resveratrol associada às nanopartículas [eficiência de encapsulação (E.E)] foi calculada como a diferença entre a quantidade do BAC adicionado inicialmente e a quantidade deste quantificada nos sobrenadantes.

Processo geral para produção de nanopartículas de zeína contendo ácido fólico

O processo geral para produção de nanopartículas de zeína carregadas com ácido fólico compreende a dissolução da proteína (zeína) em um meio hidroalcoólico (50% (w/v) de etanol), conjuntamente com uma quantidade particular de lisina, seguida pela adição, mediante agitação magnética, de um volume particular de uma diluição alcoólica de uma solução aquosa preparada previamente de tal vitamina. Após encubar a mistura por alguns minutos, a última etapa consiste da adição de um volume particular de água para dar início à formação das nanopartículas com a aparência de uma suspensão leitosa amarelada.

Então, se desejado, após a homogeneização por 3 minutos através de agitação, um volume particular de solução de um sacarídeo (lactose, trehalose, manitol, glicose, sorbitol, maltodextrina, maltose etc.) é adicionado sem que se interrompa a agitação. Finalmente, a suspensão é espalhada em um secador por pulverização (Büchi Mini Spray Drier B-191, Büchi Labortechnik AG, Suíça) mediante as seguintes condições: Temperatura de entrada de ar: 70-130°C Temperatura de saída de ar: 30-90°C Pressão do ar: 2-10 bar [2x105 - 10x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 2-9 mL/min Aspiração (Aspirador): 30-100% Fluxo de ar. 200-900 L/h

Opcionalmente, após a adição do sacarídeo, as formulações podem ser secas por meio de liofilização, em vez de aspiração ou espalhamento (secagem por espalhamento).

Determinação da quantidade de ácido fólico associada às partículas de zeína

A quantidade de ácido fólico associada às nanopartículas foi quantificada por meio da cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), de acordo com o processo descrito por Faye [Faye Russell, L, Quantitative Determination of Water- Soluble Vitamins. In Food Analysis by HPLC, Nollet, L.M.L. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, Second Edition, Chapter 10 (2000) pp. 444-445], A análise foi realizada em um modelo de cromatografia 1100 da série LC (Agilent, Waldbornn, Alemanha) acoplado a um sistema de detecção UV de arranjo de díodo. Os dados foram analisados em um computador Hewlett-Packard por meio do software Chem-Station G2171. Para a separação do ácido fólico, foi usada uma coluna Alltech C18 Alltima™ (5 μm, 150 mm x 2,1 mm), aquecida a 40°C, com uma pré- coluna Gemini® C18 AJO-7596. A fase móvel foi formada ao se misturar H2PO4 (33 Mm, pH 2,3) / acetonitrila em um gradiente (Tabela 2) e foi bombeada em um fluxo de 0,25 mL/min. A detecção foi realizada a 290 nm. O volume de injeção de amostra foi de 10 μL. O tempo de retenção do ácido fólico é de 22,6 ± 0,5 minutos. Tabela 2

Condições de gradiente para a fase móvel (A: H3PO4 33 mM, B: acetonitrila)

Antes de quantificar as amostras, linhas de calibração diferentes de concentrações entre 2 e 400 μg/mL foram preparadas, obtendo-se resultados de precisão e exatidão superiores a 95%, com a confirmação do fato de que a presença de zeína e/ou aminoácidos na solução não interferiu na quantificação correta de ácido fólico.

Para a análise de amostras frescas (antes de secá-las) foram quantificados os sobrenadantes obtidos após filtragem de um volume particular da formulação através dos tubos de diálise Vivaspin® 300,00 MWCO (VIVASPIN 2, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha). O pellet foi, por sua vez, dissolvido em 0,05 M NaOH para quebrar as partículas e manter a zeína, como também o ácido fólico e o aminoácido, em solução e então realizar a sua quantificação. A soma do conteúdo de ácido fólico encontrada em ambas as frações (sobrenadante e pellet) coincidiu em todas as vezes ao total adicionado inicialmente. Além disso, também foi possível quantificar a quantidade total de ácido fólico ao se dissolver 1 ml_ da formulação em 1 mL de 0,05 m NaOH. Esse estudo permitiu confirmar que as diferenças entre a quantidade de ácido fólico adicionado e aquele obtido por meio de quantificação através do método de cromatografia descrito são inferiores a 10% em todos os casos.

Adicionalmente, para quantificar as amostras de pó, 15 mg de nanopartículas foram retiradas, ressuspensas em 2 mL de água e centrifugadas, então procedeu-se da mesma maneira como com as amostras frescas.

Estudos farmacocinéticos. Biodisponibilidade de ácido fólico encapsulado em nanopartículas de zeína

Os estudos farmacocinéticos foram realizados de acordo com as regras do comitê de ética da Instituição, como também conforme as leis Europeias sobre animais experimentais (86/609/EU). Para esse fim, 20 ratinhos machos Wistar, com um peso médio de 200 g, foram submetidos a condições normais de luz- escuridão (12 horas - 12 horas) e, durante a semana anterior ao estudo, foram alimentados com uma ração deficiente em ácido fólico (Dieta Deficiente em Ácido Fólico. TD 95247. Harlan, USA) e água. Doze horas antes da administração das formulações, os ratinhos foram isolados em gaiolas metabólicas, sem acesso à comida, porém com livro acesso à água potável.

Os animais foram divididos em 4 grupos de tratamento (5 ratos por grupo). Somente 1 mL de PBS (Tampão de Fosfato, pH 7,4) foi administrado oralmente ao primeiro do grupo. Os dois grupos seguintes foram tratados com doses orais individuais de 1 mg/kg (200 μg/ratinho de ácido fólico (Aditio, Panreac Química, Barcelona, Espanha) incorporadas em nanopartículas de zeína, ou na forma livre (não encapsulada) dissolvidas em água. 1 mL de cada uma das formulações diferentes dispersas em água foi administrada através de uma cânula gastroesofágica. Finalmente, a mesma dose de ácido fólico livre (1 mg/kg) dissolvida em tampão de fosfato (PBS) (0,5 mL) foi administrada de forma intravenosa ao quarto grupo na veia safena. Antes da administração das formulações, sangue foi extraído da cauda da veia safena com o propósito de checar o nível da linha base de vitamina em cada ratinho. Após a administração, um volume de sangue de aproximadamente 500 μL foi extraído em diferentes períodos utilizando-se tubos separadores de soro (Microtubo SARSTEDT 1.1 mL Z-Gel). Em todos os casos, a fim de prevenir a dor nos ratinhos, a extração foi realizada após anestesiar o animal com a anestesia de inalação (isoflurano: oxigênio), checando-se seus sinais vitais em todas as vezes.

O volume de sangue foi, subsequentemente, substituído por administração intraperitoneal de 500 μL de soro fisiológico previamente aquecido à temperatura do animal. Durante esse período, a condição dos animais (mobilidade, agressividade, reações alérgicas e temperatura) foi examinada, sendo que nenhuma alteração significativa foi observada.

Pré-tratamento e quantificação do ácido fólico das amostras de soro

A quantificação de ácido fólico nas amostras de soro, obtidas após centrifugação dos tubos com sangue (6,000 rpm, 20 minutos, 20°C), foi realizada por meio de uma técnica de imunoensaio de enzima. Para esse fim, foi usado um Kit Elisa (Automação de diagnóstico, INC. Calabasas, Califórnia EUA), aprovado pela FDA para a determinação quantitativa de ácido fólico em alimentos. As amostras de soro foram quantificadas sem tratamento prévio e ao se seguir as especificações do fabricante.

Tendo em vista o fato de que o kit é designado para uso em alimentos, uma série de estudos anteriores foi conduzida, com o objetivo de confirmar a capacidade delas de quantificar a vitamina em amostras de soro. Tais estudos consistiram em fazer uma comparação exaustiva entre os resultados obtidos por meio do kit e aqueles obtidos por meio da cromatografia líquida de alto desempenho descrita em seções anteriores, com o seguinte processo de preparação prévio: quantidades variáveis (0-300 μL) de ácido fólico dissolvidas em uma solução de 50 mM de tetraborato de sódio preparada em 1% (w/v) de ascorbato de sódio foram adicionadas a 50 μL de soro. A solução resultante foi tirada para um volume final de 350 pL (1:7 de diluição do soro) com a solução de 50 mM de tetraborato de sódio. Cada mistura foi levada à ebulição por 30 minutos e foi subsequentemente resfriada a 2°C e preservada durante uma noite a tal temperatura.

Após centrifugar as amostras resultantes a 20,000 rpm por 20 minutos e filtrá-las por meio de um filtro de 20 pm, o conteúdo de ácido fólico delas foi quantificado por meio de cromatografia líquida de alto desempenho ao se usar o método descrito acima. Nesse caso e devido à baixa concentração de soro da vitamina, a técnica de adições padrões foi usada para minimizar os erros na quantificação e remoção de qualquer interferência da matriz. Esse método de extração e quantificação por meio de HPLC foi validado de acordo com o critério estabelecido pela FDA.

Em todos os estudos de caso, as diferenças nas concentrações de soro de ácido fólico encontradas por meio de ambos os métodos foram inferiores a 10%. Portanto, a técnica de imunoensaio de enzima foi escolhida para quantificar todas as amostras, uma vez que ela requer uma quantidade menor de soro para a análise deste e é uma técnica mais simples e rápida, cujo limite de detecção (2 ng/mL é muito inferior àquele da técnica de cromatografia.

EXEMPLO 1

Preparação e caracterização de nanopartículas de zeína vazias. Rendimento do processo de obtenção. Influência da quantidade de lisina incorporada na formulação nas características físico-químicas das nanopartículas. 60 mg de zeína (Sigma-Aldrich), juntamente com 10 mg de lisina (Sigma- Aldrich) foram dissolvidas em 8.8 mL de uma solução de 50% (w/v) de etanol. Subsequentemente, 8,8 mL de água foram adicionados a esta solução mediante agitação magnética e um fluxo constante para formar as nanopartículas. Esse processo foi realizado em triplicata.

Figura 1 (A e B) mostra as imagens obtidas por meio do microscópio eletrônico de transmissão das partículas de zeína obtidas através desse método.

Para o propósito de conhecer a influência da lisina e o percentual de etanol da solução hidroalcoólica inicial, 3 novas formulações foram preparadas por meio da variação desses parâmetros: (i) uma delas sem lisina, (ii) uma outra com lisina e a solução hidroalcoólica inicial preparada em 75% (w/v) de etanol em vez de 5 50% (w/v), e (iii) a terceira também foi preparada em 75% (w/v) de etanol e sem lisina. Tabela 3 resume os parâmetros físico-químicos principais das nanopartículas resultantes. Tabela 3 10 Características físico-químicas das nanopartículas de zeína (média ± SD, n=6) na presença de quantidades diferentes de lisina e percentuais de etanol nos quais a zeína é dissolvida antes da formação das nanopartículas.

presença de lisina, uma vez que isso previne a agregação das nanopartículas, tornando-as versáteis para a encapsulação tanto dos BACs solúveis em água quanto daqueles solúveis em gordura e, ainda, uma economia significante no uso do reagente é alcançada.

EXEMPLO 2 Preparação e caracterização de nanopartículas de zeína contendo resveratrol. Influência do conteúdo de lisina e resveratrol na eficiência de encapsulação

Diferentes soluções hidroalcoólicas foram preparadas, todas elas contendo 60 mg de zeína e quantidades variáveis de lisina (0, 5, 10 ou 20 mg) em um volume final de 8,8 mL de 50% de etanol.

Adicionalmente, 47 mg de resveratrol foram dissolvidos em 15 ml de etanol e então diluídos para 24 mL com água.

Volumes variáveis da solução de resveratrol (1, 2 ou 3 mL) foram, subsequentemente, adicionados nas diferentes soluções de zeína preparadas. Após 5 minutos de incubação, 8,8 mL de água foram adicionados à mistura mediante agitação magnética e fluxo constante. Esse processo foi realizado em triplicata para cada tipo de formulação. Tabela 4 mostra as características físico-químicas das nanopartículas obtidas em cada caso. Tabela 4

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína (inicialmente dissolvidas em 50% de etanol (w/v), com quantidades variáveis de lisina (média ± zeína é de 1 : 16

SD, n = 3) com resveratrol encapsulado. A proporção em peso entre resveratrol e R: Resveratrol; NP: Nanopartícula

Os resultados obtidos mostram que a presença de lisina não afeta significativamente a eficiência de encapsulação. Assim, levando em consideração que tal aminoácido modifica a carga de superfície das partículas e reduz a possibilidade de sua agregação e, ainda, que isso aumenta o rendimento da formação de partículas, a formulação contendo o aminoácido incorporado a ela foi escolhida para continuar o estudo. Tabela 5 mostra as características físico-químicas das nanopartículas obtidas ao se variar o conteúdo de resveratrol quando a quantidade de lisina é constante. Tabela 5

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína (inicialmente dissolvidas em 50% de etanol w/v), com quantidades variáveis de resveratrol

(média ± SD, n = 3). A proporção em peso entre lisina e zeína é de 1 . 6

Os resultados obtidos revelam que, conforme a quantidade de resveratrol adicionada à formulação aumenta, a eficiência de encapsulação diminui, porém a quantidade de substância bioativa encapsulada dentro das partículas aumenta.

EXEMPLO 3

Preparação e caracterização de nanopartículas de zeína contendo resveratrol seco por aspiração (secagem por pulverização) 126 mg de zeína foram dissolvidas juntamente com 21 mg de lisina em 14 mL de 50% (w/v) de etanol.

Adicionalmente, 60 mg de resveratrol foram dissolvidas em 10 mL de etanol e 1,4 mL daquela solução foram subsequentemente coletados e levados a um volume final de 2,8 mL com água. 1,1 mL da solução de resveratrol diluído foram então adicionados à solução de zeína e a mistura foi incubada por 5 minutos. Após esse tempo, 15 mL de água foram adicionados à mistura mediante agitação magnética e fluxo constante.

Finalmente, 260 mg de maltodextrina foram adicionadas à mistura antes de secá-la por meio do uso do secador por pulverização. As condições do processo foram: Temperatura de entrada de ar: 110°C Temperatura de saída de ar: 70°C Pressão do ar: 6 bar [6x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 mL/min Aspiração: 94% Fluxo de ar: 700 L/h Tabela 6 resume as características físico-químicas da formulação resultante. Tabela 6

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com lisina e resveratrol (R) (média ± SD, n = 3), secas por meio da técnica de secagem por pulverização, usando maltodextrina como um adjuvante do processo. A proporção em peso entre lisina e zeína é de 1 : 6. A proporção em peso entre o sacarídeo (maltodextrina) e zeína é de 2 : 1

A quantidade encapsulada por mg de nanopartículas e a eficiência de encapsulação não são modificadas pela secagem por pulverização. Figura 2 mostra as imagens obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura das partículas de zeína contendo resveratrol.

Adicionalmente, os mesmo experimentos foram realizados ao se aplicar a técnica de alta pressão (150 MPa em um ciclo de 5 minutos e 400 MPa em um ciclo de 5 minutos) após a formação das nanopartículas, antes de sua passagem pelo secador por pulverização. Os resultados de encapsulação obtidos foram similares àqueles obtidos sem tal tratamento.

EXEMPLO 4 Preparação e caracterização das nanopartículas de zeína contendo quercetina. Influência do conteúdo de lisina e quercetina na eficiência de encapsulação

Soluções diferentes foram preparadas, todas elas contendo 60 mg de zeína e 10 mg de lisina em um volume final de 8,8 mL de 50% de etanol.

Adicionalmente, 150 mg de quercetina foram dissolvidas em 50 mL de etanol e subsequentemente diluídas ao se levar 31 mL da solução prévia e levá- las a um volume final de 50 mL com água. Volumes variáveis da solução de quercetina (0,5-3 mL) foram subsequentemente adicionados às diferentes soluções de zeína preparadas. Após 5 minutos de incubação, 8,8 mL de água foram adicionados à mistura mediante agitação magnética e fluxo constante. Esse processo foi realizado em triplicate para cada tipo de formulação. Figura 3 mostra as imagens obtidas por meio de microscopia eletrônica de transmissão das partículas de zeína com quercetina encapsulada obtida através desse método. Tabela 7 mostra as características físico-químicas obtidas em cada caso. Tabela 7 Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com lisina e quantidades variáveis de quercetina (Q) (média ± SD, n = 6). A proporção em peso entre lisina e zeína é de 1 : 5,5

NP: Nanopartícula

Os estudos estatísticos conduzidos (teste não paramétrico de amostras independentes: Kruskal-Wallis) revelaram a existência de evidência estatisticamente significante para considerar que havia diferenças nas características físico-químicas das diferentes formulações. Tendo em vista os resultados obtidos, pode-se considerar que, conforme a quantidade de quercetina adicionada à formulação aumenta, a eficiência de encapsulação diminui e a quantidade de BAC encapsulado (quercetina) aumenta potencialmente (Figura 4), considerando a seguinte expressão matemática:

em que y corresponde à quantidade de quercetina encapsulada (µg Q/mg NP), e x corresponde à proporção inicial entre quercetina e zeína (mg de zeína/mg de quercetina).

Com relação aos tamanhos e potenciais, diferenças estatisticamente significantes não foram encontradas entre as diferentes amostras analisadas.

Adicionalmente, uma tentativa foi feita para conhecer a influência da maior ou menor presença de lisina na formulação nas características físico-químicas das nanopartículas, portanto, o mesmo estudo foi conduzido, mantendo-se constante a quantidade inicial de quercetina e variando-se a quantidade de aminoácido adicionado, nesse caso.

Assim, diferentes soluções de zeína contendo quantidades variáveis de lisina (0 a 20 mg) foram preparadas. A quantidade da solução de quercetina descrita acima e que foi adicionada à formulação foi de 3 mL em todos os casos, portanto, a proporção em peso de quercetina : zeína foi de 1 :11.

A tabela 8 mostra os resultados de caracterização físico-química obtidos em cada caso. Tabela 8 Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com quercetina e quantidades variáveis de lisina (média ± SD, N = 6). A proporção em peso entre quercetina e zeína é de 1 :11

Os resultados obtidos mostram que, no caso da quercetina, quando quantidades superiores a 10 mg são adicionadas à solução inicial de zeína, a eficiência de encapsulação é reduzida em aproximadamente 20% com relação às formulações contendo quantidades menores de lisina, provavelmente devido ao fato de que tais quantidades de aminoácido induzem uma oxidação parcial do ingrediente ativo. No entanto, diferenças estatisticamente significantes não foram encontradas entre as eficiências de encapsulação das amostras sem lisina e aquelas contendo cerca de 5 mg desta última na formulação. Portanto, esta era a formulação selecionada para continuar com os estudos de secagem.

EXEMPLO 5

Preparação e caracterização de nanopartículas de zeína contendo quercetina seca por meio de secagem por pulverização 602 mg de zeína, juntamente com 51 mg de lisina foram dissolvidas em 80 mL de 50% (w/v) de etanol.

Adicionalmente, 250 mg de quercetina foram dissolvidas em 50 mL de etanol e 20 mL daquela solução foram subsequentemente coletados e levados a um volume final de 32 mL com água. 20 mL da solução de quercetina diluída foram então adicionados à solução de zeína e a mistura foi incubada por 5 minutos. Após esse tempo, 80 mL de água foram adicionados à mistura mediante agitação magnética e fluxo constante.

Finalmente, 1,209 mg de manitol foram adicionadas à mistura antes de secá-la por meio da utilização do secador por pulverização. As condições do processo eram: Temperatura de entrada de ar: 90°C Temperatura de saída de ar: 45°C Pressão do ar: 6 bar [6x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 mL/min Aspiração (Aspirador): 100% Fluxo de ar: 600 L/h A tabela 9 resume as características físico-químicas da formulação resultante. Tabela 9

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com lisina e quercetina (Q) (média ± SD, n = 3), seca por meio da técnica de secagem por pulverização, usando-se manitol como um adjuvante do processo, A proporção em peso entre lisina e zeína é de 1 : 11. A proporção em peso entre o sacarídeo (manitol) e a proteína é de 2 :1

A quantidade encapsulada por mg de nanopartículas e a eficiência de encapsulação não são modificadas pela secagem por pulverização.

Figura 5 mostra as imagens obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura das partículas de zeína contendo quercetina.

O mesmo estudo foi realizado usando-se maltodextrina em vez de manitol como um adjuvante, obtendo-se maiores eficiências de encapsulação, uma vez que a maltodextrina atua, além disso, revestindo as nanopartículas e encapsulando parte da quercetina que permanece fora delas.

Adicionalmente, os mesmos experimentos foram realizados ao se aplicar a técnica de alta pressão (150 MPa em um ciclo de 5 minutos, 400 MPa em um ciclo de 5 minutos e 800 MPa em um ciclo de 5 minutos) após a formação das partículas, antes de sua passagem através da secagem por pulverização. Os resultados de encapsulação obtidos foram similares àqueles obtidos sem tal tratamento.

EXEMPLO 6

Preparação e caracterização de nanopartículas de zeína contendo ácido fólico 121 mg de zeína, juntamente com 18 mg de lisina foram dissolvidas em 14 mL de 50% (w/v) de etanol.

Adicionalmente, 303 mg de ácido fólico, juntamente com 402 mg de lisina foram dissolvidas em 50 mL de água e subsequentemente diluídas pela metade com etanol. 5 mL da solução de ácido fólico diluído foram então adicionados à solução de zeína e a mistura foi incubada por 5 minutos, Após esse tempo, 0,6 mL de Tween® 80 (polisorbato) foram adicionados à mistura, e a mistura foi incubada por outros 5 minutos. 15 mL de água foram adicionados, então, mediante agitação magnética e fluxo constante para formar as nanopartículas. Finalmente, 253 mg de lactose foram adicionadas à mistura antes de secá- la por meio do uso do secador por pulverização. As condições do processo foram: Temperatura de entrada de ar: 125°C Temperatura de saída de ar: 90°C Pressão do ar: 6 bar [6x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 mL/min Aspiração: 90% Fluxo de ar; 750 L/h A tabela 10 resume as características físico-químicas da formulação resultante. Tabela 10

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com lisina e ácido fólico (FA) (média ± SD, n = 3) secas por meio da técnica de secagem por pulverização usando-se lactose como um adjuvante do processo. A proporção final em peso entre o sacarídeo (lactose) e zeína é de 2 : 1

FA: ácido fólico; NP: nanopartícula

Adicionalmente, uma nova formulação de nanopartículas de zeína contendo ácido fólico foi preparada, omitindo-se, nesse caso, a etapa de adição do surfactante. Para esse fim, 1,270 mg de zeína, juntamente com 200 mg de lisina foram dissolvidas em 140 mL de 50% (w/v) de etanol. Outra solução foi adicionalmente preparada, a qual continha 121 mg de ácido fólico e 200 mg de lisina em 25 mL de água, o que foi subsequentemente diluído pela metade com etanol. 43 mL da solução de ácido fólico diluído foram então adicionados à solução de zeína, deixando-se incubar a mistura por 5 minutos. Após esse tempo, 150 mL de água foram adicionados mediante agitação magnética e fluxo constante para obter as nanopartículas.

Finalmente, 2,415 mg de manitol foram adicionada à mistura antes de secá-la por meio da técnica de secagem por pulverização. As condições do processo foram: Temperatura de entrada de ar: 120°C Temperatura de saída de ar: 80°C Pressão do ar: 6 bar [6x105 Pa] Taxa de bombeamento de amostra: 4,5 mL/min Aspiração: 90% Fluxo de ar: 750 L/h

A tabela 11 resume as características físico-químicas da formulação resultante. Tabela 11

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com lisina e ácido fólico (FA) (média ± SD, n = 3) secas por meio da técnica de secagem por pulverização usando-se manitol como um adjuvante do processo. A proporção final em peso entre lisina e zeína é de 1 : 3,5. A proporção em peso entre o sacarídeo (manitol) e zeína é de 2 :1

Conteúdo de FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

As nanopartículas resultantes foram facilmente ressuspensas, tendo tamanhos inferiores àqueles obtidos quando o surfactante é usado.

EXEMPLO 7

Estudo farmacocinético do ácido fólico encapsulado em nanopartículas de zeína

A tabela 12 resume as características físico-químicas principais das nanopartículas testadas no estudo farmacocinético. Tais nanopartículas foram obtidas ao se seguir o processo descrito na segunda seção do Exemplo 6 (sem surfactante). Tabela 12

Características físico-químicas das nanopartículas de zeína com ácido fólico (média ± SD, n = 6) usadas nos estudos farmacocinéticos.

FA: Ácido fólico; NP: Nanopartícula

O estudo farmacocinético foi dividido em três fases. A primeira delas consistiu de administração intravenosa de 1 mg/kg de ácido fólico dissolvido em tampão de fosfato; a segunda consistiu de administração oral ao ratinhos de 1 mL de tampão de fosfato (PBS) a um grupo de 5 ratinhos Wistar machos (os níveis de linha base da vitamina ao longo do tempo foram estudados nesse grupo de ratinhos). Finalmente, a terceira fase consistiu de administração oral de 1 mg/kg de (i) ácido fólico dissolvido em água, (ii) ácido fólico encapsulado em nanopartículas de zeína aos grupos de ratinhos formados por 5 animais.

Após a administração, um volume de sangue de aproximadamente 500 μL foi extraído em diferentes períodos (0, 1, 2, 3, 8 e 24 horas) e coletado em tubos separadores de soro, recuperando, subsequentemente, o volume de sangue do animal com um volume equivalente de solução salina via intraperitoneal. A análise farmacocinética dos dados obtidos após a administração do ácido fólico foi conduzida ao se usar o processo de ajuste não compartimentai do programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1,5 (Pharsight Corporation, Mountain View, United States).

Os resultados obtidos (após subtração dos valores de linha base) são mostrados na figura 6. Conforme pode ser observado, a administração i.v. de ácido fólico (Figura 6A) mostra um pico de concentração de soro da droga na primeira amostragem, seguido por uma diminuição drástica dos níveis de soro. Os perfis obtidos quando a vitamina é administrada oralmente (Figura 6B) são diferentes, uma vez que a concentração significativamente inferior encontrada aparece mais vezes e diminui de maneira mais gradual. No entanto, ao se comparar os níveis de vitamina encontrados após a administração oral de ácido fólico na sua forma livre (sem encapsulação) ou encapsulado em nanopartículas de zeína, perfis semelhantes de concentração ao longo do tempo foram encontrados, porém tanto os valores máximos como as áreas abaixo da curva foram superiores quando a vitamina foi administrada em uma forma encapsulada.

A tabela 13 mostra os valores dos parâmetros farmacocinéticos obtidos após condução de uma análise não compartimentai dos dados experimentais do presente estudo. Tabela 13

Parâmetros farmacocinéticos das diferentes formulações testadas (média ± SD, n = 5)

(MRT) do ácido fólico em plasma também foi significativamente superior àquele obtido quando a vitamina livre foi administrada.

De acordo com esses resultados, a biodisponibilidade das nanopartículas de zeína com ácido fólico encapsulado foi calculado, a qual foi de 70% a 95% 5 superior aos valores obtidos após a administração oral do ácido fólico livre.

Claims

1. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz de zeína e um aminoácido básico.

2. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido aminoácido básico é selecionado a partir do grupo formado por arginina, lisina, histidina e misturas destes.

3. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um composto biologicamente ativo.

4. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o referido composto biologicamente ativo é selecionado a partir de um composto biologicamente ativo solúvel em gordura e de um composto biologicamente ativo solúvel em água.

5. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o composto biologicamente ativo solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo formado por a) um polifenol; b) uma vitamina da família das vitaminas A, D, E ou K; c) um precursor ou um derivado de uma vitamina de acordo com b); d) um fosfolipídio; e) carotenóide; f) um ácido graxo; g) um fitostanol ou um fitosterol; h) um sal ou um éster de qualquer um dos compostos anteriores a) — g); e i) combinações destes.

6. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido composto biologicamente ativo solúvel em gordura é selecionado a partir do grupo formado por um flavonol, uma antocianina, uma fitoalexina, hidroxitirosol, ácido retinóico, retinal, retinol, calciferol, alfa-tocoferol, tocotrienol, fitomenadiona, alfa-caroteno, beta- caroteno, licopeno, capsantina, luteína, zeaxantina, xantofila, EPA, DHA, ácido linoléico, campesterol, estigmasterol, sitosterol, seus derivados farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

7. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido composto biologicamente ativo solúvel em gordura é selecionado a partir de quercetina, resveratrol, seus derivados farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar, ésteres ou sais e misturas destes.

8. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o composto biologicamente ativo solúvel em água é selecionado a partir do grupo formado por: a) uma vitamina da família B ou C; b) um derivado de uma vitamina de acordo com a); c) um composto selecionado a partir do ácido hialurônico, sulfato de condroitina e ácido tióctico; d) um sal ou um éster de qualquer um dos compostos anteriores a) — c); e e) combinações destes.

9. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o composto biologicamente ativo solúvel em água é selecionado a partir de ácido fólico, de seus sais ou ésteres farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis ou de grau alimentar e de misturas destes.

10. Processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico, caracterizado pelo fato de que compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica contendo uma zeína e um aminoácido básico; e b) adicionar água à solução da etapa a).

11. Processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico e um composto biologicamente ativo solúvel em gordura, caracterizado pelo fato de que compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico; b) preparar uma solução alcoólica compreendendo um BAC solúvel em gordura e diluí-la com água para obter uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura; c) misturar a referida solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico com a referida solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em gordura; e d) adicionar água à mistura resultante da etapa c).

12. Processo para produzir uma nanopartícula compreendendo uma matriz de zeína e um aminoácido básico e um composto biologicamente ativo solúvel em água, caracterizado pelo fato de que compreende: a) preparar uma solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico; b) preparar uma solução aquosa compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico, e diluí-la com um álcool para obter uma solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico; c) misturar a referida solução hidroalcoólica (i) contendo uma zeína e um aminoácido básico com a referida solução hidroalcoólica (ii) compreendendo um BAC solúvel em água e, opcionalmente, um segundo aminoácido básico; d) adicionar, opcionalmente, um surfactante à mistura resultante da etapa c); e e) adicionar água à mistura resultante da etapa c) ou da etapa d).

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a referida solução hidroalcoólica é uma solução aquosa de etanol.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda: a) submeter a suspensão contendo as nanopartículas de zeína formadas para pelo menos um ciclo de pressão hidrostática a uma pressão compreendida entre 100 e 800 MPa; b) se desejado, secar a suspensão contendo as nanopartículas formadas, em que a referida secagem é opcionalmente realizada na presença de um agente protetor e/ou de um agente antioxidante.

15. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que é obtida por meio de um processo conforme qualquer uma das reivindicações 10 a 14.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma nanopartícula conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 15 e um veículo aceitável em alimento, farmácia ou cosmético.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o tamanho médio das nanopartículas está compreendido entre 100 e 450 nm, preferencialmente em torno de 200 nm.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que compreende: - zeína, entre 15% e 45% em peso; - um aminoácido básico, entre 1% e 4% em peso; - quercetina ou resveratrol, entre 0,5% e 5% em peso; e - um sacarídeo, entre 45% e 80% em peso, em que todas as proporções estão em peso com relação ao peso total da composição.

19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 e 17, caracterizada pelo fato de que compreende: - zeína, entre 15% e 45% em peso; - um aminoácido básico, entre 4% e 10% em peso; - opcionalmente, um polisorbato, entre 0,05% e 0,5% em peso; - ácido fólico, entre 0,5% e 5% em peso; - um sacarídeo, entre 45% e 80% em peso; e em que todas as proporções estão em peso com relação ao peso total da composição.

20. Produto alimentar, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 19.