KR100456427B1

KR100456427B1 - 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트를 함유한나노유화입자 및 그의 제조방법, 및 이를 함유하는피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR100456427B1
Application number: KR10-2001-0079358A
Authority: KR
Inventors: 유병희; 강병영; 김진한; 한상훈
Original assignee: 주식회사 태평양
Priority date: 2001-12-14
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2004-11-10
Also published as: KR20030049206A

Abstract

본 발명은 화학식 1으로 표시된 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트(Tocopheryl 3-aminopropyl phosphoric acid: Toco-APPA)를 유효성분으로 함유하는 나노유화입자 및 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

상기식에서, R₁, R₂, R₃= H 또는 Me기로서 토코페롤의 5, 7 또는 8번 위치에 적어도 하나의 메틸기를 가지며, A 는 -CH₂-CH(CH₃)- 또는 -CH=C(CH₃)- 이다.

본 발명의 나노유화입자를 함유하는 피부외용제 조성물은 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트를 나노유화입자 내부에 포집, 안정화함으로써, 피부에 적용시 경피흡수, 생분해되어 항산화력을 가지며 콜라겐 생합성을 유도하여 피부노화억제효과가 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

3-아미노프로필토코페릴 포스페이트를 함유한 나노유화입자 및 그의 제조방법, 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물{Nano-emulsion particle and preparation method thereof, and a composition for skin external application containing the nano-emulsion particle}

본 발명은 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트(Tocopheryl 3-aminopropyl phosphoric acid ; 이하 ‘Toco-APPA’라함)를 유효성분으로 함유하는 나노유화입자 및 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 수~수백 나노미터 크기를 갖는 나노유화입자 내부에 우수한 항산화력을 갖는 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자를 제조하고 제형화함으로써, 이를 피부에 적용할 경우 피부에 흡수되어 피부내부에서 효소인 포스포리파아제 (phospholipase)에 의하여 생분해되어 토코페롤과 3-아미노프로필인산(3-aminopropylphosphoric acid;이하 '3-APPA'라함)으로 분해에서 상기 토코페롤은 우수한 항산화력으로 피부내부의 각종 라디칼을 불활성화시켜 피부세포의 정상화에도움을 주며, 상기 3-APPA는 진피내의 콜라겐 합성을 촉진시킬 뿐아니라, 섬유아세포의 증식효과와 같은 피부생기활성 효과, 특히 피부노화 억제효과를 나타내도록 하는 나노유화입자를 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 제기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 상기의 기능을 갖는 피부의 노화현상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여, 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키면서 피부세포를 활성화시켜 피부노화 및 멜라닌의 침착을 효과적으로 억제하기 위한 노력이 있어 왔었다. 이중, 피부세포의 활성에 의해 피부에 잔주름의 생성을 방지하고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있으며, 많은 물질들이 개발되어 사용되고 있다. 이러한 물질로는 레티놀 및 아스코르빈산 등의 비타민류, 각종 동식물에서 추출한 단백질 및 플라보노이드, 아미노산, 표피성장인자(Epidermal growth factor), 알파 히드록시산 등이 알려져 있으며, 현재 화장료 등에 응용되어 사용되고 있다.

그러나, 이러한 상기 성분들 대부분이 그 자체가 불안정하거나, 피부에 어느정도 자극을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이에, 물질 자체가 안정하며 화장료에 응용하기에 용이하면서도 세포의 성장 및 진피의 콜라겐 합성을 촉진할 수 있는 물질로 감마-아미노 부티르산(g-Amino butylic acid)류의 3-아미노프로판 설폰산(3-Aminopropane sulfonic acid) 및 특히, 3-아미노프로판인산 (3-Aminopropane phosphoric acid)이 개발되어 사용되고 있다. 이와 같이 피부 생리활성성분 자체에대한 연구의 진행과 함께 유효성분의 피부전달체에 대한 연구도 진행되어 왔다. 그러나, 토코페롤 및 3-아미노프로판인산염은 경피흡수에 있어 구조적인 불리한 점이 있으며, 특히, 3-아미노프로판인산염은 구조자체의 높은 극성에 의해서 경피흡수가 거의 되지 않는 단점이 있다. 이를 극복하고자 토코페롤의 알코올기에 3-아미노프로판인산염을 에스터 결합을 통하여 토코페릴 아미노포스포린산을 제조하였으며, 이러한 구조는 3-아미노프로판인산염의 인산기를 토코페롤의 알코올기과 반응시킴으로써 전체적인 구조의 극성을 줄여줄 수 있었으며, 상대적인 비극성화를 통해서 더 높은 경피흡수효율을 나타내게 될 것임을 예상할 수 있었으며, 특히, 경피흡수된 토코페릴 3-아미노프로판인산은 체내에서 여러 종류의 에스터결합 가수분해효소에 의해서 생분해되어 토코페롤과 3-아미노프로판 인산염으로 분리되어지며, 각각의 성분에 의한 활성산소 및 라디칼 억제 및 분해효과 및 콜라겐 생합성효과가 매우 우수할 것으로 예상하였다.

특히, 나노기술의 발달과 함께 나노크기의 경피흡수 전달체에 대한 연구는 극히 최근에 급속히 이루어지고 있다. 이러한 예를 보면, 유용성 약물과 지질, 글리세롤과 물, 인지질 혹은 수용성 비이온성 계면활성제를 사용하여 나노미터 크기 내지 마이크로미터 크기의 유화입자를 제조하는 기술이 보고되었으며(미국특허 5,338,761호), 전하를 지닌 인지질(lipid)을 유화제로 사용한 나노입자를 제조하는 기술이 보고되었다(미국특허 6,120,751호). 또한, 계면활성제, 오일 및 물로 이루어진 3상이 적당한 농도를 이룰 때 형성되는 마이크로에멀젼(microemulsion)을 이용한 나노크기의 유 화입자의 제조에 관한 기술들이 보고되고 있다(미국특허5,152,923호, WO 91/06,286호 및 WO 91/06,287호). 또한, 유화입자의 단점을 보완하기 위하여 고분자를 사용한 나노입자의 제조에 대한 연구가 진행되고 있으며, 하나의 예로 마이크로 캡슐을 피부 표면에 장기간 머물게 하면서 서서히 약물을 방출시키도록 하는 서방화 제제에 대한 연구가 보고되었다(미국특허 5,286,495호, WO 89/08,449호 및 WO 88/01,213호). 또한, cochleate를 사용함으로써 내부의 포집물질이 외계와의 접촉을 최소화하고, 피부적용이나 복용시 일시에 활성성분을 방출하는 장점을 극대화시킨 방법도 보고되고 있다(미국특허 4,663,161).

이러한, 나노 유화입자는 실제 피부에 도포할 경우 피부내부로 흡수되어 유화막이 깨지거나 나노유화입자의 계면막이 파괴됨으로써, 내부 포집 약물이 일시에 방출되는 장점이 있으며, 특히, 피부를 통한 생리활성성분의 전달을 통하여 우수한 항산화력 및 콜라겐 생합성효과를 이용하여 피부노화 억제효과를 극대화시키기 위한 기술 및 관련 연구에 대하여 주목하고 있는 실정이다. 또한, 그 자체의 구조적인 특성에 의해서 경피흡수가 어려운 물질에 대해서 쉽게 생분해되는 화학구조적 개질을 통하여 경피흡수를 촉진시켜주고, 경피흡수된 물질은 체내에서 각각의 토코페롤과 3-아미노프로판 인산으로 분해되어 원 물질 자체의 생리활성을 나타내게 하는 방법에 관한 연구가 이루어 지고 있다.

이와 같은 상황에서 토코페롤과 3-아미노프로판인산염을 화학적인 에스터 결합을 통해서 제조한 토코페릴 3-아미노프로판인산(토코페릴 APPA)은 전형적인 경피흡수 촉진을 위한 화학구조적 개질의 일례로 볼 수 있으며, 특히, 각각의 구성성분인 토코페롤과 3-아미노프로판인산은 체내에서 생분해되어 각각의 생리활성이 높게나타낼 수 있을 것으로 예상할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 나노유화입자의 장점을 유지하면서, 각각의 유효성분 자체의 문제점을 해결하기 위해 섬유아세포 증식, 콜라겐 합성에 관한 효과 및 피부노화 억제효과가 우수한 토코페롤과 APPA를 서로 결합시켜 Toco-APPA 형태의 화합물을 제조한 후 이를 나노유화입자에 포집시킬 경우, 성분이 안정화되고 나노유화입자가 피부에 용이하게 흡수되고 생체내에서 생분해되어 각각의 생리활성이 높게 나타나 피부노화 억제효과를 나타낼 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화력과 콜라겐 생합성 및 섬유아세포 증식효과가 우수한 Toco-APPA를 유효 활성성분으로 내부에 포집한 나노유화입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 나노유화입자를 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 실시예 4의 전자현미경 사진이다(×90,000).

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 나노유화입자는 토코페롤의 알코올기와 APPA의 인산기를 에스터반응에 의해 결합시켜 제조된 하기 화학식 1으로 표현되는 3- 아미노프로필토코페릴 포스페이트(Toco-APPA)를 전체 나노유화입자 분산액에 대하여 0.001~50중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 Toco-APPA는 나노유화입자에 의해 피부내부에 흡수되어 포스포리파아제에 의해 각각 토코페롤과 APPA로 분리되어 각각의 특성을 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 나노유화입자는 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트(Tocopheryl 3-aminopropyl phosphoric acid; 이하, 'Toco-APPA'라함)를 생리활성 유효성분으로 1~500nm 크기를 갖는 나노유화입자 내부에 포집되어 있음을 특징으로 한다. 즉, Toco-APPA은 토코페롤의 특징과 APPA의 특징으로 동시에 가져서, 콜라겐 생합성 촉진 및 섬유아세포 증식효과에 의하여 우수한 피부노화억제 효과를 갖는 나노유화입자 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 나노유화입자에 사용된 Toco-APPA는 화학식 1으로 나타낼 수 있으며, 본 발명에 사용된 Toco-APPA는 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트를 제조하여 사용하였다(참고문헌:Journal of the American Oil Chemist's Society, 78 (4), 2001).

[화학식 1]

상기에서 나노유화입자는 나노(nm)단위의 크기를 갖는 입자를 의미하며, 입자크기는 입자의 지름을 나타낸다.

본 발명의 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자의 제조방법은 세틸에틸헥사노에이트에 Toco-APPA 및 계면활성제를 혼합하고 60℃까지 가열하여 균일한 유상을 제조하는 단계; 글리세린 및 메틸파라벤을 증류수에 가열용해하여 수상을 제조하는 단계; 상기에서 제조한 수상에 유상을 서서히 부어주면서 유화기로 유화시키는 단계; 50~60℃에서 수용성 고분자를 0.001중량%~5중량% 부가하여 분산시켜주는 단계; 및 상기를 냉각한 후 고압유화기로 3회이상 처리하여 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자를 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 나노유화입자의 크기는 바람직하게는 30~150㎚, 더 바람직하게는 50㎚이다. 상기 나노유화입자는 나노미터 크기의 입자가 용매에 분산되어 있는 상태를 의미하며, 나노유화입자의 함량은 수용액 중 0.0001~90중량％로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.1~50중량％, 더 바람직하게는 5중량％이다.

본 발명에서 사용되는 계면활성제는 고급지방산비누, 알킬황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬에테르인산에스테르염, N-아실아미노산염 등의 음이온성 계면활성제, 염화알킬트리메틸암모늄, 염화디알킬디메틸암모늄, 염화벤잘코늄 등의 양이온성 계면활성제, 알킬디메틸아미노초산베타인, 알킬아미드 디메틸아미노초산베타인, 2-알킬-N-카르복시-N-하이드록시이미다졸리늄베타인 등의 양쪽성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌류, 다가알콜에스테르류, 에틸렌옥사이드/프로필렌옥사이드 블록 공중합체 등의 비이온성 계면활성제, 에틸셀룰로스 등과 같은 고분자 계면활성제, 레시틴, 라놀린, 콜레스테롤, 사포닌 등의 천연 계면활성제 등을 사용한다. 상기 계면활성제는 전체 분산체 조성에 대하여 0.01~50중량%가 바람직하다.

또한, 본 발명에서 나노유화입자의 분산안정성 향상을 위하여 사용될 수 있는 수용성 고분자는 제한이 없으며, 구체적으로는 아카시아검, Irish moss, karaya gum, 트래거캔스 고무(gum tragacanth), 구아야크 고무(gum guaiac), 잔탄 고무(xanthan gum), locust bean gum과 같은 천연 고분자류 및 이의 유도체, 카세인, 젤라틴, 콜라겐, 알부민, 글로블린, 피브린 등의 단백질 및 이의 유도체, 셀룰로오스, 덱스트린, 펙틴, 전분, 아가, 만난 등의 천연유래 카보하이드레이트류 및 이의 유도체, 합성고분자인 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 등의 폴리비닐류 고분자 및 이의 유도체, 폴리아크린산, 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타그릴레이트 등의 폴리카르복시산 및 이의 유도체, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 탄화수소류 및 이의 이성질체, 폴리사카라이드 및 이의 유도체(폴리슈크로즈, 폴리글루코스, 폴리락토스 및 이의 염류) 등이 가능하며, 상기한 고분자들의 단독, 병용, 가교화된 형태 및 염의 형태를 갖는 고분자들을 사용하기도 한다. 천연유래 고분자는 생체적합성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 상기한 고분자류는 생체적합성이 우수한 고분자로서, 나노유화입자의 분산안정성을 향상시킨다. 상기 수용성 고분자를 전체 나노유화입자 분산액에 대하여 0.001~5중량%가 바람직하다.

본 발명에 의해 제조된 나노유화입자는 제형화화하여 피부에 도포시, 물리적인 전단력에 의하여 계면막이 일시에 파괴되거나 피부내부에 침투하여 나노유화입자의 외부환경이 소수성으로 바뀜으로써 계면막의 급속한 붕괴가 이루어지며, Toco-APPA가 세포사이의 인지질 층으로 흡수되도록 유도할 수 있다. 특히, 50㎚이하의 나노유화입자는 각질층이하로 침투, 확산되어 진피층 상단까지 침투, 확산이 되어 방출된 내부포집물질의 피부흡수가 극대화 될 수 있는 장점이 있다. 방출된 Toco-APPA는 피부중의 분해효소(phospholipase)에 의하여 생분해되어 토코페롤과 3-APPA로 분해된다. 분해 생성된 토코페롤은 높은 항산화력으로 피부내부에 생성된 라디칼류의 활성억제효과를 가지며, 라디칼의 활성억제를 통해서 피부세포 노화현상을 억제해줄 수 있다. 또한, 3-APPA는 콜라겐의 생합성 및 섬유아세포의 증식을 촉진함으로써 피부에 있어서는 잔주름의 개선효과가 있으며, 피부탄력을 높여주는 효과를 나타내게 된다. 이와 같이 Toco-APPA를 나노유화 입자내부에 포집하여 피부내부로 안정하게 운반함으로써 우수한 피부노화 억제효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 나노유화입자의 내부에 포집가능한 Toco-APPA의 함량은 전체 유화입자 분산액 중에 0.001~50중량%이며, 적의하게는 0.5~5중량%범위가 바람직하다. 이는 나노유화입자의 제조에 있어 Toco-APPA가 50중량%이상이 되는 경우에는 나노유화입자의 제조가 불가능하며, 0.001%이하의 함량은 제형화에 있어 유효한 효과를 나타내지 못한다.

본 발명의 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자를 피부외용제 조성물로 제조하였으며, 그 조성물의 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료,립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션 등의 제형을 갖는 화장료, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제 등의 세정료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 의약료 제형을 가질 수 있다.

이하, 실시예, 제형예 및 비교예를 들어 본 발명을 좀 더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

참고예 1 Toco-APPA의 제조

1-1 . α-토코페릴 디클로로포스페이트(α-Tocopheryl dichlorophosphate)의 제조

옥시염화인 9.87g(6.44mmol)을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 테트라히드로퓨란

10㎖로 용해시키고, 얼음물 중탕에서 용액을 0~5℃로 냉각시켰다. 다른 용기에 α-토코페롤 21.54g(5.00mmol)과 트리에틸아민 6.10g(6.03mmol) 용액을 테트라히드로퓨란

40㎖로 희석한 후, 앞에서 제조한 용액에 1시간 동안 적가하였다. 적가가 끝난 후 30분 동안 더 교반하였다. 교반이 끝난 후 생성된 염화 트리에틸암모늄을 여과하여 제거하였다. 이 액을 다음 단계의 반응에서 바로 사용하였다.

1-2. d-토코페릴 포스포디클로리데이트(d-Tocopheryl dichlorophosphate)의 제조

d-토코페롤 20.13g을 사용한 것을 제외하고는 1-1과 동일한 방법으로 실시하여 d-토코페릴 포스포디클로리데이트(d-tocopheryl dichlorophosphate)를 얻었다.

1-3. 3-아미노프로필토코페릴포스페이트의 제조

상기 1-1에서 제조한 토코페릴 디클로로포스페이트 여액을 얼음물 중탕에서0~5 ℃로 냉각시켰다. 다른 용기에 3-아미노-1-프로판올 3.76g(5.00mmol)과 트리에틸아민 11.11g(10.98mmol)용액을 테트라히드로퓨란 20㎖로 희석한 후 앞서 제조한 반응액에 1간 동안 적가하여 2-토코페릴테트라히드로-2H-1,3,2-옥사자포스포린P-옥시드를 생성시킨다. 적가 후 30분 동안 더 교반하고, 생성된 염화 트리에틸암모늄을 여과하여 제거하였다. 그 후, 여액을 소금물로 세척하고 이온수 40㎖와 염산을 적가하여 pH 2 ~4 로 만든다. 상온에서 2시간 동안 교반하여 가수분해시키고, 소금물을 적가하여 세척하여 유기층을 분리한다. 무수 황산 마그네슘 10g을 넣어 탈수시키고 여과 후 용매를 완전히 제거하여 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트 25g(88%)을 얻는다.

¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) d 0.86 (t, 12 H), 1.00-1.80 (m, 29 H), 2.01 (s, 3 H), 2.11 (s, 3 H), 2.15 (s, 3 H), 2.40-2.50 (m, 2 H), 2.70-2.80 (m, 2 H), 3.90-4.00 (m, 2 H), 7.80 (br, 3 H)

1-4. b-토코페릴 3-아미노프로판인산 에스테르의 제조

상기 1-2에서 제조한 d-토코페릴 디클로로포스페이트(d-Tocopheryl dichlorophosphate)를 사용한 것을 제외하고는 1-1과 동일한 방법으로 실시하여 3-아미노프로필 b -토코페릴포스페이트 23g(87%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) d 0.86 (t, 12 H), 1.00-1.80 (m, 29 H), 2.03 (s, 3 H), 2.55-2.65 (m, 2 H), 3.10-3.20 (m, 2 H), 4.10-4.20 (m, 2 H), 7.91 (br, 3 H)

실시예 1~5

Toco-APPA는 자사에서 제조한 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트(토코페릴 APPAR, Pacific Co. Ltd)를 사용하였으며, 그 제조방법은Journal of the American Oil Chemist's Society, 78 (4), 2001에서 나타낸 방법으로 제조하여 사용하였다. 사용된 Toco-APPA는 고성능액체크로마토그래피로 정량한 결과, 순도가 99.9%였다.

Toco-APPA를 포집한 나노유화입자를 제조하기 위하여 세틸에틸헥사노에이트 5g에 상기의 Toco-APPA 3g, 비이온성 계면활성제인 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5g 및 폴리소르베이트 60 0.5g을 혼합하여 60℃까지 가열하고 균일 용해하여 유상을 제조하였다. 다음, 글리세린 5g, 메틸파라벤 0.3g을 증류수 85.7g에 녹이고 60℃까지 가열하여 수상을 제조하였다. 상기에서 제조한 수상에 유상을 서서히 부어주면서 유화기로 5,000rpm, 3분간 1차 유화를 시켜주고, 50℃까지 냉각된 후 고압유화기로 1000bar에서 3회 처리하여 Toco-APPA를 3중량% 함유한 나노유화 입자를 제조하였다.

또한, 나노유화입자 내부의 Toco-APPA의 함량을 0, 0.1, 0.5, 1, 3, 5중량%와 같이 달리하여 나노유화입자를 제조하였다.

비교예

Toco-APPA 3중량%를 오일인 세틸에틸헷사노에이트 중에 분산시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 1~5와 동일한 방법으로 제조하였다.

[시험예 1]

상기 실시예 및 비교예에서 제조한 나노유화입자를 동적레이저 광산란법 (Dynamic light scattering, Zetasizer 3000HS, Malvern, UK)으로 산란각 90°로, 25℃온도를 유지하면서, 평균입경을 측정하였다. 수역학적 입자직경을 측정하고, 응집, 침전이 육안으로 관찰되는 경우는 별도로 입경을 측정하지 않았으며, 상기의 결과를 표 1에 나타내었다.

	Toco-APPA의 함량(중량%)	수용성 고분자(중량%)	평균입경(㎚)
비교예	3.00		-
실시예 1	0.00	폴리비닐알콜(0.2%)	35
실시예 2	0.10	폴리비닐알콜(0.2%)	38
실시예 3	0.50	폴리비닐알콜(0.2%)	42
실시예 4	1.00	-	45
실시예 5	3.00	-	48
실시예 6	5.00	-	51

상기 표 1에 알 수 있는 바와 같이, Toco-APPA의 함량비가 증가함에 따라 제조되는 나노유화입자의 크기가 약간씩 증가함을 확인하였으며, 그 크기는 35~51㎚사이임을 확인할 수 있었다. 또한 각각의 실시예에 있어 폴리비닐알콜을 0.2% 용해시켜 나노유화물의 안정도를 향상시키고자 하였으며, Toco-APPA의 함량을 1.0% 이상을 사용하는 경우에는 유화안정도가 매우 좋아지게 되어 별도의 수용성 고분자에 의한 유화안정화를 유도할 필요가 없으며, Toco-APPA를 낮은 농도로 사용하는 경우에는 수용성 고분자를 첨가해 줌으로써 더 향상된 유화안정도를 가지게 되는 경향이 있었다.

[시험예 2]

상기에서 제조한 나노유화입자의 제조를 확인하기 위하여 전자현미경으로 확인하였다. 측정방법은 약 10~20㎖의 시료를 구리홀더에 넣고, 액체질소 제트냉각기(Polaron. UK)로 급냉시킨 후, Polaron freeze-fracture 장치를 사용하여 냉각된 시료를 쪼개서 단면이 노출되도록 하였다. 소량의 2% 암모늄몰리브데이트 용액으로 negative staining 처리하고, 탄소 박막필름에 붙여서 Jeol 100CX II 전자현미경을 사용하여 측정하였다. 상기의 방법으로 90,000배 확대하여 측정된 나노유화입자 실시예 4를 도 1에 나타내었다.

하기 도 1은 나노유화입자를 90,000배 확대하여 관찰한 것으로 자그마한 원모양으로 보이는 것들이 나노유화 입자들이며, 제조시 크기가 서로 다른 유화입자가 형성되며, 동적레이저 광산란법에 의한 측정에서 나타나는 평균입경의 편차가 비교적 큼을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] Toco-APPA를 함유한 나노유화입자의 장기안정도

상기에서 제조한 실시예의 나노유화입자 장기안정도를 확인하기 위하여 각각의 실시예를 온도별로 조건을 달리하여 보관하고, 30일이 경과한 후에 나노유화입자의 분산 안정성 및 유화안정도를 확인하였다. 나노유화입자의 입경의 증감을 측정하기 위하여 실험예 1에서 사용된 동적 레이저 광산란법을 사용하여 측정을 하였으며, 육안으로 응집, 침전이 관찰되는 시료에 대해서는 별도의 입경측정을 실시하지 않았다. 시험결과를 하기 표 2에 나타내었다.

실시예	0℃	25℃	37℃	45℃
1	△	△	x	x
2	o	o	o	o
3	o	o	o	o
4	o	o	o	o
5	o	o	o	o
6	o	o	o	o
* o : 입경의 변화가 초기입경에 대하여 ±50%이하인 경우△ : 입경의 변화가 초기입경에 대하여 ±50%초과, ±100%이하x : 입경의 변화가 초기입경에 대하여 ±100%초과인 경우

상기 표 2의 결과로부터, Toco-APPA를 함유한 나노유화입자의 경우 장기보관에 따른 안정도가 약간은 향상되었으며, Toco-APPA를 함께 사용하여 제조한 나노유화입자는 한달이 경과한 후에도 물리적으로 안정하게 분산되어 있음을 확인할 수 있으며, Toco-APPA가 가지는 물리적 성질에 기인한 것으로 보여진다.

제형예 1크림제형

조성	함량(중량%)
밀납글리세릴스테아레이트세토스테아레이트폴리솔베이트 60솔비탄세스퀴올리에이트세칠에칠헥사노에이트스쿠알란유동파라핀글리세린프로필렌글리콜실시예 5방부제증류수	2.02.51.50.55.05.08.08.04.05.05.0미량to 100

제형예 2영양화장수

조성	함량(중량%)
세칠에칠헥사노에이트세토스테아릴알콜친유형모노스테아린산 스테아레이트스쿠알란폴리솔베이트 60솔비탄세스퀴올리에이트실시예 5글리세린트리에탄올아민카르복시비닐폴리머방부제증류수	5.01.00.82.01.50.55.08.00.20.2미량to 100

제형예 3유연화장수

조성	함량(중량%)
베타인낫토검셀룰로오스검에탄올폴리옥시에칠렌경화피마자유초산토코페롤실시예 5방부제증류수	3.03.00.085.00.50.25.0미량to 100

제형예 4겔

조성	함량(중량%)
디소듐에틸렌디아민테트라아세테이트에톡시글리콜폴리아크릴레이트에탄올실시예 5수소첨가피마자유페닐트리메치콘트리에탄올아민증류수	0.021.0020.0030.005.00.800.200.40to 100

제형예 5분무제

조성	함량(중량%)
트리에탄올아민폴리비닐피롤리돈 / 비닐아세테이트실시예 5글리세린폴리아크릴레이트증류수	0.23.05.05.00.2to 100

상기 처방을 펌프용기에 담아 사용한다.

제형예 6연고

조성	함량(중량%)
카프린/카프릴트리글리세리드액상 파라핀솔비탄세스퀴올리에이트옥틸도데세스-25세칠에칠헥사노에이트스쿠알란살리실산글리세린솔비톨실시예 5증류수	10.010.06.09.010.01.01.015.010.05.0to 100

제형예 7패치

조성	함량(중량%)
폴리비닐알콜폴리비닐피롤리돈소듐폴리아크린산소듐알지네이트레티닐팔미테이트부틸렌글리콜황산콘드로이친치마버섯추출물메도폼오일PEG(20)솔비탄스테아레이트BHT산화아연실시예 5증류수	2.03.03.01.01.03.01.01.01.01.0미량미량5.0to 100

[실험예 4] 나노유화입자내부의 Toco-APPA의 안정도

상기 실시예, 비교예 및 제형예의 나노유화입자 내부의 Toco-APPA의 보관 온도에 따른 장기안정도를 확인하기 위하여, 온도별로 조건을 달리하여 보관하고, 30일이 경과한 후에 고성능 액체크로마토그라피를 사용하여 정량분석을 실시하였다.분석을 위하여 역상 C18 컬럼을 사용하였으며, 전개액은 메탄올/테트라하이드로퓨란 (9/1) 혼합액을 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

시료	초기량	0℃	25℃	37℃	45℃
비교예	3.00	2.92	2.51	1.83	1.20
실시예 2	0.10	0.10	0.09	0.08	0.07
실시예 3	0.50	0.50	0.49	0.48	0.47
실시예 4	1.00	1.00	0.98	0.97	0.96
실시예 5	3.00	3.00	2.98	2.96	2.94
실시예 6	5.00	5.00	4.97	4.95	4.93
제형예 1	0.15	0.15	0.14	0.14	0.13
제형예 2	0.15	0.15	0.14	0.13	0.13
제형예 3	0.15	0.15	0.14	0.13	0.12
제형예 4	0.15	0.15	0.14	0.13	0.12
제형예 5	0.15	0.15	0.14	0.14	0.14
제형예 6	0.15	0.15	0.14	0.14	0.13
제형예 7	0.15	0.15	0.14	0.13	0.13

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 오일중에 Toco-APPA를 3중량%로 용해시킨 비교예의 경우, 같은 함량의 Toco-APPA를 함유한 실시예 5에 비해서 급격한 Toco-APPA의 감소를 확인하였으며, 나노유화입자의 내부에 포집된 Toco-APPA는 우수한 안정도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 실시예 5를 5% 함유한 제형예 1~7에서 Toco-APPA의 함량은 매우 안정하게 유지됨을 확인할 수 있었다.

[실험예 5] Toco-APPA의 경피흡수율 측정

상기의 비교예, 실시예 2~6, 제형예 1~7의 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자에 대해서 경피흡수를 시험하여, Toco-APPA를 함유한 나노유화입자의 경피흡수율을 확인하였다.

1) 시험방법

Toco-APPA의 경피흡수시험을 위하여 8주정도의 암컷 무모 기니아 피그(strain IAF/HA-hrBR)의 복부부위의 피부를 절취하여 프란즈-타입 디퓨젼 셀(Franz-type diffusion cells)에 장착하여 실험하였다. 프란즈-타입 디퓨젼 셀의 수용 용기(5㎖)에 50mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.1M NaCl)을 넣어 32℃를 유지해주면서 600rpm으로 혼합, 분산시켜주었으며, 상기의 실시예, 비교예 및 제형예 10％(w/v) 분산된 용액 50㎕를 셀에 넣었다.

그후, 12시간동안 흡수 확산시켜주었으며, 흡수 확산이 일어나는 피부의 넓이가 0.64㎠가 되게 하였다. Toco-APPA를 함유한 나노유화입자의 흡수 확산이 끝난 후에는 건조된 킴와이프스(Kimwipes) 또는 에탄올 10㎖로 피부위에 남아있는 흡수되지 못한 나노유화입자를 씻어주었다. 팁형(tip-type) 호모게나이저(Polytron PT2100, Switzerland)를 사용하여 나노유화입자가 흡수 확산되어 있는 피부를 갈아준 후, 피부내부로 흡수된 나노유화입자 내부의 Toco-APPA를 4㎖의 디클로로메탄을 사용하여 추출하였다. 이후, 추출액을 0.45㎛의 나일론막 여과막을 사용하여 여과하고, 상기한 실험예 4 및 5과 동일한 HPLC 분석조건에서 함량을 측정하였다. 대조군으로써 비교예를 사용하였으며 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시료	경피흡수량(㎍)	경피흡수 증가율
비교예	12.5 (±2.4)	1.0 배
실시예 2	18.7 (±5.3)	1.5 배
실시예 3	45.4 (±5.5)	3.6 배
실시예 4	76.5(±3.1)	6.1 배
실시예 5	85.7(±4.2)	6.9 배
실시예 6	98.4(±5.2)	7.9 배
제형예 1	5.01	5.9 배
제형예 2	5.27	6.2 배
제형예 3	5.70	6.7 배
제형예 4	5.87	6.9 배
제형예 5	4.85	5.7 배
제형예 6	4.68	5.5 배
제형예 7	4.93	5.8 배

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, Toco-APPA를 오일에 용해시킨 비교예 보다도 실시예 2~6의 경피흡수율이 높게 나타났으며, 경피흡수율은 나노유화 입자내에 포집된 Toco-APPA의 함량에 비례하여 증가함을 알 수 있었으며, 특히, 제형예에 있어서도 비교예에 비해서 평균적으로 6.1배 높은 경피흡수증가율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] 생체효소에 의한 3-아미노프로필 토코페릴 포스페이트의 분해 실험

상기에서 제조한 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자의 피부에의 적용시, 피부흡수 후 생체내에 존재하는 효소에 의해서 토코페롤과 3-아미노프로판인산(3-APPA)으로 분해되는지의 여부를 실험하였다. 실험에 사용된 효소는 Phosphodiesterase이며, 용액은 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자 수용액을 사용하였다. 완충용액에서 온도 37℃로 24시간 교반한 후, HPLC(C18 column, MeOH : THF = 9:1)를 이용하여 가수분해 된 정도를 분석하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

시료	초기량	가수분해량	가수분해율(%)
비교예	3.00	1.20	40
실시예 2	0.10	0.04	43
실시예 3	0.50	0.21	42
실시예 4	1.00	0.43	43
실시예 5	3.00	1.35	45
실시예 6	5.00	2.25	45
제형예 1	0.15	0.07	46
제형예 2	0.15	0.06	43
제형예 3	0.15	0.07	47
제형예 4	0.15	0.07	46
제형예 5	0.15	0.07	45
제형예 6	0.15	0.06	43
제형예 7	0.15	0.07	45

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 전부와 제형예 전부에서 분해효소에 의한 Toco-APPA의 가수분해율은 40~47%의 범위에 있으며, 이 수치는 비교예의 경우에 비하면 모든 실시예와 제형예에서 조금씩 높은 수치를 보였다. 상기의 실시예와 제형예의 제조에 있어 계면활성제가 도입되어 생체 효소의 비활성화가 상당한 수준으로 진행될 수 있으므로, 실제로 생체효소에 의한 Toco-APPA의 가수분해는 상기의 시험결과보다 훨씬 많이 진행될 것으로 예상된다.

[실험예 6] Toco-APPA의 콜라겐 합성촉진효과

경피흡수된 나노유화입자의 내부에 포집된 Toco-APPA에 의한 콜라겐 생합성 촉진효과를 확인하기 위하여,in vitro방법으로 콜라겐(collagen) 생합성 촉진 효과를 3-아미노프로판인산(3-APPA)과 비교하였다. 시험방법은 fibroblast (neonatal)을 24웰(well)에 각 웰당 105개씩 seeding하여 90%정도까지 발전할 때까지 배양한다. 이를 PBS로 한번 세척한 후, 상기의 실시예 및 비교예는 동일양을 사용하고 제형예는 Toco-APPA의 함량이 일정하게 되도록 하여 동일 농도가 되도록 희석하여 처리하고 24시간 동안 CO₂배양기에서 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 procollagen type(I) ELISA kit 를 이용하여 procollagen의 증감여부를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 6으로 나타내었으며, 합성능은 control (비처리군)을 100으로 하여 대비한 것이다.

시료	나노유화입자의 농도 (%)	합성능 (%)
3-APPA	10^-4	146
비교예	10^-7	141
실시예 2	10^-7	152
실시예 3	10^-7	167
실시예 4	10^-7	185
실시예 5	10^-7	201
실시예 6	10^-7	254
제형예 1	10^-7	154
제형예 2	10^-7	156
제형예 3	10^-7	152
제형예 4	10^-7	154
제형예 5	10^-7	158
제형예 6	10^-7	148
제형예 7	10^-7	149

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, Toco-APPA는in vitro실험에서 콜라겐 생성능이 뛰어남을 알 수 있었다. 상기의 결과는 경피흡수되어 피부내부로 흡수된 Toco-APPA가 피부내에 존재하는 분해효소에 의하여 토코페롤과 3-아미노프로판인산 (3-APPA)으로 분해되며, 이중 3-APPA성분은 피부내에서 콜라겐 생합성을 촉진할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 콜라겐 생합성은 결과적으로 피부의 탄력을 높여주며, 나이에 따라 생성되는 잔주름의 제거효과를 나타낼 것으로 예상된다.

[실험예 7] 피부자극도 측정

건강한 남녀 실험자 50명의 팔 하박부에 상기 각 실시예의 시료를 폐쇄 첩포 시험 방법에 따라, 1일 1회씩 도포 후 외부와의 차단을 위해 플라스틱 캡을 씌운 다음 1일 후, 3일 후, 7일 후에 하기의 판정 방법에 따라 자극 정도를 관찰하였다.


0	자극 없음
1	최소한의 자극(겨우 감지할 정도)
2	약간의 자극(홍반)
3	심한 자극(홍반, 부종)
4	극심산 자극(홍반, 부종)

각 피험자의 자극 정도를 측정한 후 피험자의 수로 나누어 그 평균 자극 정도를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

시 료	피부자극도(%)
시 료	1일 후	3일 후	7일 후
비교예	0.5	0.5	0.8
실시예 2	0.6	0.7	0.5
실시예 3	0.5	0.5	0.4
실시예 4	0.7	0.5	0.6
실시예 5	0.5	0.6	0.7
실시예 6	0.2	0.5	0.5
제형예 1	0.3	0.4	0.8
제형예 2	0.4	0.5	0.6
제형예 3	0.1	0.4	0.4
제형예 4	0.2	0.3	0.2
제형예 5	0.3	0.1	0.7
제형예 6	0.5	0.5	0.5
제형예 7	0.1	0.8	0.4

상기 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예, 실시예 2~6 및 제형예 1~7의 전 시료에 있어 피부 자극은 없음을 알 수 있다. 나노유화입자 내부에 포집된 Toco-APPA의 함량이 서로 다른 실시예 2~6의 경우에도 피부 자극은 없음을 확인할 수 있었다. 이외에도 제형예 1~7까지의 각각 다른 농도의 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자를 함유한 화장료 등의 조성물에 있어서도 피부자극은 거의 없음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명에서 제공되는 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자 및 이를 함유하는 화장료 조성물의 피부적합성을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자는 물리화학적으로 안정한 상태를 장기간 유지하는 특징이 있으며, 특히, 내부에 포집된 Toco-APPA의 안정도도 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 적량의 Toco-APPA를 포집한 나노유화입자를 함유한 피부외용제 조성물을 피부에 사용함으로써 Toco-APPA의 경피흡수를 증가시켜줄 수 있으며, 경피흡수된 Toco-APPA는 피부내부에 존재하는 분해효소에 의하여 분해되어 토코페롤과 3-APPA성분을 생성시키며, 각각의 성분은 항산화효과와 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내을 확인할 수 있었다. 이러한 효과는 결과적으로 피부노화억제효과로 볼 수 있으며, 본 발명에서 제공되는 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자 및 이를 함유한 피부 외용제 조성물을 이용함으로써 달성할 수 있다.

Claims

삭제
세틸에틸헥사노에이트에 하기 화학식 1으로 표시되는 3-아미노프로필토코페릴 포스페이트(Toco-APPA) 및 계면활성제를 혼합하고 60℃까지 가열하여 균일한 유상을 제조하는 단계;

글리세린 및 메틸파라벤을 증류수에 가열용해하여 수상을 제조하는 단계;

상기에서 제조한 수상에 유상을 서서히 부어주면서 유화기로 유화시키는 단계;

50~60℃에서 수용성 고분자를 전체 나노유화입자 분산액에 대하여 0.001~5중량% 부가하여 분산시켜주는 단계; 및

상기를 냉각한 후, 고압유화기로 처리하여 Toco-APPA를 함유한 나노유화입자를 제조하는 단계;를 포함하는 나노유화입자의 제조방법에서,

상기 수용성 고분자는 천연 고분자류 및 이의 유도체, 단백질 및 이의 유도체, 천연유래 카보하이드레이트류 및 이의 유도체, 폴리비닐류 고분자 및 이의 유도체, 폴리카르복시산 및 이의 유도체, 탄화수소류 및 이의 이성질체, 폴리사카라이드 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 나노유화입자의 제조방법:

[화학식 1]

상기식에서, R₁, R₂, R₃= H 또는 Me기로서 토코페롤의 5, 7 또는 8번 위치에 적어도 하나의 메틸기를 가지며, A는 -CH₂-CH(CH₃)- 또는 -CH=C(CH₃)- 이다.
제 2항에 있어서, 상기 나노유화입자의 크기가 30~150㎚임을 특징으로 하는 나노유화입자의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 계면활성제는 고급지방산비누, 알킬황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬에테르인산에스테르염, 및 N-아실아미노산염인 음이온성 계면활성제; 염화알킬트리메틸암모늄, 염화디알킬디메틸암모늄, 및 염화벤잘코늄인 양이온성 계면활성제; 알킬디메틸아미노초산베타인, 알킬아미드 디메틸아미노초산베타인, 및 2-알킬-N-카르복시-N-하이드록시이미다졸리늄베타인인 양쪽성 계면활성제; 폴리옥시에틸렌류, 다가알콜에스테르류, 및 에틸렌옥사이드/프로필렌옥사이드 블록 공중합체인 비이온성 계면활성제; 에틸셀룰로스인 고분자 계면활성제; 및 레시틴, 라놀린, 콜레스테롤, 및 사포닌인 천연 계면활성제;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 나노유화입자의 제조방법.
삭제
상기 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 제조방법으로 제조된 나노유화입자를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션의 제형을 갖는 화장료; 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제의 세정료 조성물; 또는 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 제형 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 피부노화를 억제함을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.