CN101415395A - 酪蛋白纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供不使用表面活性剂和合成高分子制造，可以控制大小，而且在酸性下稳定，还内含活性物质的纳米粒子及其制造方法。根据本发明可以提供通过下述工序(a)到(c)制造的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子，(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序。

Description

酪蛋白纳米粒子
技术领域
本发明涉及生命科学或者医疗诊断等领域中使用的纳米粒子。更详细地，本发明涉及含有活性物质的酪蛋白纳米粒子。
背景技术
一直希望微粒材料可以在生物技术中广泛应用。特别是，近年来，随着纳米技术的发展，对在生物技术和医疗中应用发明出的纳米微粒材料进行了大量的研究，还报道了大量的研究成果。
在药物传递系统(DDS)的领域中，从很早开始就强烈期待纳米粒子的加入，极其希望纳米粒子能作为药剂和遗传因子的载体。特别是，使用高分子胶粒的研究极为盛行，但是在大部分的情况下，AB型或ABA型嵌段共聚物是由于其结构简单而被使用的。高分子胶粒的特征包括：大的药物容量、高水溶性、高结构稳定性、非蓄积性、小粒径(100nm以下)、功能分离性。由此，以对标的部位的指定性以及疏水性药物的可溶化性为目的，进行了研究。
近年来，在化妆品中，通过引入以纳米技术为代表的各种新技术，而提高功能性、实用性、或者构成与其它公司产品区别，而且可以得到更明显的皮肤效果。皮肤通常由于角质层作为阻隔层存在，而使药物对皮肤的渗透性低下。为了充分发挥出对皮肤的效果，不可欠缺的是改善有效成分对皮肤的透过性。另外，即使对皮肤有高的有效性，但是很多成分由于保存稳定性差，或者容易对皮肤产生刺激，所以难以形成制剂。为了解决这些问题，以改善经皮吸收性和提高保存稳定性、降低皮肤刺激性等为目的，开发了各种各样的胶囊。目前，还对超微细乳化和脂质体等各种材料进行了研究(例如，非专利文献1)。但是，乳化使用的表面活性剂在安全性方面有所保留，而且，离子络合物形成的结构与共价键相比，稳定性差。
可以推测使用高分子材料在保存稳定性和生物体内的粒子稳定性方面有大幅度的改善。但是，大部分研究是使用以乳化聚合为代表的合成高分子，与低分子相比，虽然毒性有所减轻，但是必须解决某种程度的毒性，所以需要更安全的载体。
天然高分子和合成高分子同样地，显示出高的结构稳定性，而且与合成高分子相比，安全性更高，还兼具作为DDS载体的优点。但是，与合成高分子相比，天然高分子载体的难点在于粒子的制造方法。作为天然高分子的粒子制造方法可以使用的有喷雾干燥、冷冻干燥和喷射磨，但是在大部分的情况下，粒子的大小都是微小尺寸(microsize)，大小的控制困难。
在专利文献1中，提出了含有活性化合物的多核(multi-core)结构的固体配制品，粒子大小为5～3000μm。另外，在专利文献2中，提出了使用高分子材料的纳米粒子经皮吸收剂，该纳米粒子经皮吸收剂是使用表面活性剂的乳化物，如前所述，对安全性和稳定性有点担忧。此外，在专利文献3中，记载了球形的蛋白质粒子，但是作为含有药物的组合物的粒子大小为1μm以上。包括上述物质，到目前为止已知的高分子纳米粒子还没有提及合成高分子，即使是天然高分子，在粒子形成过程中，使用表面活性剂和聚合物单体、化学交联剂等，在安全性方面有问题。
然而，酪蛋白是乳汁中含有的不溶于水的蛋白质。由于疏水性部分朝向外面，所以容易制造集合体，聚集10-100个酪蛋白，形成20nm左右的亚胶粒，进而聚集100-1000个酪蛋白，形成90-150nm的酪蛋白胶粒。酪蛋白胶粒进一步聚集，形成500nm左右的胶粒缔结体。因此，酪蛋白胶粒的尺寸分布广，添加钠、镁等盐，以及使pH为酸性，就可以产生凝聚。
非专利文献1：西田光广，普雷古兰思嘉纳陆(フレグランスジャ—ナル)，11月，17(2005)
专利文献1：特开2002-204673号公报
专利文献2：特开2002-308728号公报
专利文献3：特表2005-500304号公报
发明内容
本发明的课题在于解决上述现有技术的问题。也就是，本发明的课题在于提供可以不使用表面活性剂和合成高分子制造的，可以控制大小，且在酸性中稳定，以及内含活性物质的纳米粒子及其制造方法。
本发明人为了解决上述问题进行了认真的研究，结果发现将酪蛋白混合到pH为8以上、小于11的碱水性介质中，添加至少1种活性物质，将该溶液注入到pH3.5～7.5的酸性水性介质中，或者将该溶液从等电点下降到pH偏离1以上的pH，从而制造内含活性物质的纳米粒子，由此完成本发明。
也就是，根据本发明提供通过下述工序(a)到(c)制造的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序。
本发明的另一个方面是提供通过下述工序(a)到(c)制造的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于50nm的酪蛋白纳米粒子。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)边搅拌工序(b)得到的溶液，边将该溶液的pH从等电点下降到pH偏离1以上的pH的工序。
优选的是，活性物质是离子性物质或脂溶性物质。
优选的是，活性物质是化妆品用成分、功能性食品用成分或药品成分。
优选地，作为化妆品用成分可以列举出保湿剂、美白剂、毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗白发剂、防老化剂、抗氧化剂、胶原合成促进剂、防皱纹剂、防痤疮剂、维生素、紫外线吸收剂、香料、色素、止汗剂、冷却剂、保温剂、黑色素生成抑制剂、黑色素细胞活化剂、清洁剂、瘦身剂；作为功能性食品用成分，可以列举出维生素、矿物质、抗氧化剂、抗压剂、营养补充剂、氨基酸类物质、类胡萝卜素、果实和植物的萃取物；作为药品，可以列举出毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗生素、抗癌药、抗炎药、抗过敏剂、激素、抗血栓剂、免疫抑制剂、皮肤疾病治疗剂、抗真菌药、核酸药物、麻醉药、解热药、镇痛药、止痒药、抗浮肿药、止咳化痰药、抗癫痫药、抗帕金森药、催眠镇静剂、抗焦虑药、兴奋剂、精神神经用药、肌松药、抗抑郁药、复方感冒药、自主神经类药物、止咳药、发汗剂、止汗剂、强心剂、心率不齐用药、抗心率不齐药、血管紧张素、血管扩张药、抗心率不齐剂、降血压药、糖尿病治疗药、高血脂剂、呼吸兴奋剂、止咳药、维生素、寄生性皮肤疾病用药、体内平衡剂、多肽、激素、缺损性角化抑制剂、疫苗或皮肤软化剂等。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，本发明的酪蛋白纳米粒子含有0.1～100重量％的活性物质。
优选的是，在工序(b)中，添加活性物质溶液，该活性物质溶液是活性物质溶解到水或者水和至少10重量％的混和性有机溶剂中形成的。
优选的是，相对于碱性水性介质，添加0.1～100重量％的水和至少10重量％的混和性有机溶剂。
优选的是，在工序(b)中，添加内含活性物质的脂质体水分散液。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的内含活性物质的脂质体。
优选的是，在工序(b)中，添加活性物质的环糊精溶液。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的环糊精。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的脂质。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的其它类型的蛋白质。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的阳离子性或阴离子性多糖。
优选的是，相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的阳离子性蛋白质或阴离子性蛋白质。
本发明的另一个方面是提供含有上述本发明的酪蛋白纳米粒子的药物传递剂。
优选的是，药物传递剂作为经皮吸收剂、局部治疗剂、经口治疗剂、化妆品、功能性食品或补充剂(supplement)使用。
优选的是，药物传递剂中含有的乙醇为20％以下。
优选的是，在药物传递剂中含有添加剂。
优选的是，添加剂是选自保湿剂、柔化剂、经皮吸收促进剂、防腐剂、色素、香料或pH调节剂的1种以上。
本发明的又一方面是提供包括下述工序(a)到(c)的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子的制造方法。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序。
本发明的另一个方面是提供通过包括下述工序(a)到(c)的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于50nm的酪蛋白纳米粒子的制造方法。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)边搅拌工序(b)得到的溶液，边将该溶液的pH从等电点下降到pH偏离1以上的pH的工序。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方案进行详细说明。
本发明是一种内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子，该纳米粒子通过下述工序(a)到(c)制造。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序，或者一边搅拌工序(b)得到的溶液，一边将该溶液的pH从酪蛋白的等电点下降到pH偏离1以上的pH的工序。
本发明发现可以制造所希望的大小的酪蛋白纳米粒子。另外，还发现利用脂溶性的活性物质和酪蛋白疏水性部分的相互作用，可以在酪蛋白内部包含活性物质。此外，还发现这些粒子可以在水溶液中稳定地存在。
作为脂溶性物质优选ClogP大于0，更优选ClogP为1以上，进一步优选ClogP为3以上的。
另外，发现通过酪蛋白和离子性多糖或其它种类的离子性蛋白质的混和粒子，也可以内含离子性活性物质。
也就是，根据本发明可以不使用表面活性剂和合成高分子，也可以制造安全性高的内含活性物质的纳米粒子。
本发明的酪蛋白纳米粒子的平均粒子大小通常是10nm以上、小于300nm，优选为10～100nm，进一步优选为10～50nm。
本发明的酪蛋白纳米粒子包含至少1种活性物质。活性物质的量没有特别的限定，通常相对于酪蛋白的重量，含有0.1～100重量％的活性物质。
本发明中使用的酪蛋白的来源没有特别的限定，可以来自乳汁，也可以来自豆子，可以使用α-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白和它们的混合物。还可以使用转基因产品。优选使用酪蛋白钠的形态。酪蛋白可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
本发明的酪蛋白纳米粒子的制造方法可以列举出将酪蛋白混和到碱性水性介质中，注入酸性水性介质的方法；以及将酪蛋白混和到碱性水性介质溶液中，边搅拌边降低pH的方法。
作为将酪蛋白混和到碱水性介质溶液中，注入到酸性水性介质中的方法，注射器注入由于简单方便而优选使用，但是只要是满足注入速度、溶解性、温度、搅拌状态的方法，就没有特别的限定。通常，注入速度可以是1mL/min到100mL/min。碱性水性介质的温度可以适当设定，标准的可以是0℃到80℃，优选为25℃到70℃。水性介质的温度可以适当设定，标准地可以是0℃到80℃，优选为25℃到60℃。搅拌速度可以适当设定，标准地可以是100rpm到3000rpm，优选为200rpm到2000rpm。
作为将酪蛋白混和到碱性水性介质溶液中，边搅拌边降低pH的方法，滴加酸的方法由于简单方便而优选，但是只要是满足溶解性、温度、搅拌状态的方法，就没有特别的限定。碱性水性介质的温度可以适当设定，标准的可以是0℃到80℃，优选为25℃到70℃。搅拌速度可以适当设定，标准地可以是100rpm到3000rpm，优选为200rpm到2000rpm。
本发明中使用的水性介质可以使用有机酸或碱、无机酸或无机碱的水溶液或缓冲液。
具体地，可以列举出使用柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、羧酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸或邻苯二甲酸、三氟乙酸、吗啉基乙磺酸、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸这样的有机酸，三(羟甲基)氨基甲烷、氨这样的有机碱，盐酸、高氯酸、碳酸这样的无机酸，磷酸钠、磷酸钾、氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁这样的无机碱的水溶液，但是并不限于此。
本发明中使用的水性介质的浓度优选为约10mM到约500mM。更优选为约10mM到约200mM。
本发明中使用的碱性水性介质的pH优选为8以上、小于11，更优选为9以上、小于11。进一步优选pH为9.5到10.5。如果pH过高，则可能会水解以及操作时可能有危险，所以优选上述范围。
在本发明中，将酪蛋白混和到pH8以上的碱性水性介质中的温度优选为0～80℃，更优选为10～60℃，进一步优选为20～40℃。
本发明中使用的酸性水性介质的pH优选为3.5～7.5，更优选为4～6，进一步优选为5～6。pH为3以下时，发现粒子大小有变大的趋势。在将酪蛋白混和到碱性水性介质溶液中，边搅拌边降低pH的方法中，下降后的优选的pH是从等电点离开1以上的pH到8。
本发明中使用的活性物质的种类可以选自例如化妆品用成分或药品用成分。作为化妆品用成分，可以列举出保湿剂、美白剂、毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗白发剂、防老化剂、抗氧化剂、胶原合成促进剂、防皱纹剂、防痤疮剂、维生素、紫外线吸收剂、香料、色素、止汗剂、冷却剂、保温剂、黑色素生成抑制剂、黑色素细胞活化剂、清洁剂、瘦身剂等。作为功能性食品用成分，可以列举出维生素、矿物质、抗氧化剂、抗压剂、营养补充剂、氨基酸类物质、类胡萝卜素、果实和植物的萃取物。作为药品，可以列举出毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗生素、抗癌药、抗炎药、抗过敏剂、激素、抗血栓剂、免疫抑制剂、皮肤疾病治疗剂、抗真菌药、核酸药物、麻醉药、解热药、镇痛药、止痒药、抗浮肿药、止咳化痰药、抗癫痫药、抗帕金森药、催眠镇静剂、抗焦虑药、兴奋剂、精神神经用药、肌松药、抗抑郁药、复方感冒药、自主神经类药物、止咳药、发汗剂、止汗剂、强心剂、心率不齐用药、抗心率不齐药、血管紧张素、血管扩张药、抗心率不齐剂、降血压药、糖尿病治疗药、高血脂剂、呼吸兴奋剂、止咳药、维生素、寄生性皮肤疾病用药、体内平衡剂、多肽、激素、缺损性角化抑制剂、疫苗或皮肤软化剂等。上述活性物质可以单独使用，也可以将2种以上组合后使用。
本发明中使用的保湿剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出透明质酸、神经酰胺、Lipidure(利皮久性阿，商品名)、异黄酮、氨基酸、胶原等。上述保湿剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
本发明中使用的美白剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出维生素C衍生物、氢醌类、熊果苷、丁基雷琐酚(Rucinol)、鞣酸等。上述美白成分可以单独使用，也可以组合2种以上后使用。
本发明中使用的抗老化剂、抗氧化剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出胡萝卜素类、视黄酸、松香油、维生素C衍生物、激动素、虾黄质、维生素A酸、维生素E及其衍生物、芝麻素、α-硫辛酸、辅酶Q10、类黄酮类等。上述的抗老化剂、抗氧化剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
本发明中使用的抗痤疮剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出水杨酸、间苯二酚、视黄酸、诺那氟沙星、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、林肯霉素类抗生素等。上述抗痤疮剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
本发明中使用的抗癌剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出氟化嘧啶类代谢拮抗剂药物(5-氟代尿嘧啶(5FU)以及皮炎菌、去氧氟尿苷、卡培他滨(Capecitabine)等)，抗生素(丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)以及阿霉素(Doxorubicin，DXR)等)，嘌呤代谢拮抗剂(氨甲喋呤等叶酸代谢拮抗剂、巯基嘌呤等)，维生素A的活性代谢物(羟基脲等的代谢拮抗剂、维生素A酸以及他米巴罗汀(Damibarotene)等)，分子标的药(赫赛汀(Herceptin)以及甲磺酸伊马替尼等)，铂制剂(Briplatin和Randa(CDDP)、佳铂帝(CBDC)、eluplat(Oxa)、奈达铂等)，植物生物碱药物(伊立替康(Topotecin)以及喜树碱(Camptothecine)、岩沙海葵毒素(Palytoxin，PTX)、鳍藻毒素(Dinophytoxins，DTX)、依托泊苷(Etoposide)等)，烷基化剂(白消安(Busulfan)、环磷酰胺(Ifomide)、依厚迈斗(イホマイド)等)，抗男性荷尔蒙药物(卡鲁胺(bicalutamide)和氟他胺(Flutamide)等)，女性荷尔蒙药(呋罗雌酚以及醋酸氯地孕酮、磷酸雌莫司汀(Estramustine)等)，LH-RH药(亮丙瑞林(Leuprorelin)以及诺雷德(Zoladex)等)，抗雌激素药(柠檬酸他莫西芬以及柠檬酸托瑞米芬等)，芳香酶抑制剂(盐酸法倔唑以及阿那曲唑(Anastrozole)、依西美坦(Exemestan)等)，黄体荷尔蒙药(醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)等)，BCG等，但是并不限于此。上述抗癌剂可以单独使用，也可以组合2种以上后使用。
作为本发明的抗过敏剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出色甘酸钠以及曲尼司特等抑制介质游离药物、富马酸酮替芬以及盐酸五塑胺等受阻胺H1-拮抗药、盐酸奥扎格雷(Ozagrel)等凝血酶抑制药、普仑斯特(Pranlukast)等无色三烯拮抗药、甲磺司特等。上述抗过敏剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
作为本发明中使用的免疫抑制剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出雷帕霉素(Rapamycin)、他克莫司(Tacrolimus)、环孢素(Ciclosporin)、泼尼松龙(Prednisolone)、甲基泼尼松龙、霉酚酸酯(Mycophenolate mofefil)、硝基咪唑硫嘌呤(Azathiopurine)、咪唑立宾等。上述免疫抑制剂可以单独使用，也可以混和2种以上后使用。
本发明中使用的育毛成分的种类没有特别的限定，可以选自例如化妆品用成分或药品用成分。在本发明中，内含于蛋白质纳米粒子的育毛成分的具体例子，可以列举出甘草次酸及其衍生物、甘草酸及其衍生物、日扁柏醇、维生素E或其衍生物、维生素C衍生物、6-苄基氨基嘌呤、烟酸酰胺、烟酸苄酯、烟酸生育酚、烟酸β-丁氧基酯、异丙基甲基苯酚、十五(碳)烷酸或其衍生物、Cefalatin、非那甾胺(Finasteride)、t-黄烷酮、类胡萝卜素以及激动素等抗氧化剂，乙炔雌二醇、泛醇、泛醇乙基醚、西诺科西基陆(シノキシジル)或其类似物、氯化阳碳(carbonium chloride)、腺苷等。上述育毛成分可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。
作为本发明中使用的水和至少10重量％混合性的有机溶剂虽然列举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。优选为乙醇、异丙醇、乙二醇、甘油、丙酮、THF等水溶性有机溶剂。
在本发明中，活性物质可以以内含活性物质的脂质体水分散液的形式添加。作为用于形成本发明的脂质体的脂质虽然举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱等。除此以外，还可以含有磷脂酰丝氨基类、磷脂酰胆碱乙醇胺类、胆固醇等。
作为本发明中使用的环糊精虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、2，6-二-O-甲基-α-环糊精、2，6-二-O-甲基-β-环糊精、葡糖醛基葡糖基-β-环糊精、七(2，6-二-O-甲基)-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、6-O-α-麦芽糖基-α-环糊精、甲基-β-环糊精、2，3，6-三-O-甲基-β-环糊精、6-O-α-D-葡糖基-α-环糊精等。
作为本发明中使用的脂质虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些混合物。可以列举出磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰基甘油、二磷脂酰基甘油、神经鞘氨醇类、神经酰胺、油酸、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、大豆油、橄榄油、角鲨烯等。
本发明中使用的其它种类的蛋白质的种类没有特别的限定，优选使用分子量为1万到100万程度的蛋白质。蛋白质的来源没有特别的限定，优选使用来自人类的蛋白质。作为蛋白质虽然举出了具体例子，但是本发明并不限于这些化合物。可以列举出例如胶原、明胶、白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、丝纤蛋白、层粘素、纤维蛋白连接素或玻璃粘连蛋白(vitronectin)等。另外，蛋白质的来源没有特别的限定，也可以使用牛、猪、鱼和转基因体的任意一种。特别优选的是明胶、白蛋白。
所述的本发明中使用的阴离子性多糖是具有羧基、硫酸基或磷酸基等酸性极性基团的多糖。以下举出具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出软骨素硫酸、葡聚糖硫酸、羧甲基葡聚糖、海藻酸、果胶、角叉菜胶、岩藻依聚糖、琼脂胶、紫菜聚糖、卡那牙胶、冻胶(Gellan Gum)、黄原胶、透明质酸类等。
所述的本发明中使用的阳离子性多糖是具有氨基等碱性极性基团的多糖。以下虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出壳多糖、壳聚糖等含有葡糖胺和半乳糖胺作为结构单糖的多糖等。
所述的本发明中使用的阴离子性蛋白质是等电点比生理的pH更靠近碱性侧的蛋白质和脂蛋白质。虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出聚谷氨酸、聚天冬氨酸、细胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、α-糜蛋白酶等。
所述的本发明中使用的阳离子性蛋白质是等电点比生理的pH更靠近酸性侧的蛋白质和脂蛋白质。虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出聚赖氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、卵白蛋白等。
本发明中使用的离子性蛋白质和多糖优选具有和活性物质的电荷相反的电荷，相对于酪蛋白的重量，添加量优选为0.1～100重量％。
本发明的酪蛋白纳米粒子是在其中含有活性物质的纳米粒子，这种含有活性物质的纳米粒子可以供应到病患部位使用。也就是，本发明的酪蛋白纳米粒子可以作为药物传递剂使用。
在本发明中，药物传递剂的使用没有特别的限定，可以列举出经皮吸收剂、局部治疗剂、经口治疗剂、化妆品、补充物等。
在本发明中，药物传递剂优选含有0.01～50重量％的蛋白质纳米粒子，进一步优选含有0.1～10重量％蛋白质纳米粒子。
优选的是，药物传递剂中含有的乙醇为20％以下。更优选为10％以下。
在本发明中，可以在药物传递剂中含有添加剂。作为添加剂没有特别的限定，可以列举出保湿剂、柔化剂、经皮吸收促进剂、防腐剂、色素、香料或pH调节剂等。
作为可以在本发明中使用的保湿剂虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出琼脂、二聚丙三醇、二硬脂基二亚铵锂蒙脱石、丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、透明质酸钠、己二醇、薏苡仁萃取物、凡士林。
作为柔化剂虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出甘油、矿物油、软化剂(emollient)成分(例如，异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸聚甘油酯、异壬酸异十三烷基酯、异壬酸辛酯、油酸、油酸甘油酯、可可蜡、胆固醇、混合脂肪酸三甘油酯、琥珀酸二辛酯、醋酸硬脂酸蔗糖酯、环戊硅氧烷、二硬脂酸蔗糖酯、软脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、山嵛酸二十烷基酯、聚山嵛酸蔗糖酯、聚甲基硅倍半氧烷、肉豆蔻醇、肉豆蔻酸十六烷基酯、肉豆蔻酸十四烷基酯、月桂酸己酯。
作为经皮吸收促进剂虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出乙醇、肉豆蔻酸异丙酯、柠檬酸、角鲨烯、油酸、薄荷醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、己二酸二乙酯、己二酸二异丙基酯、癸二酸二乙基酯、癸二酸二异丙基酯、软脂酸异丙基酯、油酸异丙基酯、油酸辛基十二烷基酯、异十八烷醇、2-辛基十二醇、尿素、植物油、动物油。
作为防腐剂虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出苯甲酸、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸、脱氢乙酸钠、对羟甲基苯甲酸甲酯。
作为色素虽然举出了具体例子，但是在本发明中，并不限于这些具体的化合物。可以列举出高岭土、胭脂红、佛青、氧化铬、氧化铁。
作为pH调节剂虽然举出了具体例子，但是在本发明中并不限于这些化合物。可以列举出柠檬酸钠、醋酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸。
作为本发明的酪蛋白纳米粒子的给药方法，优选地可以列举出经皮、经粘膜吸收。作为给药方法虽然列举出了具体方法，但是在本发明中并不限于此。可以列举出外用液体、泥敷剂、涂布剂、清洁剂、沐浴露、消毒剂、软膏、凝胶剂、面霜、泥膏剂、泥罨剂、硬膏剂、创可贴、薄纱型创可贴、止血剂、粘合剂、胶带、经皮吸收型胶带、创伤保护剂、气雾剂、洗剂、滋补剂、搽剂、乳剂、悬浊液、饱和剂、酊剂、粉剂、泡剂、化妆水、按摩膏、营养霜、敷剂、片状皮肤外用剂、皮肤粘合型化妆品、口红、补妆底(makeup base)、粉底(foundation)、香波、柔发剂(rinse)、香皂、肥皂、洗澡液、经指甲药剂、鼻粘膜药剂、口腔粘膜药剂、直肠粘膜药剂、阴道粘膜药剂、眼粘膜药剂和肺粘膜药剂等
本发明的酪蛋白纳米粒子的给药量可以根据患者的体重、疾病的状态等适当设定，通常是每1次给药，提供10μm～100mg/kg程度，优选提供20μg～50mg/kg程度。
以下，通过实施例对本发明进行更详细地说明，但是本发明并不限于此。
实施例
实施例1：
将20mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)、2mg软骨素硫酸-C(和光纯药制造)混和到1mL的pH10的50mM的磷酸缓冲液中。使5mg生育酚(和光纯药制造)溶解到1mL乙醇中。将2种溶液混和，接触超声波后，在外部设置为40℃、800rpm的搅拌条件下，使用微量注射器将1ml混和溶液注入到10mL的pH为5的200mM的磷酸缓冲水溶液中，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为57nm。
实施例2：
在50ml茄型烧瓶中加入1mg松香油(和光纯药制造)、20mg蛋黄磷酰基胆碱(日本油脂制造)，溶解到5ml的乙醇中后，通过旋转蒸发器减压除去乙醇。在其中加入5ml的pH为9的100mM的磷酸缓冲水溶液，通过VARDEX混和器(バルデツクスミキサ—)振动，对所得的悬浊液照射超声波，得到脂质体分散液。将1ml所得的脂质体分散液、20mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)、1ml的pH为10的200mM磷酸缓冲水溶液混和。在外部设置为40℃、800rpm的搅拌条件下，使用微量注射器将1ml前述溶液注入到10mL的pH为5的磷酸缓冲水溶液中，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为60nm。
实施例3：
将5mg的β-胡罗卡素(和光纯药制造)、0.5ml乙醇、20mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)、5mg环糊精(和光纯药制造)、1ml的pH为10的50mM磷酸缓冲液混和，接触超声波。在外部设置为40℃、800rpm的搅拌条件下，使用微量注射器将1ml前述溶液注入到10mL的pH为5的300mM磷酸缓冲水溶液中，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为88nm。
实施例4：
将20mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)、1mg鱼精蛋白硫酸盐(和光纯药制造)在1ml的pH为10的50mM磷酸缓冲液中混和。将1mg的α-硫辛酸溶解到离子交换水中。将这2种溶液混和，在外部设置为40℃、800rpm的搅拌条件下，使用微量注射器将1ml前述溶液注入到10mL的pH为5的200mM磷酸缓冲水溶液中，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为48nm。
在改变粒径测定器时，测定器的值越小，电子显微镜照片也越接近该值。
实施例5：
将100mg酪蛋白钠(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为10的100mM硼酸缓冲液中混和。将1mg的醋酸生育酚溶解到0.1ml乙醇中。将5mg甘草次酸溶解到1ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下加入盐酸，将pH调节为7，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为32nm。
实施例6：
将100mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为10的50mM磷酸缓冲液中混和。将3.4mg甘草次酸(和光纯药制造)溶解到0.1ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下加入盐酸，将pH调节为7，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为23nm。
实施例7：
将200mg酪蛋白钠(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为10的200mM磷酸缓冲液中混和。将8.5mg烟酸苄基酯解到0.15ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下加入盐酸，将pH调节为7，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为27nm。
实施例8：
将50mg酪蛋白钠(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为10的25mM磷酸缓冲液中混和。将1.7mg日扁柏醇解到0.1ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下加入盐酸，将pH调节为7，得到酪蛋白纳米粒子。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为16nm。
比较例1：
将100mg酪蛋白钠(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml蒸馏水中混和。将3.4mg甘草次酸(和光纯药制造)溶解到0.1ml乙醇中。将这2种溶液混和。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为327nm。
比较例2：
将100mg酪蛋白(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为10的50mM磷酸缓冲液中混和。将3.4mg甘草次酸(和光纯药制造)溶解到0.1ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下，加入盐酸，将pH调节为4，形成白色浑浊，凝聚。
比较例3：
将100mg酪蛋白钠(来自乳汁，和光纯药制造)在10ml的pH为12的50mM磷酸缓冲液中混和。将3.4mg甘草次酸(和光纯药制造)溶解到0.1ml乙醇中。将这2种溶液混和，在搅拌下，加入盐酸，将pH调节为7。
上述粒子的平均粒径使用光散射光度计(日机装株式会社制造的纳诺斗拉库(ナノトラツク))测定，为485nm。
试验例1：
使用日立工机公司制造的超级离心机CS100GXL，将实施例5～8的纳米粒子离心分离，从上清液的HPLC分析结果和添加量，求得内含在粒子内的活性物质的内含率。
[表1]
 
活性物质 ClogP值 内含率
实施例5 醋酸生育酚 12.2 99％
实施例6 甘草次酸 6.3 99％
实施例7 烟酸苄基酯 2.6 45％
实施例8 日扁柏醇 1.9 38％
本发明的酪蛋白纳米粒子由于不使用表面活性剂、合成高分子，而是使用生物体适应性方面没有问题的酪蛋白，所以安全性高。另外，本发明的酪蛋白纳米粒子可以控制尺寸，而且为酸性，是稳定的，所以可以改善吸收率和使用感。此外，本发明的酪蛋白纳米粒子由于内含活性物质，所以可以将不溶于水或者只是部分溶解的活性物质稳定地分散到水中。

Claims (23)

1.一种通过下述工序(a)到(c)制造的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子，
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序。
2.一种通过下述工序(a)到(c)制造的内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于50nm的酪蛋白纳米粒子。
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)边搅拌工序(b)得到的溶液，边将该溶液的pH从酪蛋白的等电点下降到pH偏离1以上的pH的工序。
3.根据权利要求1或2所记载的酪蛋白纳米粒子，其中活性物质是离子性物质或脂溶性物质。
4.根据权利要求1～3任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中活性物质是化妆品用成分、功能性食品用成分或药品成分。
5.根据权利要求4所记载的酪蛋白纳米粒子，其中活性物质是保湿剂、美白剂、毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗白发剂、防老化剂、抗氧化剂、胶原合成促进剂、防皱纹剂、防痤疮剂、维生素、紫外线吸收剂、香料、色素、止汗剂、冷却剂、保温剂、黑色素生成抑制剂、黑色素细胞活化剂、清洁剂、瘦身剂；功能性食品用成分是维生素、矿物质、抗氧化剂、抗压剂、营养补充剂、氨基酸类物质、类胡萝卜素、果实和植物的提取物；药品成分是毛发护理剂、毛发恢复剂、毛发生长剂、抗生素、抗癌药、抗炎药、抗过敏剂、激素、抗血栓剂、免疫抑制剂、皮肤疾病治疗剂、抗真菌药、核酸药物、麻醉药、解热药、镇痛药、止痒药、抗浮肿药、止咳化痰药、抗癫痫药、抗帕金森药、催眠镇静剂、抗焦虑药、兴奋剂、精神神经用药、肌松药、抗抑郁药、复方感冒药、自主神经类药物、止咳药、发汗剂、止汗剂、强心剂、心率不齐用药、抗心率不齐药、血管紧张素、血管扩张药、抗心率不齐剂、降血压药、糖尿病治疗药、高血脂剂、呼吸兴奋剂、止咳药、维生素、寄生性皮肤疾病用药、体内平衡剂、多肽、激素、缺损性角化抑制剂、疫苗或皮肤软化剂。
6.根据权利要求1～5任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，酪蛋白纳米粒子含有0.1～100重量％的活性物质。
7.根据权利要求1～6任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中在工序(b)中，添加活性物质溶液，该活性物质溶液是活性物质溶解到水或者水和至少10重量％的混和性有机溶剂中形成的。
8.根据权利要求7所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于碱性水性介质，添加0.1～100重量％的水和至少10重量％的混和性有机溶剂。
9.根据权利要求1～8任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中在工序(b)中，添加内含活性物质的脂质体水分散液。
10.根据权利要求9所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的内含活性物质的脂质体。
11.根据权利要求1～8任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中在工序(b)中，添加活性物质的环糊精溶液。
12.根据权利要求11所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的环糊精。
13.根据权利要求1～12任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的脂质。
14.根据权利要求1～13任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的其它类型的蛋白质。
15.根据权利要求1～14任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的阳离子性或阴离子性多糖。
16.根据权利要求1～15任一项所记载的酪蛋白纳米粒子，其中相对于酪蛋白的重量，添加0.1～100重量％的阳离子性蛋白质或阴离子性蛋白质。
17.一种含有权利要求1～16任一项所记载的酪蛋白纳米粒子的药物传递剂。
18.根据权利要求17所记载的药物传递剂，该药物传递剂作为经皮吸收剂、局部治疗剂、经口治疗剂或补充剂使用。
19.根据权利要求17或18所记载的药物传递剂，其中乙醇含量为20％以下。
20.根据权利要求17～19任一项所记载的药物传递剂，其中在药物传递剂中含有添加剂。
21.根据权利要求20所记载的药物传递剂，其中添加剂是选自保湿剂、柔化剂、经皮吸收促进剂、防腐剂、色素、香料或pH调节剂的1种以上。
22.一种内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于300nm的酪蛋白纳米粒子的制造方法，该方法包括下述工序(a)到(c)：
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)将工序(b)得到的溶液注入pH3.5～7.5的酸性水性介质的工序。
23.一种内含活性物质的平均粒径为10nm以上、小于50nm的酪蛋白纳米粒子的制造方法，该方法包括下述工序(a)到(c)：
(a)将酪蛋白混合到pH为8以上、pH小于11的碱性水性介质中的工序；
(b)在工序(a)得到的溶液中添加至少1种活性物质的工序；以及
(c)边搅拌工序(b)得到的溶液，边将该溶液的pH下降到pH为3.5～7.5的工序。
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