CN116172115B - 通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过添加L‑Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，属于肉类加工技术领域；通过依次将L‑Lys和EGCG溶液加入到MP中，并通过加热诱导形成蛋白凝胶。经实验验证高剂量EGCG条件下L‑Lys通过静电相互作用和氢键与蛋白结合，占据了EGCG的结合位点，减弱了EGCG与MP之间的相互作用，抑制了过量EGCG导致的蛋白聚集，提高了蛋白的溶解度和蛋白分子之间的交联程度，从而形成连续的网络结构，凝胶的蒸煮损失减小，弹性和凝胶强度增加。本发明方法为改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性的损伤提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于肉类加工技术领域，具体涉及一种通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法。
背景技术
植物提取物中的酚类化合物如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和迷迭香酸由于具有较强的抗氧化性和安全性，常用作肉制品中的天然抗氧化剂。因此，肉类蛋白质与多酚的相互作用得到了广泛研究。
天然多酚对人体健康有益，在抗氧化、抗癌、心血管疾病等方面有重要作用。然而，与合成抗氧化剂相比，天然多酚往往需要高剂量才能达到预期的抗氧化效果。值得注意的是，多酚对肌原纤维蛋白（MP）凝胶特性有双重影响。有报道称，低剂量的多酚通过促进MP分子之间的疏水相互作用、二硫键和氢键增加了MP的凝胶强度，但是高剂量的多酚会导致蛋白质过度变性，从而产生大量聚集，破坏蛋白质之间的相互作用，导致形成品质较差的三维凝胶网络。因此，解决高剂量多酚对肉制品质量的不利影响具有重要的现实意义。
目前，多糖对MP-多酚相互作用的抑制已被广泛报道。例如公开文献：Inhibitionof Epigallocatechin-3-gallate/Protein Interaction by Methyl-β-cyclodextrin inMyofibrillar Protein Emulsion Gels under Oxidative Stress [J]. Yumeng Zhang,Yuanqi Lv, Lin Chen, Haizhou Wu, Yingyang Zhang, Zhiyao Suo, Shuxin Wang,Yuxin Liang, Xinglian Xu, Guanghong Zhou, Xianchao Feng. Journal ofAgricultural and Food Chemistry. 2018, 66, 8094-8103，其中公开了β-环糊精通过包埋EGCG以减少EGCG与MP之间的相互作用，防止了高剂量EGCG对MP结构的破坏和溶解度降低，从而提高了MP凝胶的质量。另一项研究：Improved effect of flaxseed gum on theweakened gelling properties of myofibrillar protein induced by catechin. NaJia, Shiwen Lin, Fengxue Zhang, Duoduo Zheng, Dengyong Liu. Food Chemistry.2022, 372, 131136，表明亚麻籽胶的加入提高了蛋白乳液的均匀稳定性和表观粘度，增强了二硫键交联和疏水相互作用，从而改善了经高剂量儿茶素处理的MP凝胶的保水性和强度。然而，β-环糊精和亚麻籽胶的溶解度较差，应用范围受一定的限制；并且它们可被水解为葡萄糖等单糖，从而增加糖的摄入，这对节食者或糖尿病患者等特殊人群有潜在的不利影响。因此，有必要探索其他抑制多酚与肉类蛋白质相互作用的方法。
L-Lys和谷氨酰胺转移酶对氧化损伤蛋白凝胶性能的修复已经被研究。例如公开文献：Synergistic recovery and enhancement of gelling properties ofoxidatively damaged myofibrillar protein by L-lysine and transglutaminase.Yungang Cao, Baoling Li, Xin Fan, Jiankang Wang, Zhenbao Zhu, Junrong Huang,Youling Xiong. Food Chemistry. 2021, 358, 129860，以及授权公布号为CN112167543B、发明名称为一种基于赖氨酸-谷氨酰胺转氨酶的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法的专利，公开了添加L-Lys促进了MP结构展开及内部疏水基团和巯基暴露，谷氨酰胺转移酶促进了蛋白之间的交联，从而显著提高了MP的溶解度和凝胶特性。然而，到目前为止，还没有文献报道通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的相关研究。
发明内容
本发明的目的是：克服现有技术中存在的问题，提供一种通过添加L-Lys改善EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，阐明了L-Lys与MP和EGCG相互作用的方式，L-Lys可以通过和蛋白发生静电和氢键相互作用，抑制了高剂量EGCG诱导的蛋白聚集，提高了蛋白溶解度，形成了较精细的凝胶网络结构，从而降低了蛋白凝胶的蒸煮损失并增加了蛋白凝胶的强度，为改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤提供了新方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，包括以下步骤：
S1、从猪肉中提取肌原纤维蛋白，猪肉部位为猪背部最长肌；
S2、将L-Lys和EGCG分别溶于磷酸盐缓冲液，配制成母液，其中L-Lys母液的浓度为250~255mM，EGCG母液的浓度为22~25mM；
S3、先将磷酸盐缓冲液添加到等质量的肌原纤维蛋白中，配制成肌原纤维蛋白溶液，再在肌原纤维蛋白溶液中加入配制好的L-Lys母液，混合均匀后得到肌原纤维蛋白-L-Lys混合溶液，最后加入配制好的EGCG母液，反应后得到肌原纤维蛋白样品；
S4、将上述步骤S3中反应得到的肌原纤维蛋白样品置于0~4℃的环境中，反应10~12h，再将肌原纤维蛋白样品转移到小烧杯中，水浴加热形成肌原纤维蛋白凝胶。
所述步骤S2中，所述磷酸盐缓冲液为20~25mM磷酸二氢钠和20~25mM磷酸氢二钠的混合溶液，含0.4~0.6M的NaCl，溶液pH值为6.5~6.8。
所述步骤S3中，反应后的肌原纤维蛋白样品中肌原纤维蛋白的终浓度为35~40mg/mL，L-Lys的终浓度为0~20mM，EGCG的终浓度为2mM即50µmol/g蛋白。
所述步骤S4中，水浴加热过程从室温加热到72~75℃，并在72~75℃的条件下保温10~12min。
所述步骤S4中，将制好的肌原纤维蛋白凝胶样品用冰水迅速冷却，后用注射器针头沿烧杯内壁轻轻刮至凝胶脱离杯壁，杯口朝下倾斜置于0~4℃下过夜储存20~24h，除去蒸煮过程中损失的水分，使凝胶达到平衡状态后改善蛋白凝胶特性损伤。
本发明的有益效果是：
1）本发明方法中验证了L-Lys对高剂量EGCG造成的肉蛋白凝胶特性损伤的改善作用，得到L-Lys与MP和EGCG相互作用的方式，并为保证MP凝胶性能前提下增加多酚的添加量提供了新方法，为在高剂量EGCG存在时肉蛋白凝胶特性的改进提供了策略。
2）本发明的实验验证了高剂量EGCG存在时，添加L-Lys可以通过其和蛋白发生的相互作用以抑制过量EGCG诱导的蛋白聚集，从而提高了蛋白溶解度，形成了较精细的凝胶网络结构，降低了蛋白凝胶的蒸煮损失并增加了蛋白凝胶的强度。
3）本发明中L-Lys与MP和EGCG相互作用的方式包括：（1）带正电荷的L-Lys容易与带负电荷的蛋白质发生静电相互作用；（2）L-Lys可通过氢键与蛋白质结合，由于L-Lys占据了EGCG的结合位点，以及L-Lys的空间位阻作用，减弱EGCG与MP之间的相互作用。
附图说明
图1为本发明制备的肌原纤维蛋白凝胶的外形图；
图2为本发明测定的肌原纤维蛋白凝胶的蒸煮损失图；
图3为本发明测定的肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度图；
图4为本发明测定的肌原纤维蛋白的流变学特性图；
图5为本发明测定的肌原纤维蛋白的溶解度变化图；
图6为本发明测定的肌原纤维蛋白凝胶的微观结构图；
图7为本发明测定的肌原纤维蛋白的电位图；
图8为本发明进行的分子对接图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例：如图1-8所示，本发明提供通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，包括以下步骤：
S1、从猪肉中提取肌原纤维蛋白，猪肉部位为猪背部最长肌；
S2、将L-Lys和EGCG分别溶于磷酸盐缓冲液，配制成母液，其中L-Lys母液的浓度为250mM，EGCG母液的浓度为22mM；
S3、先将磷酸盐缓冲液添加到等质量的肌原纤维蛋白中，配制成肌原纤维蛋白溶液，其中磷酸盐缓冲液为20mM磷酸二氢钠和20mM磷酸氢二钠的混合溶液，含0.6M的NaCl，溶液pH值为6.8；再在肌原纤维蛋白溶液中加入配制好的L-Lys母液，混合均匀后得到肌原纤维蛋白-L-Lys混合溶液，最后加入配制好的EGCG母液，反应后得到肌原纤维蛋白样品；反应后的肌原纤维蛋白样品中肌原纤维蛋白的终浓度为40mg/mL，L-Lys的终浓度为0~20mM，EGCG的终浓度为2mM即50µmol/g蛋白；
S4、将上述步骤S3中反应得到的肌原纤维蛋白样品置于0~4℃的环境中，反应10~12h，再将肌原纤维蛋白样品转移到小烧杯中，水浴加热从室温25℃加热到72℃，并保温10min制得肌原纤维蛋白凝胶。制备好的凝胶迅速冷却至室温后于4℃下过夜储存20h，用于以下测定试验。
1、肌原纤维蛋白凝胶的蒸煮损失和凝胶强度测定试验：
如图1所示，可以看出，与对照组的凝胶相比，添加50µmol/g的EGCG由于破坏了凝胶网络结构的形成，使MP凝胶的体积变小。而进一步添加L-Lys后，凝胶的体积随着L-Lys浓度的增大而增大，这表明L-Lys改善了MP凝胶的结构，降低了EGCG对凝胶品质和保水性的破坏。此外，20mM的L-Lys时凝胶颜色呈浅棕色，颜色的变化是因为L-Lys和EGCG发生反应。
如图2所示，可以看出，与对照组凝胶的蒸煮损失相比，50µmol/g的EGCG使MP凝胶的蒸煮损失增加了46.08%，而进一步添加5、10、20mM的L-Lys分别使MP凝胶的蒸煮损失降低了7.12%，12.21%，21.18%，这说明L-Lys可以降低高剂量EGCG导致的蒸煮损失。这是由于L-Lys和MP通过氢键和静电相互作用结合后抑制了过量EGCG导致的MP之间的聚集，提高了MP的亲水性，增强了MP和水的相互作用。
如图3所示，可以看出，与对照组凝胶的凝胶强度相比，50µmol/g的EGCG使凝胶强度降低了68.2%，而进一步添加20mM的L-Lys使凝胶强度升高了90.14%，这说明L-Lys减弱了MP和EGCG的相互作用，抑制了EGCG导致的MP之间的聚集，降低了EGCG对MP凝胶的强度的破坏程度。
2、肌原纤维蛋白的流变学特性测定试验：
采用配备40mm平行板的流变仪测定MP样品的弹性，平板间距为1000μm，频率为0.1Hz，应变为2%。将肌原纤维蛋白凝胶样品以5℃/min的加热速率从25℃加热至80℃，根据储能模量分析弹性。
储能模量可以反映弹性，弹性一般与凝胶性能呈正相关。如图4所示，可以看出，储能模量的变化与凝胶强度的变化一致，与对照组的储能模量相比，50µmol/g的EGCG使MP的储能模量显著降低，说明高剂量EGCG减弱了MP的弹性。而进一步添加L-Lys使储能模量升高。这说明L-Lys的添加可以改善高剂量EGCG对MP弹性的损伤，从而改善MP的凝胶性能。
3、肌原纤维蛋白的溶解度测定试验：
将样品稀释到2mg/mL，5000g离心10min，用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白浓度，计算得到MP样品的溶解度。
一般来说，溶解度越高，蛋白分子间的交联程度越高，凝胶性能越好。如图5所示，可以看出，与对照组的溶解度相比，50µmol/g的EGCG使溶解度降低了70.13%，说明高剂量EGCG导致蛋白变性和聚集，从而使溶解度降低，而进一步添加L-Lys使溶解度升高86.96%。这说明高剂量EGCG时，L-Lys优先与MP相互作用，阻碍了MP和EGCG之间的相互作用，抑制了过量EGCG导致的MP聚集，从而使溶解度升高，有利于提高其凝胶性能。
4、肌原纤维蛋白凝胶的微观结构测定试验：
使用扫描电子显微镜对MP凝胶的微观结构进行观察和成像。MP凝胶切成小块（5×5×5mm），在2.5%戊二醛中固定3天。用0.1M的PBS洗涤4次，然后用不同浓度的乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%）进行梯度脱水，在无水乙醇中浸泡30min后用超临界二氧化碳干燥。最后对干燥后的样品喷金以进行观察。
凝胶网络结构的形态是决定凝胶性能的重要因素，具有均匀致密的网络结构的凝胶通常呈现较好的凝胶性能，而具有孔径大、不连续的网络结构的凝胶一般呈现出较差的凝胶性能。如图6所示，对照组蛋白凝胶呈现出规则致密的三维网络结构，50µmol/g的EGCG使蛋白凝胶呈现出了聚集体和粗糙的网络结构。而进一步添加5mM和10mM的L-Lys使团聚体数量减少，孔径减小，20mM的L-Lys使团聚体数量明显减少，呈现连续致密的网络结构。这说明20mM的L-Lys可以通过抑制聚集体形成而改善了高剂量EGCG条件下MP凝胶的三维网络结构，从而提高MP的凝胶特性。
5、肌原纤维蛋白的电位测定：
如图7所示，与对照相比，50µmol/g的EGCG使电位绝对值减小，这是由于过量EGCG导致蛋白聚集，从而掩蔽了电荷。进一步添加L-Lys使电位绝对值继续减小，这是由于L-Lys的阳离子可以与MP中带负电荷的氨基酸发生静电相互作用，而L-Lys与蛋白结合后，增强了MP表面的亲水性，增加了MP的溶解度，从而有利于改善凝胶特性。
6、肌球蛋白与EGCG和L-Lys的分子对接试验：
从蛋白数据库（Protein Date Bank，PDB）获取肌球蛋白分子结构（PDB ID:2V26），从Pubchem数据库获取EGCG（Compound CID: 65064）和L-Lys（Compound CID: 5962）的分子结构，然后用Sybyl-X 2.0软件进行分子对接，对接结果的总分用于分析MP和EGCG、MP和L-Lys以及MP-L-Lys和EGCG的结合能力。进一步通过Discovery Studio 2019软件得到分子对接结果的二维图像。
如图8所示，MP与EGCG主要通过氢键和疏水相互作用结合，而MP与L-Lys之间主要通过氢键结合，MP与并且L-Lys和EGCG与肌球蛋白有三个相同的结合位点：Asn92、Lys133和Ser664，表明L-Lys会与EGCG竞争结合位点，从而抑制MP和EGCG的结合。此外，通过将MP-L-Lys复合物与EGCG对接，发现EGCG不能与MP-L-Lys复合物对接，对接总分为负值。而单独的肌球蛋白可以不断与EGCG结合。这说明L-Lys可以优先与蛋白结合，从而抑制EGCG和蛋白的结合。
经上述试验验证证明以本发明方法制备得到的肌原纤维蛋白凝胶样品，添加L-Lys可以通过和蛋白发生的静电和氢键相互作用以抑制高剂量EGCG诱导的蛋白聚集，从而提高了蛋白溶解度，形成了较精细的凝胶网络结构，降低了蛋白凝胶的蒸煮损失并增加了蛋白凝胶的强度。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、从猪肉中提取肌原纤维蛋白，猪肉部位为猪背部最长肌；
S2、将L-Lys和EGCG分别溶于磷酸盐缓冲液，配制成母液，其中L-Lys母液的浓度为250~255mM，EGCG母液的浓度为22~25mM；
S3、先将磷酸盐缓冲液添加到等质量的肌原纤维蛋白中，配制成肌原纤维蛋白溶液，再在肌原纤维蛋白溶液中加入配制好的L-Lys母液，混合均匀后得到肌原纤维蛋白-L-Lys混合溶液，最后加入配制好的EGCG母液，反应后得到肌原纤维蛋白样品；
S4、将上述步骤S3中反应得到的肌原纤维蛋白样品置于0~4℃的环境中，反应10~12h，再将肌原纤维蛋白样品转移到小烧杯中，水浴加热形成肌原纤维蛋白凝胶；
反应后的肌原纤维蛋白样品中肌原纤维蛋白的终浓度为40mg/mL ，L-Lys的终浓度为20mM，EGCG的终浓度为2mM即50µmol/g蛋白。
2.根据权利要求1所述的通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述磷酸盐缓冲液为20~25mM磷酸二氢钠和20~25mM磷酸氢二钠的混合溶液，含0.4~0.6M的NaCl，溶液pH值为6.5~6.8。
3.根据权利要求1所述的通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，其特征在于：所述步骤S4中，水浴加热过程从室温加热到72~75℃，并在72~75℃的条件下保温10~12min。
4.根据权利要求1所述的通过添加L-Lys改善高剂量EGCG对肉蛋白凝胶特性损伤的方法，其特征在于：所述步骤S4中，将制好的肌原纤维蛋白凝胶样品用冰水迅速冷却，后用注射器针头沿烧杯内壁轻轻刮至凝胶脱离杯壁，杯口朝下倾斜置于0~4℃下过夜储存20~24h，除去蒸煮过程中损失的水分，使凝胶达到平衡状态后改善蛋白凝胶特性损伤。
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