KR20200003827A

KR20200003827A - 장 투과성-관련 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20200003827A
Application number: KR1020197033206A
Authority: KR
Inventors: 마리아 레씨그노; 알레산드로 산니노; 이새 조하르; 엘렌 치켓; 알레산드라 실베스트리; 크리스티안 드미트리
Original assignee: 젤레시스 엘엘씨
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-01-10
Also published as: JP2020516629A; US20180333428A1; CN110740746A; US20200330502A1; US10695363B2; WO2018191752A1; EP3609525A1; RU2019135203A; BR112019021370A2; CA3059445A1; JP2023071765A; MX2019012086A; RU2019135203A3; EP3609525A4; AU2018251210A1

Abstract

탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa인 하이드로겔을 치료학적 유효량으로 필요한 개체의 위장관에 투여하는 것을 포함하는, 장 투과성-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

장 투과성-관련 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법

인간의 위장 (GI) 관은 위와 장을 지칭하며, 종종 입에서 항문까지의 모든 구조를 지칭한다. 상부 위장관은 식도, 위 및 십이지장으로 구성된다. 또한, 일부 자료에서는 구강과 인두도 포함된다. "상부"와 "하부"의 정확한 경계는 달라질 수 있다. 전체 해부시, 십이지장은 단일 기관인 것으로 보일 수 있지만, 대개는 기능에 따라 동맥을 공급하는 부위 또는 발생 (embryology) 부위 2가지로 나뉜다. GI 관에 통합된 부위는 GI 관의 보조 장기로 지칭된 췌장과 간이다.

하부 위장관은 소장 대부분과 대장 전체를 포함한다. 일부 자료에 따라서는, 항문도 포함된다. 장- 또는 창자-는 소장과 대장으로 나뉜다. 소장은 3가지 부위가 있다: i) 췌장과 간에서 나온 소화액이 혼합되는 곳인 십이지장, ii) 십이지장에서 회장까지 이어지는, 장의 중간 부분인 공장, iii) 소형 수용성 분자를 혈액으로 흡수하는 융모가 있는 회장. 대장 역시 3가지 부위를 가지고 있다: i) 막창자 꼬리가 붙어있는 맹장, ii) 상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장 및 S자 결장으로 이루어진, 결장, 및 iii) 직장.

장은 주된 역할 2가지를 담당한다: 영양분 소화와 흡수, 그리고 외부 환경에 대한 장벽 유지. 또한, 장은 체내 가장 큰 내분비 기관일 뿐 아니라 면역 시스템에서 가장 크고 가장 복잡한 부위이다. 성인의 경우, 장 표면적은 약 100 m²로 넓다. 이 면적이 식품 성분, 정상적인 장내 미생물총 및 병원체 형태의 여러가지 항원에 계속적으로 노출되는 것이다.

본원에서 "장 조직"으로 언급되는 장 점막 표면은, 음와 (crypt) 내 비-분화된 세포의 복제에 의해 계속적으로 빠르게 (7x10⁶세포/분) 대체되는 상피 세포 (IEC) 단일층이 라이닝되어 있다. 이 장 점막의 상피 세포 층은 매우 복잡하고, 독특하다. 이는 식품을 소화하기 위해 선단부 (apical part)에서부터 내강까지 소화 효소를 분비한다. 또한, 1/2 지점부터 고유층 (LP)까지는 여러가지 단백질들을 분비한다. 나아가, 상피 세포는 내강 (신호를 수신한 다음 정보를 LP 내 다양한 세포 집단에 전달함)과 기저측부측 둘다로부터 신호를 수신한다. 장 상피 세포 (IEC)는 기저측부측에서 다양한 면역 세포, 신경 세포 및 기질 세포로부터 많은 신호들을 수신한다. 양 측면 상의 신호는 각각의 미세환경에 의해 영향을 받아, 위장관의 온전성 (integrity) 및 항상성을 형성하는 장 세포의 기능적 상태, 거동 및 구조에 영향을 미치게 된다.

상피 장벽의 보호는 상피 세포를 봉인하는 밀착 정션 (tight junction, TJ) 및 어드헤렌스 정션 (adherens junction, AJ)으로 구성된 정션 복합체에 의해, 그리고 점액 생산에 의해 보장된다. 술잔세포 (goblet cell)로 지칭되는 특수 상피 세포에 의해서도 또한 만들어지는 점액은 섭취된 음식물, 미생물 및 박테리아 산물에 의한 물리적 및 화학적 상해를 방어하는 제1 선이다. 술잔세포를 비롯한 GI 관의 어느 부위가 손상되면 장 장벽이 손상되면, 내강의 내용물들이 장벽 안으로 유입되어 GI 관의 염증 등의 만성 염증이 개시될 수 있다. 장 투과성-관련 질환 및 장애를 예방 및 치료하기 위한 새로운 조성물 및 방법이 요구되고 있다.

위장 염증을 비롯하여 장 투과성-관련 질환 및 장애를 예방 및 치료하기 위한 조성물, 및 필요한 개체의 위장관에 하이드로겔, 바람직하게는, 본원에 정의된 바와 같이 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa, 바람직하게는, 약 500 Pa 내지 약 8,000 Pa, 더 바람직하게 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 하이드로겔을 항상성의 치료학적 유효량 (therapeutically and homeostatic effective amount)으로 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 첨부된 이건 특허 또는 특허 출원 공개공보의 복사본은 요청서와 필요한 비용 제출시 사무국으로부터 제공받을 수 있을 것이다.
도 1은 점액 가시화를 위해 Alcian Blue-PAS로 염색한 대조군 마우스 및 하이드로겔 처리 마우스의 공장 염색 사진이다.
도 2는 점액 가시화를 위해 Alcian Blue-PAS로 염색한 대조군 마우스 및 하이드로겔 처리 마우스의 회장 염색 사진이다.
도 3은 점액 가시화를 위해 Alcian Blue-PAS로 염색한 대조군 마우스 및 하이드로겔 처리 마우스의 맹장 염색 사진이다.
도 4는 점액 가시화를 위해 Alcian Blue-PAS로 염색한 대조군 마우스 및 하이드로겔 처리 마우스의 결장 염색 사진이다.
도 5는 정션의 ZO-1 (ZO-1, 밀접 정션의 구성성분, 적색; CD34, 장 혈관 마커, 청색, 및 DAPI 핵 마커, 청록색)을 염색한 대조군 동물 (하이드로겔 비-섭취)의 결장 염색 사진이다.
도 6은 정션의 ZO-1을 염색한, 5% Gel B 처리 동물의 결장 사진이다.
도 7은 8% Gel B로 처리된 동물 및 대조군 동물의 결장 염색 사진이다.
도 8은 대조군 동물의 회장 염색 결과를 보여주는 사진이다 (ZO-1, 밀접 정션의 구성성분, 적색; CD34, 장 혈관 마커, 청색, 및 DAPI 핵 마커, 청록색).
도 9는 2% Gel B로 처리된 동물의 회장 염색 사진이다.
도 10은 4% Gel B로 처리된 동물의 회장 염색 사진이다.
도 11은 6% Gel B 처리된 동물의 회장 염색 사진이다.
도 12는 8% Gel B 처리된 동물의 회장 염색 사진이다.
도 13은 점액 가시화를 위해 Alcian Blue-PAS로 염색한, 배지, PBS, Gel B-01, Gel B-02, Gel B-03 또는 Gel B-04가 처리된 인간 결장 조직 샘플을 나타낸 사진이다.
도 14는 사료 식이 (Chow), Gel B-02 2% 보충 식이 및 GelB-02 4% 보충 식이를 먹은 마우스의 체중 변동 %를 나타낸 그래프이다; n=5 /그룹 (***P<0.01, 2원식 ANOVA에 의해 계산됨).
도 15는 사료 식이, Gel B-02 2% 보충 식이 및 Gel B-02 4% 보충 식이를 먹은 마우스의 9일째 결장 길이 (cm)를 나타낸 것이다; n=5 /그룹 (*P<0.05; ***P<0.01 일원식 ANOVA에 의해 계산함).
도 16은 여러가지 탄성 수준의 다양한 CMC/CA 하이드로겔과 함께 인큐베이션한 마우스 결장 조직 단편을 점액 가시화를 위해 염색한 (Alcian Blue/PAS 및 Ki67 IHC) 사진이다.
도 17은 여러가지 탄성 수준의 다양한 CMC/CA 하이드로겔 또는 CMC/CA 하이드로겔과 비슷한 탄성을 가진 CMC/PEGDE 하이드로겔과 함께 인큐베이션한 마우스 결장 조직 단편을 염색한 사진이다.
도 18은 여러가지 탄성 수준의 다양한 CMC/CA 하이드로겔 또는 CMC/CA 하이드로겔과 비슷한 탄성을 가진 PEGDA 하이드로겔과 함께 인큐베이션한 마우스 결장 조직 단편을 염색한 사진이다.
도 19는 여러가지 탄성 수준의 다양한 비-가교 섬유와 함께 인큐베이션한 마우스 결장 조직 단편을 염색한 사진이다.

본원에서, 단수 형태 "a", "and", 및 "the"는 명시적으로 달리 언급되지 않은 한 복수도 포함한다. 즉, 예를 들어 "바이오마커"는 복수의 바이오마커를 내포한다.

본 발명의 목적에서, "위장관" 또는 "GI 관"은 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장), 대장 (맹장, 결장, 직장) 및 항문을 포괄하는 것으로 이해된다. 하부 위장관은 소장 대부분과 대장 전체를 포함한다. 일부 자료에 따르면, 이는 항문도 포함한다. "장"은 소장과 대장으로 나뉜다. 소장은 3부분으로 구성된다: i) 췌장과 간에서 나온 소화액이 함께 혼합되는 곳인 십이지장, ii) 십이지장에서 회장까지 이어지는, 장의 중간 부분인 공장, iii) 소형 수용성 분자들이 모두 혈액으로 흡수되는 융모가 있는 회장. 대장 역시 3부분으로 구성된다: i) 막창자 꼬리가 붙어있는 맹장, ii) 상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장 및 S자 결장으로 이루어진, 결장, 및 iii) 직장. 본원에서, 위장관에 라이닝된 조직은 "장 조직", "점막 표면", "점막 조직" 또는 "점막"으로 언급될 수 있다.

용어 "장 투과성-관련 질환 또는 장애"는 정상적인 투과성과 비교해 증가되어 장 항상성의 상실, 기능적 손상 및 질환으로 이어지는, 장 투과성 교란과 관련된 질환 또는 장애를 지칭한다. 개체는 공지된 장 투과성 분석 및/또는 부착 분자, 면역 또는 염증의 바이오마커, 또는 내독소와 같은 박테리아 마커 등의, 상피 온전성에 대한 마커 분석을 이용하여, 개체의 장 투과성을 특정함으로써, 장 투과성 교란을 앓고 있는 개체로 동정될 수 있다 (Bischoff et al., BC Gastroenterology 2014, 14:189). 또한, 개체는 본원에 기술된 바와 같이 장 투과성-관련 질환 또는 장애를 가진 개체 진단시 장 투과성 교란을 앓고 있는 것으로 동정될 수도 있다.

본원에서, "치료학적 유효량", 또는 "유효량", 또는 "치료학적으로 유효한"은 주어진 병태 및 투약 용법에서 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미하며; 예를 들어, 건강한 장 상피 조직을 유지하거나, 예를 들어, 장 투과성-관련 질환 또는 약물의 부작용으로 인한 건강한 장 상피 조직의 손상을 방지하거나, 장 조직을 복구 및 재생하거나, 및/또는 장 투과성-관련 질환 또는 장애의 GI 관 염증과 같은 병증, 신호 또는 증상을 경감하는데 충분한 양을 의미한다. 이는, 필수 첨가제 및 희석제, 즉 담체 또는 투여 비히클과 조합하여, 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 활성 물질의 사전 결정된 양이다. 나아가, 환자의 활동, 기능 및 반응에 임상적으로 유의한 결함을 경감하거나 또는 예방하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료학적 유효량은 환자에서 임상적으로 유의한 병태의 개선을 유발하는데 충분하다. 당해 기술 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 이의 구체적인 활성에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 함량은 필수 희석제와 조합하여 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 사전 결정된 양의 활성 조성물을 포함할 수 있다.

"개체" 또는 "환자"는 인간, 영장류, 인간을 제외한 영장류, 실험 동물, 농장 동물, 가축 또는 애완 동물을 지칭한다.

용어 "치료한다" 또는 "치료"는 질환, 병리학적 증상 또는 장애를 치유, 완화, 안정화 또는 예방하기 위한 의도의 환자에 대한 의학적 조처를 의미한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 개선을 구체적으로 지향하는 치료를 포함하며, 또한 원인 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 원인 제거를 지향하는 치료를 포함한다. 또한, 이 용어는 고식적 치료 (palliative treatment), 즉 질환, 병리학적 증상 또는 장애를 치유하기보다는 증상 완화 목적으로 설계된 치료; 예방 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 발병을 최소화하거나 또는 부분적으로 또는 완전히 억제하는 치료; 지지적 치료 (supportive treatment), 즉 관련 질환, 병리학적 증상 또는 장애를 개선하고자 하는 다른 특정 요법을 보조하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.

본원에서, "하이드로겔"은 상대적인 큰 부피의 수용액을 보유할 수 있는 친수성 폴리머 또는 2종 이상의 친수성 폴리머의 조합이다. 하이드로겔은 선형 또는 분지형의 폴리머, 또는 선형 및 분지형 폴리머의 혼합물, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% (w/w) 선형 대 분지형의 혼합물일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 친수성 폴리머 또는 폴리머들은 예를 들어 물리적, 이온성 또는 공유적 가교를 통해 가교된다. 하이드로겔은 하이드로겔의 원하는 물성에 따라 다양한 가교 정도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 하이드로겔은 본 발명에 따른 장 투과성-관련 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위해 최적화된 탄성 특징을 가진다. 본 발명의 방법에 사용되는 하이드로겔의 탄성 특성은 가교 정도, 가교제의 타입, 분자량 및 백본의 구조 등의 이의 거대분자 구조와 관련있다. 바람직하게는, 하이드로겔은 가소제를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법에 사용가능한 적절한 하이드로겔은 미국 특허 9,353,191, 미국 특허 8,658,147, 미국 특허 공개공보 2016/0222134 및 미국 출원번호 15/944,960에 기술된 것을 포함하며, 이들 문헌의 각 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본원에서, 용어 "친수성 폴리머"는 실질적으로 수용성인 폴리머를 지칭하며, 바람직하게는, 하이드록시화된 모노머 유닛을 포함한다. 친수성 폴리머는 오직 한가지 반복 모노머 유닛을 가진 호모폴리머 또는 2종 이상의 서로 다른 반복 모노머 유닛을 포함하는 코폴리머일 수 있다. 특정 구현예에서, 친수성 폴리머는 부가 폴리머 (addition polymer) 또는 축합 폴리머 (condensation polymer)이다. 친수성 폴리머의 반복 유닛 중 일부 또는 그 전체는 극성 관능기, 예를 들어, 산성, 염기성 또는 중성의 친수성 관능기, 예를 들어, 하이드록시; 카르복실; 설포네이트, 포스포네이트; 구아니딘; 아만딘; 1차, 2차 또는 3차 아미노; 또는 4급 암모늄을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 친수성 폴리머는 폴리알릴 알코올, 폴리비닐 알코올 또는 다당류와 같이 하이드록시화된다. 적합한 다당류의 예로는 치환된 셀룰로스 등의 변형된 셀룰로스, 치환된 덱스트란, 전분 및 치환된 전분, 글리코스아미노글리칸, 키토산 및 알기네이트 등이 있다.

특정 구현예에서, 하이드로겔은, 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드와 같이, 중성 모노머를 가진 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 가교된 코폴리머, 가교된 폴리메타크릴레이트 또는 가교된 폴리아크릴레이트 등의 가교된 부가 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리머 및 코폴리머는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용해 가교될 수 있다. 특정 구현예에서, 하이드로겔은 폴리에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트 (PEGDA)를 포함한다. 바람직하게는, PEGDA의 평균 분자량은 약 250 Da 내지 약 20,000 Da 범위이다. 바람직하게는, PEGDA의 평균 분자량은 250 Da, 575 Da, 700 Da, 750 Da, 1000 Da, 2000 Da, 6,000 Da, 10,000 Da 또는 20,000 Da이다.

본 발명의 하이드로겔에 사용될 수 있는 다당류로는 셀룰로스 에스테르 및 셀룰로스 에테르와 같은 변형된 셀룰로스를 포함한다. 셀룰로스 에스테르로는 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트 및 셀룰로스 아세테이트 부티레이트 등이 있다. 셀룰로스 에테르로는 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 및 n-프로필셀룰로스를 비롯하여, C₁-C₆-알킬셀룰로스와 같은 알킬셀룰로스; 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시-n-프로필셀룰로스, 하이드록시-n-부틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸하이드록시에틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스와 같이, 하이드록시-C₁-C₆-알킬셀룰로스 및 하이드록시-C₁-C₆-알킬-C₁-C₆-알킬셀룰로스 등의 치환된 알킬셀룰로스; 전분 및 치환된 전분, 예를 들어 옥수수 전분, 하이드록시프로필스타치 및 카르복시메틸스타치; 치환된 덱스트란, 예를 들어 덱스트란 설페이트, 덱스트란 포스페이트 및 다이에틸아미노덱스트란; 글리코스아미노글리칸, 예를 들어 헤파린, 히알루로난, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트; 및 폴리우론산, 예를 들어 폴리글루쿠론산, 폴리마누론산, 폴리갈락투론산 및 폴리아라빈산 등이 있다.

본원에서, 용어 "이온성 폴리머"는 카르복실, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트 또는 포스포네이트 기와 같은 산성 관능기, 또는 아미노, 치환된 아미노 또는 구아니딜 기와 같은 염기성 관능기를 가진 모노머 유닛을 포함하는 폴리머를 지칭한다. 적절한 pH 범위의 수용액 내에 존재할 경우, 산성 관능기를 포함하는 이온성 폴리머는 폴리음이온 (polyanion)일 것이며, 이러한 폴리머는 "음이온성 폴리머"로 본원에 언급된다. 마찬가지로, 적절한 pH 범위의 수용액 내에서, 염기성 관능기를 포함하는 이온성 폴리머는 폴리양이온일 것이다. 이러한 폴리머는 본원에서 "양이온성 폴리머"로 언급된다. 본원에서, 용어 이온성 폴리머, 양이온성 폴리머 및 음이온성 폴리머는 산성 또는 염기성 관능기가 하전되지 않은 친수성 폴리머뿐 아니라, 산성 또는 염기성 관능기 중 일부 또는 그 전부가 하전되어, 적절한 반대이온과 조합된, 폴리머를 지칭한다. 적합한 음이온성 폴리머로는 알기네이트, 덱스트란 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스, 히알루론산, 폴리글루쿠론산, 폴리마누론산, 폴리갈락투론산, 폴리아라빈산; 콘드로이틴 설페이트 및 덱스트란 포스페이트 등이 있다. 적합한 양이온성 폴리머로는 키토산 및 다이메틸아미노덱스트란 등이 있다. 바람직한 이온성 폴리머는 카르복시메틸셀룰로스이며, 이는 소듐 또는 포타슘과 같은 적절한 양이온을 가진 염으로서 또는 산성 형태로 사용될 수 있다.

본원에서, 용어 "비-이온성 폴리머"는 산성 또는 염기성 기와 같은 이온화가능한 관능기를 가진 모노머 유닛을 포함하지 않는 친수성 폴리머를 지칭한다. 이러한 폴리머는 수용액 내에서 비-하전될 것이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 비-이온성 폴리머의 예로는 폴리알릴알코올, 폴리비닐알코올, 전분 및 치환된 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 하이드록시프로필스타치, 만난, 글루코만난, 아세만난 (acemannan), 알킬셀룰로스, 예로 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 및 n-프로필셀룰로스 등의 C₁-C₆-알킬셀룰로스; 치환된 알킬셀룰로스, 예로 하이드록시에틸셀룰로스 (HEC), 하이드록시-n-프로필셀룰로스, 하이드록시-n-부틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 및 에틸하이드록시에틸셀룰로스와 같은 하이드록시-C₁-C₆-알킬셀룰로스 및 하이드록시-C₁-C₆-알킬-C₁-C₆-알킬셀룰로스가 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 하이드로겔은 가교된다. 가교는 공유 가교 또는 비-공유 가교를 통해 달성될 수 있다. 공유 가교는 2관능성 가교성 물질 (본원에서, 2관능성 "가교제"로도 지칭됨)을 이용해 달성되거나, 또는 2종의 서로 다른 폴리머 가닥 상의 관능기들의 직접 반응에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 전형적인 공유 가교제로는, 예를 들어, 다이글리시딜 에테르, 치환된 및 비-치환된 다이-N-하이드록시 숙신이미드 (NHS), 다이이소시아네이트, 이산 (diacid), 다이에스테르, 이산 (diacid) 클로라이드, 다이말레이미드, 다이아크릴레이트 등과 같은 반응성 관능기를 가진, 동형의 2관능성 (homobifunctional) 가교제 등이 있다. 이형 2관능성 가교제도 사용될 수 있다. 이형 2관능성 가교제는 통상적으로 가교, 예를 들어, NHS 및 말레이미드, 산 및 에스테르 등의 조합을 달성하기 위해 서로 다른 반응성 관능기를 가진 분자를 포함한다. 또한, 공유 가교는 친수성 폴리머의 방사선 조사에 의해, 또는 친수성 폴리머의 조합에 의해, 예를 들어, X선 또는 전자 빔을 처리하여 달성될 수 있다.

예를 들어, 이온성 결합, 수소 결합, 소수성 상호작용 및 기타 분자내 결합에 기반한 비-공유 가교 역시 본 발명의 실시에 사용하는 것으로 고려된다.

본 발명의 바람직한 하이드로겔은 폴리카르복시산과 같은 가교제를 이용해 가교된다. 본원에서, 용어 "폴리카르복시산"은 다이카르복시산, 트리카르복시산 및 테트라카르복시산과 같이 카르복시산 관능기를 2 이상 가진 유기산을 지칭하며, 또한 상기한 유기산의 무수물 형태도 포함한다. 다이카르복시산으로는 옥살산, 말론산, 말레산, 말산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, o-프탈산, 이소프탈산, m-프탈산 및 테레프탈산 등이 있다. 바람직한 다이카르복시산으로는 C₄-C₁₂-다이카르복시산 등이 있다. 적합한 트리카르복시산으로는 구연산, 이소-구연산, 아코니트산 및 프로판-1,2,3-트리카르복시산 등이 있다. 적합한 테트라카르복시산으로는 피로멜리트산, 2,3,3',4'-바이페닐테트라카르복시산, 3,3',4,4'-테트라카르복시다이페닐에테르, 2,3',3,4'-테트라카르복시다이페닐에테르, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복시산, 2,3,6,7-테트라카르복시나프탈렌, 1,4,5,7-테트라카르복시나프탈렌, 1,4,5,6-테트라카르복시나프탈렌, 3,3',4,4'-테트라카르복시다이페닐메탄, 2,2-비스(3,4-다이카르복시페닐)프로판, 부탄테트라카르복시산 및 사이클로펜탄테트라카르복시산 등이 있다. 특히 바람직한 폴리카르복시산은 구연산이다.

바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔은 공유적으로 가교된다. 바람직하게는, 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정하였을 때 적어도 500 Pa의 탄성 계수 (G')를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 700 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 800 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 1000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 1500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 2000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 3000 Pa 적어도 약 3500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 4000 Pa 바람직하게는, 적어도 약 4500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 5000 Pa 바람직하게는, 적어도 약 5500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 6000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 6500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 7000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 7500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 8000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 8500 Pa의 G'를 가진다. 바람직하게는, 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 약 500 Pa 내지 약 1500 Pa, 약 500 Pa 내지 약 800 Pa, 약 500 Pa 내지 약 1000 Pa, 약 1500 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 5500 Pa, 약 6000 Pa 내지 약 8000 Pa 또는 약 6500 Pa 내지 약 8000 Pa의 G'를 가진 가교된 카르복시메틸셀룰로스이다.

바람직하게는, 본 발명의 공유적으로 가교된 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 600 Pa 내지 약 9,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 800 Pa 내지 약 8,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 1,000 Pa 내지 약 6,000 Pa의 탄성 계수 (G')를 가진다.

바람직하게는, 본 발명의 고유적으로 가교된 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 약 500 Pa 내지 약 9,000 Pa, 약 500 Pa 내지 약 6,000 Pa, 약 500 Pa 내지 약 5,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 10,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 8,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 5500 Pa, 약 1,200 Pa 내지 약 10,000 Pa 또는 약 1,200 Pa 내지 약 8000 Pa의 G'를 가진다. 바람직한 하이드로겔은 SGF/물 (1:8) 및 인공 장액 (SIF)에서 팽윤시 비슷한 탄성 및/또는 흡수 특성을 가진다. 예를 들어, 바람직한 하이드로겔은 SIF에서 팽윤시의 G'가 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시의 G'의 20% 이내이다. 바람직한 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 MUR의 20% 이내인 SIF에서의 MUR을 가진다.

본 발명의 바람직한 하이드로겔 (공유 가교된, 비-공유 가교된, 또는 비-가교된)은 SGF/물 (1:8) 및 인공 장액 (SIF)에서의 팽윤시 비슷한 탄성 및/또는 흡수 특성을 가진다. 예를 들어, 바람직한 하이드로겔은 SIF에서의 팽윤시의 G'가 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시의 G'의 20% 이내이다. 바람직한 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 MUR의 20% 이내인 SIF에서의 MUR을 가진다.

바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔은 GI 관을 통해 이동하는 중에 바람직한 탄성 계수 (G') 특성을 유지할 수 있는 임의의 하이드로겔 폴리머를 포함한다. 바람직하게는, 하이드로겔은 결장을 포함한 GI 관을 통과하는 중에 안정적으로 유지된다. 다른 예로, 바람직한 하이드로겔은 결장을 통해 이동하는 중에 분해 또는 부분적으로 분해된다. 다른 예로, 바람직한 하이드로겔은 소장 또는 결장을 통해 이동하는 중에 부분적으로 분해될 수 있다. 하이드로겔의 일부 분해는 네트워크 내 코폴리머의 안정화에 의해 달성될 수 있으며, 이때 하나 이상의 폴리머가 GI 관의 다른 부위에서 분해될 수 있다. 이러한 기전의 예는, 비-제한적으로, CMC 및 키토산, 또는 CMC 및 글루코만난의, 예를 들어, 구연산 또는 2관능성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과의 가교이다. 이들 코폴리머 백본은 일부 분해 방식을 제공할 수 있다. CMC 부분은 결장에서 분해되고, 키토산 또는 글루코만난 부분은 높은 탄성 계수를 유지하면서 안정적으로 남아있을 것이다. 다른 예로, 일부 분해는, 하나 이상의 가교제가 서로 다른 GI 관에서 분해가능한 경우, 여러가지 가교제를 사용해 호모폴리머에 의해 달성될 수 있다. 그 예는 구연산 또는 2관능성 PEG와 가교된 셀룰로스 유도체로서, 구연산 가교는 분해되겠지만, PEG 가교는 분해되지 않을 것이다. 일부 분해는 전술한 기법들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 하이드로겔이 폴리머 및/또는 가교제 분해에 의해 일부 분해되면, 본질적으로 엔트로피인 변형 (deformation)에 대한 탄성 반응이 줄어된다. 즉, 탄성 계수가 그에 따라 감소한다. 부분 분해는 여러가지 GI 관에서 이동하는 중에 이들 방법에 언급된 하이드로겔의 탄성 계수를 조정하기 위한 툴로서 사용될 수 있다. 후술한 이온성 폴리머와 더불어, 본 발명의 적합한 폴리머는 가교된 또는 비-가교된 형태로 하기 폴리머를 포함하며, GI 관에 배치시 비-제한적으로 하기를 포함하는 자가-가교할 수 있는 비-가교된 폴리머를 포함한다: HEC, 키토산, 글루코만난, 전분, 아크릴레이트 미세결정 셀룰로스, 사일륨 (psyllium) 및 구아르 검.

바람직한 한가지 가교제는 폴리(에틸렌 글리콜) 다이글리시딜 에테르 (PEGDE)이다. 용어 "2관능성 폴리에틸렌 글리콜" 및 "2관능성 PEG"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 각 말단이 말단 반응성 관능기로 관능화된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 지칭한다. 적합한 반응성 기로는 하이드록시, 카르복시 및 아미노 기와 같이 다당류에서 상보성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 기를 포함한다. 적합한 이러한 기로는 아지드, 티올, 숙신이미드, 에폭사이드, 카르복시, 아미노, 에테닐, 에티닐, 니트로페닐 및 브로모알킬 기 등이 있다. 바람직하게는, 관능기는 중성 pH에서 수중에 안정적이다. 바람직한 관능기는 에폭사이드이다. 2관능성 PEG의 PEG 유닛은 임의의 적절한 길이를 가질 수 있으며, 통상적으로 2관능성 PEG의 수 평균 분자량 (M_n)으로 특정된다. 특정 구현예에서, 2관능성 PEG는 약 150 Da 내지 약 1,000,000 DA, 바람직하게는, 200 Da 내지 100,000 Da, 바람직하게는, 250 Da 내지 50,000 Da, 바람직하게는, 200 Da 내지 10,000 Da, 더 바람직하게 250 Da 내지 5000 Da, 400 Da 내지 2500 Da, 250 Da 내지 1000 Da, 350 Da 내지 650 Da, 450 Da 내지 550 Da 또는 약 500 Da 내지 약 550 Da의 M_n을 가진다. 바람직하게는, 2관능성 PEG는, 분자량이 약 450 Da 내지 약 600 Da, 또는 약 500 Da 내지 약 550 Da 또는 약 520 Da 내지 약 530 Da인, 폴리(에틸렌 글리콜) 다이글리시딜 에테르 (PEGDE)이다. 바람직하게는, PEGDE는 약 또는 약 400 Da 내지 약 10,000 Da, 바람직하게는, 약 400 Da 내지 약 8,000 Da, 바람직하게는, 약 400 Da 내지 6,000 Da, 바람직하게는, 약 460 Da 내지 약 4,600 Da, 바람직하게는, 약 460 Da 내지 약 3,000 Da의 평균 분자량을 가진다. 바람직하게는, 2관능성 PEG는 PEGDE이고, 단계 (1)의 용액에서 PEGDE에 대한 폴리머(들), 예를 들어, 다당류(들)의 중량비는 약 20 w/w 내지 약 20000 w/w, 바람직하게는, 약 50 w/w 내지 약 10000 w/w, 더 바람직하게 약 100 w/w 내지 약 1000 w/w이다.

바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔은 이온성 폴리머, 바람직하게는, 음이온성 폴리머, 가장 바람직하게는, 카르복시메틸셀룰로스를 포함한다. 바람직하게는, 음이온성 폴리머는 본원에 기술된 바와 같이 구연산 또는 2관능성 PEG와 공유적으로 가교된 카르복시메틸셀룰로스이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔은 이온성 폴리머 및 비-이온성 폴리머를 포함한다. 이온성 폴리머는 바람직하게는 음이온성 폴리머이고, 가장 바람직하게는, 카르복시메틸셀룰로스이다. 비-이온성 폴리머는 바람직하게는, 비-이온성 다당류, 예를 들어, 치환된 셀룰로스, 글루코만난, 구아르 검 또는 사일륨이다. 다른 구현예들에서, 비-이온성 폴리머는 하이드록시알킬셀룰로스, 예를 들어 하이드록시에틸셀룰로스 ("HEC") 또는 하이드록시알킬 알킬셀룰로스이다. 특정 구현예에서, 이온성 폴리머는 비-이온성 폴리머와, 예를 들어 폴리카르복시산과 같은 가교제, 바람직하게는, 구연산 또는 PEGDE와 같은 2관능성 PEG와 가교된다. 이온성 및 비-이온성 폴리머의 중량비는 (이온성:비-이온성) 약 1:10 내지 약 10:1, 바람직하게는, 약 1:5 내지 약 5:1 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 중량비는 1:1 보다 높으며, 예를 들어, 약 2 내지 약 5이다. 특히 바람직한 구현예에서, 이온성 폴리머는 카르복시메틸셀룰로스이고, 비-이온성 폴리머는 하이드록시에틸셀룰로스이고, 중량비 (이온성:비-이온성)는 약 3:1이다.

가장 바람직하게는, 본 발명은, 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정하였을 때, SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 탄성 계수 (G')가 적어도 1500 Pa인, 가교된 카르복시메틸셀룰로스, 예를 들어 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 제공한다. 바람직하게는, 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 700, 바람직하게는, 적어도 약 800, 바람직하게는, 적어도 약 1000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 1500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 2000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 3000 Pa 적어도 약 3500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 4000 Pa 바람직하게는, 적어도 약 4500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 5000 Pa 바람직하게는, 적어도 약 5500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 6000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 6500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 7000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 7500 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 8000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 8500 Pa의 G'를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 약 1500 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 5500 Pa, 약 6000 Pa 내지 약 8000 Pa 또는 약 6500 Pa 내지 약 8000 Pa의 G'를 가진다.

가장 바람직하게는, 본 발명은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 600 Pa 내지 약 9,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 800 Pa 내지 약 8,000 Pa, 바람직하게는, 적어도 약 1,000 Pa 내지 약 6,000 Pa의 탄성 계수 (G')를 가진, 가교된 카르복시메틸셀룰로스, 예를 들어, 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 제공한다.

가장 바람직하게는, 본 발명은 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 약 500 Pa 내지 약 9,000 Pa, 약 500 Pa 내지 약 6,000 Pa, 약 500 Pa 내지 약 5,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 10,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 8,000 Pa, 약 1,000 Pa 내지 약 5500 Pa, 약 1,200 Pa 내지 약 10,000 Pa 또는 약 1,200 Pa 내지 약 8000 Pa의 G'를 가진, 가교된 카르복시메틸셀룰로스, 예를 들어 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 제공한다. 바람직한 하이드로겔은 SGF/물 (1:8) 및 인공 장액 (SIF)에서 팽윤시 비슷한 탄성 및/또는 흡수 특성을 가진다. 예를 들어, 바람직한 하이드로겔은 SIF에서의 G'가 SGF/물 (1:8)에서의 팽윤시의 G'의 20% 이내이다. 바람직한 하이드로겔은 SGF/물 (1:8)에서 MUR의 20% 이내인 SIF에서의 MUR을 가진다.

바람직하게는, 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 500 Pa 내지 약 1500 Pa, 약 500 Pa 내지 약 800 Pa, 약 500 Pa 내지 약 1000 Pa, 약 1500 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 5500 Pa, 약 6000 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 6500 Pa 내지 약 8000 Pa, 약 5000 Pa 내지 약 5500 Pa의 G'; 또는 적어도 약 2700 Pa의 G'를 가진다.

카르복시메틸셀룰로스는 광범위한 분자량을 가진 것으로 상업적으로 입수가능하다. 통상적으로 25℃ 수중에서 1.0% (wt/wt) 소듐 카르복시메틸셀룰로스 용액의 점도 측면에서 소듐 카르복시메틸셀룰로스의 분자량을 나타내는 것이 가장 편리하다. 본 발명에 사용하기 적합한 카르복시메틸셀룰로스는 수중에서 바람직하게는 이러한 조건에서 약 50 센티푸아즈 (cp) 내지 약 11,000 cp, 더 바람직하게 약 500 cp 내지 약 11000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 용액을 형성한다. 특정 구현예에서, 이러한 조건에서 상기한 용액의 점도는 약 1000 cp 내지 약 11000 cp, 약 1000 cp 내지 약 2800 cp, 약 1500 cp 내지 약 3000 cp, 약 2500 내지 약 6000 cp이다. 특정 구현예에서, 이러한 조건에서 용액의 점도는 약 6000 cp 내지 약 11000 cp이다. 카르복시메틸셀룰로스 용액의 점도는 ASTM D1439-03(2008)e1 (ASTM International, West Conshohocken, PA (2008), 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 따른 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정한다.

일 구현예에서, 하이드로겔은 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스와 가교하여 제조된다. 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 공유적으로 가교되거나 또는 물리적으로 가교될 수 있다. 예를 들어, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는, 예를 들어, 적합한, 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 2관능성 가교제를 사용해 가교될 수 있다. 일 구현예에서, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 구연산과 같은 폴리카르복시산과 가교된다. 다른 구현예에서, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 PEGDE와 같은 2관능성 PEG와 가교된다. 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스를 구연산과 가교함으로써 형성된 폴리머 하이드로겔은 US 2016/0222134에 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본원에서, 용어 "고 점도의 카르복시메틸셀룰로스"는 수중에서 적어도 1500 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 용액을 형성하는, 소듐염으로서 카르복시메틸셀룰로스를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 또한 약 8 이하의 다분산 지수와 같은 낮은 다분산 지수를 가진다. 바람직하게는, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 바람직하게는, 25℃ 수중에서 적어도 약 1500, 2,000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 7500 또는 8000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 용액을 형성한다. 특정 구현예에서, 카르복시메틸셀룰로스는 25℃에서 6000 내지 약 10000 cp 또는 약 6000 내지 11000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 수용액을 형성한다. 특정 구현예에서, 카르복시메틸셀룰로스는 25℃에서 약 6000 내지 약 9500 cp 또는 약 7000 내지 9500 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 수용액을 형성한다. 다른 구현예에서, 카르복시메틸셀룰로스는 25℃에서 약 7000 내지 약 9200 cp 또는 약 7500 내지 9000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 수용액을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 카르복시메틸셀룰로스는 25℃에서 약 8000 내지 약 9300 cp, 또는 약 9000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 수용액을 형성한다. 바람직하게는, 카르복시메틸셀룰로스는 소듐염의 형태이다. 바람직하게는, 카르복시메틸셀룰로스는 약 7800 cp 이상, 예를 들어, 약 7800 내지 11000 cp 또는 약 8000 cp 내지 약 11000 cp의 점도를 가진 1% (wt/wt) 수용액을 형성하는 소듐 카르복시메틸셀룰로스이다.

바람직한 구현예에서, 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스는 약 8 이하, 바람직하게는, 약 7 이하 또는 6 이하의 다분산 지수 (Mw/Mn)를 추가로 가진다. 일 구현예에서, 다분산 지수는 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6.5, 약 3.0 내지 약 6; 약 3.5 내지 약 8, 약 3.5 내지 약 7, 약 3.5 내지 약 6.5, 약 3.5 내지 약 6, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6.5, 약 4 내지 약 6, 약 4.5 내지 약 8, 약 4.5 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 7.5, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6.5, 또는 약 5 내지 약 6이다.

바람직하게는, 입자 형태에서, 적어도 95%가 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위이고; 평균 크기가 400 내지 800 ㎛이며; 건조시 중량 감소율이 10% (wt/wt) 이하인, 가교된 카르복시메틸셀룰로스, 예를 들어 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스는, 후술한 G', 매질 흡수율 (media uptake ratio) 및 탭 밀도 (tapped density)를 가진다. 이러한 가교된 카르복시메틸셀룰로스는, 예를 들어, 본원에 기술된 방법 및 US 2016/0354509에 따라 제조할 수 있다.

(A) G': 적어도 약 1500 Pa, 1800 Pa, 2000 Pa, 2200 Pa, 2500 Pa 또는 2700 Pa. 특정 구현예에서, 본 발명의 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 적어도 약 2800 Pa의 G'를 가진다. 특정 구현예에서, 본 발명의 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 약 1800 Pa 내지 약 3000 Pa, 약 2000 Pa 내지 약 4000 Pa, 약 2100 Pa 내지 약 3500 Pa, 약 2100 Pa 내지 약 3400 Pa, 또는 약 2500 Pa 내지 약 3500 Pa의 G'를 가진다

(B) SGF/물 (1:8)에서의 매질 흡수율 (MUR): 적어도 약 40, 바람직하게는, 적어도 약 50 또는 60. 특정 구현예에서, 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 약 50 내지 약 110, 약 55 내지 약 100, 약 60 내지 약 95, 약 60 내지 약 90, 또는 약 60 내지 약 85의 MUR을 가진다.

(C) 탭 밀도: 적어도 0.5 g/mL, 바람직하게는, 약 0.55 g/mL 내지 약 0.9 g/mL. 바람직한 구현예에서, 탭 밀도는 약 0.6 g/mL 이상, 예를 들어, 약 0.6 g/mL 내지 약 0.8 g/mL, 약 6.5 g/mL 내지 약 7.5 g/mL 또는 약 0.6 g/mL 내지 약 0.7 g/mL이다.

바람직하게는, 본 발명은, 입자 형태에서, 적어도 95%가 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위이고; 평균 크기가 400 내지 800 ㎛이며; 건조시 중량 감소율이 10% (wt/wt) 이하인, 다음과 같은 G' 및 매질 흡수율을 가진 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 제공한다:

(A) G' 약 500 Pa 내지 약 8000 Pa 및 매질 흡수율 약 40 내지 100;

(B) G' 약 1200 Pa 내지 약 2000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 75;

(C) G' 약 1400 Pa 내지 약 2500 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 70;

(D) G' 약 1600 Pa 내지 약 3000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 65;

(E) G' 약 1900 Pa 내지 약 3500 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 60;

(F) G' 약 2200 Pa 내지 약 4000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 55;

(G) G' 약 2600 내지 약 5000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 40;

(H) G' > 3000 내지 약 8,000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 30;

(I) G' > 4000 내지 약 10,000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 20;

(J) G' > 6000 내지 약 11,000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 15;

(K) G' > 7,000 내지 약 12,000 Pa 및 매질 흡수율 적어도 약 10.

바람직하게는, 상기한 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 선택적으로 적어도 0.5 g/mL, 바람직하게는, 약 0.55 g/mL 내지 약 0.9 g/mL의 탭 밀도를 추가로 가진다. 바람직한 구현예에서, 탭 밀도는 약 0.6 g/mL 이상, 예를 들어, 약 0.6 g/mL 내지 약 0.8 g/mL, 약 0.65 g/mL 내지 약 0.75 g/mL 또는 약 0.6 g/mL 내지 약 0.7 g/mL이다.

바람직하게는, 가교된 카르복시메틸셀룰로스는 적어도 약 2100 Pa의 G' 및 적어도 약 75의 매질 흡수율; 또는 적어도 약 2700 Pa의 G' 및 적어도 약 70의 매질 흡수율을 가진다.

달리 언급되지 않은 한, 본원에 기술된 G', MUR 및 탭 밀도에 대한 모든 측정은, (1) 건조시 중량 감소율이 10% (wt/wt) 이하이고; (2) 입자 크기 범위에서 적어도 95 중량%가 100 ㎛ - 1000 ㎛이고, 평균 크기가 400 내지 800 ㎛ 범위인 미립자 형태의, 가교된 카르복시메틸셀룰로스와 같은, 하이드로겔 샘플에서 수행된다.

달리 언급되지 않은 한, 본원에 기술된 G', MUR 및 탭 밀도에 대한 모든 측정은, (1) 건조시 중량 감소율이 15% (wt/wt) 이하이고; (2) 입자 크기 범위에서 적어도 90 중량%가 100 ㎛ - 1000 ㎛이고 평균 크기가 400 내지 800 ㎛ 범위인 미립자 형태의, 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스 샘플을 비롯하여, 하이드로겔 샘플에서 수행된다.

본원에서, 용어 "인공 위액/물 (1:8)" 및 동의어 "SGF/물 (1:8)"은 실시예 2에 기술된 방법에 따라 제조된 용액을 지칭한다.

본원에서, 가교된 폴리머의 "매질 흡수율" 또는 "MUR"은 하기 식으로 표시되는 가교된 폴리머가 지정된 수성 매질을 흡수하는 능력을 나타내는 측정값이다:

MUR = (W_swollen-W_dry)/W_dry

W_dry는 가교된 폴리머의 초기 건조 샘플의 무게이고, W_swollen은 팽윤 평형시 가교된 폴리머의 무게이다. 달리 언급되지 않은 한, 본원에서 매질 흡수율 또는 MUR은 실시예 2에 기술된 방법에 따라 SGF/물 (1:8) 내에서 수득된 값을 나타낸다. 본원에 기록된 MUR 값에 대한 단위는 g/g로 이해된다.

본원에서, "탄성 계수" 또는 G'는 실시예 2에 기술된 방법에 따라 SGF/물 (1:8)에서 팽윤된 가교된 폴리머에서 측정한다.

본원에서, 샘플의 "탭 밀도"는 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정한다.

본원에서, 샘플의 "수분율" 또는 "건조시 중량 감소율"은 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리머 하이드로겔은 예를 들어 폴리머가 GI 관에서 이동하는 중에 안정적이며, 또한 결장을 비롯하여 GI 관의 임의 부위에서 분해되지 않는, G' 특성을 가진 가교된 폴리머를 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 바람직한 하이드로겔은 결장을 통해 이동하기 전에 분해될 수도 있다. 다른 예로, 본 발명의 바람직한 하이드로겔은 GI 관을 통과하는 중에 부분적으로 분해될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명은, 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa, 예를 들어, 약 500 Pa 내지 약 8000 Pa인 하이드로겔, 바람직하게는, 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 하이드로겔을 포함하는, 장 투과성-관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 활성 물질로서 하이드로겔, 바람직하게는, 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 하이드로겔을, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하여 포함한다. 약학적 조성물에 존재하는 하이드로겔은 예를 들어 수분율 약 25 중량% 미만으로 수화되거나 또는 탈수될 수 있다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 경구 투여하기 적합하다. 예를 들어, 하이드로겔은 탈수 처리될 수 있으며, 캡슐제, 정제 또는 사셰제로 제형화될 수 있다. 하이드로겔은 또한 점막부착제로서 사용되는 제형 또는 디바이스의 구성성분일 수 있다. 이러한 디바이스는 하이드로겔 층을 장벽 층에 고정하는 패치를 포함한다. 장 표면에 하이드로겔이 부착되면, 패치는 이것이 덮고 있는 장벽의 일부분에 투과성 장벽을 형성한다. 예를 들어, US 2016/0354509를 참조하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 하이드로겔은 인 시추로 가교될 수 있거나, 또는 부분적으로 가교된 형태로 투여될 수 있다. 하이드로겔은 건조한 상태로 (제로겔) 또는 일부 팽윤된 형태 또는 팽윤된 형태 (하이드로겔)로, 단독으로, 또는 식품 또는 음료 또는 이들의 조합물과 조합하여, 투여될 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔은 푸드 바, 시리얼, 젤 벌크가 첨가된 요거트, 아이스크림 및 과일 쥬스, 바람직하게는, 비-제한적으로, 오렌지 쥬스 또는 레몬 쥬스와 같은 산성 pH 음료와 같이, 식품과 혼합되거나 또는 식품의 구성성분으로서 혼합될 수 있다. 다른 구현예에서, 하이드로겔은 구강 점막과 접촉을 유지할 수 있는 형태, 예를 들어, 팝시클 (popsicle)과 같이 씹는 제형 및 식품으로 제공된다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 물 또는 수성 용액과 조합하여 경구로 투여된다. 다른 구현예들에서, 조성물은 직장으로, 예를 들어, 좌제 또는 관장제로서 투여된다.

바람직하게는, 하이드로겔은 캡슐제 또는 정제와 같은 투약 형태를 경구 섭취함으로써 환자의 소장 또는 결장으로 투여되며, 하이드로겔은 크론 질환 및 궤양성 대장염에 따라 다양한 활동성 질환이 만연한 장 부위에 도달하였을 때 투약 형태로부터 방출되도록 코팅된다. 따라서, 전형적으로, 장용 코팅된 캡슐의 경우, 장용 코팅은 공장 (약 pH 5.5), 회장 (약 pH 6) 또는 결장 (약 pH 6-7))에서 용해되어야 한다. 예를 들어, 이러한 도세지 (dosage)는, 하이드로겔, 예를 들어 정제 또는 캡슐제로 압축된 미세입자의 형태의 하이드로겔을, 위의 낮은 pH에서는 온전하게 유지하지만 특정 코팅의 최적 용해 pH에 도달하였을 때 쉽게 용해되는 코팅으로 코팅함으로써, 달성될 수 있다. 코팅은 대상 GI 영역에서만 캡슐이 용해되도록 캡슐 상에 직접 제공될 수 있다. 코팅은, 장의 타겟 영역의 pH에서 용해되도록, 선택될 수 있다. 또한, 하이드로겔 방출은 pH, 이온 강도 및 온도와 같은 특정 환경 조건에서만 팽윤하는 제로겔 제형을 투여함으로써, 조절할 수 있다.

지연 방출형 제형 (delayed release formulation)은, 특이적인 백본 안정화 및 구조로 인해, 확산 및 분해 기전 둘다에 의해 발생할 수 있다. 벌크를 통한 분자 확산은 네트워크 확장 및 수축 기전과 가교도에 의해 제어될 수 있다. 확장 및 수축은 분자 확산에 대한 네트워크 3D 구조의 입체 간섭과 하이드로겔 내 '자유' 수 (free water)의 양 (백본 상에 결합되거나 흡수되지 않은 부분) 둘다를 조절한다. 다량의 유리수는 컨벡션 기전 (convection mechanism)을 활성화하여, 분자 투과성을 가속화하고 따라서 방출을 가속화한다. 이러한 기전은 하이드로겔의 팽윤 및 수축에 의해 조절되며, 외부 GI 환경의 pH와 이온 강도의 변화에 의해 미세하게 조정된다. 바람직하게는, 하이드로겔은 위장 환경에서 빠르게, 예를 들어 한시간 안에, 바람직하게는 30분 안에 팽윤된다. 가교 정도는 네트워크 확장 용량과 백본 가동성 (mobility)을 모두 조절한다. 확장 및 가동성이 높을수록, 벌크 물질 전체의 분자를 확산시키기 위한 활성화 에너지는 작다. 예상치 못하게도, 높은 확장 용량이 높은 가교 수준에서 수득되었는데, 이는 분자량과 폴리머 백본의 치환도를 조정한다. 이는 방출 기전을 제어하기 위한 강력한 툴을 부가한다. 부가적인 조절은 폴리머 백본의 특성을 바꾸거나 또는 적절하게 설계된 컴포지트 네트워크를 구축함으로써 달성될 수 있다.

본원에 기술된 조성물은 건강한 장 상피 조직을 유지하고, 장-간-뇌 축에서 장 투과성-관련 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는데 이용가능하다. 이러한 질환 및 장애로는, 비-제한적인 예로, 위염, 소화성 궤양, 십이지장 궤양, 위식도 역류 질환 (GERD), 위산 역류, 호산성 식도염, 크론 질환 및 궤양성 대장염을 비롯한 염증성 장 질환 (IBD), 식품 알레르기, 과민성 장 증후군 (IBS), 셀리악 질환, NSAID-유발성 궤양, 감염성 대장염, 헬리코박터 필로리 (H. pylori); 살포넬라 엔테리카 세로바 티피무르 (Salmonella enterica serovar typhimur)를 포함한 살모넬라 spp.; 쉬겔라 (Shigella); 스타필로코커스 (Staphylococcus); 캄필로박터 (Campylobacter); 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile); 병원성 대장균 (pathogenic Escherichia coli); 예르시나 (Yersinia); 비브리오 콜레라 (V. cholera) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (V. parahaemolyticus)를 포함한 비브리오 spp.; 칸디다 (Candida); 지아르디아 (Giardia); 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica); 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis); 로타바이러스; 노로바이러스; 아데노바이러스; 및 아스트로바이러스 (astrovirus)에 의한 감염을 비롯하여 위장관의 감염 또는 외상; 위장관의 염증, 장 급성 방사선 증후군, 식품 알레르기; 환경성 장병증 (environmental enteropathy) 및 화학요법-유발성 또는 방사선요법-유발성 구강 또는 장 점막염과 같은 점막염; 대장염과 관련있으며 특발성인 결장직장암과 같은, GI 염증성 질환 및 장애 등이 있다. 이러한 질환 및 장애는 비만, 혼성 결합 조직 질환 (MCTD); 관절염을 비롯한 만성 염증; 패혈증을 비롯한 급성 염증; 비-알코올성 지방간염 (NASH) 및 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 간경변 및 간세포암을 비롯한 간 질환; 1형 진성 당뇨병; 2형 진성 당뇨병; 만성 알코올 중독의 후유증; 호흡기 감염을 비롯한 감염; 자폐 스펙트럼 장애 (as autism spectrum disorder), 알츠하이머 및 파킨슨 질환과 같은 신경 장애를 비롯하여, 대사 질환 및 위장관 이외의 조직 및 장기에 작용하는 대사 질환을 추가로 포함한다.

또한, 본원에 기술된 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 다양한 약물 요법의 부작용으로 인한 장 상피 조직에 대한 상해를 예방학적으로 방지하는데 사용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 약물 요법으로 치료한 후 또는 치료하는 중에 유지 및 방지로서 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 약물 요법 및 활성 치료 약물 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 이는 필요 용량 및/또는 치료 기간을 줄임으로써 이러한 치료의 부정적인 효과를 낮추도록 돕거나 및/또는 장 투과성과 관련된 질환에 대한 약물 치료 효과를 개선하기 위해 이용할 수 있다. 본원에서, 용어 "병용 요법 (combination therapies)", "공동-치료학적 치료 용법 (co-therapeutic treatment regimens)" 등은, 2가지 약물을 개별 제형으로 또는 조합된 제형으로서 동시에 또는 수분, 수시간 또는 수일 간격으로 서로 다른 시점에 순차적으로 투여되지만, 원하는 치료학적 반응을 제공하기 위해 함께 작용하는, 치료 용법을 의미한다. 특정 질환 (예, 장 투과성과 관련있는 질환)을 치료하는 것으로 공지된 임의 약물 요법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약물 요법을 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 약물 전달 툴로서 사용될 경우, 이는 약물 이용가능성과 접촉 시간 증가 및 상피 조직의 보호 및 자극을 통한 치료학적 효과 둘다를 제공하는 여러가지 역할을 수행하여, 상피 조직의 재생을 개선하고, 염증을 방지한다. 이러한 관점에서, 본 발명의 하이드로겔은 약물 투여에 대한 부가적인 툴일 뿐 아니라 장 투과성 관련 병증에 상승적인 효과를 제공한다. 이는 치료 기간 중에 유익할 수 있으며, 또한 치료 후 장을 보호하고 장 건강을 유지하는데에도 유익할 수 있다. 이러한 병용 요법은 전체 테라피에 대해 개선된 효능 및 안전성 프로파일을 제공할 수 있거나 및/또는 단순히 편의성 및 삶의 질 개선을 제공할 수도 있다.

약물 전달은 비-용해성, 부분 용해성 또는 완전 용해성 하이드로겔 경우에 모두 조절될 수 있다. 비-용해성 하이드로겔의 경우, 약물 전달은 분자량, 백본의 가교도, 고정된 전하의 존재 및 이의 치환도에 따라 조절될 수 있다. 이는 하이드로겔 내부에서 분자 수송에 대한 간섭 및 이의 팽윤 특성에 직접적으로 영향을 미치며, 이는 또한 확산 카이네틱 (diffusion kinetic)도 조절한다.

이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니고, 단순 예로서, 높은 가교도 및 높은 분자량을 가진 하이드로겔은 분자 수송에 대해 더 높은 간섭 및 낮은 가동성을 나타내며, 또한 이동 카이네틱이 감소된다. 보다 낮은 팽윤 용량 역시 수송 기전을 감소시키고, 따라서 전달 카이네틱도 줄어든다. 고분자 전해질의 경우, 팽윤 용량, 즉 전달 카이네틱스는 또한 pH 및 이온 세기와 같은 외부 매질 (external media)의 특성에 의해 조절될 수 있다. 이는 특정 GI 관 부위로 약물 전달을 적절하게 타겟팅할 수 있게 해준다. 고분자 전해질과 비-고분자 전해질 기반의 네트워크의 조합은 전술한 기전을 통해 수송 현상 (transport phenomena), 즉 전달 기전에 대한 추가적인 제어를 제공한다.

또한, 이러한 조합은 본원에 기술된 바와 같이 부분적인 또는 완전한 하이드로겔 분해를 촉진할 수 있다. 이러한 분해는 전달 특성을 조절하기 위한 부가적인 툴로서 사용될 수 있다. 실제, 백본의 (일부 또는 완전한) 분해는 분해성 하이드로겔 매스에 존재하는 약물의 방출을 활성화한다. 그래서, 분해가 외부 환경 변경 또는 외부 툴에 의해 활성화되므로, GI 전달 섹션과 전달할 약물의 양을 적절하게 조절할 수 있다.

정확한 전달 부위를 제어하기 위한 또 다른 툴은 고분자 전해질의 적절한 전하를 선택하는 것이다. 실제, 염증이 생긴 조직이 하전된 백본과 강하게 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 고분자 전해질-기반의 하이드로겔은 염증이 생긴 조직 섹션에 결합하여, 전달 부위를 타겟팅하고 이들 부위에서 약물 이용성을 개선할 수 있다.

또한, 약물 전달 제어는 미소구 또는 미세캡슐 내 약물의 캡슐화에 의해 보강될 수 있으며, 그래서 이를 하이드로겔 내에 통합하고, 초음파, 국소 온도 변화, 방사선 등과 같은 외부 툴 또는 외부 매질과의 접촉에 의해 용해 또는 파괴시킨다. 이의 제어된 용해로, 2종 이상의 동심원 캡슐 (concentric capsule)의 셸 (shell) 또는 캡슐 내에 이미 캡슐화된 약물이 방출된다. 하이드로겔 백본과 캡슐 조합은 단순 혼합, 이차 또는 일차 결합에 의해 이루어질 수 있다.

타겟 약물 전달 기전과 재생 기전 (regeneration mechanism)의 커플링은 단독 약물 투여가 안전성 및 효능 문제가 있는 다수 질환들에서 중요한 역할을 한다. 일 예는, 이 경우로 제한되는 것은 아니지만, 장 조직 염증과 관련있는 것으로 알려진 화학요법제의 투여이다.

장 장벽에 대한 효과를 통해 상승적으로 작용하거나 또는 질환에 접근하기 위한 다른 기전을 추가하거나 또는 하이드로겔에 첨가되어 투여의 연장된 또는 느린 방출 모드를 제공할 수 있는, NAFLD/NASH 치료학적 후보물질로는, FHX 작용제, 담즙산 흡수 저해제, 항산화제 (미토퀴논, 시스테인 고갈제), PPAR 작용제 (단독 및 더블), 카스파제 프로테아제 저해제, 섬유모세포 성장인자 유사체 (FGF 19 또는 FGF 21), 시르투인 자극제 (Sirtuin stimulant), 지방산 저해제, DGAT1 저해제, ROCK2 저해제, ASK1 저해제, TLR-4 길항제, THR-beta 작용제, 세포자살 신호 감소 키나제-1 저해제, 콜레스테롤 생합성 저해제/IL-6 모듈레이터, 스테아로일 코엔자임 A 데사투레이즈 (Desaturase) 1 저해제, 케모카인 수용체 타입 2 및 5 저해제, 카텝신 B 저해제, 아세틸-CoA 카르복실라제 저해제 및 갈렉틴 1 및 3 저해제 등이 있다.

펩타이드 전달에 하이드로겔을 이용한다면, 다음과 같은 치료제 즉 LOXL2 항체, GLP-1 작용제, GLP-2 작용제, 갈렉틴 1 및 3 저해제의 경구 투여가 가능해질 것이다.

장 장벽에 대한 효과를 통해 상승적으로 작용할 수 있거나, 또는 질환에 접근하기 위한 다른 기전을 추가할 수 있거나, 또는 하이드로겔에 첨가되어 투여의 연장된 또는 느린 방출 모드를 제공할 수 있는, 염증성 장 질환의 치료학적 후보물질로는 메스알라닌 (mesalanine), 아자티오프린 (azathioprine), 6-머캅토푸린 (6-mercaptopurine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 코르티코스테로이드 (corticosteroid), 항-종양 괴사 인자 (anti-tumor necrosis factor, TNF) 약물 (인플릭시맵 (infliximab), 아달리무맵 (adalimumab), 세르톨리주맵 페골 (certolizumab pegol), 인플릭시맵, 아달리무맵 및 골리무맵 (golimumab)), 항-α-4β-7 인테그린 항체 (베돌리주맵 (vedolizumab), 에트롤리주맵 (Etrolizumab)), 스핑고신-1-포스페이트 (S1P1) 수용체 조절자 (오자니모드 (ozanimod)), 항-P40 항체 (우스테키누맵 (Ustekinumab)), 항-IL-23 항체, 항-P19 항체, Janus kinase (JAK) 저해제 (토팍시티닙 (Tofacitinib), 필고티닙 (filgotinib)), 메탈로프로테이나제 (metalloproteinase)-9 항체, SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 (mongerse) 등이 있다.

장 장벽에 대한 효과를 통해 상승적으로 작용할 수 있거나 또는 질환에 접근하기 위해 다른 기전을 추가할 수 있거나 또는 하이드로겔에 첨가되어 투여의 연장된 또는 느린 방출 모드를 제공할 수 있는 과민성 장 증후군 (변비형)의 치료학적 후보물질로는, 폴리에틸렌 글리콜 물질; 구아닐레이트 사이클라제-C 작용제 (리나클로티드 (linaclotide), 플레카나티드 (plecanatide)), 염소 채널 활성제 (루비프로스톤 (lubiprostone)), 나트륨/수소 교환제 저해제 (테나파노르 (tenapanor)) 등이 있다. IBS (설사형인 경우)의 경우, 뉴로키닌 (neurokinin)-2 수용체 길항제 (이보두탄트 (ibodutant)), 히스타민 H1-수용체 길항제 (에바스틴 (ebastine)), FXR-작용제가 하이드로겔과 상가적 (additive)이거나 또는 상승적일 수 있다. 하이드로겔에 첨가되는 엘루사돌린 (Eluxadoline) 및 5-HT3 길항제와 같은 물질은 IBS-D의 경우 췌장염의 위험을 줄이고 저 용량으로 사용할 수 있게 된다.

바람직하게는, 본 발명은 본 발명의 하이드로겔을, 장의 미생물총 변화, 관리 또는 영향을 수반하는 작용 기전을 가진 약물 또는 식품 또는 식품 보충제와 조합하여 포함하는, 병용 요법을 제공한다. 예를 들어, 이눌린 또는 기타 용해성 섬유는 환자에게 매우 다량 투여하여, 마이크로바이옴 (microbiome) 및 관련 대사산물에 긍정적인 변화를 발생시킬 수 있다. 그러나, 많은 용해성 섬유들이 기계적 특성이 매우 좋지 않기 때문에, 효과적이기 위해서는 상당량이 필요하고, 이러한 많은 양은 부적절한 부작용을 유발할 수 있다. 본 발명의 하이드로겔과 이들 용해성 섬유의 조합은, 미생물총에 작용하는 복수의 기전, 기계적 및 화학적 수단을 통해 전달할 용량은 줄이면서도 효능은 높여, 개선된 테라피를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료학적으로 효과적인 용법 이후에 하나 이상의 증상의 개선이 달성되는 시간 동안 개체에게 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 조성물은 적어도 매일 1회, 적어도 매일 2회, 적어도 매일 3회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 개체는 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상, 예를 들어, 염증의 중증도, 염증의 범위, 통증 등을 낮추는데 효과적인 시간 동안 치료된다. 예를 들어, 개체는 1주간, 2주간, 3주간, 4주간, 5주간, 6주간, 7주간, 8주간, 9주간 또는 10주간 치료받을 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 다른 생활성 물질과 조합하여 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명은, 개체의 위장관에 치료학적 유효량의 하이드로겔, 바람직하게는 전술한 바와 같이 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa, 예를 들어, 약 500 Pa 내지 약 8,000 Pa, 바람직하게는, 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 하이드로겔을 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 디스바이오시스 (dysbiosis)(즉, 장내 상호공생 미생물총 (미생물무리 (microbiota))의 균형이 깨진 상태)를 수반 또는 비-수반한 장 투과성- 및/또는 염증-관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 하이드로겔은 개체에 경구로 투여된다. 질환 또는 장애는 위장관으로 한정될 수 있으며, 위장관 외부 조직(들) 또는 장기(들)에서 나타나거나 또는 전신성일 수 있다. 이러한 질환 및 장애로는 디스바이오시스를 수반 또는 비-수반한 GI 염증성 질환 및 장애, 비-제한적인 예로, 위염, 소화성 궤양, 십이지장 궤양, 위식도 역류 질환 (GERD), 위산 역류, 호산성 식도염, 크론 질환 및 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환 (IBD), 셀리악 질환, NSAID-유발성 궤양, 식품 알레르기, 과민성 장 증후군 (IBS), 감염성 대장염, 헬리코박터 필로리 (H. pylori); 살포넬라 엔테리카 세로바 티피무르 (Salmonella enterica serovar typhimur)를 포함한 살모넬라 spp.; 쉬겔라 (Shigella); 스타필로코커스 (Staphylococcus); 캄필로박터 (Campylobacter); 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile); 병원성 대장균 (pathogenic Escherichia coli); 예르시나 (Yersinia); 비브리오 콜레라 (V. cholera) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (V. parahaemolyticus)를 포함한 비브리오 spp.; 칸디다 (Candida); 지아르디아 (Giardia); 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica); 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis); 로타바이러스; 노로바이러스; 아데노바이러스; 및 아스트로바이러스 (astrovirus)에 의한 감염을 비롯하여 위장관의 감염 또는 외상; 위장관 염증, 장 급성 방사선 증후군, 식품 알레르기; 환경성 장병증 및 화학요법-유발성 또는 방사선요법-유발성 구강 또는 장 점막염과 같은 점막염; 디스바이오시스; 대장염과 관련있으며 특발성인 결장직장암 등이 있다. 이러한 질환 및 장애는 혼성 결합 조직 질환 (MCTD); 관절염을 비롯한 만성 염증; 패혈증을 비롯한 급성 염증; 비-알코올성 지방간염 (NASH) 및 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 간경변 및 간세포암을 비롯한 간 질환; 1형 진성 당뇨병; 2형 진성 당뇨병; 만성 알코올 중독의 후유증; 호흡기 감염을 비롯한 감염; 자폐 스펙트럼 장애 (as autism spectrum disorder), 알츠하이머 및 파킨슨 질환과 같은 신경 장애를 비롯하여, 위장관 이외의 조직 및 장기에 작용하는 질환 및 장애를 추가로 포함한다.

바람직하게는, 하이드로겔은 구연산 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 하이드로겔, 바람직하게는, 탄성 계수 (G')가 적어도 500 Pa, 예를 들어 약 500 Pa 내지 약 8,000 Pa, 바람직하게는, 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa 또는 약 500 Pa 내지 약 6500 Pa인 하이드로겔을 포함하는, 경구 투여에 적합한 투약 형태로 (dosage form) 투여된다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 질환 또는 장애로 인해 손상된 또는 기능부전성 점막에 생리학적 구조와 기능을 회복하기 위해 점막의 재생을 촉진하는 방법에 사용하기 적합하다. 점막 재생 및 밀접 정션은 장내 분자 수송에 대한 양호한 장벽 기능을 수행하여, 조직 기저 (tissues underneath)의 염증을 완화한다. 이는 전술한 바와 같은 장 투과성- 및/또는 염증 또는 디스바이오시스-관련 질환 및 장애를 치료하는데 영향을 미친다. 따라서, 본 발명은, 하이드로겔, 바람직하게는 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa, 예를 들어, 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 하이드로겔을, 복구 또는 재생이 필요한 장 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 장 투과성- 및/또는 염증 또는 디스바이오시스-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물 및 방법은 GI 관 점막의 상피 세포들 간의 밀접 정션의 형성을 촉진하는 방법에 적합하다. 온전한 밀접 정션을 가진 건강하고 성숙한 장 점막은 거대분자 통과에 대해 주요 장벽으로서 작용한다. 따라서, 본 발명은 또한 하이드로겔, 바람직하게는 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa 내지 약 8,000 Pa, 바람직하게는, 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 하이드로겔을, 투과성이 손상된 장관의 영역 또는 영역들과 접촉시키는 단계를 포함하는, 위장 (GI) 관의 밀접 정션의 형성을 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명의 하이드로겔은 투과성이 손상된 부위에서 장벽과 직접 접촉하여야 하는 것은 아니지만, 일시적인 내강 부피 및/또는 상피에 부속된 점액층의 탄성을 단순히 증가시킬 수 있다. 장벽이 탄성 겔 또는 겔-보강된 내강 내용물과 접촉되면, 장 장벽의 재생이 촉진되거나, 또는 아울러 내강 점막층의 재구축 유도 및 외부 매질의 응집에 의해, 장벽 파괴가 예방 또는 억제된다. 이론으로 결부되는 것은 아니나, 하이드로겔이 기저 조직 또는 점액의 다양한 기계적 특성에 맞는 스캐폴드로서 작용하며, 따라서 메카노-감지 신호 (mechano-sensing signal)를 기저 조직에 제공하고, 조직 재생을 지속시키는 것으로, 생각된다. 하이드로겔은, 재생 조직 및/또는 점액과의 기계적 특성의 유사성 및 투과성으로 인해, 기저 조직을 재생하는데 필수적인 영양분의 수송을 막지 않는다.

특히, 장 내강에 존재할 경우, 하이드로겔은 세포-생체물질 상호작용, 세포 부착, 세포 생존, 증식 및 분화를 위한 조절 인자, 영양분 및 가스의 충분한 수송을 촉진하며, 장 내강이 하이드로겔과 접촉하기 전의 장 내강의 염증 정도와 비교해, 장 내강의 조직 염증을 자극 또는 증가시키지 않는다.

따라서, 본 발명은 GI 관을 하이드로겔, 바람직하게는, 탄성 계수 (G')가 적어도 약 500 Pa, 예를 들어, 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 하이드로겔과 접촉시키는 것을 포함하는 GI 관 내에 일시적인 스캐폴드를 형성하는 방법을 추가로 제공하며, 이때 하이드로겔은 GI 관 내에서 스캐폴드를 형성하고, 스캐폴드는 세포-생체물질 상호작용, 세포 부착, 세포 생존, 증식 및 분화를 위한 조절 인자, 영양분 및 가스의 충분한 수송 또는 이들의 임의 조합을 촉진하며, 일시적인 스캐폴드는 GI 관이 하이드로겔과 접촉하기 전 장 내강 내 염증의 양과 비교해 GI 관의 염증을 증가시키지 않는다.

본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 비추어 추가로 이해될 수 있다.

실시예

실시예 1 - GelB -01, GelB -02, GelB -03 및 GelB -04의 제조 방법

표 1에 따른 폴리머를 US 2016/0222134의 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였으며, GelB-03 및 GelB-04의 경우에는 가교 시간을 표 1에 나타낸 바와 같이 증가시켰다.

명칭	X-가교 시간 (시간, 120℃)	MUR	평균 MUR	G' [Pa]	평균 G'[Pa]
Gel B-01	X-연결되지 않음
Gel B-02	4 hours	78, 76, 77	77	1966, 1885,1688	1827
Gel B-03	6 hours	36, 36, 36	36	5358, 5064, 5227	5293
Gel B-04	8 hours	24, 25, 21	23	6880,7757	7319

Gel B-01, Gel B-02, Gel B-03 및 Gel B-04를 다음과 같이 제조하였다 .

혼합 단계에서, 구연산 (0.2% w/w CMCNa), 7H4MF (6% w/w 탈이온수) 카르복시메틸 셀룰로스 및 탈이온수 (DI water)로 된 균질한 혼합물을 플래너터리 믹서 (planetary mixer) 기법을 통해 수득하였다. 건조 단계에서, CA/CMC/물 혼합물의 얇은 층을 실리콘 시트 위에서 밀어서 폈다. 층의 균질성은 균질적인 건조를 촉진하고, 물질 내 임의 잔류 응력 (residual stress)을 방지하기 위해 중요하다. 건조 온도는 70℃였다. 1차 밀링 단계에서, 건조된 물질을 2 mm 스크린을 통한 절단 밀 (cutting mill)에 의해 분쇄하였다. 1차 체질시, 분쇄된 물질을 100-1600 미크론으로 체질하였다. 이 단계에서 수득한 물질은 Gel B-01로 표시한다. 가교 단계에서, 선택 입자 크기 100-1600 미크론의 분말 5 g을 알루미늄 디쉬에 놓고, 4시간 동안 120℃에서 가교 반응을 수행하였다. 이 단계에서 수득한 물질은 Gel B-02로 표시한다. Gel B-02 오(5) g을 알루미늄 디쉬에서 다시 2 및 4시간 동안 120℃에서 추가로 가교하여, Gel B-03 및 Gel B-04를 각각 수득하였다. 세척 및 건조 단계에서, 가교된 분말을 3시간 동안 일정하게 교반하면서 탈이온수로 세척한 다음 여과하고, 70℃에서 건조시켰다. 2차 밀링 단계에서, 건조된 가교 물질을 1 mm 스크린을 통한 절단 밀에 의해 분쇄하였다. 2차 체질 단계에서, 분쇄된 물질을 최종 선택 입자 크기 100-1000 미크론으로 체질하였다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 Gel B -01, Gel B-02 Gel B-03 및 Gel B-04 각각의 탄성 (G')은 표 1에서 확인된다.

Gel A를 다음과 같이 제조하였다 .

혼합 단계에서, 구연산 (0.3% w/w CMCNa), 7H3SXF (6% w/w 탈이온수) 카르복시메틸 셀룰로스 및 탈이온수로 된 균질한 혼합물을 플래너터리 믹서 기법을 통해 수득하였다. 세(3)시간 혼합은 혼합물에 어떠한 덩어리도 형성되지 않게 하는데 충분하였다. 건조 단계에서, CA/CMC/물 혼합물을 실리콘 시트 위에서 얇은 층으로 밀어서 폈다. 층의 균질성은 균질적인 건조를 촉진하고, 물질 내 임의 잔류 응력을 방지하기 위해 중요하다. 건조 온도는 70℃였다. 1차 밀링 단계에서, 건조된 물질을 2 mm 스크린을 통한 절단 밀을 사용해 분쇄하였다. 1차 체질시, 분쇄된 물질을 100-1600 미크론으로 체질하였다. 제1 가교 단계에서, 선택 입자 크기 100-1600 미크론인 분말 5 g을 알루미늄 디쉬에 놓고, 8시간 동안 120℃에서 가교시켰다. 세척 및 건조 단계에서, 가교된 분말을 3시간 동안 일정하게 교반하면서 탈이온수에서 세척한 다음 여과하고, 70℃에서 건조시켰다. 2차 밀링 단계에서, 건조된 가교 물질을 1 mm 스크린을 통한 절단 밀을 이용해 분쇄하였다. 2차 체질 단계에서, 분쇄된 물질을 최종 선택 입자 크기 100-1000 미크론으로 체질하였다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 Gel A의 탄성 (G')은 표 2에서 확인된다.

Gel C 및 D를 다음과 같이 제조하였다 .

증류수에 NaCMC 7H3 및 7H4를 각각 용해하여, 전체 용액 중량을 기준으로 폴리머를 약 6 중량%로 포함하는 균질한 용액 (용액 A)을 제조하여, Gel C 및 Gel D를 수득하였다. 폴리(에틸렌 글리콜) 다이글리시딜 에테르 (PEGDE)를 물에 용해하여, 전체 용액 중량을 기준으로 PEGDE를 1 중량%로 포함하는 용액 (용액 B)을 제조하였다. 수산화나트륨을 물에 용해하여, 전체 용액 중량을 기준으로 NaOH (1M)를 4 중량%로 포함하는 스톡 용액 (용액 C)을 제조하였다. 용액 B (가교제)를 용액 A에 첨가하여, 폴리머와 PEGDE가 원하는 비율로 포함된 용액을 제조하였다. 촉매 첨가 제형의 경우, 용액 C를 폴리머 및 PEGDE의 용액에 첨가하여, 최종 용액 내 0.25 M 하이드록사이드 농도를 구축하였다. NaCMC, PEGDE (및 선택적인 NaOH, 촉매 첨가 제형의 경우)로 구성된 제조된 용액을 3시간 이상 혼합하여 균질하게 만들었다. 혼합물을 공기-대류 오븐에서 48시간 동안 50℃에서 증발 건조하여 캐스팅 (casting)하였다.

건조 후, 회수한 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 블랜더에서 과립으로 분쇄하였다. 분쇄된 물질을 체질하고, 100 - 1000　mm 크기의 분획을 수집하여 다음 단계에 사용하였다.

기계적 특성을 개선하기 위해, 필요에 따라, 폴리머/PEGDE 건조 믹스 (촉매 첨가 또는 무첨가)를 오븐에서 120℃에서 4시간 처리하여, 가교 반응을 완료하였다. 촉매로서 NaOH 및 PEGDE와 반응시킨 가교된 카르복시메틸셀룰로스 (글루코만난 또는 이의 혼합물)를 산성 수 (0.25M 염산)로 1-3시간 동안 헹궈, 미반응 물질과 부산물을 제거하고, pH를 7로 회복시켜 촉매를 중화하였다. 촉매없이 PEGDE와 반응시킨 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 증류수로 1-3시간 헹궈, 미반응 물질과 부산물을 제거하였다.

건조 후 수득되는 물질을 분쇄하고, 500 - 1000 미크론으로 체질하였다. 이 단계에서 수득된 최종 물질은 (기본 물질 7H3 및 7H4에 따라) Gel C 또는 Gel D로 표시한다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시, Gel C 및 D의 탄성 (G')은 표 2에서 확인된다.

PEGDA 5%, 10% 및 15% 겔을 다음과 같이 제조하였다.

PEGDA (Sigma-Aldrich, 700Da)를 증류수 (각각 5%, 10% 및 15%)에 용해하여 부드럽게 혼합하여, PEGDA 5%, PEGDA 10% 및 PEGDA 15% 샘플을 수득하였다. 광개시제 Darocur 1173(Basf)를 PEGDA 함량에 대해 3% w/w 함량으로 첨가하였다.

용액을 페트리 디쉬 (1.5ml, 35mm 디쉬)에 캐스팅하고, 온도 제어 (-40℃, 냉동 속도 -1℃/min) 하에 동결-건조기 (Virtis Advantage)에서 냉동시켰다. -40℃에서 1시간 둔 후, 샘플을 30초 또는 60초간 UV 광 (365nm, 2mW/cm²)에 노출시키고, 마지막으로 얼음 결정과 미반응 전구체를 제거하기 위해 증류수에서 팽윤시켰다. 그런 후, 물질을 50℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 수득한 샘플을 분쇄하여, 100-1000 미크론 입자를 수득하였다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시 각 PEGDA 겔의 탄성 (G')은 표 2에서 확인된다.

FIBER A ( 사일륨 메타무실 ) 겔 설명

메타무실은 여러가지 이점으로 사일륨 섬유를 함유한 섬유 보충제 브랜드이다. 사일륨은 플란타고 오바타 (Plantago ovata)의 천연 섬유 성분이다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시, FIBER A의 탄성은 표 2에서 확인된다.

FIBER B (미세결정 셀룰로스 ( AVICEL ) 겔 설명 .

AVICEL 셀룰로스 겔은 콜로이드형 미세결정 셀룰로스 (MCC)를 첨가하여 제조된 겔 네트워크이다. 지정된 양의 재생가능한 경재 및 연재 펄프로부터 변형된 것이다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시, FIBER B의 탄성 (G')은 표 2에서 확인된다.

FIBER C (글루코만난 ) 겔 설명 .

글루코만난은 곤약 식물로부터 추출된 식이성 식물 섬유이다. 이 섬유는 건강 상의 이점이 일본에서 이미 다년간 알려져 있다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시, FIBER C의 탄성 (G')은 표 2에서 확인된다.

FIBER D ( 구아르 검) 겔 설명 .

구아르 검은 하이드로콜로이드를 형성할 수 있는 생성물이다. 이는 인도와 파키스탄에 자생하는 콩과 초본 식물인 구아르 시아몹시스 테트라고놀로바 (Cyamopsis tetragonoloba)의 종자 내배유를 분쇄함으로써 수득되는데, 이의 종자는 수세기 동안 현지에서 식품으로 사용되고 있다. 주 성분은 특이적으로 중합된 만노스 및 갈락토스 유닛으로 형성된 삼당류인 갈락토만난으로, 이는 β-D-(1-4) 글리코시드 결합으로 조합된 α-D-만노피라노실 체인을 형성하고 있으며, 분자량이 약 200,000-300,000 달톤이고, 갈락토스의 짧은 측면 분지 1-6와 직쇄 1-4를 형성한다. SGF/물 (1:8)에서 팽윤시, FIBER D의 탄성 (G')은 표 2에 나타낸다.

하이드로겔/섬유 명칭	설명	SGF:물 1:8에서 탄성 (Pa)
Gel A	CMC ( LV )/CA - 하이드로겔*	1298
Gel C	CMC ( LV )/ PEGDE* - 하이드로겔	941
Gel D	CMC ( HV )/ PEGDE - 하이드로겔**	2,254
PEG 5%	PEGDA - 가교된 하이드로겔 - 5% 농도	380
PEG 10%	PEGDA - 가교된 하이드로겔 - 10% 농도	2,000
PEG 15%	PEGDA - 가교된 하이드로겔 - 15% 농도	5,500
FIBER A	사일륨	77
FIBER B	미세결정 셀룰로스	NA (불용성)
FIBER C	글루코만난	570
FIBER D	구아르 검	236
* LV - 저 점도 CMC (7H3)
** HV - 저 점도 CMC (7H4)

실시예 2 - 예로서 카르복시메틸셀룰로스 ( CMC )를 사용해 본 발명의 하이드 로겔을 특정화하기 위한 재료 및 방법.

인공 위액/물 (1:8)의 제조

SGF/물 (1:8) 용액 제조에 사용된 물질은 정제수, 소듐 클로라이드, 1M 염산 및 펩신이다.

1. 1L 메스 실린더 (graduated cylinder)에 물 약 880 mL을 붓는다.

2. 실린더를 자기 교반기 위에 놓고, 자기 막대를 넣어 교반을 개시한다.

3. pH 측정기를 사용해 물의 pH 모니터링을 시작한다.

4. pH 2.1 ± 0.1을 만들기 위한 충분한 양의 1M 염산을 첨가한다.

5. NaCl 0.2 g과 펩신 0.32 g을 첨가한다. 완전히 용해될 때까지 용액을 교반한다.

6. 자기 막대와 전극을 실린더에서 제거한다.

7. 900 mL 부피로 만들기 위해 필요한 양의 물을 첨가한다.

카르복시메틸셀룰로스 용액의 점도 측정

장치 및 재료:

정온 수조.

뚜껑이 달린 500 ml 유리 바틀, 바틀 입구 (neck)의 직경 80 mm 이상.

브록필드 점도계, model Myr VR3000 (EC0208) 또는 하기 장치가 장착된 유사 장치:

Spindle L4.

열 인쇄기 (PRP-058GI).

앵커 스테인리스 스틸 교반기가 수반된 기계식 오버헤드 교반기.

유리 제품을 고정하기 위한 체인 클램프.

랩 스파튤러.

알루미늄 도가니.

최소 0.001 g까지 칭량할 수 있는 분석 저울.

최소 0.1 g까지 칭량할 수 있는 보정된 저울.

정제수.

시험 샘플 준비:

후술한 바와 같이 CMC/물 용액 3가지를 준비하였다:

1. 아래 [B]에 기술된 바와 같이 CMC 분말의 수분량을 측정한다.

2. 아래 식에 따라 필요한 물의 양을 계산한다:

필요한 물 [g]= 3 * (99 - LOD _평균 ).

3. CMC 용액 제조에 필요한 물의 양을 계량해 비이커에 넣는다.

4. 이 물의 대략 절반을 바틀에 붓고, 나머지 물은 비이커에 둔다.

5. 바틀을 교반기 모터 아래에 놓고 체인 클램프로 고정한다.

6. 교반기를 삽입한다.

7. 샘플이 균일해지도록 혼합한다.

8. CMC 분말 3.0 ± 0.1 g을 계량하다.

9. 저속 (약 600 rpm)으로 혼합하면서, 바틀에 분말을 소량씩 넣는다.

10. 2분간 혼합하고, 혼합 속도를 1000 rpm으로 설정한다.

11. 10분 이상, 30분 이하로 혼합한다.

12. 나머지 물을 넣는다.

13. 다시 30분간 혼합한다.

14. CMC가 완전히 용해되지 않으면, 계속 교반한다.

15. CMC가 모두 용해되면, 앵커 스테인리스 스틸 교반기를 제거하고, 용기를 뚜껑으로 덮는다.

16. 플라스크를 25.0℃ ± 0.1 ℃ 정온 수조에서 적어도 30분간, 1시간 이하로 둔다.

17. 바틀을 10초간 세게 흔든다. 용액은 검사할 준비가 완료된다.

점도 측정:

1. 점도계 설명에 따라 각 샘플의 점도를 측정한다. 스핀들을 정확히 3분간 회전시킨다.

2. 용액 3종의 평균 점도를 결정한다.

건조시 중량 감소율 측정

카르복시메틸셀룰로스 또는 가교된 카르복시메틸셀룰로스의 수분 함량을 USP <731>, 건조시 중량 감소율에 따라 측정한다.

기구/장치

수분 분석기 Radwag, Model WPS 50S

랩 스파튤러

알루미늄 도가니

실리카 겔 데시케이터

절차

1. 샘플을 데시케이터에서 12시간 이상 둔다.

2. 수분 분석기의 저울 팬에 알루미늄 도가니를 놓고, 무게를 측정한다.

3. 알루미늄 도가니에서 샘플을 1.000 ± 0.005 g으로 정확하게 계량하여 넣는다. 샘플의 초기 무게는 W_i이다.

4. 샘플을 주변 압력 및 습도 하에 30분간 105℃에서 가열하도록 수분 분석기를 설정한다.

5. 수분 분석기의 전원을 켜고, LOD 프로그램 (105℃에서 30분)을 실행한다.

6. 샘플의 무게를 측정한다. 샘플의 최종 무게는 W_f이다.

LOD 값을 하기 식에 따라 계산한다:

LOD = (W_i-W_f)/W_i x 100%.

건조시 중량 감소율은 3세트로 측정하며, 기록된 LOD는 3개의 값의 평균이다.

입자 크기 범위 측정

장치 및 재료:

Sieve Shaker Retsch, Model AS 200 basic

메쉬 크기 100 ㎛ 및 1000 ㎛의 스테인리스 스틸 체

알루미늄 계량 팬

실험용 스테인리스 스틸 스파튤러

0.1 g까지 측정할 수 있는 보정된 저울.

절차:

1. 빈 체와 알루미늄 팬의 무게를 0.1 g까지 측정한다.

2. 분말 40.0 ± 0.1 g을 측정한다.

3. 100 ㎛ 및 1000 ㎛ 크기의 체들을 포어 크기가 큰 체는 위에 작은 체는 하단에 오도록 겹쳐 스택을 조립한다. 이의 하단에 알루미늄 팬을 조립한다.

4. 샘플을 스택 상부에 배치된 1000 ㎛ 체에 붓는다.

5. 스택을 교반기의 커버와 엔드 팬 사이에 배치하여, 샘플이 어셈블리 내에 유지되게 한다.

6. 교반기의 메인 스위치의 전원을 켠다.

7. 교반기의 노브 UV2를 연속 작동으로 설정한다.

8. 교반기의 노브 MN2를 오른쪽으로 돌려, 진동 높이가 50이 될 때까지 높인다.

9. 스택을 5분간 교반기에서 교반한다.

10. 체를 분리하고, 각각의 체의 무게를 다시 측정한다.

11. 단락 8에 기술된 바와 같이 각 체에서 검사 샘플의 중량%를 측정한다.

12. 전체 및 빈 검사 체의 무게를 측정한 후, 각 체 안에 있는 물질의 무게를 차이에 의해 구한다.

13. 비슷한 방식으로 수집 팬에 있는 물질의 무게를 구한다.

14. 각 체와 수집 팬에 있는 샘플의 무게를 이용해, 하기 식에 따라 분포 %를 계산한다:

W_χ%= W_χ/W_샘플 * 100%

식에서:

W_χ% = 인덱스 "_χ"가 다음과 같은 각 체 또는 수집 팬에서의 샘플의 무게 %:

">1000": 입자 크기 > 1000 ㎛.

"100-1000": 100 내지 1000 ㎛.

"<100" : 입자 크기 < 100 ㎛.

W_샘플 = 검사 샘플의 초기 무게.

탭 밀도 측정

장치 및 재료:

100 mL 유리 메스 실린더

100 mL 유리 비이커

랩 스파튤러

기계적 탭 밀도 검사기, Copley Scientific 사의 Model JV 1000

0.1 g까지 측정가능한 보정된 저울.

절차:

1. 테스트 샘플 40.0 ± 0.1 g을 계랑한다. 이 값을 M으로 한다.

2. 샘플을 건조된 100 mL 유리 메스 실린더에 넣는다.

3. 분말의 표면이 눌러지지 않게 조심하면서 평평하게 만들고, 미정의 겉보기 부피 V0를 가장 가까운 눈금 단위로 읽는다.

4. 기계적 탭 밀도 검사기를 설정해, 먼저 실린더를 500회 두드려 탭 부피 (tapped volume) V500을 가장 가까운 눈금 단위로 읽는다.

5. 750회 두드린 다음 탭 부피 V750을 가장 가까운 눈금 단위로 읽는다.

6. 2개의 부피 차이가 2% 미만이면, V750이 최종 탭 부피 Vf이고, 그렇지 않으면, 연속 측정 간의 차이가 2% 미만일 때까지, 탭 횟수를 필요에 따라 1250회 증가시켜 반복한다.

탄성 계수 (G') 측정

탄성 계수 (G')는 아래 기술된 프로토콜에 따라 측정한다. 사용한 유변량계는, Peltier Plate; Lower Flat plate Xhatch, 직경 40 mm; 및 Upper Flat plate Xhatch, 직경 40 mm가 장착된, TA Instruments 사의 Rheometer Discovery HR-1 (5332-0277 DHR-1)이거나 또는 이와 비슷한 장치이다.

절차

1. 자기 교반 막대를 100 mL 비이커에 넣는다.

2. 이 비이커에, 상기에서 제조한 SGF/물 (1 :8) 용액 40.0 ± 1.0 g을 넣는다.

3. 비이커를 자기 교반기 위에 놓고, 실온에서 천천히 교반한다.

4. 유산지를 사용해 가교된 폴리머 (예, 카르복시메틸셀룰로스) 분말 0.250 ± 0.005 g을 정확하게 계량한다 (W_in).

5. 분말을 비이커에 넣고, 자기 교반기를 사용해 와류 형성없이 30 ± 2분간 천천히 교반한다.

6. 형성된 현탁물에서 교반 막대를 꺼내고, 깔때기를 지지체 위에 장착한 다음 깔때기를 통해 현탁물을 붓고, 남아있는 물질은 스파튤러로 긁어 모은다.

7. 물질을 10 ± 1분간 배출시킨다.

8. 수득한 물질을 수집한다.

9. 유변량계를 사용해 물질에 대해 스위프 주파수 검사를 수행하여, 각주파수 10 rad/s에서 G' 값을 구한다.

측정은 3세트로 실시한다. 3번의 측정값의 평균을 G' 값으로 기록한다.

SGF /물 (1: 8)에서 매질 흡수율 측정

SGF/물 (1:8)에서 가교된 카르복시메틸셀룰로스의 매질 흡수율을 하기 프로토콜에 따라 측정한다.

1. 지지체 위에 건조된 프릿 유리 깔때기를 장착하고, 정제수 40.0 ± 1.0 g을 깔때기를 통해 넣는다.

2. 깔때기의 대 (neck)에서 방울이 떨어지지 않을 때까지 기다린 다음 (약 5분), 흡수지를 사용해 깔때기의 팁을 건조시킨다.

3. 깔때기를 비어있는 건조시킨 유리 비이커 (#1 비이커)에 넣고, 0으로 설정된 저울 위에 비이커를 두어, 빈 장치의 무게를 측정한다 (W_tare).

4. 100 mL 비이커 (#2 비이커)에 자기 교반 막대를 넣고; #2 비이커를 저울에 놓고, 무게를 측정한다.

5. 상기에서 준비한 SGF/물 (1:8) 용액 40.0 ± 1.0 g을 #2 비이커에 넣는다.

6. #2 비이커를 자기 교반기 위에 놓고, 실온에서 천천히 교반시킨다.

7. 가교된 카르복시메틸셀룰로스 분말 0.250 ± 0.005 g을 유산지 (W_in)를 사용해 정확하게 계량한다.

8. 이 분말을 #2 비이커에 넣고, 자기 교반기를 사용해 30 ± 2분간 천천히 와류 형성없이 교반시킨다.

9. 형성된 현탁물에서 교반 막대를 꺼내고, 깔때기를 지지체에 장착하여 이 현탁물을 깔때기를 통해 붓고, 스파튤러를 사용해 남아있는 물질을 모운다.

10. 물질을 10 ± 1분간 배출시킨다.

11. 배출된 물질이 담긴 깔때기를 #1 비이커에 넣고, 무게를 잰다 (W'_fin).

매질 흡수율 (MUR)을 다음과 같이 계산한다:

MUR = (W_fin - W_in) / W_in

W_fin은 하기 식에 따라 계산한 팽윤된 하이드로겔의 무게이다:

W_fin = W'_fin - W_tare.

W_in은 건조 샘플의 초기 무게이다. MUR은 가교된 카르복시메틸셀룰로스 샘플을 3세트로 사용해 측정하고, 3번 측정한 MUR 값의 평균을 기록한다.

실시예 3 - 동물 실험

C57BL6/J 마우스를 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 사용한 마우스 모두 실험 시점에 8-12주령이었다. 마우스를 특수 무균 조건 (pathogen-free condition) 하에 IFOM-IEO 캠퍼스 동물 시설에 두었다. 모든 실험은 실험 동물 관리 원칙에 따라 확립된 가이드라인 (지침 86 /609 /EEC)에 따라 수행하였다.

8주령의 C57BL6/J 암컷 및 수컷 마우스에 Gel B-02가 여러가지 농도 (2% - 4% - 6% - 8%)로 첨가된 사료 (chow diet)와 대응되는 대조군 사료 (4RF21 재펠릿화됨, Mucedola srl)를 4주간 제공하였다. Gel B-02에 대한 설명은 실시예 1의 표 1에서 확인된다.

4주간 공급 후, 마우스를 오전 6시간 동안 금식시키고, 꼬리 정맥에서 날카로운 메스로 절개한 작은 절개부로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈액 한 방울은 Roche (Accu-Chek Aviva, Roche) 사의 휴대용 전혈 글루코스 모니터를 사용해 혈당 수치를 직접 측정하고, 나머지 혈액 중 50 mL은 수집하여 ELISA (마우스 초민감성 인슐린 ELISA, Mercodia AB)에 의한 인슐린 농도 측정을 위해 혈장을 준비하였다.

4주간, 마우스의 무게를 측정하고, 음식물과 물 섭취를 모니터링하였으며, 변 샘플을 수집해 무게를 측정하였다. 4주 후, 마우스를 희생시켰다. 혈장을 수득하기 위해 심장에서 혈액을 채혈하고, 간, 부고환/서혜부 백색 지방세포 조직, 견갑골사이 갈색 지방세포 조직, 소장 및 대장을 각 마우스에서 수집하였다. 장의 여러 세그먼트를 파라포름알데하이드, L-라이신 pH 7.4 및 NaIO₄ (PLP 완충제) 또는 카르노이 고정제에서 고정하였다. 간을 PLP 완충제 또는 파라포름알데하이드에 고정하고, 갈색 및 백색 지방세포 조직은 파라포름알데하이드에 고정하였다.

사용된 마우스 모두 실험 시점에 8-12주령이었다. 마우스는 특수 무균 조건 하에 IFOM-IEO 캠퍼스 동물 시설에 두었다. 모든 실험은 실험 동물 관리 원칙에 따라 확립된 가이드라인 (지침 86 /609 /EEC)에 따라 수행하였다.

카르노이 고정 및 점액 염색

점액 층을 보존하기 위해, 조직을 카르노이 고정제 (에탄올, 빙초산, 클로로포름 6:1:3)에 고정하였다. 40분 (생체외 장기 배양) 또는 2시간 (생체내 실험) 고정 후, 조직을 무수 에탄올로 옮기고, 적어도 72시간 동안 +4℃에 보관하고, 가공 처리한 다음 파라핀 포매하였다.

그런 후, 조직을 Alcian Blue-PAS 레디 투 유즈 염색 키트 (NovaUltra^TM Alcian Blue/PAS Stain Kit, IHC WORLD)를 공급사의 설명서에 따라 사용해 염색하였다. Alcian blue는 산성 뮤신을 청색으로 강하게 염색하고, PAS (과옥소산 용액 및 쉬프 시약)는 중성 뮤신을 자홍색으로 염색할 것이다. 산성 뮤신과 중성 뮤신의 혼합물은 청보라색으로 염색될 것이다.

면역조직화학을 Ki67에 대해 카르노이 고정된 파라핀-포매된 조직에서 수행하였다. 조직 단편으로부터 파라핀을 히스톨레몬 (histolemon) 내에서 제거하고, 단계별 알코올 (graded alcohol) 시리즈를 사용해 수화 처리하였다. 항원 노출 (unmasking)을 50분간 95℃에서 Tris-EDTA pH 9를 사용해 수행한 다음 3% H₂O₂를 이용해 내인성 퍼옥시다제를 퀀칭하였다.

그런 후, 조직 단편을 Ki67 (ab15580, ABCAM)에 대한 일차 토끼 다클론 항체와 함께 실온에서 2시간 인큐베이션하고, 이차 항체 레디 투 유스 (DAKO Envision system HRP rabbit)와 실온에서 20분간 인큐베이션하였다. 조직 단편을 헹구고, 퍼옥시다제 (DAB, DAKO) 용액과 인큐베이션하였다. 그런 후, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색하고, 단계별 알코올 시리즈로 탈수 처리 후 히스톨레몬으로 세척하고, 마운팅하였다. 니콘 DS-5M 카메라와 연결된 올림푸스 BX51 와이드필드 현미경을 사용해 사진을 촬영하였다.

면역형광 및 공초점 현미경

장 샘플을 밤새 파라포름알데하이드, L-라이신 pH 7.4 및 NaIO4 (PLP 완충제)에서 고정하였다. 그 후, 이를 세척하고, 20% 슈크로스 내에서 적어도 4시간 동안 탈수 처리한 다음 OCT 화합물 (Sakura)에 넣었다. 10 ㎛ 냉동 절단 조직을 재수화시키고, 0.1M Tris-HCl pH 7.4, 2% FBS, 0.3% Triton X-100으로 차단 처리 후 다음의 항체로 염색하였다: 항-마우스 PLVAP (clone MECA32, BD Pharmingen), 항-마우스 CD34 (clone RAM34, eBioscience) 및 항-마우스 폐쇄띠 (zonula occludens) [ZO-1 (clone ZO1-1A12, Invitrogen)]. 그런 후, 슬라이스를 적절한 형광단 접합된 이차 항체와 인큐베이션하였다. 이미지 촬영 전, 핵을 4',6-다이아미딘-2-페닐인돌로 (DAPI)로 대조염색하고, 슬라이드를 VECTASHIELD® 마운팅 매질 (Cat.H-1000) 내에 마운팅하였다. 네일 폴리쉬로 커버슬립의 가장자리를 영구적으로 밀봉하였다. 슬라이드는 레이카 공초점 소프트웨어를 사용해 Leica TCS SP2 AOBS로 촬영하기 전까지 +4℃ 암 조건 하에 보관하였다. 사진은 오일 이머젼 (oil immersion) 대물렌즈 63X 또는 HCX PL APO 40X (NA 1.25) 오일 이머젼 대물렌즈를 사용해 입수하였다. 이미지 분석 및 형광 정량에는 Fiji 소프트웨어 패키지를 사용하였다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 값은 데이터의 분산에 따라 단일 변수에 대한 스튜던트 t-검정 또는 일원식 ANOVA 본페르니 다중 비교 검정을 이용해 비교하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

결과

이들 실험의 결과는 도 1-12에 나타낸다. 도 1은 마우스 공장 단편의 와이드필드 현미경 사진을 나타낸다. 청색 염색은 뮤신의 존재를 나타낸다. 진청색 점은 점액 생산을 담당하는 술잔세포를 나타내며, 이는 대조군 마우스와 비교해 하이드로겔 투여 마우스에서 증가되었다. 실험 마우스는 정상적인 점액 층을 가진 건강한 마우스였으므로, 하이드로겔이 정상 조직에서도 뮤신의 생산을 촉진하는 것으로 나타났다. 비슷한 결과는 회장 조직에 대한 도 2 및 맹장 조직에 대한 도 3에서도 확인된다.

도 4는 대조군 및 하이드로겔-투여 마우스의 결장 조직에 대한 뮤신 염색 결과를 보여준다. 다른 조직들과 비교해, 대조군 대비 하이드로겔 투여군은 결장 조직에 뮤신 함량이 크게 증가하였다. 특히, 하이드로겔 군은 우수한 뮤신 분포, 즉 진청색 염색이 더 넓게 분산되어 있었다. 장관의 이 부위는 다른 조직과 비교해 박테리아가 더 많고, 스트레스를 더 많이 받는 부위로, 이는 하이드로겔이 스트레스 받은 조직에 더 큰 효과적임을 시사한다.

도 5는 대조군의 결장 조직에 대한 ZO-1 염색 결과 (적색)를 나타낸 것이다. 2번째 단과 3번째 단의 사진은 밀접 정션 단백질 ZO-1의 수준이 낮음을 보여준다.

도 6은 8% 하이드로겔 보충된 사료 군의 결장 조직의 ZO-1 염색 결과를 보여준다. 대조군 도 7과 비교해, 이 군에서는 밀접 정션 단백질 ZO-1의 현저한 증가, 즉 상피 장벽의 견고성 증가가 관찰된다.

도 8-12는 회장 조직의 ZO-1 염색 결과를 나타낸 것이다. 회장에는 박테리아가 많이 존재하므로, ZO-1은 정션 조직에서 현저하게 발현되며, 대조군과 겔-처리 제품 사이에 차이는 관찰되지 않는다.

이들 결과는, 하이드로겔-보충된 사료가 마우스에서 장 조직 재생 패턴을 유도함을, 보여준다. 특히, 밀접 정션의 형성이 결장에서 관찰되었다. 또한, 적절한 탄성을 가진 물질을 사료에 첨가하였을 때 점액 재생도 관찰되었다. 최상의 재생을 좌우하는 것은 첨가된 물질의 최적의 탄성 값이다. 더 낮은 그리고 더 높은 탄성은 하위의 재생 패턴을 나타낸다.

실시예 4 - 인간 조직 샘플을 이용한 시험관내 실험

암 수술을 받은 환자의 건강한 조직으로부터 건강한 결장 샘플을 수득하였다. 병리학자에 의해 근육층으로부터 점막층을 분리하였으며, 이는 정균 항생제가 첨가된 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)에 넣어 4℃ 하에 실험실로 이송하였다. 샘플은 맹검 처리하였다.

깨끗한 점막층을 HBSS 완충제로 헹구고, 멸균 메스로 1 cm² 조작으로 잘랐다.

카브 실린더 (cave cylinder) (보로실리케이트 클로닝 실린더, 마우스 샘플의 경우 6x6mm, 인간 샘플의 경우 8x8, BellCo)를 점막의 정상면 (apical face)에 외과용 글루 (Vetbond, 3M, Milan, Italy)를 사용해 접착하였다. 이후, 센터 웰 장기 배양 디쉬 (BD Falcon)에서, 점막을 소 태아 혈청으로 미리 세척한 멸균 메탈 그리드 상에 배치하고, 15% FBS, 글루타민, 상피 성장 인자 (200 ng/ml, Peprotech) 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X (10 μl/ml, Gibco)를 포함하는 DMEM 1 mL을 플레이트의 센터를 채우도록 부었다.

조직은 5% 이산화탄소 배양기에 넣어 37℃에서 1시간 두어, 점액이 재구축되도록 하였다. 점액 재구축 후, 카브 실리더에 완전 배지, PBS (Phosphate Buffer Saline) 및 여러가지 겔 제형 Gel B-01, Gel B-02, Gel B-03 및 Gel B-04를 각각 넣었다. 각각의 Gel B-01, Gel B-02, Gel B-03 및 Gel B-04 제형들은 약하게 교반하면서 PBS 내에서 30분간 37℃의 일정 온도에서 수화시켰다. 처리된 조직은 5% 이산화탄소 배양기에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 조직을 카르노이 고정제로 40분간 고정하고, 무수 에탄올 내에 넣어 이송한 다음 가공 처리 및 파라핀 포매하기 전 적어도 72시간 동안 +4℃에서 보관하였다.

결과

이들 실험의 결과는 도 13에 나타내며, 도에서 청색 염색은 점액 층을 표시한다. 표시된 매질 및 PBS는 하이드로겔로 처리되지 않은 조직 샘플을 표시한다. Gel B-01, Gel B-02, Gel B-03 및 Gel B-04는 실시예 1의 표 1에 언급된 것이다. 하이드로겔 Gel B-01은 구연산과의 혼합물로 투여하였다. 점액 층 재생에 대한 하이드로겔 탄성의 명백한 효과가 관찰되었다. Gel B-03이 가장 우수한 재생 특성을 나타내었다 (더 진하고 균일하게 분포된 청색 영역, 염증성 면역 세포의 침윤이 훨씬 적음). 가교 정도가 더 낮은 경우 (Gel B-02)와 더 높은 경우 (Gel B-04) 역시 점액 재생 패턴을 촉진하지만, Gel B-03 보다는 정도가 낮았으며, 뮤신이 최적으로 분포된 것 (연장된 패턴)은 아니었다. 비-가교된 카르복시메틸셀룰로스 (Gel B-01)는 재생 특성이 불량하였으며, PBS 조직 샘플 역시 그러하였다.

실시예 5 - 생체내 점막염 모델

위장 점막염은 대장암의 항암 요법에 일반적으로 사용되는 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항암 화학요법의 일반적인 부작용이다. 점막염은 심한 통증을 동반하기 때문에 대부분의 암 환자의 삶의 질을 떨어뜨릴뿐 아니라 호중구 감소증 및 영양 실조로 인한 패혈증의 고위험 요인이기도 하다. 따라서, 이러한 연관성으로 점막염은 임상적으로 중요한 질환이 되었으며, 점막염-관련 증상을 완화할 수 있는 임의의 보완제 (complementary agent)가 상당히 유용할 것이다. 본 실험을 수행하여, 짧은 5-FU 코스 후 투여된 하이드로겔이 질환 프로세스를 변형시키고 점막염의 중증도를 최소화하는지를 확인하였다.

방법

Charles River 사에서 입수한 8주령의 수컷 C57B6/J 마우스 15마리를 본 실험에 사용하였다. 동물은 12시간 주/야 사이클로 온도-제어된 환경 하에 펠릿 사료 및 물에 자유롭게 접근가능하게 하여 수용하였다. 모두 1일에 5-FU 볼루스 (450mg/kg 복막내)를 투여한 후, 3일 더 5-FU를 50mg/kg으로 복막내 투여하였다. 5-FU에 노출시킨 후, 마우스를 군당 5마리씩 3개의 실험군으로 무작위 분류하였다; 1) 사료 (Chow diet) 단독, 2) Gel B-02 2% 첨가 사료, 또는 3) Gel B-02 4% 첨가 사료, 5일간. 매일 체중을 기록하였으며, 마지막 5-FU 투여 후 5일째에 동물을 희생시켰다.

통계 분석

모든 실험 분석 결과에서, 각 군의 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 각 군의 평균에 대한 통계학적 유의성을, 유의성 수준 α = 0.05에서, 일원식 ANOVA 또는 이원식 ANOVA 및 다중 비교를 위한 본페로니 사후 검증으로 검정하였다.

결과

5-FU를 매일 투여한 결과 전체 군에서 체중이 빠르게 감소하였다. 체중 감소는 모든 군에서 계속되었지만, Gel B-02 4%는 하이드로겔 투여 4일간 체중이 점차적으로 회복되었으며, 사료 식이 마우스와 비교해 9일째에 통계학적 유의한 차이를 나타내었다 (p<0.01) (도 14).

9일째에, 결장 조직을 수집하였으며, 장 염증의 파라미터로서 결장 길이를 측정하여 결장 단축을 비교하였다. Gel B-02 2% 첨가 사료 및 Gel B-02 4% 첨가 사료를 먹은 마우스의 결장은, 사료 대조군 단독과 비교해 결장 길이의 현저한 (각각 p<0.005 및 p<0.01) 개선이 관찰되었으며, 정상 길이로 거의 완전히 회복되었다 (도 15).

실시예 6 - 생체외 장기 배양 및 겔 실험.

실험의 목적은 여러가지 탄성 특성을 가진 하이드로겔의 장 조직 건강 및 재생 특성을 보존하는 능력을 조사하는 것이었다.

Charles River Labs에서 입수한 C57BL6/J 마우스의 건강한 결장 조직으로부터 샘플을 수득하였다.

깨끗한 점막 층을 15% 소 태아 혈청 (FBS), 글루타민 (2mM), 상피 성장 인자 (200 ng/ml, Peprotech) 및 인슐린-프랜스페린-셀레늄-X (10 ㎕/ml, Gibco)가 첨가된 둘베코의 변형 이글 배지로 세척하고, 멸균 메스로 1 cm² 조각으로 절단하였다.

카브 실린더 (보로실리케이트 클로닝 실린더, 마우스 샘플의 경우 6x6mm, BellCo)를 점막의 정상면에 외과용 글루 (Vetbond, 3M, Milan, Italy)를 사용해 접착하였다. 이후, 센터 웰 장기 배양 디쉬 (BD Falcon)에서, 점막을 소 태아 혈청으로 미리 세척한 멸균 메탈 그리드 상에 배치하고, 15% FBS, 글루타민, 상피 성장 인자 (200 ng/ml, Peprotech) 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X (10 ㎕/ml, Gibco)를 포함하는 DMEM 1 mL을 플레이트의 센터를 채우도록 부었다.

점액이 재구축되면 (하이드로겔 없이 37℃에서 1시간), 결장 조직을 여러가지 탄성을 가진 하이드로겔, 즉 Gel B01 (탄성이 가장 낮은 하이드로겔), 02, 03 및 04 (탄성이 점차적으로 높은 하이드로겔)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 및 매질 처리된 조직을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다.

인큐베이션한 다음 조직을 카르노이로 고정하고, 파라핀으로 포매하여 조직 단편을 수득하였다. 이 조직을 일반적으로 장 내용물에 노출되는 면만 매질 또는 하이드로겔에 노출시켰다. 조직 단편을 (점액 및 점액-분비 세포를 가시화하기 위해) Alcian Blue/PAS 또는 (세포 증식을 검출하기 위해) Ki-67 항체로 염색하였다.

이 실시예에서 참조한 겔은 실시예 1의 표 1 및 2에 기술된 바와 같이 제조하였으며, 실시예 2에 기술된 바와 같이 특정화하였다.

결과:

A) 여러가지 탄성 수준을 가진 CMC /CA 하이드로겔 비교:

부가적인 독립 실험들 (실시예 4의 여러가지 마우스 및 인간 조직)의 분석으로부터, Gel B02 및 Gel B03가 조직 구조 온전성, 점액 층 생산 및 온전성 (도 16에서 Alcian Blue/PAS 염색으로 확인됨)과 증식 능력 (갈색으로 나타난 Ki-67 양성 핵의 존재에 의해 확인됨)을 보다 잘 보존하는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는, Gel B02 및 B03가 보다 조직 순응적이며, 이들의 탄성 범위가 바람직함을, 시사해준다.

B) 여러가지 탄성 수준을 가진 CMC /CA 하이드로겔과 비슷한 탄성 수준을 가진 CMC / PEGDE 하이드로겔의 비교: 파트 1.

도 17에서 비슷하거나 또는 다른 강성 (stiffness) 특성을 가진 겔 (예, Gel B-02와 Gel D 비교, Gel A와 Gel C 비교; Gel B-02 및 D와 Gel A 및 C의 비교)을 분석한 바, Gel B-02 및 Gel D가 보다 우수하지만, 결장 조직 대해 비슷한 보존 효과를 가지며, 구조 온전성 및 점액 층 생산과 온전성을 보존하는데 우수한 것으로, 나타났다. 반면, Gel A 및 Gel C는 조직 온전성 효과는 불량하지만, Gel A가 Gel C 보다 우수하였다. 이는, Gel B-02 및 Gel D가, Gel A 및 Gel C와 비교해, 더 높은 및 비슷한 점탄성 특성으로 인해, 조직 순응성이 더 높은 것으로 보인다.

CMC 타입 또는 가교제를 달리하였을 때 CMC 하이드로겔들 간의 조직 건강 및 재생은 비슷하지만, 탄성 수준은 영향을 받는 것으로 관찰되었다.

상피 및 점막 건강과 재생을 촉진하는 하이드로겔은 고 점도 또는 저 점도의 CMC를 이용하여 수득할 수 있으며, 탄성이 적절한 범위인 한 여러가지 타입의 가교제를 이용함으로써 수득할 수 있는 것으로 보인다.

C) 여러가지 탄성 수준의 CMC /CA 하이드로겔과 비슷한 탄성 수준의 PEGDA 하이드로겔의 비교: 파트 2.

도 18에 나타낸 Gel B 및 PEGDA 겔의 분석으로부터, 비슷한 점탄성/강성 특징을 가진 화합물 (Gel B-01 및 PEGDA 5%; Gel B-02 및 PEGDA 10%; Gel B-03 및 PEGDA 15%)이, 구조 보존 및 점액 층 생산 및 온전성 측면에서 결장 조직에 비슷한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 결론적으로, 겔의 점탄성 특성을 조절하여, 조직 반응을 다양하게 만들 수 있다.

조직 건강 및 재생은, 물론 PEG 백본을 가진 하이드로겔을 이용한 경우에 탄성 수준에 의해 영향을 받는 것으로 관찰되었다. PEG 하이드로겔에 의해 달성되는 조직에 대한 최적 효과는 PEG 5% 내지 PEG 15%에 의해 제공된 탄성 수준 사이였다. 그러나, CMC 기반의 하이드로겔이 비슷한 탄성 범위에서 보다 양호한 결과를 나타내었다. 이러한 관찰 결과는, 재생 패턴에 있어 조성물 물질과 관련된 부가적인 효과가 있다는 것을 의미한다. 이는 미생물총 효과 또는 기타 효과와 관련있을 수 있다.

이들 결과 및 관찰 결과로부터, 광범위한 하이드로겔을 상피 조직 및 점막 건강과 재생을 위해 사용할 수 있음이 명백하게 확인되었다. 하이드로겔 탄성은 중요한 파라미터이다. 하이드로겔 조성물은 재생 패턴에 추가적인 효과를 제공하는 것으로 보이며, 따라서 물질의 적절한 조성 및 적절한 탄성 범위가 커플링된 하이드로겔의 사용이 제안된다. 바람직하게는, 흡수성이 더 높고 생체접합성이 우수한 하이드로겔이 보다 효과적이고 안전한 투여와 사용이 가능하므로, 이를 사용하여야 한다.

D) 여러가지 탄성 수준을 가진 비- 가교된 섬유들 간의 비교.

이러한 분석으로, 섬유 C가 일부 조직 구조 온전성 및 점액 층의 생산과 온전성을 보존하는 것으로 나타났다 (도 19에서 Alcian Blue/PAS 염색에 의해 확인됨). 섬유 A 및 섬유 D는 조직 및 점액 온전성에 부정적인 효과를 나타내는 것으로 보인다.

이러한 분석의 관찰 결과, 조직 건강과 재생이 기능성 섬유의 기계적 특성을 통해 개선되지 않으며, 특히 미세결정 셀룰로스와 같은 불용성 섬유에 의해 개선되지 않는 것으로 보인다. 글루코만난과 같이 높은 수준의 탄성을 나타내는 섬유는 이의 높은 탄성과 관련하여 약간의 개선을 나타내었다. 그러나, 비-가교된 섬유는 기계적 효과를 통해 적절한 재생 패턴을 제공하지 않는다. 따라서, 글루코만난 및 기타 용해성 다당류는 이의 비-가교된 형태로 사용하기에 바람직하지 않은 것으로 결론내릴 수 있다.

본원에 언급된 특허 및 관학 문헌들은 당해 기술 분야의 당업자가 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개된 또는 비공개된 미국 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 선행 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 모든 공개된 참조문헌, 문헌, 메뉴스크립트 및 과학 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명이 바람직한 구현예들을 들어 구체적으로 기술 및 설명되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 첨부된 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 이탈하지 않으면서 다양한 형태 및 상세 내용에 대해 수정을 가할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 기술된 구현예들은 상호 배타적이지 않으며, 다양한 구현예들의 특징들은 본 발명에 따라 그 전체가 또는 일부가 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

장 투과성-관련 (gut permeability-related) 질환 또는 장애를 필요한 개체에서 예방 또는 치료하는 방법으로서,
상기 개체의 위장관에, 탄성 계수 (elastic modulus, G')가 적어도 약 500 Pa 내지 약 10,000 Pa인 가교된 하이드로겔을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서,
상기 탄성 계수 (G')가 약 1000 Pa 내지 약 9,000 Pa인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 탄성 계수 (G')가 약 600 Pa 내지 약 9,000 Pa인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 탄성 계수 (G')가 약 800 Pa 내지 약 8,000 Pa인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 탄성 계수 (G')가 약 1000 Pa 내지 약 6,000 Pa인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 가교된 다당류인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 위염, 소화성 궤양, 십이지장 궤양, 위식도 역류 질환 (GERD), 위산 역류 (acid reflux), 호산성 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 셀리악 질환 (celiac disease), 식품 알레르기, 과민성 장 증후군 (IBS), 감염성 대장염, 위장관의 감염 또는 외상, 위장관 염증, 장 급성 방사선 증후군 (gut acute radiation syndrome), 환경성 장병증 (environmental enteropathy), 점막염, 혼성 결합 조직 질환 (mixed connective tissue disease, MCTD), 만성 염증, 급성 염증, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 1형 진성 당뇨병, 만성 알코올 중독의 후유증, 호흡기 감염 및 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 크론 질환, 궤양성 대장염, 헬리코박터 필로리 (H. pylori); 살모넬라 spp.; 쉬겔라 (Shigella); 스타필로코커스 (Staphylococcus); 캄필로박터 (Campylobacter); 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile); 병원성 대장균 (pathogenic Escherichia coli); 예르시나 (Yersinia); 비브리오 spp.; 칸디다 (Candida); 지아르디아 (Giardia); 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica); 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis); 로타바이러스; 노로바이러스; 아데노바이러스; 및 아스트로바이러스 (astrovirus)에 의한 감염으로부터 선택되는 감염, 화학요법-유발성 구강 또는 장 점막염, 관절염, 패혈증, 자폐증 스펙트럼 장애 (autism spectrum disorder), 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 공유적으로 가교된, 방법.
제10항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 폴리카르복시산 또는 2관능성 (bifunctional) PEG와 가교된, 방법.
제11항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 PEGDE 또는 구연산과 가교된, 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 하이드로겔이 구연산과 가교된 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
위장 투과성 관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
탄성 계수 (G')가 500-10000 Pa인 하이드로겔을 포함하며, 경구 투여에 적합한 투약 형태 (dosage form)인, 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 하이드로겔이 가교된 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는, 약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 구연산 또는 2관능성 PEG와 가교된, 약학적 조성물.
필요한 개체에서 장 투과성-관련 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서,
상기 질환 또는 장애가 위장관 이외의 조직에 영향을 미치고,
상기 개체의 위장관에 하이드로겔을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 하이드로겔이 상기 개체에 경구로 투여되는, 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 혼성 결합 조직 질환; 만성 염증; 급성 염증; 간 질환; 만성 알코올 중독의 후유증; 감염; 및 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제20항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 관절염, 패혈증, 비-알코올성 지방간염, 비-알코올성 지방간 질환, 간경변, 간세포암, 만성 알코올 중독의 후유증, 호흡기 감염, 자폐증 스펙트럼 장애, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 가교된 친수성 폴리머를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서,
상기 친수성 폴리머가 다당류인, 방법.
제23항에 있어서,
상기 다당류가 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
제24항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 공유적으로 가교된, 방법.
제26항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 폴리카르복시산과 가교된, 방법.
제27항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 구연산 또는 2관능성 PEG와 가교된, 방법.
제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 약 500 Pa 내지 약 10000 Pa의 탄성 계수 (G')를 가지는, 방법.
제29항에 있어서,
상기 탄성 계수가 약 1000 Pa 내지 약 8000 Pa인, 방법.
제29항에 있어서,
상기 탄성 계수가 약 1000 Pa 내지 약 6000 Pa인, 방법.
위장 (GI) 관의 점막 조직을 복구 또는 재생하는 방법으로서,
탄성 계수 (G')가 약 500 Pa 내지 약 10000 Pa인 하이드로겔을 복구 또는 재생이 필요한 점막 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
위장 (GI) 관의 밀접 정션 (tight junction)의 형성을 촉진하는 방법으로서,
탄성 계수 (G')가 약 500 Pa 내지 약 10000 Pa인 하이드로겔을 복구 또는 재생이 필요한 위장관과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
GI 관에서 일시적인 스캐폴드를 형성하는 방법으로서,
GI 관을, 탄성 계수 (G')가 약 500 Pa 내지 약 10000 Pa인 하이드로겔과 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 하이드로겔이 GI 관 내에 스캐폴드를 형성하고,
상기 스캐폴드가 세포-생체물질 상호작용, 세포 부착, 세포 생존, 증식 및 분화를 위한 조절 인자, 영양분 및 가스의 충분한 수송 또는 이들의 임의 조합을 촉진하고,
상기 일시적인 스캐폴드는, 장 내강 (intestinal lumen)이 하이드로겔과 접촉되기 전 GI 관의 염증 정도와 비교해, GI 관의 염증을 증가시키지 않는, 방법.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 가교된 친수성 폴리머를 포함하는, 방법.
제35항에 있어서,
상기 친수성 폴리머가 다당류인, 방법.
제35항에 있어서,
상기 다당류가 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
제37항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 고 점도의 카르복시메틸셀룰로스인, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 공유적으로 가교된, 방법.
제39항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 폴리카르복시산과 가교된, 방법.
제39항에 있어서,
상기 카르복시메틸셀룰로스가 구연산 또는 2관능성 PEG와 가교된, 방법.
제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔이 약 500 Pa 내지 약 10000 Pa의 탄성 계수 (G')를 가지는, 방법.
제42항에 있어서,
상기 탄성 계수가 약 1000 Pa 내지 약 8000 Pa인, 방법.
제43항에 있어서,
상기 탄성 계수가 약 1000 Pa 내지 약 6000 Pa인, 방법.
제1항 또는 제15항에 있어서,
제2 치료학적 물질의 공동-투여를 더 포함하는, 방법.
제6항, 제23항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당류가 변형된 셀룰로스인, 방법.