JP2013532630A - 化合物をカプセル化するためのナノ粒子、その製造方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、化合物をカプセル化するためのナノ粒子、その製造方法およびその使用に関する。ナノ粒子は、ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸とを含んでなる。このナノ粒子は、水溶性または脂溶性の生物学的に活性な化合物をカプセル化することができる。このナノ粒子は、食品、医薬品および化粧品の分野、並びにナノテクノロジーの分野に適用可能である。

Description

本発明は、食品、医薬品および化粧品の分野、並びにナノテクノロジーの分野に含まれ、コーティング剤としてゼインを用いる、生物学的に活性な化合物のカプセル化に関する。本発明は、具体的には、生物学的に活性な化合物をカプセル化するのに有用な、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含んでなるナノ粒子、並びにその製造方法およびその用途に関する。

産業、とりわけ食品産業、化粧品産業および医薬品産業にあっては、消費者の新たな要求を満たすため、技術を発展させる必要がある。これらの産業に対しナノテクノロジーは興味深い解決手段を提供することができる。

具体的には、ナノテクノロジーは、食品産業、化粧品産業および医薬品産業を根本的に変える大きな可能性を秘めており、それは、この技術が、生物学的に活性な化合物［ＢＡＣ］、例えば精油、酸化防止剤、ミネラル、プレバイオティクス、香味料、ビタミンなどを、様々な利点のため、例えば生産物の有用な寿命を高めること、使用するＢＡＣの量を減らすこと、ＢＡＣの放出を制御すること、ＢＡＣのバイオアベイラビリティを高めること、望ましくない味をマスキングすることを目的として、カプセル化できるからである。

酸化防止剤（消費者の健康にとって利点を生み出すことができる物質）は、ＢＡＣ群を形成し、その使用には、益々より大きな関心が集まっている。前記抗酸化化合物（例えば、ケルセチンまたはレスベラトロル）を特定の系（例えば、微粒子またはナノ粒子）内にカプセル化することは、抗酸化化合物を保護し、貯蔵中安定な状態に保っておくために、非常に興味深い選択肢である。

今日まで、カプセル化された抗酸化化合物の用途は、一般的に、化粧品分野および医薬品分野に限定されている。実例としては、ケルセチンを、（ｉ）乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）および酢酸エチルによって形成されたナノカプセルでカプセル化すること（Ｇｈｏｓｈら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９；８４：７５−８０）、（ｉｉ）Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）［ポリ（メタ）アクリレート］およびポリビニルアルコールによって作成されたナノ粒子でカプセル化すること（Ｗｕら、Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｐｈａｒｍ ２００８；３４６：１６０−１６８）、および（ｉｉｉ）ホスファチジルコリンおよびトリステアリンを用いて作成された脂質微粒子でカプセル化すること（ＳｃｃａｌｉａおよびＭｅｚｚｅｎａ、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ２００９；４９：９０−９４）が記載されている。同様に、レスベラトロルを、（ｉ）ポリカプロラクトンナノ粒子でカプセル化すること（Ｌｕら、Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｐｈａｒｍ ２００９；３７５：８９−９６）、（ｉｉ）ペクチン微粒子でカプセル化すること（ＤａｓおよびＮｇ、Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｐｈａｒｍ ２０１０；３８５：２０−２８）、（ｉｉｉ）リポソームでカプセル化すること（Ｃａｄｄｅｏら、Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｐｈａｒｍ ２００８；３６３：１８３−１９１）、（ｉｖ）キトサンミクロスフェアでカプセル化すること（Ｐｅｎｇら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２０１０；１２１（１）：２３−２８）および（ｖ）ポリスチレンミクロスフェアでカプセル化すること（Ｎａｍら、Ｐｏｌｙｍｅｒ ２００５；４６：８９５６−８９６３）が記載されている。

しかし、抗酸化化合物をカプセル化するために使用される材料は、毒性の問題があるか、あるいは食品での使用が承認されていないため、食品分野におけるカプセル化された抗酸化化合物の使用は、きわめて制限されている。同様に、種々の理由の中でもとりわけ、半減期が短い、易罹病性が高い、経口バイオアベイラビリティが低いという理由で、機能性食品の設計における抗酸化化合物の使用もきわめて制限されている。抗酸化化合物（例えば、ケルセチンまたはレスベラトロル）を、食品中で保護し、貯蔵期間中ずっと安定に保つためにカプセル化し、さらに、有機体中でのバイオアベイラビリティを高める放出制御を可能にすることが非常に望ましいであろう。

知られているように、ＢＡＣをカプセル化するのに適した担体を設計するに際し、マトリックスを形成するコーティング剤として使用する材料を正しく選択することはきわめて重要であり、そのために、いろいろな因子の中でもとりわけ、その投薬形態、毒性、製剤を組み込むべき製品を考慮しなければならない。

食品ナノテクノロジー分野では、毒性の問題が生じ得るため、合成ポリマーの使用は推奨されない。天然ポリマーならばこれらの欠点はないが、天然ポリマーを使用するには、粒子を製造するのにより複雑な方法を開発する必要があり、さらに、ほとんどの場合、得られる粒径（通常、１００μｍより大きい）を制御することが困難であり、そのため、このような微粒子は消費者に感覚的に気づかれてしまい、対象食品の官能特性を変えてしまうことがある。

動物由来のタンパク質（例えば、カゼイン、アルブミンなど）および植物由来のタンパク質（例えば、プロラミンなど）の双方がＢＡＣコーティング剤として使用されていること（ＥＳ ２２６９７１５号、ＵＳ ２００４／８６５９５号、ＵＳ ５６７９３７７号）が記載されている。

ゼインは、トウモロコシの種子に存在する主要な貯蔵タンパク質である。ゼインは、プロリンおよびグルタミンというアミノ酸を大量に含む傾向があり、水に非常に溶けにくいという特徴をもつため、プロラミン類に属する球状タンパク質である。近年、このタンパク質は、その特定の物理化学的特性および分子構造のため、両親媒性の特性を有し、媒体中に存在する親水性−脂溶性化合物によって異なる自己組織化された構造を形成することができるので、科学分野および産業分野で非常に重要となってきている（Ｗａｎｇら、Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２００８；３：１７４−１８１）。したがって、ゼインは、優れた柔軟性および圧縮性をもつ硬質の疎水性コーティングを形成することができ、さらに、微生物の攻撃に対する耐性があるため、膜の原材料として多くの潜在的な利点を提供する。

これらの特性の結果として、接着剤、生分解性プラスチック、チューイングガム、食料品用コーティング、繊維、化粧品粉末、殺虫剤のマイクロカプセル化剤、およびインクなどとしてのゼインの新しい用途が見出されてきている（Ｍｕｔｈｕｓｅｌｖｉ ａｎｄ Ｄｈａｔｈａｔｈｒｅｙａｎ、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ： Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２００６；５１：３９−４３）。このタンパク質は、保護する、制御された手法で放出する、および望ましくない味および香りをマスキングする目的で、カプセルをコーティングするために医薬産業でも使用されている（ＳｈｕｋｌａおよびＣｈｅｒｙａｎ、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｒｏｐｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ２００１；１３：１７１−１９２）。さらに、ゼインは、インスリン、ヘパリン、イベルメクチンおよびギトキシンのマイクロカプセル化にも提案されている。高湿高温条件であっても、安定で、さらに細菌の攻撃に対する耐性がある微粒子／ミクロスフェアが、一般的に実現されている（ＵＳ５６７９３７７号）。

しかし、カプセル化された成分を含む機能性食品を設計する食品分野で、カプセル化剤としてゼインを使用することは、まだ初期段階である。相分離技術を用いて、精油をカプセル化するゼインナノ粒子を得ること（Ｐａｒｒｉｓら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２００５；５３：４７８８−４７９２）、および、目的の食品にω−３脂肪酸を導入するときに、流動床技術を適用して、ゼインタンパク質内にω−３脂肪酸をカプセル化し、この脂肪酸を酸化から保護し、その良くない官能特性をマスキングすること（ＭＸ２００８００３２１３号）が記載されている。さらに、エレクトロスピニング技術によって、リコピンおよびポリフェノールエピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ）をゼイン繊維内にカプセル化すること（それぞれ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ ２００９；２３：１４２７−１４３２およびＬｉら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ ２００９；７４（３）：Ｃ２３３−Ｃ２４０）、ＳＡＳ（超臨界貧溶媒化）法によって、リゾチームをカプセル化すること（Ｚｈｏｎｇら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９；１１５（２）：６９７−７００）、および液−液分散法によって、魚油をカプセル化すること（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｐｒｅｓ ２００９；３３（２）：２５５−２７０）が最近実現されている。これらの研究は、産業に応用するために調整することが比較的複雑かつ困難である製造技術、または脂溶性化合物のカプセル化だけに限定され、親水性化合物のカプセル化には適していない製造技術を記載していた。

したがって、上述の欠点の全てまたは一部を克服し、水溶性化合物および脂溶性化合物の双方、特に、抗酸化化合物のように、他の手段では投与に困難を伴う化合物を保持するのに適した、生物学的に活性な化合物をカプセル化するための用途の広い系を開発することが必要である。さらに、この系を単純な方法で得ることができ、貯蔵中および投与後に適切な安定性を有し、異なる技術分野（例えば、食品分野、医薬品分野および化粧品分野）での応用を容易にすることも非常に望ましいであろう。

今般、驚くべきことに、水溶性および脂溶性の生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）の双方を、ゼインマトリックスおよび塩基性アミノ酸でコーティングすることにより、食品、化粧品および医薬品への応用のためにＢＡＣをカプセル化し、安定化する新しい系を形成するナノ粒子を提供することを見出した。

本発明者らによって行われた種々の試験は、塩基性アミノ酸をゼインと一緒に加えることにより、比較的少ない割合でアルコールを含む含水アルコール溶液を用いてゼインを溶解することができ、同様に、脂溶性および水溶性のＢＡＣ双方をカプセル化することができるという事実に起因して、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子を製造する方法を容易にすることを示している。さらに、毒性の問題を生じかねない塩基性添加剤または溶媒の使用が抑えられるため、ナノ粒子の栄養特性が向上する。同様に、塩基性アミノ酸は、ナノ粒子の表面電荷を高め、凝集するのを防ぐため、ナノ粒子に安定性を付与する。

したがって、一つの態様では、本発明は、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子に関する。このナノ粒子を使用し、水溶性または脂溶性のＢＡＣをカプセル化することができる。特に好ましい実施形態では、ＢＡＣは、抗酸化化合物である。さらに、このナノ粒子は、技術的助剤として使用することができる［カプセル化された助剤は、この助剤がその中では可溶性とならないマトリックス内に組み込まれ、その媒体中で均一な分散物になりやすくなる。実例としては、本発明によれば、このナノ粒子にカプセル化された脂溶性のＢＡＣは、ＢＡＣが遊離形態のとき（カプセル化されていないとき）には複雑になると思われる方法で、水性マトリックス内に分散することができる］。

このナノ粒子は安定であり、製品（例えば、食品、医薬品または化粧品）の加工中およびその貯蔵中の双方に、ＢＡＣが外部因子（例えば、光、ｐＨ変化、酸化など）によって分解しないように保護することができる。さらに、このナノ粒子を経口投与するとき（例えば、食品）、ナノ粒子は、ＢＡＣを胃の酸性状態から保護し、所望の場所（例えば、腸内）にＢＡＣを放出する。

別の態様では、本発明は、空の（すなわち、ＢＡＣを含まない）ナノ粒子を製造する方法に関する。

別の態様では、本発明は、ＢＡＣ（例えば、脂溶性のＢＡＣまたは水溶性のＢＡＣ）を保持するナノ粒子を製造する方法に関する。

この方法は、簡便であり、工業的規模で応用が可能であり、そして有利なことに、食品添加剤として承認されていない合成ポリマーまたは試薬の使用を含まず、界面活性剤または乳化剤の含有を最小限に抑えることができ、さらに、ナノメートル尺度のナノ粒子の粒径を制御した状態で得ることができる。

特定の実施形態では、この方法はさらに、ＢＡＣを長期間安定に保つことができる、粉末形態で製剤を得るために、ナノ粒子を含む懸濁物を乾燥させる工程を含み、粉末形態の製剤は固体食品に使用するのに特に適している。ナノ粒子を乾燥させることは、ナノ粒子の保護剤の存在下で行うのが有利である。このようにして得られたＢＡＣを含有するナノ粒子は、水性媒体に容易に再懸濁させることができ、ＢＡＣが溶液中で分解しないように保護する。得られた最終産物は安定であり、長期にわたる保存の間ずっとＢＡＣを保護し、さらに液体食品（例えば、飲料）および固体食品双方、様々な種類の食品に適用可能である。

別の態様では、本発明は、食品、医薬品または化粧品の分野で使用するためのナノ粒子を含む組成物に関する。実際、ナノ粒子は、これらの分野での使用に適した安定な化粧品または医薬製剤を得るため、クリーム、ゲルおよびヒドロゲル中に組み込むことができる。ナノ粒子は、同様に、局所投与に適した賦形剤とともに配合することができる。

別の態様では、本発明は、本発明によって提供されるゼインナノ粒子に基づく前記組成物を含む食料品に関する。特定の実施形態では、この食料品は、液体、半固体または固体の形態である。

図１は、空のゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。（Ａ）８，０００倍（画像の左下周縁に置かれている黒色の棒は、２００ｎｍの基準に相当する）。（Ｂ）１５，７５０倍（画像の左下周縁に置かれている黒色の棒は、１００ｎｍの基準に相当する）。 図２は、レスベラトロルを含有するゼインマトリックスおよびリジンを含むナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の顕微鏡写真を示す。画像は、保護剤の糖を洗浄して除去した後の粉末製剤に相当する。 図３は、ケルセチンを含有するゼインマトリックスおよびリジンを含むナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。（Ａ）２５，０００倍（画像の左下周縁に置かれている黒色の棒は、１５０ｎｍの基準に相当する）。（Ｂ）１０，０００倍（画像の左下周縁に置かれている黒色の棒は、１５０ｎｍの基準に相当する）。 図４は、ゼインマトリックスおよびリジンを含むナノ粒子（ＮＰ）内にカプセル化されたケルセチンの量を、製剤中に最初に組み込まれたケルセチンの量の関数として示す。 図５は、ケルセチンを含有するゼインマトリックスおよびリジンを含むナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）電子顕微鏡写真を示す。画像は、保護剤の糖を洗浄して除去した後の粉末製剤に相当する。 図６は、実験動物に様々なビタミン製剤を投与した後の血清葉酸濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間の関数として示す。結果は、平均±標準偏差（ｎ＝５）を示す。（Ａ）静脈内経路（ｉ．ｖ．）、１ｍｇ／ｋｇの投薬量。（Ｂ）経口経路、１ｍｇ／ｋｇの投薬量：水に溶解したカプセル化されていない葉酸（黒塗りの四角）；水に分散したゼインナノ粒子内のカプセル化された葉酸（黒塗りの丸）。

本発明は、ゼインマトリックスおよび塩基性アミノ酸を含むナノ粒子、並びに外部因子（例えば、光、ｐＨ、酸化など）によって分解しないように保護するために、生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）をカプセル化する方法を提供する。このナノ粒子は、バイオアベイラビリティを高めるために、ＢＡＣを放出制御するように設計することができ、バイオアベイラビリティは、カプセル化されたＢＡＣを腸内で一貫して放出することによって（食品マトリックス中でのおよび／または貯蔵によって、および、胃の酸性状態に対して与えられる保護によって、分解は元々最小限に抑えられている）、および、制御された手法でのまたは長期間にわたって継続するＢＡＣの放出効果によって、という２つの経路によって高めることができる。

定義
本発明を理解しやすくするための、本明細書で使用されるいくつかの用語および表現の意味は以下のとおりである。

本明細書において、「塩基性アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ_２）およびカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）および正電荷を含む有機分子を指し、塩基性アミノ酸は、好ましくは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのような塩基性α−アミノ酸である。

本明細書において、「おおよそ」は、所定の値に近い値の範囲を指す（例えば、所定の値の±１０％）。例えば、「おおよそ２０」は、２０の±１０％、すなわち、１８〜２２を含む。さらに、用語「おおよそ」が明記されているか否かに関わらず、当業者は、本明細書で示す任意の数値が、その値に近い範囲を包含することを理解する。このような所定の値の変動量は、対応する測定中の実験誤差から生じ得る。

本明細書において、「生物学的に活性な化合物」または「ＢＡＣ」は、栄養、治療および／または美容作用を有する化合物を指し、この化合物は、脂溶性であっても水溶性であってもよい。本発明のＢＡＣの非限定的な具体例としては、アミノ酸、抗菌剤、香味剤、防腐剤、甘味剤、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミンなどが挙げられる。

本明細書において、「水溶性の生物学的に活性な化合物」または「水溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療および／または美容作用を有し、スペイン薬局方によって規定される基準にしたがって、水溶液中で可溶性（極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）である、化合物を指す。

水溶性のＢＡＣの非限定的な具体例としては、ビタミン（例えば、Ｂ群またはＣ群のビタミン）およびこれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、これらの塩またはエステルなどが挙げられる。特定の実施形態では、水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタメート；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸（α−リポ酸）、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、これらの食品グレードのまたは医薬的もしくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

本明細書において、「脂溶性の生物学的に活性な化合物」または「脂溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療および／または美容作用を有し、スペイン薬局方によって規定される基準にしたがって、脂中および油中で可溶性（極めてて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）である化合物を指す。脂溶性のＢＡＣの非限定的な具体例としては、ビタミン、例えば、Ａ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｋ群のビタミンおよびこれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド（カロテン、リコピン、ルテイン、カプサンシン、ゼアキサンチンなど）、ω−３脂肪酸（ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）など）、植物スタノールおよび植物ステロール（シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロル、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）およびこれらの誘導体が挙げられる。

国または機関（例えば、国連食糧農業機関（ＦＡＯ）または世界保健機関（ＷＨＯ））の国際食品規格にしたがって、ある製品がヒト用または動物用の食品に使用するのが安全であるとき、「食品グレード」の製品であると言われ、その結果、「食品グレード」の製品は、非毒性の「食用に適した」製品であり、そのため、この両表現は、同義語であり、本明細書では区別なく使用される。

本明細書において、「水性媒体」は、水を含む媒体を指す。特定の実施形態では、水性媒体は、本質的に水からなる。

本明細書において、「含水アルコール媒体」は、水とアルコールとを様々な相対比率で含む媒体を指す。特定の実施形態では、含水アルコール媒体は、前記化合物間における任意の相対比率でエタノール水溶液を含む。

本明細書において、「ナノ粒子」は、１マイクロメートル（μｍ）未満、好ましくは、１０〜９００ナノメートル（ｎｍ）の粒径を有する球状またはこれに類似する形状のコロイド系を指す。

本明細書において、「平均径」は、水性媒体中で一緒に移動するナノ粒子集団の平均直径を指す。これらの系の平均径は、当業者に知られている標準的な方法によって測定することができ、例えば、実験例に記載されている（後記参照）。

本明細書において、用語「ゼイン」は、プロラミン類に属する任意の球状タンパク質を含み、このタンパク質は、一般的に、胚乳（種子植物の胚嚢で作られる栄養組織であり、通常は、種々の被子植物の種子の胚のための食物の貯蔵庫を形成する）の成長中に合成される。ゼインは、任意の適切な供給源から得ることができるが、好ましくは、トウモロコシから得られる。トウモロコシの胚乳からゼインを抽出する種々の方法および技術が知られており、市販のゼインは、一般的に、コーングルテンミールから抽出される（ＵＳ２００９／０２５８０５０号）。

ゼインの研究は、遺伝子レベルで著しい変動性があり、そのため、ゼインとして知られているタンパク質群の一部を形成する異なるタンパク質の中で、複雑な状況があることがわかっている。天然のゼインは、実際は、分子の大きさ、溶解度、電荷が異なるいくつかの群のタンパク質からなる大きな異種のファミリーである。２０種類を超える異なるゼインが存在すると見積もられている。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、アミノ酸分析、およびＤＮＡクローニング技術によるゼイン抽出物の分析によって、ゼインタンパク質がよりよく理解されてきている。

ゼインのアミノ酸組成の分析から、大量のロイシン、アラニン、グルタミンおよびフェニルアラニンが明らかになっているが、リジンおよびトリプトファンは存在していないか、または、非常に少量だけ存在している。非極性アミノ酸残基の比率が大きく、イオン性基が例外的に存在していないことが、その疎水性の性質および特定の溶解度の原因となっている。

ゼインのタンパク質集団は、アルファ−ゼイン（α−ゼイン）、ガンマ−ゼイン（γ−ゼイン）［ベータゼイン（β−ゼイン）を含む］、およびデルタ−ゼイン（δ−ゼイン）といった構造的に異なる３種類のタンパク質によって作られている。このタンパク質は、溶解度および配列の違いに基づき、４種類（α−ゼイン、β−ゼイン、γ−ゼイン、およびδ−ゼイン）に分類することができる。

還元剤を用いずに抽出されたゼインは、α−ゼインと呼ばれるポリペプチドの多くの多重遺伝子族を形成する。α−ゼインは、一般的に、天然のゼインに最も多く含まれるフラクションであり、アミノ末端に約４０のアミノ酸を含み、その後に、２０アミノ酸の９または１０の繰り返し配列ペプチドを含む。これらの繰り返し配列は、αらせんであり、棒状の分子にタンパク質が巻きついていると考えられる。

ゼインの他のフラクション（β−、γ−およびδ−ゼイン）は、ジスルフィド結合を破壊するための還元剤を含有するアルコールのアルコール溶液を用いて抽出しなければならない。実例として、メルカプトエタノールは、実験室での抽出に使用される。β−、γ−およびδ−ゼインは、α−ゼインと配列同一性を示さない。

γ−ゼインは、還元条件下で水性溶媒およびアルコール溶媒の双方に可溶性である。γ−ゼインはそれぞれ固有のＮ末端配列を有する。例として、５０ｋＤａのγ−ゼインにおいて、この領域は、１３６アミノ酸長であり、ヒスチジンが非常に豊富である。２７ｋＤａのγ−ゼインは、アミノ末端の後に一連の８個のヘキサペプチド縦列反復配列（１１個のアミノ酸を生成する）を有する。１６ｋＤａのγ−ゼインタンパク質の１つ目の８個のアミノ酸は、２７ｋＤａのγ−ゼインの１つ目の８個のアミノ酸と同一であるが、１６ｋＤａのγ−ゼインは、プロリンを豊富に含む繰り返し配列の３種類の縮重態様を有する。γ−ゼインは、通常は、ゼイン全体の１０〜１５％に相当する。

β−ゼインは、γ−ゼインに関連し、メチオニンが豊富な１７ｋＤａポリペプチドを含み、ゼイン全体の１０％を構成する。β−ゼインおよびγ−ゼインのおおよそ最後の１４０アミノ酸は、８５％同一である。β−ゼインは、反復ペプチドを含まず、ほとんどがβ−シートを構成し、逆向きに配置していると考えられる。

δ−ゼインは、１０ｋＤａのタンパク質であり、ゼインの少量のフラクションである。δ−ゼインは、群の中で最も疎水性であり、反復ペプチドを含まず、例外的にメチオニンおよびシステインが豊富である。

ゼインは、食品医薬品局（米国）によって、１９８５年から「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）製品であるとみなされている［ＣＡＳ（化学情報検索サービス）番号：９０１０−６６−６］。

本発明において、ゼインの供給源またはグレードは、１種類のゼインに限定されず、実際、本発明を実施するために、任意のゼインを使用することができる。実例として、本発明で使用可能な市販のゼインとしては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されるゼイン（製品番号Ｚ３６２５）；Ｗａｋｏ Ｐｕｒａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓによって供給されるゼイン（製品番号２６１−０００１５、２６４−０１２８１および２６０−０１２８３）；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌによって供給されるゼイン（製品番号Ｚ１１３１およびＺＥ１０５）；ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ ｕｎｉｔｓ ＳＬＺ１１５０；ＳＪＺ Ｃｈｅｍ−Ｐｈａｒｍａ社によって供給されるゼイン（製品名ＺＥＩＮ（ＧＬＩＤＺＩＮ）；Ａｒｃｏ Ｏｒｇａｎｉｃｓによって供給されるゼイン（カタログ番号１７９３１−００００、１７９３１−１０００および１７９３１−５０００）；およびＦｒｅｅｍａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ゼイン一般グレードＦ４０００、ゼイン一般グレードＦ４４００、ゼイン特殊グレードＦ６０００などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給される、トウモロコシから得られる市販のゼイン（製品番号Ｚ３６２５）が用いられる。

本明細書において、「ゼイン」との用語は、天然ゼインおよび改質ゼインの双方を含む。「改質ゼイン」との用語は、通常天然には存在しないアミノ酸配列を有するが、本物のゼインと同様の挙動を示し、アルコールに可溶性である任意のゼインを含む。アミノ酸の置換、特に、疎水性を実質的に変えない置換を導入してもよい。実例として、アミノ酸の置換は、反復領域内で行われてもよく、または、１個のアミノ酸を置換してもよく、さらにまた、置換は、反復配列のドメインを連結するセグメント中で行われてもよい。また、挿入および置換が、ゼイン分子のカルボキシル末端およびアミノ末端に導入されてもよい。さらに、得られるタンパク質がゼインと機能的に等価である（すなわち、その性質を維持する）場合は、アミノ酸配列において、欠失が行われてもよい。

本発明のナノ粒子
一つの態様では、本発明は、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子（以下「本発明のナノ粒子」という）に関する。

事実上、任意のゼインが本発明のナノ粒子のマトリックスを形成することができる。しかし、特定の実施形態では、前記ゼインは、トウモロコシ由来のゼインであり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されるゼイン（製品番号Ｚ ３６２５）である。

特定の実施形態では、前記塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびこれらの混合物からなる群から選択される。

本発明のナノ粒子は、生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）をカプセル化するのに用いることができる。本発明のナノ粒子は、さらに、技術的助剤として使用することができ、例えば、水性マトリックス内への脂溶性のＢＡＣの組み込みを容易にすることなどができる。

したがって、別の特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣをさらに含む。前記ＢＡＣは、水溶性のＢＡＣであっても脂溶性のＢＡＣであってもよく、この場合、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣを含んでいない本発明の他のナノ粒子（時に、「本発明の空のナノ粒子」として特定する）と区別するために、本明細書では、時に、「本発明の保持しているナノ粒子」として特定する。

特定の実施形態では、前記ＢＡＣは、脂溶性のＢＡＣである。さらに特定の実施形態では、脂溶性のＢＡＣは、
（ａ）ポリフェノール；
（ｂ）ビタミンＡ群、Ｄ群、Ｅ群またはＫ群のビタミン；
（ｃ）（ｂ）のビタミンの前駆体または誘導体；
（ｄ）リン脂質；
（ｅ）カロチノイド；
（ｆ）脂肪酸；
（ｇ）植物スタノールまたは植物ステロール；
（ｈ）上述の化合物（ａ）〜（ｇ）のいずれかの塩またはエステル；および
（ｉ）これらの組み合わせ
からなる群から選択される。

さらに特定の実施形態では、前記脂溶性のＢＡＣは、
（ｉ）ポリフェノール、例えば、フラボノール（例えば、カテキン、エピカテキン、イソラムネチン、ケンペロール、ミリセチン、ケルセチンなど）；アントシアニン（例えば、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペオニジン、ペツニジンなど）；フィトアレキシン（例えば、レスベラトロルなど）；ヒドロキシチロソールなど；
（ｉｉ）脂溶性ビタミン、例えば、ビタミンＡおよびその誘導体（例えば、レチノイン酸、レチナール、レチノールなど）；ビタミンＥおよびその誘導体（例えば、トコフェロール、例えば、α−トコフェロールなど、トコトリエノールなど）；ビタミンＤおよびその誘導体（例えば、ビタミンＤ_１、ビタミンＤ_２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ_３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ_４（２２−ジヒドロエルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ_５（シトカルシフェロール）など）；ビタミンＫまたはフィトメナジオンおよびその誘導体（例えば、ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、メナジオンなど）；
（ｉｉｉ）カロチノイド、例えば、カロテン（例えば、α−カロテン、β−カロテン、クリプトキサンチン、リコピンなど）；キサントフィル（例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプサンシン、クリプトキサンチン，フラボキサンチン、ルテイン、ロドキサンチン、ルビキサンチン、ビオラキサンチン、ゼアキサンチンなど）；
（ｉｖ）脂肪酸、例えば、ω−３脂肪酸（例えば、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）など；ω−６脂肪酸（例えば、γ−リノール酸など）；または
（ｖ）植物ステロールまたは植物スタノール（例えば、ブラシカステロール、カンペステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、シトスタノール、シトステロールなど）
である。

特定の実施形態では、前記脂溶性のＢＡＣは、フラボノール（例えば、ケルセチンなど）、アントシアニン、フィトアレキシン（例えば、レスベラトロルなど）、ヒドロキシチロソール、レチノイン酸、レチナール、レチノール、カルシフェロール（エルゴカルシフェロールおよびコレカルシフェロール（ｃｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ））、α−トコフェロール、トコトリエノール、フィトメナジオン、α−カロテン、β−カロテン、リコピン、カプサンシン、ルテイン、ゼアキサンチン、キサントフィル、ＥＰＡ、ＤＨＡ、リノール酸、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、これらの食品グレードのまたは医薬的もしくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

さらに特定の実施形態では、前記脂溶性のＢＡＣは、ケルセチン、レスベラトロル、これらの食品グレードのまたは医薬的もしくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

別の特定の実施形態では、前記ＢＡＣは、水溶性のＢＡＣである。さらに特定の実施形態では、前記水溶性のＢＡＣは、
（ａ）Ｂ群またはＣ群のビタミン；
（ｂ）（ａ）のビタミンの誘導体；
（ｃ）ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチンおよびチオクト酸から選択される化合物；
（ｄ）上述の化合物（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩またはエステル；および
（ｅ）これの組み合わせ
である。

特定の実施形態では、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、その食品グレードのまたは医薬的もしくは化粧品的に許容されるエステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

本発明のナノ粒子を、抗酸化化合物をカプセル化するための系として使用することは、特に好ましい実施形態である。

本発明のナノ粒子を得る方法
別の態様では、本発明は、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子（本発明のナノ粒子）を製造する方法（以下、「本発明の方法［１］」）に関し、この方法は、
（ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコールを調製する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の溶液に水を加える工程とを含む。

本発明の方法［１］の工程（ａ）で使用する含水アルコール溶液は、水とアルコール（典型的には、エタノール）とを含み、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液は、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６０％、さらに好ましくは、おおよそ５０％のアルコールを含む。

本発明の方法［１］の工程（ａ）で調製される含水アルコール溶液が含み得るゼインの量は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液に含まれるゼインの量は、０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．２％〜２．５％、さらに好ましくは、０．５％〜１％に含まれる。

本発明の方法［１］の工程（ａ）で調製される含水アルコール溶液が含み得る塩基性アミノ酸の量は、広範囲に変わり得る。一般的に、この量は、通常、溶解するゼインの量によって表される。したがって、前記含水アルコール中に存在する塩基性アミノ酸とゼインの重量比［塩基性アミノ酸：ゼイン］は、一般的に、カプセル化されるＢＡＣの種類によって変わり、広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、前記塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、１：０．０１〜１：５０、典型的には、１：０．５〜１：２５、好ましくは、１：１〜１：２０、さらに好ましくは、１：５〜１：１５に含まれ、特定の実施形態では、塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、おおよそ１：６である。

本発明の方法［１］の工程（ｂ）において、本発明のナノ粒子を形成するのに十分な量の水が加えられる。加えられる水の量は広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、水は、媒体中のアルコールの最終的な割合に対して十分な量で加えられ、１０％〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、１５％〜３０％、さらに好ましくは、おおよそ２５％に含まれる。

別の態様では、本発明は、ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸と、脂溶性のＢＡＣとを含むナノ粒子（脂溶性のＢＡＣを保持する本発明のナノ粒子）を製造する方法（以下、「本発明の方法［２］」という）に関し、この方法は、
（ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を調製する工程と、
（ｂ）脂溶性のＢＡＣを含むアルコール溶液を調製し、この溶液を水で希釈し、脂溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）を得る工程と、
（ｃ）前記ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）と、前記脂溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）とを混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物に水を加える工程とを含む。

本発明の方法［２］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）は、水とアルコール（典型的には、エタノール）とを含み、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液は、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６０％、さらに好ましくは、おおよそ５０％のアルコールを含む。前記含水アルコール溶液（ｉ）は、適切な量で成分を混合することによって調製される。

本発明の方法［２］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）が含み得るゼインの量は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液（ｉ）に含まれるゼインの量は、０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．２％〜２．５％、さらに好ましくは、０．５％〜１％に含まれる。

本発明の方法［２］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）が含み得る塩基性アミノ酸の量は、広範囲に変わり得る。この量は、一般的に、溶解するゼインの量によって表される。したがって、前記含水アルコール（ｉ）中に存在する塩基性アミノ酸とゼインの重量比［塩基性アミノ酸：ゼイン］は、広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、前記塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、１：０．０１〜１：５０、典型的には、１：０．５〜１：２５、好ましくは、１：１〜１：２０、さらに好ましくは、１：５〜１：１５に含まれ、特定の実施形態では、塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、おおよそ１：６（ＢＡＣがレスベラトロルである場合）およびおおよそ１：１１（ＢＡＣがケルセチンである場合）である。

本発明の方法［２］の工程（ｂ）で調製される脂溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）は、前記脂溶性のＢＡＣをアルコール（例えば、エタノール）に溶解または可溶化し、次いで、得られたアルコール溶液を水で希釈することによって得ることができる。したがって、本発明の方法［２］の工程（ｂ）で調製される脂溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）は、水とアルコール（典型的には、エタノール）とを含み、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液（ｉｉ）は、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６５％、さらに好ましくは、５０〜６０％のアルコールを含む。

前記含水アルコール溶液（ｉｉ）が含み得る脂溶性のＢＡＣの量は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液（ｉｉ）に含まれる脂溶性のＢＡＣの量は、０．０５％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．１％〜１％、さらに好ましくは、０．２％〜０．３％に含まれる。

本発明の方法［２］の工程（ｃ）によれば、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を、脂溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）と混合し、ゼインと、塩基性アミノ酸と、脂溶性のＢＡＣとを含む混合物をこのようにして含水アルコール媒体中で作成する。工程（ｃ）で作成した混合物中に存在する脂溶性のＢＡＣ：ゼインの重量比は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、脂溶性のＢＡＣとゼインの重量比［脂溶性のＢＡＣ：ゼイン］は、１：０．５〜１：７０、好ましくは、１：５〜１：５０、さらに好ましくは、１：１０〜１：３０に含まれる。

本発明の方法［２］の工程（ｄ）によれば、工程（ｃ）で作成られる混合物に、本発明のナノ粒子の形成に十分な量の水が加えられる。加えられる水の量は広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、水は、媒体中のアルコールの最終的な比率に対して十分な量で加えられ、１０％〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、１５％〜３０％、さらに好ましくは、おおよそ２５％含まれる。

別の態様では、本発明は、ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸と、水溶性の生物学的に活性な化合物とを含むナノ粒子（水溶性のＢＡＣを保持する本発明のナノ粒子）を製造する方法（以下、「本発明の方法［３］」という）に関し、この方法は、
（ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を調製する工程と、
（ｂ）水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む水溶液を調製し、この水溶液をアルコールで希釈し、水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む含水アルコール溶液（ｉｉ）を得る工程と、
（ｃ）前記ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）と、前記水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む含水アルコール溶液（ｉｉ）とを混合する工程と、
（ｄ）場合により、工程（ｃ）で得られた混合物に界面活性剤を加える工程と、
（ｅ）工程（ｃ）または工程（ｄ）で得られた混合物に水を加える工程とを含む。

本発明の方法［３］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含む含水アルコール溶液（ｉ）は、水とアルコール（典型的には、エタノール）とを含み、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液は、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６０％、さらに好ましくは、おおよそ５０％のアルコールを含む。前記含水アルコール溶液（ｉ）は、適切な量で成分を混合することによって調製される。

本発明の方法［３］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）が含み得るゼインの量は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液（ｉ）に含まれるゼインの量は、０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．２％〜２．５％、さらに好ましくは、０．５％〜１％に含まれる。

本発明の方法［３］の工程（ａ）で使用する、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）が含み得る塩基性アミノ酸の量は、広範囲に変わり得る。この量は、一般的に、溶解するゼインの量によって表される。したがって、前記含水アルコール（ｉ）中に存在する塩基性アミノ酸とゼインの重量比［塩基性アミノ酸：ゼイン］は、広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、１：０．０１〜１：５０、典型的には、１：０．５〜１：２５、好ましくは、１：１〜１：２０、さらに好ましくは、１：５〜１：１５に含まれ、特定の実施形態では、塩基性アミノ酸：ゼインの重量比は、おおよそ１：６．７である。

本発明の方法［３］の工程（ｂ）で調製される水溶性のＢＡＣを含む含水アルコール溶液（ｉｉ）は、場合により第２の塩基性アミノ酸の存在下、前記水溶性のＢＡＣを水に溶解または可溶化し、次いで、得られた水溶液をアルコール（例えば、エタノール）で希釈することによって得ることができる。したがって、本発明の方法［３］の工程（ｂ）で調製される水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む含水アルコール溶液（ｉｉ）は、水とアルコール（典型的には、エタノール）とを含み、特定の実施形態では、含水アルコール溶液（ｉｉ）は、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６０％、さらに好ましくは、おおよそ５０％のアルコールを含む。

水溶性のＢＡＣを、場合により前記第２の塩基性アミノ酸の存在下で水に溶解して得られる水溶液は、特定の実施形態では、前記水溶性のＢＡＣと水とを含み、別の特定の実施形態では、前記水溶性のＢＡＣと、前記塩基性アミノ酸と、水とを含む。ある種の水溶性のＢＡＣ（例えば、葉酸）の可溶化は、塩基性アミノ酸で塩基性にした水溶液を使用することによって促進することができるため、水溶性のＢＡＣを溶解するために前記第２の塩基性アミノ酸の存在が必要な場合には、前記第２の塩基性アミノ酸は、一般的に、水溶液で［それゆえ、前記含水アルコール溶液（ｉｉ）で］存在するであろう。この場合には、この塩基性にした水溶液中の前記水溶性のＢＡＣと前記第２の塩基性アミノ酸の重量比は、１：０．２５〜１：５、好ましくは、１：０．５〜１：２、さらに好ましくは、１：０．８〜１：１．８に含まれてもよく、その後、上に述べたように、この水溶液を含水アルコール媒体（例えば、エタノール）で希釈し、前記含水アルコール溶液（ｉｉ）を得る。この溶液は、上で述べたように、２５％〜７５％（ｗ／ｖ）のアルコール、好ましくは、３０％〜６０％、さらに好ましくは、おおよそ５０％のアルコールを含む。

本発明の方法［３］は、２種類の異なる塩基性アミノ酸を用いる可能性を想定している。したがって、特定の実施形態では、ゼインおよび塩基性アミノ酸（第１の塩基性アミノ酸）を含有する含水アルコール溶液（ｉ）の調製において使用される塩基性アミノ酸と、水溶性のＢＡＣおよび（この場合には）第２の塩基性アミノ酸（第２の塩基性アミノ酸）を含む含水アルコール溶液（ｉｉ）の調製において使用される塩基性アミノ酸は、同じであり、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびこれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、リジンである。

含水アルコール溶液（ｉｉ）が含み得る水溶性のＢＡＣの量は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、前記含水アルコール溶液（ｉｉ）に含まれる水溶性のＢＡＣの量は、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０５％〜５％、さらに好ましくは、０．１％〜１％に含まれる。

本発明の方法［３］の工程（ｃ）によれば、ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を、水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む含水アルコール溶液（ｉｉ）と混合し、ゼインと、塩基性アミノ酸と、水溶性のＢＡＣと、場合により第２の塩基性アミノ酸（上述のように、前記含水アルコール溶液（ｉ）に含有される塩基性アミノ酸と同じであってもよい）とを含む混合物をこのようにして形成する。工程（ｃ）で形成された混合物中に存在する水溶性のＢＡＣ：ゼインの重量比は、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、工程（ｃ）で形成された前記混合物中に存在する水溶性のＢＡＣ：ゼインの重量比［水溶性のＢＡＣ：ゼイン］は、１：０．２〜１：５０、好ましくは、１：１〜１：１５、さらに好ましくは、１：６〜１：１２に含まれる。

本発明の方法［３］の任意の工程（ｄ）において、工程（ｃ）で得られた混合物に界面活性剤を加える。如何なる理論によって束縛されるものではないが、界面活性剤は、水溶性のＢＡＣを脂溶性のポリマーマトリックス（ゼイン）に近づくように移動させ、それにより、液滴形成を誘導するとき、その捕捉を容易にするため、水溶性のＢＡＣをナノ粒子中にカプセル化しやすくすると考えられる。特定の実施形態では、前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、例えば、脂肪酸（例えば、オレイン酸）およびポリオキシエチレンソルビタンから誘導されるエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０という名称で上市されているもの）である。工程（ｄ）で形成される混合物中の界面活性剤：水溶性のＢＡＣの重量比は、適切な場合、広範囲に変わり得る。しかし、特定の実施形態では、界面活性剤と水溶性のＢＡＣの重量比［界面活性剤：水溶性のＢＡＣ］は、１：１０〜１：５０、好ましくは、１：１５〜１：４５、さらに好ましくは、１：２０〜１：３０に含まれる。

最後に、本発明の方法［３］の工程（ｅ）では、工程（ｃ）または工程（ｄ）で形成された混合物に、本発明のナノ粒子を形成するのに十分な量の水が加えられる。加えられる水は、広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、水は、媒体中のアルコールの最終的な比率に対して十分な量で加えられ、１０％〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、１５％〜３０％、さらに好ましくは、おおよそ２５％含まれる。

実際に、任意のゼインを使用し、本発明の方法［１］、［２］および［３］を実施することができるが、特定の実施形態では、ゼインは、トウモロコシ由来のゼインであり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されるゼイン（製品番号Ｚ ３６２５）である。

非常に多様な性質をもつアルコールを使用することができるが、本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明の方法［１］、［２］および［３］で使用される含水アルコール溶液は、エタノールである。

実際に、任意の塩基性アミノ酸を使用し、本発明の方法［１］、［２］および［３］を実施することができるが、特定の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびこれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、リジンである。塩基性アミノ酸は、本発明のナノ粒子の内側または外側にあってもよいが、以下の理由で基本的な技術的な役割をはたす。
− 塩基性アミノ酸は、ナノ粒子が形成される前に、成分の溶解を促進する。具体的には、ゼインは、塩基性アミノ酸の存在下では、塩基性アミノ酸の非存在下での溶解に比べて、アルコールの比率がより低い（例えば５０％）含水アルコールに溶解することができる。塩基性アミノ酸はさらに、ＢＡＣ、特に、ある種の水溶性のＢＡＣ、特に、酸性の水溶性のＢＡＣ（例えば、葉酸）の溶解を促進する；
− 塩基性アミノ酸は、ナノ粒子の両側（内側および外側）で、ナノ粒子を製造した後に、適切なｐＨを維持する；そして、
− 塩基性アミノ酸は、±１０ｍＶとは大きく離れた負の表面電荷をもつナノ粒子を得ることができ、その凝集を妨げる。

したがって、塩基性アミノ酸は、本発明のＢＡＣを保持するナノ粒子および保持しないナノ粒子双方の製造において非常に重要な役割を果たす。

本発明のナノ粒子は、平均粒径が１μ未満、典型的には、１〜９９９ｎｍ、好ましくは、１０〜９００ｎｍ、さらに好ましくは、５０〜５００ｎｍ、さらに一層好ましくは、１００〜４５０ｎｍ、よりさらに一層好ましくは、１４０〜４００ｎｍであることを特徴とする。本発明のナノ粒子は、官能特性（舌触り）を変えてしまうことを予防する目的で、粒径がおおよそ約２００ｎｍであるのが有利であり、このことは、本発明のナノ粒子が食品分野で使用される場合特に適している。

本発明のナノ粒子（ＢＡＣを保持しているもの、および保持していないもの（空のナノ粒子））は、温度および酸化に対する安定性を高める目的で、製剤中に、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込むことができる。この場合、酸化防止剤を、ＢＡＣとともに導入し、一緒にカプセル化してもよく（適切な場合）、または本発明のナノ粒子のエンベロープ（外殻）に導入してもよい。このため、本発明の方法［１］、［２］および［３］は、例えば、ＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含む水溶液に酸化防止剤を加えることによって、ナノ粒子の製剤中に酸化防止剤を組み込むように適切に合わせられるであろう。

特定の実施形態では、ＢＡＣは葉酸であり、酸化防止剤はアスコルビン酸であり、葉酸が紫外線照射、ｐＨ変化、熱、酸素などによって分解しないように保護することによって、さらに、アスコルビン酸自体が、栄養的に寄与することによって作用すると考えられる。酸化防止剤をＢＡＣと共に導入し、一緒にカプセル化してもよく、または本発明のナノ粒子のエンベロープに導入してもよい。

さらに、所望な場合、本発明の方法［１］、並びに本発明の方法［２］および［３］は、異なる処理を用いることによって得られるナノ粒子を安定化するための１つ以上のさらなる安定化工程を含んでいてもよい。

特定の実施形態では、この安定化処理は、形成された本発明のナノ粒子（ＢＡＣを保持しているもの、および保持していないもの双方）を含む懸濁物を、例えば、１００〜８００ＭＰａ、典型的には、３５０〜６００ＭＰａの圧力で高圧処理に付すことを含む。特定の実施形態では、この処理は、ナノ粒子の懸濁物を、１００〜８００ＭＰａ、典型的には、３５０〜６００ＭＰａの圧力で、３〜５分間のサイクルに付すことを含み、実際には、４００ＭＰａの圧力が良好な結果を与える。

別の特定の実施形態では、この安定化処理は、形成された本発明のナノ粒子（ＢＡＣを保持しているもの、および保持していないもの双方）を含む懸濁物を、２〜５秒間、ＵＨＴ（超高温）処理、例えば、１３０℃〜１４０℃の温度で処理した後、急速に冷却する工程に付すことを含む。
同様に、所望な場合、本発明の方法［１］、並びに本発明の方法［２］および［３］は、本発明のナノ粒子（ＢＡＣを保持しているもの、および保持していないもの双方）を粉末の形態で得る目的で、形成されたナノ粒子を含む懸濁物を乾燥させる工程を含んでいてもよい。このナノ粒子の存在形態は、その安定性の一因となり、さらに具体的には、固体食品（例えば、小麦粉、パン、ペーストリー製品、シリアル、ミルク粉末など）並びに化粧品および／または医薬品への適用可能性に対し有用である。実際、ナノ粒子を含む懸濁物を乾燥させるのに適した任意の従来の方法または技術を用い、この乾燥工程を行ってもよいが、特定の実施形態では、ナノ粒子を含む懸濁物を、アスピレーションもしくは噴霧による乾燥（スプレー乾燥）または凍結乾燥によって乾燥させる。この処理は、一般的に、ナノ粒子の懸濁物に、ナノ粒子に適した保護剤（例えば、糖、例えば、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ショ糖、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなど、およびこれらの混合物）を加えることによって行われる。保護剤は、本発明のナノ粒子を乾燥工程中の熱分解および酸化から保護する。

ゼイン：糖の重量比は、広範囲に変わり得るが、特定の実施形態では、ゼイン：糖の重量比は、１：１〜１：４に含まれ、好ましくは、約１：２である。

同様に、特定の実施形態では、糖を含有する溶液は、さらに酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などを含むことができ、この場合、ゼイン：糖：保護剤（例えば、ビタミンＣ）の重量比は、１：０．７５〜２．５：０．２５〜１．５、好ましくは、１：１．５：０．５であることができる。

本発明の方法［１］により得られた本発明のナノ粒子（すなわち、方法［１］によって形成された、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子）は、本発明のさらなる態様である。

同様に、本発明の方法［２］または［３］により得られた本発明の保持しているナノ粒子（すなわち、脂溶性のＢＡＣまたは水溶性のＢＡＣを保持している、ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子）は、本発明のさらなる態様である。

用途
本発明のナノ粒子は、ＢＡＣ（例えば、水溶性のＢＡＣまたは脂溶性のＢＡＣ）をカプセル化する能力を有する。本発明のナノ粒子は、さらに技術的助剤として使用することができ、例えば、その中では可溶性とならない媒体中でＢＡＣの均一な分散物になりやすくなる。

特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣをカプセル化することができ、医薬組成物、化粧品組成物および食品組成物に組み込むことができる。天然ポリマー（合成ポリマーに関連する毒性を予防する）ではない他の成分および食品グレードの成分ではない他の成分が、これらの調製物にも最終的な生産物（ナノ粒子）にも使用されていないためである。このナノ粒子は、ＢＡＣが外部因子（光、ｐＨ変化、酸化など）に対して分解しないように保護する。

本発明のナノ粒子は、水性媒体に再懸濁させ、ＢＡＣが溶液中で分解しないように保護することができる。本発明のナノ粒子は、さらに乾燥粉末の形態で存在し、ＢＡＣを安定に保ち、長期間にわたって貯蔵可能にすることができる（特に、固体の食品調製物への組み込みにとって）。

さらに、本発明のナノ粒子は、局所用途のための化粧品組成物および医薬組成物の調製にも適している。

したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノ粒子と、食品、医薬品または化粧品に許容される担体とを含む組成物（以下、「本発明の組成物」という）に関し、特定の実施形態では、本発明の組成物は、複数の本発明のナノ粒子を含む。特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、ゼインマトリックスと塩基性アミノ酸とを含むナノ粒子であり、別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の保持しているナノ粒子（すなわち、ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸と、栄養、治療および／または美容作用を有するＢＡＣとを含むナノ粒子）、および医薬的または化粧品的に許容される担体または食品に適した担体である。

本発明のナノ粒子は、平均粒径が１μｍ未満、典型的には、１〜９９９ｎｍ、好ましくは、１０〜９００ｎｍ、さらに好ましくは、５０〜５００ｎｍ、さらに一層好ましくは、１００〜４５０ｎｍ、よりさらに一層好ましくは、１４０〜４００ｎｍである。本発明のナノ粒子は、官能特性（舌触り）を変えてしまうことを予防する目的で、粒径がおおよそ２００ｎｍであるのが有利であり、このことは、本発明のナノ粒子が食品分野で使用される場合特に適している。

特定の実施形態では、ＢＡＣは、アミノ酸、抗菌剤、香味剤、防腐剤、甘味剤、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミンおよびこれらの混合物からなる群から選択される。

特定の実施形態では、ＢＡＣは、脂溶性のＢＡＣである。脂溶性のＢＡＣの非限定的な具体例としては、ビタミン、例えば、Ａ群、Ｄ群、Ｅ群、Ｋ群のビタミンおよびこれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド（カロテン、リコピン、ルテイン、カプサンシン、ゼアキサンチンなど）、ω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリン）、植物スタノールおよび植物ステロール（例えば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（例えば、ケルセチン、ルチン、レスベラトロル、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）およびこれらの誘導体が挙げられる。

別の特定の実施形態では、ＢＡＣは、水溶性のＢＡＣであり、好ましくは、水溶性のＢＡＣの酸である。水溶性のＢＡＣの非限定的な具体例としては、ビタミン（例えば、Ｂ群またはＣ群のビタミン）およびこれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、その塩またはエステルなどが挙げられる。特定の実施形態では、水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタメート；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、これらの食品グレードのまたは医薬的もしくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、局所投与に適した医薬組成物であり、このために、この組成物は、局所投与に適した１つ以上の賦形剤を含む医薬的に許容される担体を、例えば、ゲル、軟膏、クリームなどの形態で含む。これらの局所投与を目的とする医薬組成物の製剤に適した賦形剤、およびこの医薬組成物の製造についての情報は、「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ． Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏによる、第１０版、１９９３、Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓという本の中に見いだすことができる。本発明のナノ粒子を投与する投薬量は、広範囲に変えることができ、例えば、０．１％〜３０％、好ましくは０．５％〜５％の本発明のナノ粒子を含む本発明の組成物のおおよそ０．５（ｇ／治療される面積ｃｍ^２）〜おおよそ２（ｇ／治療される面積ｃｍ^２）である。

別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、局所投与に適した化粧品組成物であり、このために、この組成物は、局所投与に適した１つ以上の賦形剤を含む化粧品的に許容される担体を、例えば、ゲル、クリーム、シャンプー、ローションなどの形態で含む。これらの局所投与を目的とする化粧品組成物の調製に適した賦形剤、およびこの化粧品組成物の製造についての情報は、「Ｍａｎｕａｌ ｄｅ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉａ」、Ｏｃｔａｖｉｏ Ｄｉｅｚ Ｓａｌｅｓによる、第１版、１９９８、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｖｉｄｅｏｃｉｎｃｏ、Ｓ．Ａ．という本の中に見いだすことができる。

別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、食品組成物であり、例えば、固体、液体または半固体の食品調製物である。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、
− １５重量％〜４５重量％のゼインと、
− １重量％〜４重量％の塩基性アミノ酸と、
− ０．５重量％〜５重量％のケルセチンまたはレスベラトロルと、
− ４５重量％〜８０重量％の糖とを含み、
全ての比率が、組成物の合計重量に対する重量である。

別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、
− １５重量％〜４５重量％のゼインと、
− ４重量％〜１０重量％の塩基性アミノ酸と、
− 場合により、０．０５重量％〜０．５重量％のポリソルベート（例えば、ｔｗｅｅｎ ８０）と、
− ０．５重量％〜５重量％の葉酸と、
− ４５重量％〜８０重量％の糖とを含み、
全ての比率が、組成物の合計重量に対する重量である。

また、本発明の組成物は食料品に組み込むことができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の組成物を含む食料品に関する。この食料品は、液体、半固体または固体の形態であることができる。本発明のナノ粒子が全体的または部分的に溶解するのを防ぐか、または最小限に抑え、本発明のナノ粒子の安定性に寄与するため、食料品は、酸性ｐＨ、すなわち、７未満、好ましくは、６以下、さらに好ましくは、５以下のｐＨを有することが有利である。本発明の組成物を豊富に含むか、または本発明の組成物で強化され得る食料品の具体例としては、ミルクおよびその誘導体（ヨーグルト、チーズ、カードなど）、ジュース、ジャム、パンおよびペーストリー製品、発酵肉、ソースなどが挙げられる。同様に、本発明の組成物は動物用食品（例えば、餌）に組み込むことができる。

以下の実施例は、生物学的に活性な化合物［ＢＡＣ］（具体的には、レスベラトロル、ケルセチンまたは葉酸）をその中に組み込むことができるナノゼイン粒子および塩基性アミノ酸（例えば、リジン）の製造を説明する。ナノ粒子は、ｐＨの変化、光、酸化などに起因して食品で起こり得る分解からＢＡＣを保護することができる。

空のゼインナノ粒子を製造する一般的な方法
ゼインナノ粒子を製造する一般的な方法は、ゼインタンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−製品番号Ｚ ３６２５）を含水アルコール溶液、例えば、５０％（ｗ／ｖ）エタノール溶液に、特定量のリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに溶解した後、磁気攪拌下、一定流量で、特定量の水を加え、黄色がかった乳白色の懸濁物の外観を有するナノ粒子を形成することを含む。

ナノ粒子の物理化学的特性
ナノ粒子の完全な物理化学的特性を得るのに必要な種々の試験を以下に記載する。

ナノ粒子の粒径および表面電荷を物理化学的試験で測定した。第１のパラメータ（粒径）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｚ−Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｏｐｔｉｌａｓ、スペイン）を用いて、光子相関分光法によって得た。第２のパラメータ（表面電荷）は、Ｚｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク、米国）を用いて、ゼータ電位の測定によって測定した。

ナノ粒子を形成する方法の収率は、製剤を遠心分離（１７，０００×ｇ、２０分）して得た上澄みから回収したナノ粒子を得た後に残った遊離ゼインの定量によって算出した。定量化のために、７５％（ｗ／ｖ）のアルコール濃度が得られるまで、上澄みをエタノールで希釈し、このエタノールは、検量線の標準を用意するのと同じ媒体であった。

製剤中で粒子を形成するタンパク質（ゼイン）の量は、初期に加えた量と、精製工程中に回収した上澄み中の定量された量との差として概算した。収率は、以下のように概算した。

さらに、ゼインの合計量と上澄みのゼイン含有量の差によって得られる結果を確認するために、遠心分離後に得られたペレットの定量試験を行った。この場合、７５％（ｗ／ｖ）のエタノールを含む含水アルコール溶液を使用して粒子を破壊し、この溶液は、検量線を用意するのに用いたのと同じ媒体であった。したがって、この場合には、収率は、以下のように概算された。

さらに、定量方法の妥当性を確認し、マトリックス効果がないことを確認するために、遠心分離していない既知の量の製剤を採取し、エタノール濃度７５％が得られるまで希釈した。このように、製剤中に存在するゼインの合計量を定量し、これと初期に加えたゼインの量とを比較することができ、あらゆる場合に、偏差が５％未満であることがわかった。

様々な計算を行うために、９０〜１，２００μｇ／ｍＬの検量線を使用した（Ｒ^２＝０．９９９；ＬＯＤ＝４３μｇ／ｍＬ；ＬＯＱ＝１４３μｇ／ｍＬ）。

全ての定量は、２７８ｎｍにおけるＵＶ分光光度法（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３、ＵＶ−可視光分光システム）によって行われた。

ナノ粒子の形態を走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＤＳＭ ９４０Ａ、ドイツ）によって観察した。そのために、ナノ粒子を、約９ｎｍの金分子の層で覆い（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５５０ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｓｐｕｔｔｅｒ−Ｃｏａｔｅｒ、英国）、Ｚｅｉｓｓ ＤＭＳ ９４０ Ａ顕微鏡（米国）によって写真を撮った。

ケルセチンまたはレスベラトロルを含むゼインナノ粒子を製造する一般的な方法
ケルセチンまたはレスベラトロルを保持するゼインナノ粒子を製造する一般的な方法は、タンパク質（ゼイン）を、含水アルコール媒体（５０％エタノール（ｗ／ｖ））に、所定量のリジンとともに溶解し、その後、磁気攪拌しながら、予め調製した酸化防止剤（ケルセチンまたはレスベラトロル）のアルコール溶液を水で希釈したものを所定量加える工程を含む。混合物を数分間インキュベートした後、最後の工程は、所定量の水を加え、黄色がかった乳白色の懸濁物の外観を有するナノ粒子を形成する工程からなる。

次いで、所望な場合、撹拌によって３分間均質化した後、所定量の糖（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、マルトースなど）溶液を、撹拌を止めずに加える。最後に、懸濁物をスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｅｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）によって、以下の条件で噴霧した。
− 空気注入口温度：７０〜１１０℃
− 空気排出口温度：３０〜９０℃
− 空気圧：２〜１０ｂａｒ［２×１０^５〜１０×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
− アスピレーション（アスピレーター）：３０〜１００％
− 空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ

場合により、製剤は、糖を加えた後、アスピレーションまたは噴霧（スプレー乾燥）の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。

ゼイン粒子に結合するケルセチンまたはレスベラトロルの量の測定
ナノ粒子に結合するケルセチンまたはレスベラトロルの量を、いくつか変更したものの、Ｌａｃｏｐｉｎｉ（Ｌａｃｏｐｉｎｉら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐ Ａｎａｌ ２００８；２１：５８９−５９８）に記載されている方法にしたがって、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。この分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせたクロマトグラフモデル１１００シリーズＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）で行った。

製造直後のサンプル（乾燥前）を分析するため、ナノ粒子の精製工程の後に得られた上澄み［所定量の製剤を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）３００，０００ ＭＷＣＯ透析管（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）で濾過することによる］を、エタノール含有量が７５％（ｗ／ｖ）の含水アルコール溶液が得られるまで希釈した。次いで、このペレットを７５％（ｗ／ｖ）エタノールに溶解して粒子を破壊し、ゼインおよびＢＡＣ（ケルセチンまたはレスベラトロル）およびアミノ酸を溶液中に維持し、これにより定量を行った。両フラクション（上澄みおよびペレット）中に見出されたＢＡＣ含有量の合計は、常に、初期に加えた合計量と合致していた。さらに、所定量の製剤を７５％エタノール（ｗ／ｖ）に溶解することによって、ＢＡＣの合計量を定量することも可能であった。この試験から、加えたＢＡＣの量と、上述のクロマトグラフ法による定量によって得られた量の差が、全ての場合で１０％未満であることを確認することができた。

さらに、粉末サンプル（乾燥製剤）を調製するために、おおよそ１５ｍｇのナノ粒子製剤を採取し、エタノールに再懸濁させた。所定量の製剤を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）３００，０００ ＭＷＣＯ透析管（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）で濾過することによって得られた上澄みを、エタノール濃度７５％（ｗ／ｖ）になるまで蒸留水で希釈した。このペレットを所定量の７５％エタノール（ｗ／ｖ）に溶解した。さらに、１５ｍｇの粉末に含まれるＢＡＣの合計も、７５％（ｗ／ｖ）エタノールに直接溶解することによって定量した。

適合性のあるＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪ０−７５９６プレカラムを取り付け、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ^ＴＭカラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を用い、勾配のついた水／メタノール／氷酢酸の混合物（表１を参照）を移動相として流量０．２５ｍＬ／分でポンプ注入し、サンプルを分析した。

検出は、ケルセチンの場合３６０ｎｍで、レスベラトロルの場合３０６ｎｍで行った。サンプルの注入量は１０μＬであった。保持時間は、ケルセチンの場合２４．２±０．２分、レスベラトロルの場合２２．８±０．５分であった。

サンプルを定量する前に、濃度が１〜１００μｇ／ｍＬの含水アルコール媒体（７５％エタノール）中の異なる検量線を用意し、５％未満の精度および確度の結果を得た。

最後に、ナノ粒子に結合したケルセチンまたはレスベラトロルの量［カプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）］を、初期に加えたＢＡＣの量と、上澄み中で定量したＢＡＣの量との差として算出した。

葉酸を含有するゼインナノ粒子を製造する一般的な方法
葉酸を保持するゼインナノ粒子を製造する一般的な方法は、タンパク質（ゼイン）を、含水アルコール媒体（５０％エタノール（ｗ／ｖ））に所定量のリジンとともに溶解し、その後、磁気攪拌しながら、予め調製したビタミン水溶液を所定量のアルコールで希釈する工程を含む。混合物を数分間インキュベートした後、最後の工程は、所定量の水を加え、黄色がかった乳白色の懸濁物の外観を有するナノ粒子を形成する工程からなる。

次いで、所望な場合、撹拌によって３分間均質化した後、所定量の糖（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、マルトースなど）溶液を、撹拌を止めずに加える。最後に、懸濁物をスプレー乾燥機（Ｂｕｅｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｅｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）によって、以下の条件で噴霧した。
− 空気注入口温度：７０〜１３０℃
− 空気排出口温度：３０〜９０℃
− 空気圧：２〜１０ｂａｒ［２×１０^５〜１０×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
− アスピレーション（アスピレーター）：３０〜１００％
− 空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ

場合により、製剤は、糖を加えた後、アスピレーションまたは噴霧（スプレー乾燥）の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。

ゼイン粒子に結合する葉酸の量の測定
ナノ粒子と結合する葉酸の量を、Ｆａｙｅ［Ｆａｙｅ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｌ．、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｖｉｔａｍｉｎｓ． Ｉｎ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＨＰＬＣ、Ｎｏｌｌｅｔ、Ｌ．Ｍ．Ｌ．（編集）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、第２版、Ｃｈａｐｔｅｒ １０（２０００）ｐｐ．４４４−４４５］に記載されている方法にしたがって、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。この分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせたクロマトグラフモデル１１００シリーズＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）で行った。データは、Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ Ｇ２１７１ソフトウエアを用い、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄコンピュータで分析した。葉酸を分離するために、適合性のあるＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪ０−７５９６プレカラムを取り付け、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ^ＴＭカラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を用いた。移動相は、Ｈ_３ＰＯ_４（３３ｍＭ、ｐＨ２．３）／アセトニトリルの混合物によって、勾配をつけて（表２）作成し、０．２５ｍＬ／分の流量でポンプ注入した。２９０ｎｍで検出を行った。サンプルの注入量は１０μＬであった。葉酸の保持時間は、２２．６±０．５分であった。

サンプルを定量する前に、濃度が２〜４００μｇ／ｍＬの異なる検量線を用意し、精度および確度は９５％より大きくなり、溶液中にゼインおよび／またはアミノ酸が存在しても、葉酸の正確な定量を妨害しなかったことを確認した。

製造直後のサンプル（乾燥前）を分析するため、所定量の製剤を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）３００，０００ ＭＷＣＯ透析管（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）で濾過した後に、得られた上澄みを定量した。次いで、このペレットを０．０５Ｍ ＮａＯＨに溶解して粒子を破壊し、ゼインおよび葉酸およびアミノ酸を溶液中に維持し、これにより定量を行った。両フラクション（上澄みおよびペレット）中に見出された葉酸の合計は、常に、初期に加えた合計量と合致していた。さらに、製剤１ｍＬを０．０５Ｍ ＮａＯＨ １ｍＬに溶解することによって、葉酸の合計量を定量することもできた。この試験から、加えた葉酸の量と、上述のクロマトグラフ法による定量によって得られた量の差が、全ての場合で１０％未満であることを確認することができた。

それに加え、粉末サンプルを定量するために、１５ｍｇのナノ粒子を採取し、水２ｍＬに再懸濁させ、遠心分離処理し、次いで、製造直後のサンプルと同様の方法で手順を進めた。

薬物動態試験、ゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸のバイオアベイラビリティ
治験倫理委員会の規則および欧州の実験動物に関する法律（８６／６０９／ＥＵ）にしたがって薬物動態試験を行った。このために、平均体重２００ｇの雄ウィスターラット２０匹を通常の明−暗条件（１２時間−１２時間）に付し、試験の１週間前からは、葉酸欠乏性の餌（Ｆｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｅｔ．ＴＤ．９５２４７．Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）と水を摂取させた。製剤を投与する１２時間前に、餌は摂取できないが、水は自由に飲むことができるメタボリックケージへラットを隔離した。

動物を４つの治療群に分けた（１群あたりラット５匹）。第１群には、１ｍＬのＰＢＳ（リン酸バッファ、ｐＨ７．４）のみを経口投与した。続く２つの群には、ゼインナノ粒子に組み込んだ葉酸（Ａｄｉｔｉｏ、Ｐａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ、バルセロナ、スペイン）、または水に溶解した遊離形態（カプセル化していない）の葉酸を１ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／ラット）で１回経口投薬して治療した。水に分散した異なる製剤１ｍＬを、胃食道カニューレを介して投与した。最後に、同じ投薬量の遊離葉酸（１ｍｇ／ｋｇ）をリン酸バッファ（ＰＢＳ）（０．５ｍＬ）に溶解したものを第４群に伏在静脈から静脈内投与した。製剤を投与する前に、それぞれのラットにおいて、ビタミンのベースライン濃度を調べるために、尾の伏在動脈から血液を採取した。投与後、おおよそ５００μＬの血液を血清分離管（ＳＡＲＳＴＥＤＴ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ １．１ｍＬ Ｚ−Ｇｅｌ）を用いて異なる時間点で採取した。全ての試験例で、ラットの痛みを予防するために、吸入麻酔（イソフルラン：酸素）によって動物を麻酔した後に採取を行い、全ての時間点でバイタルサインをチェックした。

次いで、その血液量を、あらかじめ動物の温度に暖めておいた生理食塩水５００μＬを腹腔内投与することによって置き換えた。この期間中、動物の状態（運動性、攻撃性、アレルギー反応および温度）を試験し、有意な変化は観察されなかった。

血清サンプルの葉酸の前処理および定量
血液の入った管を遠心分離処理（６，０００ｒｐｍ、２０分、２０℃）した後に得られた血清サンプル中の葉酸の定量を、酵素イムノアッセイ法を用いて行った。このために、食品中の葉酸の定量的な測定についてＦＤＡによって承認されたＥｌｉｓａキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＩＮＣ．カラバサス、カリフォルニア州、米国）を使用した。血清サンプルは、前処理を行わず、製造業者の仕様にしたがって定量した。

このキットが食品で使用するために設計されているという事実から、血清サンプル中のビタミンを定量する能力を確認するために、一連の予備試験を行った。この試験は、以下の前準備過程：１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム中で調製した５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液に溶解した様々な量（０〜３００μＬ）の葉酸を、血清５０μＬに加える過程を有することで、キットによって得られた結果と、前項に記載した高速液体クロマトグラフィーによって得られた結果とを徹底的に比較することからなる。得られた溶液を、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液を用いて最終量が３５０μＬ（血清の１：７希釈）になるように採取した。各混合物を採取し、３０分間沸騰し、次いで、２℃まで冷却し、この温度で一晩保存した。

得られたサンプルを２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、これを２０μｍのフィルタで濾過した後、上述の方法を用い、高速液体クロマトグラフィーによって、葉酸含有量を定量した。この場合、血清のビタミン濃度が低いため、標準添加法を用いて、定量化の誤差を最小限に抑え、マトリックスによる任意の干渉を除去した。このＨＰＬＣによる抽出方法および定量方法は、ＦＤＡによって確立された基準にしたがって検証された。

全ての試験例において、両方法によって見出された血清葉酸濃度の差は、１０％未満であった。したがって、分析のための血清の量が少なくてよく、より簡便で迅速な方法であり、その検出限界（２ｎｇ／ｍＬ）はクロマトグラフィー技術の検出限界よりもかなり低いため、酵素イムノアッセイ法が全てのサンプルを定量するために選択された。

実施例１
空のゼインナノ粒子の調製および特性決定、これを得る方法の収率、製剤に組み込まれたリジンの量の、ナノ粒子の物理化学的特性に与える影響
６０ｍｇのゼイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍｇのリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、８．８ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）エタノール溶液に溶解した。次いで、磁気撹拌しながら、一定流量の下、８．８ｍＬの水をこの溶液に加え、ナノ粒子を形成した。この方法は３回行った。

図１（ＡおよびＢ）に、この方法によって得られたゼイン粒子の、透過型電子顕微鏡によって得られた画像を示す。

リジンおよび初期の含水アルコール溶液のエタノールの割合が、ナノ粒子の物理化学的特性に与える影響を知るために、以下のパラメータを変えることによって、３種類の新しい製剤を調製した。（ｉ）これらのうち、１つはリジンを含まず、（ｉｉ）他の１つは、リジンを含み、初期の含水アルコール溶液を、５０％（ｗ／ｖ）の代わりに７５％（ｗ／ｖ）エタノールで調製し、（ｉｉｉ）３番目のものは、７５％（ｗ／ｖ）エタノールで調製し、リジンも含まない。

第３表に、得られたナノ粒子の主な物理化学的パラメータをまとめる。

実施した統計学的試験（独立したサンプルのノンパラメトリック検定：クラスカル・ウォリス）により、リジンの存在が、表面電荷を高めることを確認する統計学的に有意な証拠の存在が明らかになった。初期量が多いエタノール（７５％（ｗ／ｖ））を用いて調製された製剤は、初期量が５０％（ｗ／ｖ）のエタノールを用いて調製された製剤と比べ、粒径が大きめであり、収率が大きいことが示されたが、表面電荷について有意な差はなかった。

リジンを含まなかったサンプルで見られる表面電荷は、きわめてゼロに近く、このことは、この粒子が、凝集する傾向が大きいことを意味する。しかし、リジンの存在下では、表面電荷は、この現象を予防するのに十分なほど高い。

したがって、ＢＡＣをカプセル化するために、リジン存在下で、５０％（ｗ／ｖ）エタノールを含む含水アルコールから得られた製剤を選択した。なぜなら、このことが、ナノ粒子の凝集を防ぎ、脂溶性のＢＡＣおよび水溶性のＢＡＣの双方のカプセル化への用途を広げ、さらに、試薬の使用の顕著な節約を達成するからである。

実施例２
レスベラトロルを含むゼインナノ粒子の調製および特性決定、リジンおよびレスベラトロルの含有量の、カプセル化効率に与える影響
各溶液がいずれも、最終量が８．８ｍＬの５０％エタノールの当該溶液中に、６０ｍｇのゼインと、様々な量のリジン（０、５、１０または２０ｍｇ）とを含む、異なる含水アルコール溶液を調製した。

さらに、４７ｍｇのレスベラトロルを、１５ｍＬのエタノールに溶解し、次いで、２４ｍＬの水で希釈した。

次いで、調製した異なるゼイン溶液に、様々な量のレスベラトロル溶液（１、２または３ｍＬ）を加えた。インキュベートして５分後に、磁気撹拌しながら、一定流量の下、８．８ｍＬの水を混合物に加えた。この方法は、それぞれの種類の製剤について、３回行った。

第４表に、各試験例で得られたナノ粒子の物理化学的特性を示す。

得られた結果は、リジンの存在が、カプセル化効率に有意な影響を及ぼさないことを示している。したがって、このアミノ酸が粒子の表面電荷を変え、凝集性を低下させるということを考慮し、さらに、粒子の形成収率を高めるということを考慮して、このアミノ酸が組み込まれた製剤を選択し、試験を継続した。

第５表に、リジンの含有量を一定にしたとき、レスベラトロルの含有量を変えることによって得られたナノ粒子の物理化学的特性を示す。

得られた結果から、製剤に加えるレスベラトロルの量が増えるにつれて、カプセル化効率が低下するが、粒子の内側にカプセル化された生物活性物質の量が増えることがわかる。

実施例３
アスピレーション（スプレー乾燥）によって乾燥させた、レスベラトロルを含むゼインナノ粒子の調製および特性決定
１２６ｍｇのゼインを、２１ｍｇのリジンとともに、１４ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）エタノールに溶解した。

これに加え、６０ｍｇのレスベラトロルを１０ｍＬのエタノールに溶解し、次に、この溶液を１．４ｍＬ集め、水で最終容積を２．８ｍＬにして採取した。

次いで、この希釈したレスベラトロル溶液１．１ｍＬをゼイン溶液に加え、混合物を５分間インキュベートした。その後、磁気撹拌しながら、一定流量でこの混合物に水１５ｍＬを加えた。

最後に、この混合物に２６０ｍｇのマルトデキストリンを加えた後、スプレー乾燥機を用いて乾燥させた。この方法の条件は、以下のとおりであった。
− 空気注入口温度：１１０℃
− 空気排出口温度：７０℃
− 空気圧：６ｂａｒ［６×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
− アスピレーション：９４％
− 空気流：７００Ｌ／ｈ

第６表に、得られた製剤の物理化学的特性をまとめる。

ナノ粒子１ｍｇあたりカプセル化された量およびカプセル化効率は、スプレー乾燥によって変わらない。

図２に、レスベラトロルを含むゼイン粒子の走査型電子顕微鏡によって得られた画像を示す。

さらに、ナノ粒子を形成した後で、ナノ粒子をスプレー乾燥機に流す前に、高圧技術（５分間のサイクルで１５０ＭＰａ、５分間のサイクルで４００ＭＰａ）を施し、同じ実験を行った。得られたカプセル化の結果は、この処理をしないで得られたものと同様であった。

実施例４
ケルセチンを含むゼインナノ粒子の調製および特性決定、リジンおよびケルセチンの含有量がカプセル効率に与える影響
各溶液がいずれも、最終量が８．８ｍＬの５０％エタノールの当該溶液中に、６０ｍｇのゼインと、１０ｍｇのリジンとを含む、異なる溶液を調製した。

さらに、１５０ｍｇのケルセチンを５０ｍＬのエタノールに溶解し、次いで、この溶液３１ｍＬを採取し、最終量が５０ｍＬになるように水で希釈した。

次いで、様々な量のケルセチン溶液（０．５〜３ｍＬ）を、調製した異なるゼイン溶液に加えた。インキュベーションして５分後、磁気撹拌しながら、一定流量で８．８ｍＬの水を混合物に加えた。この方法は、それぞれの種類の製剤について、３回行った。

図３に、この方法によって得られたカプセル化されたケルセチンを含むゼイン粒子の透過型電子顕微鏡によって得られた画像を示す。表７に、各試験例で得られた物理化学的特性を示す。

実施した統計学的試験（独立したサンプルのノンパラメトリック検定：クラスカル・ウォリス）により、異なる製剤の物理化学的特性に差があると考える統計的に有意な証拠の存在が明らかになった。得られた結果の観点で、製剤に加えるケルセチンの量が増えるにつれて、以下の数式を考慮しつつ、カプセル化効率は低下し、カプセル化されるＢＡＣ（ケルセチン）の量は潜在的に増えると考えることができる（図４）。
ｙ＝３６９．９２・ｘ ^{−０．７５２６}； Ｒ^２ ＝ ０．９９５５ ［式３］
式中、
ｙは、カプセル化されたケルセチンの量に対応し（μｇ Ｑ／ｍｇ ＮＰ）、そして
ｘは、ケルセチンとゼインの初期の比率に対応する（ｍｇ ゼイン／ｍｇ ケルセチン）。

粒径および電位に関し、分析した異なるサンプル間で統計的に有意な差はみられなかった。

さらに、製剤中のリジンの量の多少が、ナノ粒子の物理化学的特性に与える影響を知ろうとする試みがなされ、そのため、この試験例では、初期のケルセチン含有量は一定にしたままで、加えるアミノ酸の量を変えて同じ試験を行った。

したがって、様々な量のリジン（０〜２０ｍｇ）を含む異なるゼイン溶液を調製した。製剤に加えられた上述のケルセチン溶液の量は、ケルセチン：ゼインの重量比が１：１１になるように、全ての試験例で３ｍＬであった。

第８表に、各試験例で得られた物理化学的特性を示す。

得られた結果は、ケルセチンの場合には、１０ｍｇよりも多い量を初期のゼイン溶液に加えると、カプセル化効率は、少量のリジンを含む製剤に対し、おおよそ２０％低下し、これはおそらく、この量のアミノ酸が、活性成分の部分的な酸化を誘発するという事実のためであろう。しかし、リジンを含まないサンプルと、約５ｍｇのリジンを製剤に含むサンプルとでカプセル化効率に統計学的に有意な差はみられなかった。したがって、この製剤を、乾燥試験を続けるための製剤に選択した。

実施例５
スプレー乾燥によって乾燥させた、ケルセチンを含むゼインナノ粒子の調製および特性決定
６０２ｍｇのゼインとともに、５１ｍｇのリジンを、８０ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）エタノールに溶解した。

これに加え、２５０ｍｇのケルセチンを５０ｍＬのエタノールに溶解し、次いで、この溶液２０ｍＬを集め、水で最終容積を３２ｍＬにして採取した。

次いで、この希釈したケルセチン溶液２０ｍＬをゼイン溶液に加え、混合物を５分間インキュベートした。その後、磁気撹拌しながら、一定流量で８０ｍＬの水をこの混合物に加えた。

最後に、この混合物に１，２０９ｍｇのマンニトールを加えた後、スプレー乾燥機によって乾燥させた。この方法の条件は、以下のとおりであった。
− 空気注入口温度：９０℃
− 空気排出口温度：４５℃
− 空気圧：６ｂａｒ［６×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
− アスピレーション：１００％
− 空気流：６００Ｌ／ｈ

第９表に、得られた製剤の物理化学的特性をまとめる。

ナノ粒子１ｍｇあたりカプセル化された量およびカプセル化効率は、スプレー乾燥によって変わらない。

図５に、ケルセチンを含むゼイン粒子の走査型電子顕微鏡によって得られた画像を示す。

アジュバントとしてマンニトールの代わりにマルトデキストリンを用いて同じ試験を行い、マルトデキストリンは、ナノ粒子をコーティングし、ナノ粒子の外側に残ったケルセチン部分をコーティングすることによってより作用するため、より大きなカプセル化効率を得た。

さらに、ナノ粒子を形成した後で、ナノ粒子をスプレー乾燥機に流す前に、高圧技術（５分間のサイクルで１５０ＭＰａ、５分間のサイクルで４００ＭＰａ、および５分間のサイクルで８００ＭＰａ）を施し、同じ実験を行った。得られたカプセル化の結果は、この処理をしないで得られたものと同様であった。

実施例６
葉酸を含むゼインナノ粒子の調製および特性決定
１２１ｍｇのゼインとともに、１８ｍｇのリジンを、１４ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）エタノールに溶解した。

これに加え、３０３ｍｇの葉酸とともに４０２ｍｇのリジンを５０ｍＬの水に溶解し、次いで、エタノールで半分に希釈した。

次いで、この希釈した葉酸溶液５ｍＬをゼイン溶液に加え、混合物を５分間インキュベートした。その後、混合物に０．６ｍＬのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート）を加え、混合物をさらに５分間インキュベートした。次いで、磁気撹拌しながら、一定流量で１５ｍＬの水を加え、ナノ粒子を形成した。

最後に、２５３ｍｇのラクトースを混合物に加えた後、スプレー乾燥機を用いて乾燥させた。この方法の条件は、以下のとおりであった。
− 空気注入口温度：１２５℃
− 空気排出口温度：９０℃
− 空気圧：６ｂａｒ［６×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
− アスピレーション：９０％
− 空気流：７５０Ｌ／ｈ

第１０表に、得られた製剤の物理化学的特性をまとめる。

さらに、葉酸を含む新しいゼインナノ粒子製剤を調製し、この場合には、界面活性剤を加える工程を省いた。このために、１，２７０ｍｇのゼインとともに２００ｍｇのリジンを、１４０ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）エタノールに溶解した。１２１ｍｇの葉酸および２００ｍｇのリジンを、２５ｍＬの水中に含む別の溶液をさらに調製し、その後、エタノールで半分に希釈した。

次いで、この希釈した葉酸溶液４３ｍＬをゼイン溶液に加え、混合物を５分間インキュベートした。その後、磁気撹拌しながら、一定流量で１５０ｍＬの水を加え、ナノ粒子を得た。

最後に、この混合物に２，４１５ｍｇのマンニトールを加えた後、スプレー乾燥技術を用いて乾燥させた。この方法の条件は、以下のとおりであった。
− 空気注入口温度：１２０℃
− 空気排出口温度：８０℃
− 空気圧：６ｂａｒ［６×１０^５Ｐａ］
− サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
− アスピレーション：９０％
− 空気流：７５０Ｌ／ｈ

第１１表に、得られた製剤の物理化学的特性をまとめる。

得られたナノ粒子は、容易に再懸濁し、界面活性剤を使用したときに得られたナノ粒子よりも粒径が小さい。

実施例７
ゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸の薬物動態試験
図１２に、薬物動態試験で調べたナノ粒子の主な物理化学的特性をまとめる。このナノ粒子は、実施例６の第２項（界面活性剤を用いない）に記載した方法にしたがって得た。

薬物動態試験を３つの段階に分けた。第１段階は、リン酸バッファに溶解した１ｍｇ／ｋｇの葉酸を静脈内投与することからなり、第２段階は、５匹の雄ウィスターラット群に対し、１ｍＬのリン酸バッファ（ＰＢＳ）をこのラットに経口投与することからなっていた（経時的なビタミンのベースライン濃度は、この群のラットで試験した）。最後に、第３段階は、１ｍｇ／ｋｇの（ｉ）水に溶解した葉酸、（ｉｉ）ゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸を、５匹の動物によって構成されたラット群に経口投与することからなっていた。

投与後、おおよそ５００μＬの血液を異なる時間（０、１、２、３、８および２４時間）に採取し、血清分離管に集めた後、その血液量と同量の生理食塩水を腹腔内経路によって動物に戻した。葉酸の投与後に得られたデータの薬物動態分析を、薬物動態フィットプログラム ＷｉＮＮｏｎｌｉｎ １．５（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マウンテンビュー、米国）のノンコンパートメンタルフィット法（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｆｉｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いて行った。

得られた結果（ベースライン濃度を差し引いた後）を図６に示す。これからわかるように、葉酸の静脈内投与（図６Ａ）は、第１のサンプリング中に血清薬物濃度のピークを示し、その後、血清薬物濃度の著しい低下を示している。ビタミンを経口投与したときに得られたプロフィール（図６Ｂ）は、より長い時間で観測される有意により低い濃度が現れており、より徐々に低下しているため、異なっている。しかし、葉酸を、遊離形態（カプセル化されていない）またはゼインナノ粒子内にカプセル化された形態で経口投与した後にみられるビタミン濃度を比較すると、時間経過に伴って同様の濃度プロフィールがみられているが、最大レベルおよび曲線の下の面積の双方は、ビタミンをカプセル化した形態で投与したときの方が大きかった。

第１３表に、この試験の実験データのノンコンパートメンタル分析を行った後の薬物動態パラメータの値を示す。

これからわかるように、ＡＵＣ値は、投与するサンプルの種類によって有意に変動する。ビタミンがゼインナノ粒子内にカプセル化されているとき、ＡＵＣ値は、遊離葉酸を投与した後にみられる値よりも有意に大きくなり、さらに、投与してから２４時間までにわたって維持されている。さらに、血漿中の葉酸の平均滞留時間（ＭＲＴ）も、遊離ビタミンを投与したときに得られる値よりも有意に大きいことが観測された。

これらの結果によって、カプセル化された葉酸を含むゼインナノ粒子の経口バイオアベイラビリティが計算され、その値は、葉酸を経口投与した後に得られる値よりも７０％〜９５％大きかった。

Claims (20)

1. ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸とを含んでなる、ナノ粒子。
2. 前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびこれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 生物学的に活性な化合物をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. 前記生物学的に活性な化合物が、脂溶性の生物学的に活性な化合物および水溶性の生物学的に活性な化合物から選択されるものである、請求項３に記載のナノ粒子。
5. 前記脂溶性の生物学的に活性な化合物が、
   （ａ）ポリフェノール；
   （ｂ）ビタミンＡ群、Ｄ群、Ｅ群またはＫ群のビタミン；
   （ｃ）（ｂ）のビタミンの前駆体または誘導体；
   （ｄ）リン脂質；
   （ｅ）カロチノイド；
   （ｆ）脂肪酸；
   （ｇ）植物スタノールまたは植物ステロール；
   （ｈ）上述の化合物（ａ）〜（ｇ）のいずれかの塩またはエステル；および
   （ｉ）これらの組み合わせ
   からなる群から選択されるものである、請求項４に記載のナノ粒子。
6. 前記脂溶性の生物学的に活性な化合物が、フラボノール、アントシアニン、フィトアレキシン、ヒドロキシチロソール、レチノイン酸、レチナール、レチノール、カルシフェロール、α−トコフェロール、トコトリエノール、フィトメナジオン、α−カロテン、β−カロテン、リコピン、カプサンシン、ルテイン、ゼアキサンチン、キサントフィル、ＥＰＡ、ＤＨＡ、リノール酸、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、これらの食品グレードの又は医薬的若しくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
7. 前記脂溶性の生物学的に活性な化合物が、ケルセチン、レスベラトロル、これらの食品グレードの又は医薬的若しくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物から選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
8. 前記水溶性の生物学的に活性な化合物が、：
   （ａ）Ｂ群またはＣ群のビタミン；
   （ｂ）（ａ）のビタミンの誘導体；
   （ｃ）ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチンおよびチオクト酸から選択される化合物；
   （ｄ）上述の化合物（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩またはエステル；並びに
   （ｅ）これらの組み合わせ
   からなる群から選択されるものである、請求項４に記載のナノ粒子。
9. 前記水溶性の生物学的に活性な化合物が、葉酸、その食品グレードの又は医薬的若しくは化粧品的に許容される誘導体、エステルまたは塩、およびこれらの混合物から選択されるものである、請求項８に記載のナノ粒子。
10. ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸とを含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
    （ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコールを調製する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の溶液に水を加える工程とを含んでなる、方法。
11. ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸と、脂溶性の生物学的に活性な化合物とを含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
    （ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を調製する工程と、
    （ｂ）脂溶性のＢＡＣを含んでなるアルコール溶液を調製し、この溶液を水で希釈し、脂溶性のＢＡＣを含んでなる含水アルコール溶液（ｉｉ）を得る工程と、
    （ｃ）前記ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）と、前記脂溶性のＢＡＣを含んでなる含水アルコール溶液（ｉｉ）とを混合する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物に水を加える工程とを含んでなる、
    方法。
12. ゼインマトリックスと、塩基性アミノ酸と、水溶性の生物学的に活性な化合物とを含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
    （ａ）ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）を調製する工程と、
    （ｂ）水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含んでなる水溶液を調製し、この水溶液をアルコールで希釈し、水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含んでなる含水アルコール溶液（ｉｉ）を得る工程と、
    （ｃ）前記ゼインおよび塩基性アミノ酸を含有する含水アルコール溶液（ｉ）と、前記水溶性のＢＡＣおよび場合により第２の塩基性アミノ酸を含んでなる含水アルコール溶液（ｉｉ）とを混合する工程と、
    （ｄ）場合により、工程（ｃ）で得られた混合物に界面活性剤を加える工程と、
    （ｅ）工程（ｃ）または工程（ｄ）で得られた混合物に水を加える工程とを含んでなる、
    方法。
13. 前記含水アルコール溶液が、エタノール水溶液である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. （ａ）作成したゼインナノ粒子を含有する懸濁物を、１００〜８００ＭＰａの間の圧力で、少なくとも１つの静水圧サイクルに付す工程と、
    （ｂ）所望な場合、作成したナノ粒子を含有する懸濁物を乾燥させる工程を含んでなり、この乾燥工程が、場合により、保護剤および／または酸化防止剤の存在下で行われることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ナノ粒子。
16. 少なくとも１種の請求項１〜９または１５のいずれか一項に記載のナノ粒子と、食品、医薬品または化粧品において許容される担体とを含んでなる、組成物。
17. 前記ナノ粒子の平均径が、１００〜４５０ｎｍの間に含まれ、好ましくは約２００ｎｍである、請求項１６に記載の組成物。
18. − １５重量％〜４５重量％のゼインと、
    − １重量％〜４重量％の塩基性アミノ酸と、
    − ０．５重量％〜５重量％のケルセチンまたはレスベラトロルと、
    − ４５重量％〜８０重量％の糖とを含んでなり、
    全ての比率が、当該組成物の合計重量に対する重量である、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. − １５重量％〜４５重量％のゼインと、
    − ４重量％〜１０重量％の塩基性アミノ酸と、
    − 場合により、０．０５重量％〜０．５重量％のポリソルベートと、
    − ０．５重量％〜５重量％の葉酸と、
    − ４５重量％〜８０重量％の糖とを含んでなり、
    全ての比率が、当該組成物の合計重量に対する重量である、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
20. 請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる食品。

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