CN109745566A - 基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法。通过在低温条件下，将组氨酸短肽与活性生物大分子同时溶解；后与聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液混合；涡旋条件下加入金属盐溶液进行反应，完成反应后，通过离心洗涤得到包裹活性生物大分子的金属有机配位聚合物纳米颗粒。本发明方法简便，快速，条件温和。借助组氨酸短肽与金属配位聚合形成的纳米颗粒，能将生物大分子高效包裹于其中，并能大量、快速地将生物大分子运输进入细胞内部，且使其保持良好的生物活性。

Description

基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的 方法

技术领域

本发明属于纳米药物技术领域，具体设计的是基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法。

背景技术

近年来，随着研究者们对癌症研究的不断深入，癌症的靶向治疗和生物治疗逐渐发展成为一个活跃的研究领域。生物大分子药物在这一领域发挥着不可替代的作用。生物大分子药物主要包括：蛋白质、核酸、多肽、抗体等。其主要优点在于大部分生物大分子药物具有高度的特异性以及高效性，作为最具前途的癌症治疗方法之一，在肿瘤治疗中得到广泛应用。但是，生物大分子的临床应用仍面临着诸多问题，包括：生物大分子的结构复杂，容易变性，使得生物活性降低，免疫原性增强；且绝大多数的生物大分子无法进入细胞内发挥作用等。

为了解决生物大分子在临床应用中面临的问题，研究者们研发了多种药物载体用于包载生物大分子药物。金属有机配位聚合物作为一种新型的载药体系，其具有结构多样性、表面积大、可调的粒径及孔径大小和pH值响应性等特点，使得金属有机配位聚合物在药物递送和癌症治疗的发展中得到了广泛关注。2012年，Deng H等人，在《Science》上发表了一种方法，能够扩大MOF孔径，使得生物大分子能够进入其孔径内部；2014年Fengjiao Lyu等人在《Nano Letter》上发表了利用ZIF-8包裹PVP修饰的胞嘧啶，其过氧化物酶活性是游离胞嘧啶的10倍；同年，Mirkin，C.A. 报道了一种具有生物相容性的无限-配位-聚合物纳米粒子核酸结合物用于抗敏感基因的调节；2015年，Liang Kang等人《NatureCommunication》上报道了利用金属有机框架对生物大分子进行生物矿化，大大增加了生物大分子对外界环境的耐受力，且具有缓释及pH值响应性等优点，等等。

但是，利用基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法仍未见有报道。而且，构建同时具有高的药物装载率，pH值响应性释放，并能大量、快速地将生物大分子运输进入细胞内部，且保持良好生物活性的载药体系，仍是纳米技术领域的一个难题。

发明内容

本发明针对现有纳米载药技术存在的不足，提供基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法。本发明方法简便，快速，条件温和。借助组氨酸短肽与金属配位聚合形成的纳米颗粒，能将生物大分子高效包裹于其中，并能大量、快速地将生物大分子运输进入细胞内部，且使其保持良好的生物活性。

本发明公开了一种基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，在0～4℃下，通过将组氨酸短肽与活性生物大分子同时溶解；后与聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液混合；涡旋条件下加入金属盐溶液进行反应，完成反应后，通过离心洗涤得到包裹活性生物大分子的金属有机配位聚合物纳米颗粒。

本发明进一步设置为所述组氨酸短肽为3～12个组氨酸聚合的短肽。

本发明进一步设置为所述组氨酸短肽与金属盐的质量比为2～10: 1。

本发明进一步设置为所述组氨酸短肽与生物大分子的质量比为1 :0.001～1。

本发明进一步设置为所述聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为1～20 mg/mL。

本发明进一步设置为所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为10000～60000。

本发明进一步设置为所述缓冲溶液包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、三羟甲基氨基甲烷、双2-羟基乙胺基三羟甲基甲烷、2-(N-吗啡啉）乙磺酸。

本发明进一步设置为所述缓冲溶液的浓度为0.01～1 M，pH值范围在7.0 ~ 9.0。

本发明进一步设置为所述金属盐为硝酸锌、三氯化铁、氯化锆、硫酸铜中的任意一种。

本发明进一步设置为所述溶剂为去离子水或二甲基亚砜等溶剂。

本发明进一步设置为所述包载生物大分子包括：蛋白质、核酸、短肽、抗体、糖类、脂类等。优选：牛血清蛋白、CpG短单链DNA分子、抗体、Gp100 抗原肽、SIINFEKL多肽、葡聚糖等。

本发明的有益效果是：本发明提供的制备方法过程简单，快速，条件温和。利用该法制备的颗粒有诸多优点：（1）包载了生物大分子的金属有机配位聚合物颗粒粒径较为均一；（2）能够装载不同分子量大小及不同种类的生物大分子，且具有高效的药物装载率；（3）能够将生物大分子快速、大量运输进入细胞，且有效保持生物大分子活性，载体能在细胞内快速降解。

基于以上效果，本发明得到的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物纳米颗粒可被广泛应用于各种生物大分子的胞内递送。

附图说明

图1是实施例1制备的包载了牛血清蛋白的基于His₆的金属有机配位聚合物纳米颗粒透射电子显微镜照片；

图2是实施例1制备的包载了牛血清蛋白的基于His₆的金属有机配位聚合物纳米颗粒的粒径分布图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

在4 ℃避光条件下，将2 μL 浓度为2 mg/mL异硫氰酸荧光素修饰牛血清蛋白（FITC-BSA）的水溶液，与50 μL浓度为7.8 mg/mL的六聚组氨酸（His₆）水溶液混合；再加入48 μL含10 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液；将上述溶液混合均匀，在涡旋条件下，缓慢滴加5μL浓度为0.1 M硝酸锌的水溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心12分钟后去上清；用去离子水洗涤3遍，得到包载FITC-BSA的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒。利用透射电子显微镜（TEM）观察，所形成的纳米颗粒为不规则球形，如图1所示。进一步利用纳米粒度仪表征，得到其颗粒平均粒径约为140 nm，如图2所示。

如下评估包载了FITC-BSA的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒进入细胞情况：将包载了FITC-BSA的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒与树突状细胞共同孵育2小时后，将样品用PBS洗涤3遍；用活细胞显微镜观察，结果显示：在与细胞共同孵育2小时后，与对照组相同浓度的单纯的FITC-BSA相比，基于六聚组氨酸-锌的（His₆-Zn）配位聚合物纳米颗粒能够将FITC-BSA大量运输进入到细胞内。这一结果表明，该金属有机配位聚合物具有强大的胞内运输能力。

实施例2

在4 ℃条件下，将2 μL 浓度为2 mg/mL 的抗核孔复合物蛋白抗体（Anti-nuclearpore complex protein （Anti-NPC））水溶液，与50 μL浓度为7.8 mg/mL的六聚组氨酸水溶液混合；加入48 μL含10 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液；将上述溶液混合均匀，在涡旋条件下，缓慢滴加5 μL浓度为0.1 M的硝酸锌水溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心12分钟后去上清，用去离子水洗涤3遍，得到包载Anti-NPC抗体的His₆-Zn金属有机配位聚合物纳米颗粒。

如下评估Anti-NPC抗体被运输进入细胞后的活性保持情况，将包载了Anti-NPC抗体的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒与树突状细胞共同孵育12小时后，将样品用PBS洗涤3遍；4 %多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗涤3遍；用0.1 % Triton处理20分钟后，PBS洗涤3遍；5 %牛血清水溶液封闭1小时后，PBS洗涤3遍；利用稀释500倍的山羊抗小鼠IgG H&L（AlexaFluor^® 594）二抗室温避光孵育1小时后，PBS洗涤3遍；用5 ug/mL DAPI溶液染细胞核20分钟后，PBS洗涤3遍；滴加防荧光淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示：与对照组相比，Anti-NPC抗体被大量运输进入细胞内部，且在细胞核周围形成一圈红色荧光环。这一结果表明，Anti-NPC抗体进入细胞后依旧保持活性，能够与细胞核上的核孔复合物蛋白结合。

实施例3

在4 ℃条件下，将5 μL 浓度为3 mg/mL 的抗微管蛋白（Anti-β-tubulin）抗体水溶液，与50 μL浓度为10 mg/mL 的九聚组氨酸（His₉）的水溶液混合；加入60 μL 含5 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液；将上述溶液混合均匀，在涡旋条件下，缓慢滴加10 μL浓度为0.1 M硝酸锌的水溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心12分钟后去上清，用去离子水洗涤3遍，得到包载了Anti-β-tubulin抗体的His₉-Zn配位聚合物纳米颗粒。

实施例4

在4 ℃条件下，将2 mg葡聚糖溶解于0.5 mL浓度为8 mg/mL His₆的水溶液中，再与1mL含10 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液混合均匀；在涡旋条件下，缓慢滴加40 μL浓度为0.1 M氯化锆的水溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心30分钟后去上清，用去离子水洗涤3遍，得到包载了葡聚糖的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒。

实施例5

在4 ℃条件下，将0.5 mg OVA多肽溶解于1 mL浓度为8 mg/mL 十二聚组氨酸（His₁₂）的二甲基亚砜溶液中，与1 mL含10 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜溶液混合均匀；在涡旋条件下，缓慢滴加30 μL浓度为0.1 M硝酸锌的二甲基亚砜溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心12分钟后去上清，用去离子水洗涤3遍，得到包载了OVA多肽的His₁₂-Zn配位聚合物纳米颗粒。

实施例6

在4 ℃条件下，将0.1 mg CpG短链DNA分子溶解于0.5 mL浓度为8 mg/mL His₆的水溶液中，与1 mL含10 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液混合均匀；在涡旋条件下，缓慢滴加40 μL浓度为0.1 M氯化锆的水溶液，反应15 min后，在12000 rpm/min的离心速度下，离心12分钟后去上清，用去离子水洗涤3遍，得到包载了CpG短链DNA分子的His₆-Zn配位聚合物纳米颗粒。

本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实验方案都只能认为是对本发明的说明，权利要求指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出发明的范围。因此，在与本发明的权利要求说明书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于，在0～4℃下，将组氨酸短肽与活性生物大分子同时溶解；后与聚乙烯吡咯烷酮的缓冲溶液混合；涡旋条件下加入金属盐溶液进行反应，完成反应后，通过离心洗涤得到包裹活性生物大分子的金属有机配位聚合物纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述组氨酸短肽为3～12个组氨酸聚合的短肽。

3.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述组氨酸短肽与金属盐的质量比为2～10: 1。

4.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述组氨酸短肽与生物大分子质量比为1 :0.001～1。

5.根据权利要求1所述基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为1～20 mg/mL。

6.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述缓冲溶液的浓度为0.01～1 M，pH值范围在7.0 ~ 9.0。

7.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述金属盐为硝酸锌、三氯化铁、氯化锆、硫酸铜中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述溶剂为去离子水或二甲基亚砜溶剂。

9.根据权利要求1所述的基于组氨酸短肽的金属有机配位聚合物包裹生物大分子的方法，其特征在于：所述包载生物大分子包括蛋白质、核酸、短肽、抗体、糖类、脂类等。