CN103037707B - 包封化合物的纳米颗粒、获得其的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于包封化合物的纳米颗粒，获得其的方法及其应用。所述纳米颗粒包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸。所述纳米颗粒可以包封水溶性或脂溶性生物活性化合物。其可应用于食品、药品和化妆品行业以及纳米技术行业中。

Description

包封化合物的纳米颗粒、获得其的方法及其应用

技术领域

本发明涉及食品、药品和化妆品领域以及纳米技术领域，并涉及使用玉米蛋白作为涂布剂来包封生物活性化合物。本发明特别地涉及用于包封生物活性化合物的包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒、获得其的方法及其应用。

背景技术

在工业中，特别是食品、化妆品和药品行业中，需要不断发展技术来满足新的消费需求。纳米技术可为上述行业提供广受关注的解决方案。

特别地，纳米技术在食品、化妆品和药品行业的革新中具有极大的潜能，因为其允许包封生物活性化合物（BAC），例如精油、抗氧化剂、矿物质、益生质、调味料、维生素等，从而获得不同的益处，例如增加制品的使用寿命、降低BAC的使用量、控制BAC的释放、提高BAC生物利用率、掩蔽不期望的味道等等。

能够对消费者的健康产生益处的物质抗氧化剂，形成了一组BAC，其应用引起了人们极大的兴趣。为在存储过程中保护抗氧化剂化合物并且保持其稳定，将抗氧化剂化合物（例如槲皮素或白藜芦醇）在特定系统（例如微米颗粒或纳米颗粒）中进行包封，这是非常受人关注的选择。

迄今为止，包封的抗氧化剂化合物的应用基本限于化妆品和药品领域中。举例说明，已经公开了槲皮素包封在（i）由聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）和乙酸乙酯形成的纳米囊中（Ghosh等,Life Sciences2009;84:75-80），（ii）由（聚（甲基）丙烯酸酯）和聚乙烯醇（Wu等,Int J of Pharm2008;346:160-168）形成的纳米颗粒中，和（iii）由卵磷脂和(三)硬脂酸甘油酯形成的脂质微粒中（Sccalia和Mezzena,JPharm Biomed Anal2009;49:90-94）。同样地，已经公开了白藜芦醇包封在（i）聚已酸内酯纳米颗粒中（Lu等,Int J of Pharm2009;375:89-96），（ii）果胶微粒中（Das和Ng,Int J of Pharm2010;385:20-28），（iii）脂质体中（Caddeo等,Int J of Pharm2008;363:183-191），（iv）壳聚糖微球中（Peng等,Food Chem2010;121(1):23-28）和（v）聚苯乙烯微球中（Nam等,Polymer2005;46:8956-8963）。

然而，因为用于包封所述化合物的材料具有毒性问题或者该材料没有批准可用于食品中，所以在食品领域中包封的抗氧化剂化合物的应用是非常有限的。同样地，抗氧化剂化合物在设计功能性食品中的使用是非常有限的，其中，因为它们半衰期短、易染性高并且口服生物可利用度低。包封抗氧化剂化合物（例如槲皮素或白藜芦醇），从而在食品中保护所述抗氧化剂化合物并且保持它们的整个存储期间的稳定，而且还允许所述抗氧化剂可控的释放（其提高了所述抗氧化剂在有机体中的生物可利用度），这将是非常需要的。

众所周知，当设计适用于包封BAC的载体的时候，正确地选择用作基体的涂布剂的材料是非常重要的；为此，其中，必须考虑药物剂型、药物毒性、引入制剂的产品等。

在食品纳米技术领域中，不推荐使用合成聚合物，因为合成聚合物会具有毒性的问题。尽管天然聚合物不具有这些缺点，但是使用天然聚合物需要开发更为复杂的方法来制造颗粒，并且更进一步地，在大多数情况中，难于控制所获得的粒径（通常大于100μm），这样的颗粒能够被消费者察觉并且改变目标食品的感官特性。

现有技术中已经公开了将蛋白质作为BAC涂布剂的应用，所述蛋白质可以是动物源的蛋白质，例如酪蛋白、白蛋白等，还可以是植物源的蛋白质，例如醇溶谷蛋白等（ES2269715、US2004/86595、US5679377）。

玉米蛋白是存在于玉米谷物种子中的主要的贮藏蛋白。由于玉米蛋白通常具有大量的脯氨酸和谷氨酰胺氨基酸，并且其特征在于在水中具有高不溶性，所以玉米蛋白为属于醇溶谷蛋白组的球状蛋白质。在最近几年中，这种蛋白质由于其特别的物理化学特性及其分子结构而在科学和工业领域中变得非常重要，这是因为这种蛋白质具有两性分子的特征，并且可以根据存在于介质中的亲水-亲脂化合物而形成不同的自组装结构（Wang等,Food Biophysics2008;3:174-181）。因此，玉米蛋白被用作膜的原材料具有多种潜在的优势，因为其能够形成坚硬的且具有疏水性的涂层，该涂层同时具有极佳的弹性和可压缩性，还能够抵御微生物攻击。

由于玉米蛋白具有这些特性，因此发现了玉米蛋白作为粘合剂、生物可降解塑料、口香糖、作为食品、纤维、化妆品粉末的涂层、作为杀虫剂和墨水的微囊等的新应用（Muthuselvi和Dhathathreyan,Colloids andSurfaces B:Biointerfaces2006;51:39-43）。在制药行业中，还用这种蛋白质涂覆胶囊，来以可控的方式保护、释放（药物）并且遮掩不期望的味道和香味（Shukla和Cheryan,Industrial Crops and Products2001;13:171-192）。此外，还建议将玉米蛋白用于胰岛素、肝素、伊佛霉素和吉妥辛的微囊化作用。通常会获得甚至是在高湿和高热的条件下稳定的微粒/微球，其进一步还能抵御细菌攻击（US5679377）。

然而，在食品领域中，玉米蛋白用于设计具有包封组分的功能性食品的包封剂的使用仍然处于初始阶段。现有技术中已经描述了使用相分离技术获得用于包封精油的玉米蛋白纳米颗粒（Parris等,J Agric FoodChem2005;53:4788-4792），以及当Ω-3脂肪酸被引入至目标食品中的时候，通过应用流化床技术在所述蛋白质中包封Ω-3脂肪酸，以防止Ω-3脂肪酸的氧化，并掩盖Ω-3脂肪酸不利的感官特性（MX2008003213）。此外，最近已实现了通过静电纺丝技术的方式使番茄红素和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在玉米蛋白纤维中包封（分别在Fernández等,Food Hydrocolloids2009;23:1427-1432和Li等，J Food Sci2009;74(3):C233-C240中），溶菌酶通过SAS（超临界反溶剂法）工艺的方式（Zhong等，Food Chemistry2009;115(2):697-700）和鱼油通过液-液分散方法的方式（Zhong等,J Food Process Pres2009;33(2):255-270）包封。这些描述制造技术的工作相当复杂，并且难于在工业上大规模应用，或者仅限于包封亲脂性化合物而不适用于包封亲水性化合物。

因此，需要研发能够克服所有或部分前述缺陷的用于包封生物活性化合物的通用系统，其适用于装载水溶性或脂溶性化合物，特别是通过其它方式施用存在困难的化合物，例如抗氧化剂化合物的情况。此外，还非常需要使所述系统能够以简单的方式获得，并且在所述化合物的存储期间和施用所述化合物之后具有适当的稳定性，这将有助所述化合物在不同技术行业中的应用，例如食品、药品和化妆品行业。

发明概述

目前已经惊讶地发现用玉米蛋白基体和碱性氨基酸涂布水溶性和脂溶性生物活性化合物（BACs），提供了形成了用于包封并稳定所述生物活性化合物的新系统的纳米颗粒，以用于食品、化妆品和药品中。

发明人所实施的各种测试已经显示，基于事实上能够使用具有相对较低低百分比的醇的水醇溶液来溶解玉米蛋白，其转而能够包封脂溶性和水溶性BAC，所以一起添加碱性氨基酸与玉米蛋白，有利于制造包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的所述纳米颗粒的过程。此外，可防止使用碱性添加剂或溶剂引起的毒性问题，从而改善了纳米颗粒的营养特性。同时，碱性氨基酸可增强纳米颗粒的稳定性，因为所述颗粒的表面电荷增加，从而防止颗粒的聚集。

因此，一方面，本发明涉及包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒。所述纳米颗粒能够用于包封水溶性或者脂溶性BAC。在特别优选的实施方式中，所述BAC为抗氧化化合物。此外，所述纳米颗粒能够用作工艺添加剂[包封的添加剂可以结合在基体中，而添加剂在基体中是不溶的，从而有助于在介质中均匀的分散；举例说明，根据本发明，包封在所述纳米颗粒中的脂溶性BAC可以分散在水性基体中，如果所述BAC为其游离形式（未被包封），那么该方法将会很复杂]。

无论是在制品（例如食品、药品或者化妆品制品）的加工过程中还是在其存储过程中，所述纳米颗粒都是稳定的并且能够保护BAC不会由于外力而降解，例如光、pH改变、氧化等。而且，当口服施用所述纳米颗粒为的时候（例如食物），纳米颗粒保护BAC免受胃部酸性条件的损害，并且在所期望的位置（例如在肠内）释放BAC。

另一方面，本发明涉及所述空的纳米颗粒（即不包含BAC）的制造方法。

另一方面，本发明涉及装载有BAC（例如脂溶性BAC或水溶性BAC）的所述纳米颗粒的制造方法。

所述方法很简单并且可以工业规模实施，而且有利地不使用合成聚合物或者未被批准作为食品添加剂的试剂，允许所包含的表面活性剂或乳化剂的使用最小化，并且还允许获得具有可控粒径的纳米级的纳米颗粒。

在特别的实施方式中，所述方法进一步包括为获得粉末形式的制剂，干燥包含所述纳米颗粒的悬浮液的额外的步骤，其允许随着时间的流逝保持所述BAC的稳定性；粉末形式的制剂特别适用于用在固体食品中。有利地，在用于所述纳米颗粒的保护剂的存在下，干燥所述纳米颗粒。由此获得的包含BAC的纳米颗粒可以容易地重悬于水性介质中，保护所述BAC免于在溶液中降解。所获得的最终制品很稳定，并在长时间的存储过程期间保护所述BAC，并且还能应用于不同类型的食品，无论是液体食品（例如饮料）还是固体食品。

另一方面，本发明涉及包括所述纳米颗粒的组合物用于食品、药品或化妆品行业。事实上，所述纳米颗粒可以被整合到乳剂、凝胶和水凝胶中，从而获得适用在上述行业中的稳定的化妆品或药物制剂。所述纳米颗粒还可以与适用于其局部施用的赋形剂一起配制。

另一方面，本发明涉及包括所述组合物的食物制品，所述组合物基于由本发明提供的玉米蛋白纳米颗粒。在特别的实施方式中，所述食物制品为液体、半固体或者固体的形式。

附图说明

图1示出了空的玉米蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。A）8,000倍（位于图像下部左侧页边空白的黑条对应于200nm的参照）。B）15,750倍（位于图像下部左侧页边空白的黑条对应于100nm的参照）。

图2示出了包括玉米蛋白基体和包含白藜芦醇的赖氨酸的纳米颗粒的扫描电子显微镜（SEM）的显微照片。所述图像相应于在冲洗以移除保护糖类之后的粉末制剂。

图3示出了包括玉米蛋白基体和包含槲皮素和赖氨酸的纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。A）25,000倍（位于图像下部左侧页边空白的黑条对应于150nm的参照）。B）10,000倍（位于图像下部左侧页边空白的黑条对应于150nm的参照）。

图4示出了包封在纳米颗粒（NP）中的槲皮素用量与初始结合在制剂中的槲皮素用量的函数图，所述纳米颗粒包括玉米蛋白基体和赖氨酸。

图5示出了包含槲皮素的包括玉米蛋白基体和赖氨酸的纳米颗粒的扫描电子显微镜（SEM）的显微照片。所述图像相应于在冲洗以移除保护糖类之后的粉末制剂。

图6示出了在试验动物中施用不同配方的维生素之后，血清叶酸浓度（ng/mL）与时间的函数图。所获得的结果示出了平均值±标准偏差（n=5）。（A）静脉注射（i.v.），1mg/kg剂量。（B）口服施用，1mg/kg剂量：溶解在水中的未包封的叶酸(■)；分散在水中的包封在玉米蛋白纳米颗粒中的叶酸(●)。

发明详述

本发明提供了包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒，以及用于包封生物活性化合物（BAC）的方法，以保护生物活性化合物免于因外力（例如光、pH、氧化等）而降解。可以设计所述纳米颗粒，以出于增加其生物可利用度的目的，从而允许可控地释放BAC；可以通过两种途径来增加所述生物可利用度：通过包封的BAC在肠内的整体释放的方法（其在开始、在食物基体中和/或存储以及抵抗胃部的酸性环境时的降解被最小化），和通过以可控的方式或者随着时间的流逝持续地有效释放BAC的方法。

定义

为了帮助理解本发明，在下文中指出在本说明中使用的几种术语和表达的含义。

如在本文中所使用的，“碱性氨基酸”指包含氨基（-NH₂)和羧基（-COOH）以及正电荷的有机分子；所述碱性氨基酸优选为碱性α-氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

如在本文中所使用的，“大约”指近似于给定值的数值范围，例如给定值的±10%。举例来说，“大约20”包括20的±10%，或者从18至22。此外，无论术语“大约”是否被指明，本领域技术人员都应理解在本文中表达的任意数值均包括数值的近似值范围。给定值的这些变化可能由在相应测试过程中的试验误差而导致。

如在本文中所使用的，“生物活性化合物”或者“BAC”涉及具有营养、治疗活性和/或化妆品活性的化合物；所述化合物可以是脂溶性或者水溶性的。根据本发明的BAC的非限制性的说明性例子包括氨基酸、抗微生物剂、调味剂、防腐剂、甜味剂、类固醇、药物、激素、脂类、肽类、多核苷酸、多糖、蛋白质、蛋白聚糖、香料、维生素等。

如在本文中所使用的，“水溶性生物活性化合物”或者“水溶性BAC”涉及具有营养、治疗活性和/或化妆品活性的化合物，并且根据由西班牙皇家药典定义的标准，其在水溶液中是可溶的（极易溶的、易溶的、可溶的、难溶的或者微溶的）：

水溶性BAC的非限制性的说明性例子包括维生素，例如B族和C族维生素，以及它们的衍生物、盐或酯；透明质酸、硫酸软骨素、硫辛酸，它们的盐或酯等。在特别的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、4-氨基苯酸、烟酸、泛酸、硫胺素一磷酸、硫胺素焦磷酸、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰基聚麸胺酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸酯；聚麸胺酸叶酸酯）、亚乙酸、尼克酸、透明质酸、硫辛酸（α-硫辛酸）、对香豆酸、咖啡酸，它们的食品级或者制药上或者化妆品可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组。

如在本文中所使用的，“脂溶性生物活性化合物”或“脂溶性BAC”涉及具有营养、治疗活性和/或化妆品活性的化合物，并且根据由西班牙皇家药典定义的标准，其在脂肪或油中是可溶的（极易溶的、易溶的、可溶的、难溶的或者微溶的）。脂溶性BAC的非限制性的说明性例子包括维生素，例如A、D、E、K族维生素和它们的衍生物、磷脂、类胡萝卜素（胡罗卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄质等）、Ω-3脂肪酸（二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）等）、植物甾醇和植物固醇（谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等）、多元酚（槲皮素、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）以及它们的衍生物。

根据国家或者组织的食品法典委员会，例如联合国粮农组织（FAO）或者世界卫生组织（WHO），当用于人类或动物的食物中的制品是安全的时候，其为所谓的“食品级”制品；因此，“食品级”制品为“适用于在食物中使用的”非毒性制品，所以两种表达为同义的并且在本说明书中可以互换使用。

如在本文中所使用的，“水性介质”指包括水的介质。在一种特别的实施方式中，所述水性介质基本上由水构成。

如在本文中所使用的，“水醇介质”指包括可变的相对比例的水和醇的介质。在一种特别的实施方式中，所述的水醇介质包括在水中的乙醇溶液，所述化合物之间为任意比。

如在本文中所使用的，“纳米颗粒”指球形或者类似形状的胶质体系，具有小于1微米（μm）的尺寸，优选10至900纳米（nm）数量级。

如在本文中所使用的，“平均粒径”指在水性介质中一起移动的纳米颗粒群的平均直径。这些体系的平均粒径寸可以通过本领域技术人员已知的标准方法来测定，并且其例如在实验部分中进行了描述（参见下文）。

如在本文中所使用的，术语“玉米蛋白”包括属于醇溶谷蛋白组的任意球状蛋白质；所述蛋白质通常在胚乳（种子植物的胚囊中形成的营养组织，并且通常形成多种不同被子植物的种子胚的食物贮藏）生长过程中合成。玉米蛋白可以从任意合适的来源获得，尽管其优选地从玉米中获得。用于从玉米胚乳中提取玉米蛋白的多种不同的方法和技术均为已知的；商用玉米蛋白通常从玉米蛋白粉提取（US2009/0258050）。

对玉米蛋白的研究揭示其在基因水平可变性极大，因此在形成玉米蛋白的蛋白质组成部分的不同蛋白质情况复杂。天然玉米蛋白实际上为一种大蛋白质，且是多种蛋白质组的异源家族，这些蛋白质的分子大小、溶解性和电荷均有所不同。据估计存在20种以上的不同的玉米蛋白。通过高效液相色谱法（HPLC）、离子交换层析、凝胶排阻色谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电点聚焦（IEF）、氨基酸分析和DNA克隆技术来分析玉米蛋白提取物，使得对于玉米蛋白的理解更深入。

对玉米蛋白的氨基酸成分的分析揭示其含有大量的亮氨酸、丙胺酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸；然而，不存在赖氨酸和色氨酸，或者可替换地存在的量非常少。非极性氨基酸残基比例高和离子基团异常缺乏是其具有疏水性和特定溶解性的原因。

玉米蛋白的蛋白体由三种类型的结构上不同的蛋白质来形成：阿尔法-玉米蛋白（α-玉米蛋白），伽马-玉米蛋白（γ-玉米蛋白）[其包括贝它玉米蛋白（β-玉米蛋白）]，以及德耳塔-玉米蛋白（δ-玉米蛋白）。基于不同的溶解性和序列，所述蛋白质可以被分为四类（α-玉米蛋白、β-玉米蛋白、γ-玉米蛋白和δ-玉米蛋白）。

未利用还原剂提取的玉米蛋白形成了大的多基因家族的多肽，称为α-玉米蛋白。α-玉米蛋白通常为天然玉米蛋白的最为丰富的部分，其在氨基端包含约40个氨基酸，其位于20个氨基酸的9或10个重复的多肽系列之前。这些重复单元被认为是α-螺旋，将蛋白质缠绕成棒状分子。

玉米蛋白的其它部分（β-、γ-和δ-玉米蛋白）必须使用醇溶液来提取，所述醇包含断开二硫键的还原剂。举例说明，在实验室提取中使用巯基乙醇。β-、γ-和δ-玉米蛋白具有与α-玉米蛋白不相同的序列。

γ-玉米蛋白在还原条件下溶解于水性溶剂和醇性溶剂中。每种γ-玉米蛋白均具有独特的N-末端序列。举例说明，在50kDaγ-玉米蛋白中，这一区域具有136个氨基酸长度，并且极其富含组氨酸。27kDaγ-玉米蛋白具有一系列的八个串联的六肽重复单元，其在氨基端之后产生11个氨基酸。16kDaγ-玉米蛋白的最初的八个氨基酸与27kDaγ-玉米蛋白的相同，但是16kDaγ-玉米蛋白具有三种退化类型的富含脯氨酸的重复单元。γ-玉米蛋白通常占全部玉米蛋白的10%至15%之间。

与γ-玉米蛋白相关的β-玉米蛋白包括富含蛋氨酸的17kDa的多肽，并且组成全部玉米蛋白的高达10%。β-和γ-玉米蛋白末端的140个氨基酸有大约85%是相同的。β-玉米蛋白不具有重复的多肽，并且好像绝大多数由β-折叠和转角结构构成。

δ-玉米蛋白为10kDa的蛋白质，是玉米蛋白的最小部分。δ-玉米蛋白为所述组中最为疏水的，其不包含重复的多肽，并且特别地富含蛋氨酸和半胱氨酸。

自1985年以来，玉米蛋白已经被食品药品管理局（美国）认为是“公认安全”（GRAS）的制品[CAS（化学文摘服务）编号：9010-66-6]。

在本发明中，玉米蛋白的来源或者等级并不限于单一的玉米蛋白，实际上，任意的玉米蛋白均可用于实施本发明。以实例说明，可在本发明中使用的商用玉米蛋白包括但不限于由Sigma-Aldrich（产品编号Z3625）；Wako Puras Chemical Industries(产品编号261-00015、264-01281和260-01283);Spectrum Chemical(产品编号Z1131和ZE105);ScienceLabunits SLZ1150;SJZ Chem-Pharma Company(产品名称ZEIN(GLIDZIN);Arco Organics(目录编号17931-0000、17931-1000和17931-5000);以及Freeman Industries，玉米蛋白普通品级F4000，玉米蛋白普通品级F4400，玉米蛋白特级F6000等提供的玉米蛋白。在一种特别的实施方式中，使用由Sigma-Aldrich（产品编号Z3625）提供的，从玉米获得的商用玉米蛋白。

如在本文中所使用的，术语“玉米蛋白”包括天然玉米蛋白和改性玉米蛋白。术语“改性玉米蛋白”包括具有通常不是天然出现的氨基酸序列的任意的玉米蛋白，但是其表现与真正的玉米蛋白相似并且可溶于醇。氨基酸取代，特别是引入基本上没有改变疏水性的那些基团。以实例说明，氨基酸取代可以在重复部分内取代，或者单个的氨基酸可以被取代，并且取代还可以在连接重复序列的区域的片段中取代。还可以在玉米蛋白分子的羧基端和氨基端中引入插入和取代。此外，缺失可以在获得的蛋白质在功能上等价于玉米蛋白（即获得的蛋白质保留了玉米蛋白的特性）的氨基酸序列中实施。

本发明的纳米颗粒

一方面，本发明涉及纳米颗粒，在下文中本发明的纳米颗粒包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸。

事实上，任意的玉米蛋白均可以形成本发明纳米颗粒的基体；然而，在一种特别的实施方式中，所述的玉米蛋白为来自于谷物的玉米蛋白，例如由Sigma-Aldrich（产品编号Z3625）提供的玉米蛋白。

在一种特别的实施方式中，所述的碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物构成的组。

本发明的纳米颗粒可以用于包封生物活性化合物（BAC）。本发明的纳米颗粒还可以用作工艺添加剂，例如帮助脂溶性BAC在水性基质中混合等。

因此，在另一种特别的实施方式中，本发明的纳米颗粒进一步包括BAC。所述BAC可以是水溶性BAC或脂溶性BAC；在这种情况中，本发明的纳米颗粒有时在本说明书中被限定为“本发明的有装载的纳米颗粒”，以与本发明的不包含BAC的其它纳米颗粒（有时被限定为“本发明的空的纳米颗粒”）相区分。

在一种特别的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC。在一种更加特别的实施方式中，所述脂溶性BAC选自由如下构成的组：

a）多元酚；

b）A、D、E或K族维生素；

c）根据b）的维生素的前体或者衍生物；

d）磷脂；

e）类胡罗卜素；

f）脂肪酸；

g）植物甾烷醇和植物甾醇；

h）任意前述化合物a）-g）的盐或酯；和

i）其组合。

在一种更加特别的实施方式中，所述脂溶性BAC为：

i）多元酚，例如黄酮醇（例如儿茶酚、表儿茶酸、异鼠李素、山柰酚、杨梅酮、槲皮素等）；花色素苷（例如花色素苷、花翠素、锦葵花素、芍药花色素苷、牵牛色素等）；植物抗毒素（例如白藜芦醇等）；羟基酪醇等；

ii）脂溶性维生素，例如维生素A及其衍生物（例如视黄酸、视黄醛、视黄醇等）；维生素E及其衍生物（例如生育酚、像α-生育酚等，三烯生育酚等）；维生素D及其衍生物（例如维生素D₁、麦角钙化固醇（麦角钙化甾醇）、维生素D₃（胆钙化醇）、维生素D₄（22-二氢麦角骨化醇）、维生素D₅（谷钙化醇）等）；维生素K或植物甲萘醌及其衍生物（例如维生素K1（叶绿醌）、维生素K2（甲基萘醌）、甲萘醌等）；

iii）类胡萝卜素，例如胡罗卜素（例如α-胡罗卜素、β-胡罗卜素、隐黄素、番茄红素等）；叶黄素（例如虾青素、角黄素、辣椒黄素、玉米黄质、毛茛黄素、叶黄素、紫松果黄素、玉红黄素、紫黄素、玉米黄素等）；

iv）脂肪酸，例如Ω-3脂肪酸（例如α-亚麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等）；Ω-6脂肪酸（例如γ-亚油酸等）；或者

v）植物甾醇或者植物甾烷醇（例如菜籽甾醇、菜油甾醇、麦角固醇、豆甾醇、二氢谷甾醇、谷甾醇等）。

在一种特定的实施方式中，所述脂溶性BAC选自由黄酮醇（例如槲皮素等）、花色素苷、植物抗毒素（例如白藜芦醇等）、羟基酪醇、视黄酸、视黄醛、视黄醇、麦角钙化固醇（麦角钙化醇和胆骨化醇）、α-生育酚、三烯生育酚、维生素K1、α-胡萝卜素、β-胡罗卜素、番茄红素、辣椒黄素、叶黄素、玉米黄素、胡萝卜醇、EPA、DHA、亚油酸、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、它们的食品级或者制药或化妆品可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组。

在一种更加特别的实施方式中，所述脂溶性BAC选自由槲皮素、白藜芦醇、它们的食品级或者药学上或化妆品中可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组。

在另一种特别的实施方式中，所述BAC为水溶性BAC。在一种更加特别的实施方式中，所述水溶性BAC为：

a）B或C族维生素；

b）根据a）的维生素的衍生物；

c）选自透明质酸、硫酸软骨素和硫辛酸的化合物；

d）任意前述化合物a）-c）的盐或酯；和

e）其组合。

在一种特定的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、其食品级或者药学上或化妆品中可接受的酯或盐，及其混合物构成的组。

使用本发明的纳米颗粒作为用于包封抗氧化化合物的体系为特别的和优选的实施方式。

获得本发明的纳米颗粒的方法

另一方面，本发明涉及包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒（本发明的纳米颗粒）的制备方法，以下称为“本发明的方法[1]”，其包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液；和

b）向步骤a）的溶液中添加水。

在本发明的方法[1]的步骤a）中使用的水醇溶液包含水和醇，典型地为乙醇；在一种特别的实施方式中，所述水醇溶液包括25%至75%（w/v）的醇，优选为30%至60%，更优选为约50%。

本发明的方法[1]的步骤a）中形成的水醇溶液的玉米蛋白的量可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特定的实施方式中，包含在所述水醇溶液中的玉米蛋白的量为0.1%至10%（w/v），优选为0.2%至2.5%，更优选0.5%至1%。

本发明的方法[1]的步骤a）中形成的水醇溶液的碱性氨基酸的量可以在宽泛的范围内变化。通常地，所述量通常会根据将要被溶解的玉米蛋白的用量来表示。由此，尽管存在于所述水醇溶液中的碱性氨基酸和玉米蛋白的重量比[碱性氨基酸：玉米蛋白]通常会依赖于将要被包封的BAC的类型，并且可以是广为不同的，但是在一种特定的实施方式中，所述碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1：50，典型地为1：0.5至1：25，优选为1：1至1：20，更优选为1：5至1：15；在一种特定的实施方式中，碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比约为1：6。

在本发明的方法[1]的步骤b）中，水以足够的量来添加从而形成本发明的纳米颗粒。尽管将要被添加的水的量可以在宽泛的范围内变化，但是在一种特别的实施方式中，水以足够的量来添加，从而使得介质中所包括的醇的最终比例为10%至60%（w/v），优选为15%至30%，更优选约为25%。

另一方面，本发明涉及包括玉米蛋白基体、碱性氨基酸和脂溶性BAC的纳米颗粒（装载有脂溶性BAC的本发明的纳米颗粒）的制备方法，在下文中为“本发明的方法[2]”，其包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）；

b）制备包括脂溶性BAC的醇溶液，并且使用水将其稀释以获得包括脂溶性BAC的水醇溶液（ii）；

c）混合包含玉米蛋白和碱性氨基酸的所述水醇溶液（i）和包括脂溶性BAC的所述水醇溶液（ii）；和

d）将水添加至步骤c）获得的混合物中。

在本发明的方法[2]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）包含水和醇，典型地为乙醇；在一种特别的实施方式中，所述水醇溶液包括25%至75%（w/v）的醇，优选为30%至60%，更优选约为50%。所述水醇溶液（i）通过混合其合适用量的组分来制备。

在本发明的方法[2]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）的玉米蛋白的量可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特定的实施方式中，包含在所述水醇溶液（i）中的玉米蛋白的量为0.1%至10%（w/v），优选为0.2%至2.5%，更优选0.5%至1%。

在本发明的方法[2]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）的碱性氨基酸的量可以在宽泛的范围内变化。所述量将通常会根据将要被溶解的玉米蛋白的用量来表示。由此，尽管存在于所述水醇溶液（i）中的碱性氨基酸和玉米蛋白的重量比[碱性氨基酸：玉米蛋白]可以是广为不同的，但是在一种特定的实施方式中，所述碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1：50，典型地为1：0.5至1：25，优选为1：1至1：20，更优选为1：5至1：15；在一种特定的实施方式中，碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比约为1：6（当所述BAC为白藜芦醇的时候）和约为1：11（当所述BAC为槲皮素的时候）。

在本发明的方法[2]的步骤b）中生成的包括脂溶性BAC的水醇溶液（ii）可以通过在醇（例如乙醇）中溶解或增溶所述脂溶性BAC并且之后利用水稀释所获得的醇溶液来获得。因此，在本发明的方法[2]的步骤b）中生成的包括脂溶性BAC的所述的水醇溶液（ii）包含水和醇，典型地为乙醇；在一种特别的实施方式中，所述水醇溶液（ii）包括25%至75%（w/v）的醇，优选30%至65%，更优选50%至60%。

所述水醇溶液（ii）的脂溶性BAC的量可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特别的实施方式中，包含在所述水醇溶液（ii）中的脂溶性BAC的量为0.05%至10%（w/v），优选为0.1%至1%，更优选为0.2%至0.3%。

根据本发明方法[2]的步骤c），包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）与包括脂溶性BAC的水醇溶液（ii）相混合；从而包括玉米蛋白、碱性氨基酸和脂溶性BAC的混合物在水醇介质中形成。存在于在所述步骤c）中形成的混合物中的脂溶性BAC：玉米蛋白的重量比可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特别的实施方式中，脂溶性BAC和玉米蛋白的重量比[脂溶性BAC：玉米蛋白]为1：0.5至1：70，优选为1：5至1：50，更优选为1：10至1：30。

在本发明的方法[2]的步骤d）中，将水以足够的量添加至在步骤c）形成的混合物中，用于形成本发明的纳米颗粒。尽管将要添加的水的量可以在宽泛的范围内变化，但是在一种特别的实施方式中，水以足够的量添加，使得介质中醇的最终比例为10%至60%（w/v），优选为15%至30%，更优选约为25%。

另一方面，本发明涉及包括玉米蛋白基体、碱性氨基酸和水溶性生物活性化合物的纳米颗粒（装载有水溶性BAC的本发明的纳米颗粒）的制备方法，在下文中为“本发明的方法[3]”，其包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）；

b）制备包括水溶性BAC以及任选的第二碱性氨基酸的水溶液，并且利用醇将其稀释以获得包括水溶性BAC和任选的第二碱性氨基酸的水醇溶液（ii）；

c）混合包含玉米蛋白和碱性氨基酸的所述水醇溶液（i）与包括水溶性BAC和任选的第二碱性氨基酸的所述水醇溶液（ii）；

d）任选地将表面活性剂添加都步骤c）获得的混合物；并且

e）将水添加到步骤c）或步骤d）获得的混合物。

在本发明的方法[3]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）包含水和醇，典型地为乙醇；在一种特别的实施方式中，所述水醇溶液包括25%至75%（w/v）的醇，优选为30%至60%，更优选约为50%。所述水醇溶液（i）通过混合合适量的其组分来制备。

在本发明的方法[3]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）的玉米蛋白的量可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特定的实施方式中，包含在所述水醇溶液（i）中的玉米蛋白的量为0.1%至10%（w/v），优选为0.2%至2.5%，更优选0.5%至1%。

在本发明的方法[3]的步骤a）中使用的包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）的碱性氨基酸的量可以在宽泛的范围内变化。所述量将通常会根据将要被溶解的玉米蛋白的量来表示。由此，尽管存在于所述水醇溶液（i）中的碱性氨基酸和玉米蛋白的重量比[碱性氨基酸：玉米蛋白]可以是广为不同的，但是在一种特定的实施方式中，所述碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1：50，典型地为1：0.5至1：25，优选为1：1至1：20，更优选为1：5至1：15；在一种特定的实施方式中，碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比约为1：6.7。

在本发明的方法[3]的步骤b）中生成的包括脂溶性BAC的水醇溶液（ii）可以通过在水中，任选地在第二碱性氨基酸的存在下溶解或增溶所述水溶性BAC并且之后利用醇（例如乙醇）稀释所获得的水溶液而获得。因此，在本发明的方法[3]的步骤b）中生成的包括水溶性BAC以及任选的第二碱性氨基酸的所述水醇溶液（ii）包括水和醇，典型地为乙醇；在一种特别的实施方式中，所述水醇溶液（ii）包括25%至75%（w/v）的醇，优选为30%至60%，更优选约为50%。

通过在水中并且任选地在存在所述第二碱性氨基酸的情况下，溶解水溶性BAC而获得的水溶液在一种特别的实施方式中包含所述的水溶性BAC和水；并且在另一种特别的实施方式中包含所述的水溶性BAC，所述碱性氨基酸和水。所述第二碱性氨基酸将通常会存在于所述水溶液中[并且，当其存在对溶解水溶性BAC是必须的时候，相应地存在于所述水醇溶液（ii）中]，因为某些水溶性BAC、例如叶酸的溶解性会通过使用利用所述碱性氨基酸碱化的水溶液而得到改善；在这种情况中，在所述碱化的水溶液中的所述水溶性BAC和所述第二碱性氨基酸的重量比可以是1：0.25至1：5，优选为1：0.5至1：2，更优选为1：0.8至1：1.8；相应地，如在上文所提及的，这一水溶液在水醇介质中（例如乙醇）被稀释以获得所述水醇溶液（ii），如在上文所提及的，其包括25%至75%（w/v）的醇，优选为30%至60%，更优选约为50%。

本发明的方法[3]可以使用两种不同的碱性氨基酸来完成。由此，在一种特别的实施方式中，用于制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸（第一碱性氨基酸）的水醇溶液（i）的碱性氨基酸，和用于制备包括水溶性BAC和（在这种情况中）第二碱性氨基酸（第二碱性氨基酸）的水醇溶液（ii）的碱性氨基酸是相同的，并且其选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物构成的组，优选为赖氨酸。

所述水醇溶液（ii）的水溶性BAC的量可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特别的实施方式中，包含在所述水醇溶液（ii）中的水溶性BAC的量为0.01%至10%（w/v），优选为0.05%至5%，更优选为0.1%至1%。

根据本发明方法[3]的步骤c），包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）与包括水溶性BAC和任选的第二碱性氨基酸的水醇溶液（ii）相混合；包括玉米蛋白、碱性氨基酸、水溶性BAC和任选的第二碱性氨基酸（如在上文中所提及的，其可以是与包含在所述水醇溶液（i）中的碱性氨基酸相同的）的混合物由此而形成。存在于在所述步骤c）中形成的混合物中的水溶性BAC：玉米蛋白的重量比可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特别的实施方式中，在步骤c）中形成的所述混合物中的水溶性BAC和玉米蛋白的重量比[水溶性BAC：玉米蛋白]为1：0.2至1：50，优选为1：1至1：15，更优选为1：6至1：12。

在本发明的方法[3]的任选步骤d）中，将表面活性剂加入到步骤c）获得的混合物中。不希望被任何理论所限制，所述表面活性剂被认为能够帮助水溶性BAC在纳米颗粒中的包封，因为其允许将水溶性BAC移动至接近于亲脂性的聚合物基体（玉米蛋白），从而在诱导凝聚的时候促使其的包封。在一种特别的实施方式中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯，举例来说，来源于脂肪酸（例如油酸）和源于聚乙氧基化的山梨聚糖的酯，例如商标名为吐温80的产品。在适当的情况下，在步骤d）中形成的混合物中的表面活性剂：水溶性BAC的重量比可以在宽泛的范围内变化；然而，在一种特别的实施方式中，表面活性剂和水溶性BAC的重量比[表面活性剂：水溶性BAC]为1：10至1：50，优选为1：15至1：45，更优选为1：20至1：30。

最后，在本发明的方法[3]的步骤e）中，将水以足够的量添加到在步骤c）或步骤d）中形成的混合物，用于形成本发明的纳米颗粒。尽管将要被添加的水的量可以在宽泛的范围内变化，但是在一种特别的实施方式中，水以足够的量来添加，使得介质中醇的最终比例为10%至60%（w/v），优选为15%至30%，更优选为约25%。

实际上，任意的玉米蛋白均可以被用于实施本发明的所述的方法[1]、[2]和[3]；然而，在一种特别的实施方式中，所述玉米蛋白为来自于谷物的玉米蛋白，例如由Sigma-Aldrich(产品编号Z3625)提供的玉米蛋白。

尽管可以使用大量不同性质的醇，但是在本发明特别的和优选的实施方式中，在本发明的方法[1]、[2]和[3]中所使用的水醇溶液为乙醇。

实际上，任意的碱性氨基酸均可以用于实施本发明的所述方法[1]、[2]和[3]；然而，在一种特别的实施方式中，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物构成的组，优选为赖氨酸。可以在本发明纳米颗粒的内侧或外侧的所述碱性氨基酸扮演着重要的技术上的角色，因为：

-在纳米颗粒形成之前其促进了组分的溶解；其特别地导致了玉米蛋白的溶解，因为相对于在不存在所述氨基酸的情况下的溶解来说，玉米蛋白在存在碱性氨基酸的时候能够在更低比例的醇（例如50%）的情况下溶解于水醇溶液中，并且其还促进了BAC的溶解，特别是某些水溶性BAC，尤其是酸性水溶性BAC（例如叶酸）；

-在制造所述纳米颗粒之后，在所述纳米颗粒的两侧（内侧和外侧）均维持合适的pH；并且

-其允许获得表面电荷为负值并且远离±10mV的纳米颗粒，这阻止了纳米颗粒的聚集。

因此，碱性氨基酸在本发明的装载或者未装载BAC的纳米颗粒的制造中均具有非常重要的作用。

本发明纳米颗粒的特征在于具有小于1μm的平均粒径，典型地为1至999nm，优选为10至900nm，更优选为50至500nm，甚至是更优选为100至450nm，仍然是更优选为140至400nm。为了防止改变感官特性（味觉上的特征），本发明的纳米颗粒有利地具有约为200nm的粒径，当它们应用于食品领域中的时候为特别合适的。

本发明的纳米颗粒，无论是装载有BAC的纳米颗粒还是未装载BAC的纳米颗粒（空的纳米颗粒），均可以在它们的配方中引入抗氧化剂，例如抗坏血酸（维生素C）等，以增强它们抵抗温度和氧化的稳定性。在这种情况中，所述抗氧化剂可以通过与BAC一起共包封而引入（在适当的情况下）或者被引入至本发明纳米颗粒的包封中；对于此，本发明的所述方法[1]、[2]和[3]将会恰当地调整以将抗氧化剂引入至纳米颗粒的配方中，举例来说，通过将抗氧化剂添加到包含所述BAC和任选的所述第二碱性氨基酸的水溶液。

在一种特别的实施方式中，BAC为叶酸并且抗氧化剂为抗坏血酸，其似乎通过保护叶酸免于由紫外线、pH改变、热、氧气等而导致的降解，进一步提供抗坏血酸自身的营养而起作用。所述抗氧化剂可以通过与BAC一起共包封而引入或者被引入至本发明纳米颗粒的包封中。

另外地，如果需要的话，本发明的方法[1]以及本发明的方法[2]和[3]可以包括一个或多个额外的稳定化的步骤，以稳定通过使用不同的处理方法获得的纳米颗粒。

在一种特别的实施方式中，所述的稳定化处理方法包括对包含本发明形成的纳米颗粒、装载有BAC或者未装载BAC的悬浮液进行高压处理，例如在100至800MPa的压力下，典型地在350至600MPa的压力下。在一种特别的实施方式中，所述处理方法包括使纳米颗粒的悬浮液在100MPa至800MPa的压力下、典型地在350至600MPa的压力下处理3至5分钟；事实上，400MPa的压力能够带来良好的结果。

在另一种特别的实施方式中，所述稳定化处理方法包括对装载有BAC或者未装载BAC的包含本发明形成的纳米颗粒悬浮液进行UHT（超高温度）处理，例如在130℃至140℃的温度下持续2至5秒，随后快速冷却。

同时，如果需要的话，本发明的方法[1]以及本发明的方法[2]和[3]可以包括干燥步骤，用于干燥包含所形成的纳米颗粒的悬浮液，以获得粉末形式装载有BAC或者未装载BAC的本发明的纳米颗粒。所述纳米颗粒的这种表观形式有助于它们的稳定性，并且对于它们在固体食物，例如面粉、面包、糕点类产品、谷类食品、奶粉等，以及化妆品和/或药物制品中的应用也是特别有用的。实际上，适用于干燥包含纳米颗粒的悬浮液的任何常规的方法或技术都可以用于实施这一干燥步骤；然而，在一种特别的实施方式中，包含纳米颗粒的悬浮液通过抽吸干燥或者喷雾（喷雾干燥）的方式或者通过冻干的方式来干燥。这种处理方法通常通过在纳米颗粒的悬浮液中添加用于所述纳米颗粒的合适的保护剂来实施，所述保护剂例如为糖类，如乳糖、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糖等及其混合物。所述保护剂保护本发明的纳米颗粒，在干燥处理的过程中抗热分解及抗氧化。

玉米蛋白：糖类的重量比可以在宽泛的范围内变化：然而，在一种特别的实施方式中，玉米蛋白：糖类的重量比为1：1至1：4，优选约为1：2。

同时，在一种特别的实施方式中，包含糖类的溶液还可以包含抗氧化剂，例如抗坏血酸（维生素C）等；在这种情况中，玉米蛋白：糖类：保护剂（例如维生素C）的重量比可以是1：0.75-2.5：0.25-1.5，优选为1：1.5：0.5。

根据本发明的方法[1]获得的本发明的纳米颗粒，即，通过方法[1]的方式制备的包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒为本发明的其它方面。

同时，根据本发明的方法[2]或[3]获得的本发明的装载纳米颗粒，即装载有脂溶性或者水溶性BAC的包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒为本发明的其它方面。

应用

本发明的纳米颗粒具有包封BAC、例如水溶性BAC或者脂溶性BAC的能力。它们还可以用为工艺添加剂，例如帮助BAC在介质中均匀分散等等，所述BAC在该介质是不溶的。

在一种特别的实施方式中，本发明的纳米颗粒能够包封BAC并且能够引入药物、化妆品和食品组合物中，因为不是天然聚合物的其它的组分（避免了与合成聚合物相关的毒性）和食品级组分并没有应用于它们的制备中和最终制品（纳米颗粒）中。所述的纳米颗粒保护BAC免于外力所致的降解（光、pH改变、氧化等）。

本发明的纳米颗粒可以再次悬浮于水性介质中，保护BAC免于在溶液中的分解。其还可以干燥粉末的形式存在，保持BAC的稳定并且使之能够长时间存储（特别是引入到固体食品制备中的时候）。

另外，本发明的纳米颗粒还适用于制备局部使用的化妆品和药物组合物。

因此，另一方面，本发明涉及一种组合物，其在下文中为“本发明的组合物”，包括至少一种本发明的纳米颗粒以及在食品、药品或者化妆品中可接受的载体；在一种特别的实施方式中，本发明的所述组合物包括多种本发明的纳米颗粒。在一种特别的实施方式中，本发明的所述纳米颗粒为包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒；在另一种特别的实施方式中，本发明的所述纳米颗粒为本发明的装载纳米颗粒，即，包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸，以及具有营养、治疗和/或化妆品活性的BAC、制药或者化妆品中可接受的载体或者适用于食物的载体的纳米颗粒。

本发明的所述纳米颗粒的平均粒径小于1μm，典型地为1至999nm，优选为10至900nm，更优选为50至500nm，甚至是更优选为100至450nm，仍然是更优选为140至400nm。为了防止感官特性（味道特征）改变，本发明的纳米颗粒有利地具有约为200nm的粒径，这对于它们在食品领域中使用的时候是特别适用的。

在一种特别的实施方式中，所述BAC选自由氨基酸、抗菌剂、调味剂、防腐剂、增甜剂、类固醇、药物、激素、脂质、多肽、多聚核苷酸、多聚糖、蛋白质、蛋白聚糖、香料、维生素及其混合物构成的组。

在一种特别的实施方式中，所述BAC为脂溶性BAC。脂溶性BAC的非限制性说明性例子包括维生素，例如A、D、E、K族维生素和它们的衍生物，磷脂，类胡萝卜素（胡罗卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒黄素、玉米黄素等），Ω-3脂肪酸（例如DHA，EPA等），氨基酸（例如异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸），植物甾醇和植物固醇（谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等），多元酚（槲皮素、芸香苷、白藜芦醇、山柰酚、杨梅酮、异鼠李素等）以及它们的衍生物。

在另一种特别的实施方式中，所述BAC为水溶性BAC，优选为水溶性BAC酸。水溶性BAC的非限制性说明性例子包括维生素，例如B族和C族维生素，以及它们的衍生物、盐或酯；透明质酸，硫酸软骨素，硫辛酸，它们的盐或酯等。在一种特别的实施方式中，所述水溶性BAC选自由叶酸、4-氨基苯酸、烟酸、泛酸、硫胺素一磷酸、硫胺素焦磷酸、三磷酸硫胺素、抗坏血酸、蝶酰基聚麸胺酸（叶酸衍生物：叶酸聚麸胺酸酯；聚麸胺酸叶酸酯）、亚叶酸、尼克酸、透明质酸、硫辛酸、对香豆酸、咖啡酸，它们的食品级或制药上或化妆品中可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物构成的组。

在一种特别的实施方式中，本发明的组合物为适用于局部施用的药物组合物；为此，所述组合物包括制药上可接受的载体，其包括一种或多种适用于局部施用的赋形剂，例如以凝胶、软膏、乳剂等的形式。适用于配制意图用于局部施用的药物组合物的赋形剂的信息以及关于所述药物组合物的制造信息可以在C.Faulí i Trillo的书籍“Tratado deFarmacia Galénica”，第10版，1993，Luzán5，S.A.de Ediciones中找到。本发明的纳米颗粒的施用剂量可以在宽泛的范围内变化，例如在约0.5（g/cm²的治疗面积）至约2（g/cm²的治疗面积）之间的本发明的组合物，所述组合物包含0.1%至30%的本发明的纳米颗粒，优选为0.5%至5%。

在另一种特别的实施方式中，本发明的组合物为适用于局部施用的化妆品组合物；为此，所述组合物包括化妆品可接受的载体，其包括一个或多个适用于局部施用的赋形剂，例如以凝胶、乳剂、洗发精、洗液等的形式。可以在Octavio Díez Sales的书籍“Manual de Cosmetología”，第1版，1998，Editorial Videocinco,S.A.中找到适用于配制旨在用于局部施用的化妆品组合物的关于赋形剂的信息以及关于所述化妆品组合物的制备信息。

在另一种特别的实施方式中，本发明的组合物为食品组合物，例如固体、液体或者半固体食物制品。

在一种特别的实施方式中，本发明的组合物包括：

-玉米蛋白，15wt%至45wt%；

-碱性氨基酸，1wt%至4wt%；

-槲皮素或者白藜芦醇，0.5wt%至5wt%；和

-糖类，45wt%至80wt%，

其中，所有的重量百分比均基于所述组合物的总重量计。

在另一种特别的实施方式中，本发明的组合物包括：

-玉米蛋白，15wt%至45wt%；

-碱性氨基酸，4wt%至10wt%；

-任选的聚山梨醇酯（例如吐温80），0.05wt%至0.5wt%；

-叶酸，0.5wt%至5wt%；

-糖类，45wt%至80wt%；并且

其中，所有的重量百分比均基于所述组合物的总重量计。

可选地，本发明的组合物可以引入至食物制品中。因此，另一方面，本发明涉及食物制品，其包括本发明的组合物。所述食物制品可以是液体、半固体或者固体的形式。有利地，为了防止或者最小化本发明纳米颗粒的全部的或者部分的溶解并由此有助于它们的稳定性，所述食物制品具有酸性pH，也就是pH小于7，优选pH等于或者小于6，更优选pH等于或者小于5。可用本发明的组合物强化或者增强的食物制品的说明性例子包括牛奶及其衍生物（酸奶、乳酪、凝乳等）、果汁、果酱、面包和糕点类制品、发酵肉、调味汁等。同时，本发明的组合物可以引入至动物食物制品中，例如饲料中。

具体实施方式

下述的实施例描述了纳米玉米蛋白颗粒和碱性氨基酸、例如赖氨酸的制备，在其中可以引入生物活性化合物[BAC]，尤其是白藜芦醇、槲皮素或者叶酸。所述纳米颗粒能够保护所述BAC免于在食物中可能由于pH、光、氧化等的变化导致的降解。

空的玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法

玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法包括在水醇溶液中溶解所述的蛋白质和特定量的赖氨酸（Sigma-Aldrich），所述蛋白质为玉米蛋白（Sigma-Aldrich–产品编号Z3625），所述的水醇溶液例如为50%（w/v）的乙醇溶液，随后在磁力搅拌和恒流下，加入特定量的水，以形成纳米颗粒，其表现为淡黄色乳状悬浮液。

纳米颗粒的物理化学特性

下文描述了用于获得纳米颗粒的全部物理化学特性所必须的不同的研究。

纳米颗粒的尺寸和表面电荷在物理化学测试中测得。所述参数的第一个（尺寸）由光子关联光谱法获得，其使用Zetasizer Nano Z-S(MalvernInstruments/Optilas,Spain)。所述参数的第二个（表面电荷）通过Zeta电位的测量而确定，其使用ZETA电位分析仪（Brookhaven InstrumentsCorporation,New York,USA）。

形成纳米颗粒的方法的产率通过定量分析在获得纳米颗粒之后残余的游离玉米蛋白来计算，从离心制剂（17,000xg，20分钟）所获得的上清液中收集残余的游离玉米蛋白。为了进行定量分析，在乙醇中进行稀释上清液，直至获得75%（w/v）浓度的醇，该醇同时也是制备校准曲线的标准品的介质。

在制剂中形成颗粒的蛋白质（玉米蛋白）的量，根据所添加的初始量以及在纯化步骤期间收集的上清液中所定量的量之间的差异来估算。所述产率估算为：

[方程式1]

此外，为了确认由玉米蛋白的总量和上清液中的玉米蛋白含量之间的差异所获得的结果，对离心之后获得的小球的进行定量研究。在这种情况中，采用75%（w/v）乙醇的水醇溶液来破坏所述颗粒，所述水醇溶液也是制备校准曲线的介质。由此，在这种情况中估算产率为：

[方程式2]

此外，为了确认定量分析方法的有效性并证实不存在基体效应，量取已知体积的未离心制剂并对其稀释直至获得75%浓度的乙醇。由此能够定量存在于所述配方中的全部玉米蛋白，并与初始添加的玉米蛋白的量相比较，在所有的情况中均发现其偏差小于5%。

为了进行不同的计算，使用了介于90至1,200μg/mL之间的校准曲线（R²=0.999；LOD=43μg/mL；LOQ=143μg/mL）。

所有的定量分析均通过在278nm下的UV分光光度测定法来实施（Agilent8453，UV-可见分光光度仪）。

通过扫描电子显微镜（Zeiss,DSM940A Germany）来观察纳米颗粒的形态。对于此，所述纳米颗粒覆盖有约9nm的分子金层（Emitech K550Equipment,Sputter-Coater,英国），并且图像利用Zeiss DMS940A显微镜(美国)采集。

包含槲皮素或白藜芦醇的玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法

装载有槲皮素或白藜芦醇的玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法包括在水醇介质（50%乙醇（w/v））中溶解蛋白质（玉米蛋白）和特定量的赖氨酸，随后在磁力搅拌下加入特定量利用水稀释的之前制备的所述抗氧化剂（槲皮素或白藜芦醇）的醇溶液。在培养该混合物几分钟之后，最后的步骤包括加入特定体积的水，以形成纳米颗粒，其表现为淡黄色乳状悬浮液。

之后，如果需要的话，通过搅拌的方式均一化3分钟之后，在持续搅拌下加入特定体积的糖溶液（乳糖、海藻糖、甘露糖醇、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖等）。最后，悬浮液在如下条件下喷散在喷雾干燥器中（Büchi Mini Spray Drier B-191，Büchi Labortechnik AG，瑞士）：

-进气口温度：70℃-110℃

-排气口温度：30℃-90℃

-气压：2-10bar[2x10⁵~10x10⁵Pa]

-样品泵送速率：2-9mL/min

-抽吸（抽吸器）：30%-100%

-气流：200-900L/h

任选地，在加入所述糖类之后，可以通过冻干的方式来干燥制剂，而不是通过抽吸或者喷雾（喷雾干燥）的方式。

与玉米蛋白颗粒相关的槲皮素或白藜芦醇的量的确定

根据Lacopini（Lacopini等,J Food Comp Anal2008;21：589-598）所描述的方法通过高效液相色谱法（HPLC）来定量分析与纳米颗粒相关的槲皮素或白藜芦醇的量，尽管存在某些改变。该分析在耦合极管阵列紫外检测仪色谱仪型号1100系列LC（Agilent，Waldbornn，德国）中进行。

为了分析新鲜的试样（在它们干燥之前），稀释在纳米颗粒纯化步骤[通过300,000MWCO透析袋（VIVASPIN2，SartoriusStedim Biotech,Germany）过滤特定体积的配方]之后获得的上清液，直至获得具有75%（w/v）乙醇含量的水醇溶液。小球也相应地溶解在75%（w/v）的乙醇中以破坏该颗粒并使玉米蛋白以及BAC（槲皮素或白藜芦醇）和氨基酸维持在溶液中，并且由此对其进行定量分析。在两个部分（上清液和小球）中发现的BAC含量的总和总是与初始添加的总量相当。此外，还能够通过在75%（w/v）乙醇中溶解特定体积的制剂来定量分析BAC的总量。这一研究确认，在所有的情况中，所加入的BAC的量与通过所描述的色谱法定量分析获得的量之间的差值均小于10%。

此外，为了制备粉末样品（干燥的制剂），称取约15mg的纳米颗粒制剂并再次悬浮于乙醇中。在通过300,000MWCO透析袋（VIVASPIN2,Sartorius Stedim Biotech,德国）过滤特定体积的悬浮液之后所获得的上清液利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为75%（w/v）。将小球溶解在特定体积的75%（w/v）乙醇中。而且，包含在15mg的粉末中的全部BAC还通过直接将它们溶解在75%（w/v）乙醇中来定量分析。

通过使用Alltech C18Alltima^TM色谱柱(5μm，150mm x2.1mm)来分析样品，该色谱柱被加热至40℃，且具有兼容的C18AJ0-7596前置柱，流动相为水/甲醇/冰醋酸的梯度混合物（参见表1），以0.25mL/min的流速泵送。

在360nm检测槲皮素，在306nm检测白藜芦醇。样品的进样量为10μL。槲皮素的保留时间为24.2±0.2分钟，白藜芦醇的保留时间为22.8±0.5分钟。

表1

流动相的梯度条件（A：水，B：甲醇，C：冰醋酸）

时间（min）	A（%）	B（%）	C（%）
				0	80	15	5
15	70	25	5
				20	10	85	5
30	10	85	5
				35	80	15	5
40	80	15	5

在定量分析所述样品之前，制备了在水醇介质（75%乙醇）中1至100μg/mL之间不同浓度的校准曲线，其精密度和准确度均小于5%。

最后，根据初始添加的BAC的量和在上清液中定量的量之间的差值计算得出关于纳米颗粒的槲皮素或白藜芦醇的量[包封效率（E.E.）]。

包含叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法

装载有叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的通用制备方法包括在水醇介质（50%乙醇（w/v））中溶解蛋白质（玉米蛋白）和特定量的赖氨酸，随后在磁力搅拌下加入特定量的之前制备的所述维生素的水溶液的醇稀释物。在培养该混合物几分钟之后，最后的步骤包括加入特定体积的水，来形成纳米颗粒，其表现为淡黄色乳状悬浮液。

之后，如果需要的话，通过搅拌的方式均一化3分钟之后，在持续搅拌下加入特定体积的糖溶液（乳糖、海藻糖、甘露糖醇、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖等）。最后，悬浮液在如下条件下喷散在喷雾干燥器中（Büchi Mini Spray Drier B-191，Büchi Labortechnik AG，瑞士）：

-进气口温度：70℃-130℃

-出气口温度：30℃-90℃

-气压：2-10bar[2x10⁵~10x10⁵Pa]

-样品泵送速率：2-9mL/min

-抽吸（抽吸器）：30%-100%

-气流：200-900L/h

任选地，在加入所述糖类之后，可以通过冻干的方式来干燥制剂，而不是通过抽吸或者喷雾（喷雾干燥）的方式。

确定与玉米蛋白颗粒有关的叶酸的量

根据由Faye[Faye Russell,L.,Quantitative Determination ofWater-Soluble Vitamins.In Food Analysis by HPLC,Nollet,L.M.L.(Ed.),Marcel Dekker,Inc.,纽约,第二版,第10章(2000)页码：444-445]所描述的方法通过高效液相色谱法（HPLC）来定量分析与纳米颗粒相关的叶酸用量。该分析在耦合极管阵列紫外检测仪的色谱仪型号1100系列LC（Agilent,Waldbornn,Germany）中执行。数据在Hewlett-Packard计算机中通过Chem-Station G2171软件来分析。为了分离叶酸，使用具有兼容的C18AJ0-7596前置柱的加热至40℃的Alltech C18Alltima^TM色谱柱(5μm,150mmx2.1mm)。流动相为H₃PO₄(33mM,pH2.3)/乙腈的梯度混合物（表2），泵送速率为0.25mL/min。在290nm进行检测。样品进样量为10μL。叶酸的保留时间为22.6±0.5分钟。

表2

流动相的梯度条件（A：H₃PO₄33mM，B：乙腈）

时间（min）	A（%）	B（%）
			0	95.0	5.0
8	95.0	5.0
			33	82.5	17.5
45	95.0	5.0

在定量分析所述样品之前，制备了2μg/mL至400μg/mL之间的不同浓度的校准曲线，获得的结果其精确度和准确度大于95%，确认了在溶液中玉米蛋白和/或氨基酸的存在并不影响对叶酸的正确定量。

为了分析新鲜的样品（在它们干燥之前），定量分析在通过300,000MWCO透析袋（VIVASPIN2,Sartorius Stedim Biotech,Germany）过滤特定体积的制剂之后获得的上清液。小球相应地溶解在0.05M NaOH中以破坏颗粒，并使玉米蛋白以及叶酸和氨基酸维持在溶液中，并且由此对其进行定量分析。在两个部分（上清液和小球）中发现的叶酸含量的总和总是与初始添加的总量相当。此外，其还能够通过将1mL的制剂溶解在1mL的0.05M NaOH中来定量分析叶酸的总量。这一研究确认，在所有的情况中，所加入的叶酸的量与通过所描述的色谱法定量的量之间的差值均小于10%。

此外，为了定量分析粉末样品，称取15mg的纳米颗粒，再次悬浮于2mL的水中并离心，之后进行与新的样品一样的测定。

药代动力学研究

包封在玉米蛋白纳米颗粒中的叶酸的生物可利用度

根据伦理委员会机构以及欧洲实验动物法（86/609/EU）来进行药代动力学研究。对于此，平均重量为200g的20只雄性威斯塔大鼠经历正常条件的白天-黑夜（12小时-12小时），并且在研究之前的一周内，喂食缺乏叶酸的饲料（Folic Acid Deficient Diet.TD.95247.Harlan，美国）和水。在施用该制剂的12小时之前，大鼠被隔离在代谢笼中，不喂食，但是可以自由饮水。

将动物分为4个处理组（每组5只大鼠）。对于第一组仅口服施用1mL的PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）。接下来的两组使用1mg/kg(200μg/只)的单次口服剂量(Aditio,Panreac Química,Barcelona,Spain)的叶酸进行处理，其结合在玉米蛋白纳米颗粒中或者以游离形式（未包封的）溶解于水中。分散在水中的1mL的每种不同的制剂均通过胃食管插管来施用。最后，溶解在磷酸盐缓冲液（PBS）（0.5mL）中的相同剂量的游离叶酸（1mg/kg）通过尾部隐静脉静脉注射施用至第四组。在施用制剂之前，从尾部隐静脉抽取血液，检查每只大鼠中维生素的基线水平。在施用之后，在不同的时间使用血清分离管(SARSTEDT Microtube1.1mLZ-Gel)抽取约500μL体积的血液。在所有的情况中，为了防止大鼠的疼痛，均在利用吸入麻醉（异氟醚：氧气）来麻醉动物之后才抽取血样，随时检查动物的生命体征。

随后由腹膜内施用500μL已被加热至动物体温的生理盐水来替代血液的体积。在此期间，监测动物的情况（活动性、侵略性、变态反应和体温），没有观察到显著的变化。

血清样品的预处理和叶酸的定量分析

在离心含有血液的试管之后（6,000rpm，20分钟，20°C），获得血清样品，通过酶免疫测定技术定量分析叶酸。为此，使用由FDA批准用于食品中叶酸的定量分析测定的酶联免疫检测试剂盒(Diagnosticautomation，INC，Calabasas，California USA)。血清样品在没有预处理的情况下遵照制造商说明书进行定量分析。

基于该试剂盒被设计用于在食品中使用的事实，进行了一系列的前期研究，以确定其是否能够定量分析血清样品中的维生素。所述的研究包括详细比较通过试剂盒获得结果与通过在前述部分中描述的高效液相色谱法所获得的结果，前期制备步骤如下：将溶解在50mM的含有1%（w/v）的抗环血酸钠的四硼酸钠溶液中的不同量（0-300μL）的叶酸加入到50μL的血清中。所获得的溶液最终体积为350μL（1：7稀释的血清），其含有50mM的四硼酸钠溶液。每种混合物均煮沸30分钟，随后冷却至2℃，并且在2℃下保存过夜。

以20,000rpm离心所获得的样品20分钟，并通过20μm过滤器过滤，使用如上所述的方法通过高效液相色谱法来定量分析叶酸的含量。在这种情况中，由于维生素的血清浓度低，采用标准添加技术来最小化定量分析中的误差，并移除任意的基体干扰。抽取方法和HPLC定量方法根据由FDA设定的标准来验证。

在所有研究的情况中，由两种方法获得的血清叶酸浓度之间的差值小于10%。因此，选择酶免疫测定技术来定量分析所有的样品，因为其需要更少量的血清来进行分析，并且更为简单和快捷，检测限制（2ng/mL）大大低于色谱法。

实施例1

空的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征、制备方法的产率、配方中引 入的赖氨酸含量对纳米颗粒的物理化学特性的影响

将60mg的玉米蛋白（Sigma-Aldrich）和10mg的赖氨酸（Sigma-Aldrich）一起溶解在8.8mL的50%（w/v）乙醇溶液中。接下来，在磁力搅拌和恒流下，将8.8mL的水添加到该溶液中，以形成纳米颗粒。这一过程重复三次。

图1（A和B）示出了通过这一方法获得的玉米蛋白颗粒的透射电子显微镜图像。

为了获知赖氨酸和初始水醇溶液的乙醇百分比对于纳米颗粒的物理化学特性的影响，通过改变如下参数制备了三种新的配方：（i）其中之一不含有赖氨酸，（ii）另一种含有赖氨酸，并且初始水醇溶液在75%（w/v）乙醇而不是50%（w/v）乙醇中制备，和（iii）第三种也在75%（w/v）乙醇中制备，并且不含有赖氨酸。

表3总结了所获得的纳米颗粒的主要物理化学参数。

表3

在存在不同量的赖氨酸和乙醇百分比的情况下的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性，其中，在纳米颗粒形成之前玉米蛋白溶解在乙醇中

（*）部分溶解

^aPDI：多分散性

^b产率：转换为纳米颗粒的玉米蛋白的百分比[方程式1]

所进行的统计学研究（独立样本的非参数检验：Kruskal-Wallis）揭示了具有统计学上的显著差异，确认赖氨酸的存在会导致表面电荷的增加。利用大的初始量的乙醇（75%（w/v））所制备的配方相对于由初始50%（w/v）乙醇溶液获得的纳米颗粒具有更大的粒径和更高产率，其表面电荷没有显著的差别。

在不包含赖氨酸的试样中的表面电荷非常接近于零，其意味着所述的颗粒极其易于聚集。然而，在存在赖氨酸的情况下，表面电荷足够高来防止所述聚集的发生。

由此，对于BAC的包封，选择由包含50%（w/v）乙醇的水醇溶液和在赖氨酸的存在下获得的制剂，因为上述条件阻止了纳米颗粒的聚集，使得其通用于脂溶性和水溶性BAC的包封，此外，还显著地节省了所使用的试剂。

实施例2

包含白藜芦醇的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征、赖氨酸和白藜芦 醇的含量对于包封效率的影响

在8.8mL的50%乙醇的最终体积中，制备了不同的水醇溶液，每一种均包含60mg的玉米蛋白和不同量的赖氨酸（0、5、10或20mg）。

此外，将47mg的白藜芦醇溶解在15mL的乙醇中，然后用水将其稀释至24mL。

随后将不同体积的白藜芦醇溶液（1、2或3mL）添加到所制备的不同的玉米蛋白溶液中。在孵育5分钟之后，在磁力搅拌和恒流下，将8.8mL的水加入到该混合物中。对于每种类型的制剂，这种方法均重复三次。

表4示出了在每种情况中获得的纳米颗粒的物理化学特性。

表4

包封白藜芦醇的具有不同量赖氨酸（平均值±SD，n=3）的玉米蛋白纳米颗粒（初始溶解在50%乙醇（w/v）中）的物理化学特性。白藜芦醇和玉米蛋白的重量比为1：16

R：白藜芦醇；NP：纳米颗粒

所获得的结果表明赖氨酸的存在不会显著地影响包封效率。因此，考虑到所述氨基酸改变了颗粒的表面电荷并降低了颗粒聚集的可能性，而且还增加了颗粒的产率，选择包含氨基酸的配方继续研究。

表5示出了当赖氨酸的量恒定的时候，通过改变白藜芦醇含量而获得的纳米颗粒的物理化学特性。

表5

具有可变量的白藜芦醇（平均值±SD，n=3）的玉米蛋白纳米颗粒（初始溶解在50%乙醇w/v中）的物理化学特性。赖氨酸和玉米蛋白的重量比为1：6

R：白藜芦醇；NP：纳米颗粒

所获得的结果表明，随着添加到制剂中的白藜芦醇的量的增加，包封效率会降低，但是包封在颗粒内的生物活性物质的量会增加。

实施例3

包含白藜芦醇的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征，其通过抽吸干燥 （喷雾干燥）

将126mg的玉米蛋白与21mg的赖氨酸一起溶解在14mL的50%（w/v）乙醇中。

此外，将60mg的白藜芦醇溶解在10mL的乙醇中，随后收集1.4mL的该溶液，并用水补充至2.8mL的最终体积。

之后将1.1mL稀释的白藜芦醇溶液加入至玉米蛋白溶液，孵育该混合物5分钟。之后，在磁力搅拌和恒流下，将15mL的水加入到混合物中。

最后，在通过使用喷雾干燥器的方式将其干燥之前，将260mg的麦芽糖糊精加入至混合物中。该方法的条件为：

-进气口温度：110℃

-出气口温度：70℃

-气压：6bar[6x10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-抽吸：94%

-气流：700L/h

表6概括了所获得的制剂的物理化学特性。

表6

含有赖氨酸和白藜芦醇（R）的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=3），其通过喷雾干燥技术进行干燥，并使用麦芽糖糊精作为该方法的添加剂。赖氨酸和玉米蛋白的重量比为1：6。糖类（麦芽糖糊精）和玉米蛋白的重量比为2：1

喷雾干燥不改变每mg纳米颗粒包封的量和包封效率。

图2示出了由包含白藜芦醇的玉米蛋白颗粒的扫描电子显微镜图像。

此外，在纳米颗粒形成之后，在通过喷雾干燥器之前，通过施加高压技术（在5分钟的周期内为150MPa和在5分钟的周期内400MPa）来实施相同的试验。所获得的包封结果与不进行所述处理获得的结果相似。

实施例4

包含槲皮素的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征、赖氨酸和槲皮素含 量对包封效率的影响

在8.8mL的50%乙醇的最终体积中，制备不同的溶液备，每一种均包含60mg的玉米蛋白和10mg的赖氨酸。

此外，将150mg的槲皮素溶解在50mL的乙醇中，之后取出31mL的前述溶液将其稀释，并用水补充至50mL的最终体积。

随后将不同体积的槲皮素溶液（0.5-3mL）添加到所制备的不同的玉米蛋白溶液中。孵育5分钟之后，在磁力搅拌和恒流下，将8.8mL的水加入到该混合物中。对于每种类型的制剂，这种方法均重复三次。

图3示出了通过这种方法获得的包封有槲皮素的玉米蛋白颗粒的透射电子显微镜图像。表7示出了每种情况中所获得的物理化学特性。

表7

含有赖氨酸和可变量槲皮素（Q）的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=6）。赖氨酸和玉米蛋白的重量比为1：5.5

NP：纳米颗粒

所进行的统计学研究（独立样本的非参数检验：Kruskal-Wallis）表明，存在统计学上的显著证据，可确认不同制剂的物理化学特性存在着差异。根据所获得的结果，可以认为随着加入至制剂中的槲皮素的量增加，包封效率会降低，并且包封的BAC（槲皮素）的量会潜在地增加（图4），考虑用如下的数学式：

y=369.92·x^-0.7526；R²=0.9955 [方程式3]

其中

y相应于包封的槲皮素的量(μg Q/mg NP)，并且

x相应于槲皮素和玉米蛋白之间的初始比例（mg玉米蛋白/mg槲皮素）。

对于粒径和电位，在所分析的不同样品之间不存在统计学上显著的差异。

此外，为了获知在制剂中更大量或者更小量的赖氨酸对于纳米颗粒的物理化学特性的影响，因此进行了相同的研究，保持槲皮素的初始量恒定不变，而改变在这种情况中所添加的氨基酸的量。

由此，制备了包含不同量的赖氨酸（0~20mg）的不同的玉米蛋白溶液。添加到制剂中的如上所述的槲皮素溶液的量在所有情况中均为3mL，所以槲皮素：玉米蛋白的重量比为1：11。

表8示出了在每种情况中所获得的物理化学特性的结果。

表8

含有槲皮素和不同量的赖氨酸的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=6）。槲皮素和玉米蛋白的重量比为1：11

所获得的结果表明，当添加到初始玉米蛋白溶液中的槲皮素的量大于10mg的时候，相对于包含更小量赖氨酸的配方来说，其包封效率会降低大约20%，其可能是由于事实上所述量的氨基酸会诱导活性组分的部分氧化。然而，不含有赖氨酸的样品的包封效率和在制剂中包含约5mg的赖氨酸的样品的包封效率之间并不存在统计学上显著的差异。因此，选择该制剂继续干燥研究。

实施例5

包含槲皮素的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征，其通过喷雾干燥来 干燥

将602mg的玉米蛋白和51mg的赖氨酸一起溶解于80mL的50%（w/v）乙醇中。

此外，将250mg的槲皮素溶解在50mL的乙醇中，并且随后取出20mL的该溶液，并用水补充至32mL的最终体积。

之后将20mL稀释的槲皮素溶液加入到玉米蛋白溶液，并且孵育该混合物5分钟。之后，在磁力搅拌和恒流下，将80mL的水加入至该混合物中。

最后，在通过使用喷雾干燥器的方式将其干燥之前，将1,209mg的甘露糖醇加入到该混合物中。该方法的条件为：

-进气口温度：90℃

-出气口温度：45℃

-气压：6bar[6x10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-抽吸：100%

-气流：600L/h

表9概括了所获得配方的物理化学特性。

表9

含有赖氨酸和槲皮素（Q）的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=3），通过喷雾干燥技术的方式进行干燥，使用甘露糖醇作为该方法的添加剂。赖氨酸和玉米蛋白的重量比为1：11。糖类（甘露糖醇）和蛋白质的重量比为2：1

喷雾干燥不改变每mg纳米颗粒包封的量和包封效率。

图5示出了包含槲皮素的玉米蛋白颗粒的扫描电子显微镜图像。

使用麦芽糖糊精来代替甘露糖醇作为添加剂，进行相同的研究，获得了更高的包封效率，因为麦芽糖糊精还通过涂覆该纳米颗粒并包封纳米颗粒外侧的部分槲皮素部分而起作用。

此外，在纳米颗粒形成之后，在通过喷雾干燥器之前，通过施加高压技术（在5分钟的周期内150MPa，在5分钟的周期内400MPa和在5分钟的周期内800MPa）来实施相同的试验。所获得的包封结果与不进行所述处理获得的包封结果相似。

实施例6

包含叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的制备和表征

将121mg的玉米蛋白和18mg的赖氨酸一起溶解于14mL的50%（w/v）乙醇中。

此外，将303mg的叶酸与402mg的赖氨酸一起溶解于50mL的水中，并且接下来利用乙醇将其稀释一倍。

之后将5mL稀释的叶酸溶液加入至玉米蛋白溶液，并且孵育该混合物5分钟。之后，将0.6mL的吐温80（聚山梨醇酯）加入到该混合物，并且将该混合物再孵育5分钟。之后在磁力搅拌和恒流下，将15mL的水加入混合物中，形成纳米颗粒。

最后，在通过使用喷雾干燥器的方式将其干燥之前，将253mg的乳糖加入到该混合物中。该方法的条件为：

-进气口温度：125℃

-出气口温度：90℃

-气压：6bar[6x10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-抽吸：90%

-气流：750L/h

表10概括了所获得制剂的物理化学特性。

表10

含有赖氨酸和叶酸（FA）的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=3），其通过喷雾干燥技术的方式进行干燥，使用乳糖作为该方法的添加剂。赖氨酸和玉米蛋白的最终重量比为1：3。糖类（乳糖）和玉米蛋白的重量比为2：1

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

此外，制备了包含叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的新制剂，在这种情况中省略了添加表面活性剂的步骤。为此，将1,270mg的玉米蛋白和200mg的赖氨酸一起溶解于140mL的50%（w/v）乙醇中。还制备了另一种溶液，其在25mL的水中包含121mg的叶酸和200mg的赖氨酸，并且接下来利用乙醇将其稀释一倍。

之后将43mL稀释的叶酸溶液加入到玉米蛋白溶液中，孵育该混合物5分钟。之后，之后在磁力搅拌和恒流下，将150mL的水加入到混合物中，获得纳米颗粒。

最后，在通过使用喷雾干燥技术的方式将其干燥之前，将2,415mg的甘露糖醇加入至该混合物中。该方法的条件为：

-进气口温度：120℃

-出气口温度：80℃

-气压：6bar[6x10⁵Pa]

-样品泵送速率：4.5mL/min

-抽吸：90%

-气流：750L/h

表11概括了所获得制剂的物理化学特性。

表11

含有赖氨酸和叶酸（FA）的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=3），其通过喷雾干燥技术的方式进行干燥，使用甘露糖醇作为该方法的添加剂。赖氨酸和玉米蛋白的最终重量比为1：3.5。糖类（甘露糖醇）和玉米蛋白的重量比为2：1

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

获得的纳米颗粒可以容易地再次悬浮，并且比当使用表面活性剂的时候所获得的纳米颗粒具有更小的粒径。

实施例7

包封在玉米蛋白纳米颗粒中的叶酸的药代动力学研究

表12概括了在药代动力学研究中测试的纳米颗粒的主要物理化学特性。所述的纳米颗粒使用在实施例6的第二部分中（不具有表面活性剂）所描述的方法来获得。

表12

在药代动力学研究中所使用的含有叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的物理化学特性（平均值±SD，n=6）

FA：叶酸；NP：纳米颗粒

药代动力学研究分为三个方面。第一方面包括静脉注射施用1mg/kg的溶解于磷酸盐缓冲液中的叶酸；第二方面包括对5只雄性威斯塔大鼠的组中的大鼠口服施用1mL的磷酸盐缓冲液（PBS）（已研究了随着时间的流逝，这组大鼠维生素的基线水平）。最后，第三方面包括对由5只动物形成的大鼠组口服施用1mg/kg的（i）溶解在水中的叶酸，（ii）包封在玉米蛋白纳米颗粒中的叶酸。

在施用之后，在不同的时间（0、1、2、3、8和24小时）抽取约为500μL的血液，并收集在血清分离试管中，接下来利用等体积的盐水通过腹膜内途径恢复动物的血液体积。通过使用药代动力学拟合程序WiNNonlin1.5的无隔拟合方法来获得（Pharsight Corporation,MountainView,United States）在施用叶酸之后的药代动力学数据。

在图6中示出了（在减去基线值之后）获得的结果。可以观察到，静脉注射施用的叶酸（图6A）在第一取样时间示出了药物血清浓度的峰值，随后血清水平急剧下降。当维生素为口服施用的时候所获得的曲线（图6B）则不同，因为显著地更低的浓度出现次数更多，浓度下降更缓慢。然而，比较口服施用游离形式的叶酸（未包封）或包封在玉米蛋白纳米颗粒中的叶酸之后的维生素水平时，发现随着时间流逝，浓度曲线类似，但是当维生素以包封形式施用的时候，最大值和曲线下的面积均更大。

表13示出了在进行当前研究的实验数据的无隔分析之后获得的药代动力学参数的数值。

表13

所测试的不同制剂的药代动力学参数（平均值±SD，n=5）

^*p<0.05vs.未包封的叶酸。曼惠特尼U检验。

^**p<0.01vs.未包封的叶酸。曼惠特尼U检验。

AUC：血清浓度曲线下方的面积

C_max：最大浓度

T_max：达到C_max的时间

MRT：平均停留时间

FR：以百分比表示的相对生物可利用度

FA：叶酸

NP：纳米颗粒

IV：静脉内途径

可观察到，根据所施用样品的类型，AUC值表现出了显著的不同。当维生素被包封在玉米蛋白纳米颗粒中的时候，其AUC值显著地大于在施用游离叶酸之后的AUC值，并且该趋势一直保持到施用之后24小时。此外，观察到血浆中叶酸的平均停留时间（MRT）也显著地大于当施用游离维生素时。

根据这些结果，计算出了包封有叶酸的玉米蛋白纳米颗粒的口服生物可利用度，其比口服施用游离叶酸之后获得的数值大70%至95%。

Claims (40)

1.一种制备包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸的纳米颗粒的方法，包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液；和

b）将水添加到步骤a）的溶液。

2.根据权利要求1的方法，其中所述水醇溶液为乙醇的水溶液。

3.根据权利要求1的方法，进一步包括：

在100至800MPa的压力下，处理所形成的包含玉米蛋白纳米颗粒的悬浮液。

4.根据权利要求1的方法，进一步包括：

干燥包含所形成的纳米颗粒的悬浮液，其中所述干燥任选地在存在保护剂和/或抗氧化剂的情况下实施。

5.一种通过根据权利要求1至4任一项的方法获得的纳米颗粒。

6.根据权利要求5的纳米颗粒，其中，碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1:50。

7.根据权利要求6的纳米颗粒，其中，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物形成的组。

8.根据权利要求5或6的纳米颗粒，进一步包括生物活性化合物。

9.根据权利要求8的纳米颗粒，其中，所述生物活性化合物选自脂溶性生物活性化合物和水溶性生物活性化合物。

10.一种制备包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸以及脂溶性生物活性化合物的纳米颗粒的方法，包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）；

b）制备包括脂溶性生物活性化合物的醇溶液，并且使用水将其稀释以获得包括脂溶性生物活性化合物的水醇溶液（ii）；

c）混合包含玉米蛋白和碱性氨基酸的所述水醇溶液（i）和包括脂溶性生物活性化合物的所述水醇溶液（ii）；和

d）将水添加到步骤c）获得的混合物。

11.根据权利要求10的方法，其中所述水醇溶液为乙醇的水溶液。

12.根据权利要求10的方法，进一步包括：

在100至800MPa的压力下，处理所形成的包含玉米蛋白纳米颗粒的悬浮液。

13.根据权利要求12的方法，进一步包括：

干燥包含所形成的纳米颗粒的悬浮液，其中所述干燥任选地在存在保护剂和/或抗氧化剂的情况下实施。

14.一种通过根据权利要求10至13任一项的方法获得的纳米颗粒。

15.根据权利要求14的纳米颗粒，其中碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1:50。

16.根据权利要求15的纳米颗粒，其中所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物组成的组。

17.根据权利要求14至16任一项的纳米颗粒，其中，所述脂溶性生物活性化合物选自由如下形成的组：

a）多元酚；

b）A、D、E或K族维生素；

c）根据b）的维生素的前体或者衍生物；

d）磷脂；

e）类胡罗卜素；

f）脂肪酸；

g）植物甾烷醇和植物甾醇；

h）任意前述化合物a）-g）的盐或酯；和

i）其组合。

18.根据权利要求17的纳米颗粒，其中所述脂溶性生物活性化合物选自由黄酮醇、花色素苷、植物抗毒素、羟基酪醇、视黄酸、视黄醛、视黄醇、麦角钙化固醇、α-生育酚、三烯生育酚、植物甲萘醌、α-胡萝卜素、β-胡罗卜素、番茄红素、辣椒黄素、叶黄素、玉米黄素、胡萝卜醇、EPA、DHA、亚油酸、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇，它们的食品级或者制药或化妆品上可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物组成的组。

19.根据权利要求17的纳米颗粒，其中所述脂溶性生物活性化合物选自由槲皮素、白藜芦醇、它们的食品级或者制药或化妆品中可接受的衍生物、酯或盐，及其混合物组成的组。

20.一种制备包括玉米蛋白基体和碱性氨基酸以及水溶性生物活性化合物的纳米颗粒的方法，包括：

a）制备包含玉米蛋白和碱性氨基酸的水醇溶液（i）；

b）制备包括水溶性生物活性化合物以及任选的第二碱性氨基酸的水溶液，并且利用醇将其稀释以获得包括水溶性生物活性化合物和任选的第二碱性氨基酸的水醇溶液（ii）；

c）混合包含玉米蛋白和碱性氨基酸的所述水醇溶液（i）与包括水溶性生物活性化合物和任选的第二碱性氨基酸的所述水醇溶液（ii）；

d）任选地添加表面活性剂到步骤c）获得的混合物中；并且

e）将水添加到步骤c）或步骤d）获得的混合物。

21.根据权利要求20的方法，其中所述水醇溶液为乙醇的水溶液。

22.根据权利要求20的方法，进一步包括：

在100至800MPa的压力下，处理所形成的包含玉米蛋白纳米颗粒的悬浮液。

23.根据权利要求22的方法，进一步包括：干燥包含所形成的纳米颗粒的悬浮液，其中所述干燥任选地在存在保护剂和/或抗氧化剂的情况下实施。

24.一种通过根据权利要求20至23任一项的方法获得的纳米颗粒。

25.根据权利要求24的纳米颗粒，其中，碱性氨基酸：玉米蛋白的重量比为1：0.01至1:50。

26.根据权利要求25的纳米颗粒，其中，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其混合物形成的组。

27.根据权利要求24至26任一项的纳米颗粒，其中所述水溶性生物活性化合物选自由如下组成的组：

a）B或C族维生素；

b）根据a）的维生素的衍生物；

c）选自透明质酸、硫酸软骨素和硫辛酸的化合物；

d）任意前述化合物a）-c）的盐或酯；和

e）其组合。

28.根据权利要求27的纳米颗粒，其中所述水溶性生物活性化合物选自叶酸、其食品级或者制药或化妆品中可接受的酯或盐，及其混合物。

29.一种组合物，其包括至少一种纳米颗粒，以及食品、药品或化妆品中可接受的载体，该纳米颗粒根据权利要求5至9任一项制造。

30.根据权利要求29的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为100至450nm之间。

31.根据权利要求30的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为200nm。

32.一种组合物，其包括至少一种纳米颗粒，以及食品、药品或化妆品中可接受的载体，该纳米颗粒根据权利要求14至19任一项制造。

33.根据权利要求32的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为100至450nm之间。

34.根据权利要求33的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为200nm。

35.一种组合物，其包括至少一种纳米颗粒，以及食品、药品或化妆品中可接受的载体，该纳米颗粒根据权利要求24至28任一项制造。

36.根据权利要求35的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为100至450nm之间。

37.根据权利要求36的组合物，其中纳米颗粒的平均粒径为200nm。

38.根据权利要求29至34任一项的组合物，包括：

-玉米蛋白，15wt%至45wt%；

-碱性氨基酸，1wt%至4wt%；

-槲皮素或者白藜芦醇，0.5wt%至5wt%；和

-糖类，45wt%至80wt%，

其中，所有的重量百分比均基于所述组合物的总重量计。

39.根据权利要求29至31、35至37任一项的组合物，包括：

-玉米蛋白，15wt%至45wt%；

-碱性氨基酸，4wt%至10wt%；

-任选的聚山梨醇酯，0.05wt%至0.5wt%；

-叶酸，0.5wt%至5wt%；

-糖类，45wt%至80wt%；并且

其中，所有的重量百分比均基于所述组合物的总重量计。

40.一种食物制品，包括根据权利要求29至39任一项的组合物。