JP4974533B2

JP4974533B2 - ジスルフィド架橋したタンパク質ナノ粒子

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Publication number: JP4974533B2
Application number: JP2006020019A
Authority: JP
Inventors: 牧子相見; 良一根守
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2006-01-30
Filing date: 2006-01-30
Publication date: 2012-07-11
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Also published as: JP2007197394A

Description

本発明は、ジスルフィド架橋したタンパク質ナノ粒子、その製造方法およびその使用に関する。

微粒子材料は、バイオテクノロジーにおいて幅広い利用が期待されている。特に近年、ナノテクノロジーの進展によって生み出されたナノ微粒子材料をバイオテクノロジーや医療に応用することが活発に検討され、研究成果も数多く報告されている。

薬剤送達システム（DDS）の分野では早くからナノ粒子への期待が強く、薬剤や遺伝子のキャリアーとしてナノ粒子が極めて有望である。中でも、高分子ミセルを用いた研究は盛んに行われているが、ほとんどの場合、AB型かABA型のブロックコポリマーがその構造の単純さから用いられている。高分子ミセルの特徴として、大きな薬物容量、高い水溶性、高い構造安定性、非蓄積性、小さな粒経（１００nm以下）、機能分離性がある。このことから、標的部位へのターゲティングや、疎水性薬物の可溶化を目的とした研究が行われている。

固形ガン局所の血管内皮の透過性は異常に亢進していると同時に、リンパ系による排出が抑制されているために、高分子は本質的にガン部位に選択的に蓄積しやすい性質がある。この性質はEPR効果（Enhanced Permeability and Retention effect）と呼ばれる（例えば、非特許文献１）。このEPR効果を示すためには、その大きさは５〜２００ｎｍが最適であり、その表面は親水的で荷電は中性か弱く負に帯電していることが求められる。高分子ミセルの大きさはこの範囲内であり、疎水的な薬物を封入した疎水性内核を親水性の外殻が取り囲んでいるので、表面物性は親水的であり、上記の条件を満たしているため、EPR効果の実現に適したキャリアーシステムである。

近年開発される活性の高い薬剤にはタキソールのように水に不溶なものがある。経口吸収が困難な抗ガン剤では血液中に投与することが望ましい。よって、有機溶媒や界面活性剤を用いて非水溶性の薬剤を水に可溶化するのであるが、用いる有機溶剤や界面活性剤の毒性は相当なレベルに及ぶ。また、この毒性によるショック様症状を抑えるために、ステロイドの前投与や、カテーテルによって心臓内に導いて投与することが求められるなど、入院が必要な治療形態となる。有機溶剤や低分子の界面活性剤に比べれば毒性が低いと考えられる両親媒性高分子を用いてそのミセル構造に薬物を封入して血液中に投与する研究が行われており、臨床試験も行われている（例えば、非特許文献２）。

一方、近年、化粧品においては、ナノテクノロジーをはじめ様々な新しい技術を取り入れることにより、機能性・使用性の向上、他社品との差別化が計られており、より明確な肌効果が求められるようになってきている。肌は一般的に、角質層がバリアーとして存在するために薬物の皮膚への浸透性が低い。肌効果を十分に発揮させるためには、有効成分の皮膚透過性の改善が不可欠である。また、皮膚に対して高い有効性を持っていても、保存安定性が悪かったり、皮膚に刺激を起こしやすかったりするために製剤化が困難な成分も多い。これらを解決すべく、経皮吸収性の改善および保存安定性の向上、皮膚刺激性の低減など目的とした、様々なカプセルの開発が進められている。現在、超微細乳化やリポソームなど各種素材が研究されている（例えば、非特許文献３）。しかし、乳化に用いられる界面活性剤は安全性に懸念があり、またイオンコンプレックスによる構造形成は共有結合に比べて安定性も劣る。

高分子材料を用いれば、保存安定性や生体内における粒子の安定性の点で、大きく改善されることが予想される。しかし、ほとんどの研究は乳化重合をはじめとする合成高分子を用いたものであり、低分子に比べれば毒性は軽減されるものの、ある程度の毒性は覚悟しなければならず、より安全なキャリアーが求められている。

天然高分子は合成高分子と同様に高い構造安定性を示しながら、合成高分子よりも格段に安全性が高く、DDSキャリアーとしての利点を兼ね備えている。しかし、合成高分子に比べて天然高分子キャリアーの困難な点は、粒子作製方法である。天然高分子の粒子作製方法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥およびジェットミルが利用できるが、ほとんどの場合、粒子サイズはミクロンサイズであり、大きさの制御が困難である。

特許文献１では、高分子材料を用いたナノ粒子経皮吸収剤を提案しているが、これは界面活性剤を使用した乳化物であり、前述のように安全性および安定性に懸念がある。また、特許文献２には、球状タンパク質粒子が記載されているが、薬物を含有する組成物としての粒子サイズは１μｍ以上であり、沈殿剤による粒子形成のみで、共有結合によるタンパク質同士のネットワークがなく、保存安定性や生体内における粒子の安定性の点で問題がある。特許文献３では、高分子材料（合成高分子または天然高分子）から作られるナノ粒子の薬剤標的化システムを提案しているが、粒子作製方法として、１つ以上のモノマーおよび／またはオリゴマー前駆体を重合する工程を含んでいるため、高分子材料として天然高分子を用いたとしても、安全性に問題がある。また、特許文献４でも、スキンケア成分を含む架橋高分子ナノ粒子を提案しているが、モノマーもしくはマクロマー（重合性基を持つ合成高分子）の重合過程を含んでおり、安全性に懸念がある。非特許文献４では、ゼラチン水溶液に有機溶媒を添加して不溶化した粒子を、グルタルアルデヒドを用いて架橋しているが、グルタルアルデヒドは毒性の強い物質であり、残存した場合には安全性に問題がある。上記の通り、これまで知られている高分子ナノ粒子は、合成高分子は言うに及ばず、天然高分子であっても、粒子形成過程で、界面活性剤や重合性モノマー、化学架橋剤などを使用しており、安全性に懸念がある。

ところで、タンパク質の架橋は一般には化学架橋が知られており、グルタルアルデヒドのような架橋剤を添加する方法や、光反応性基を有するモノマーを予め用いＵＶ照射する方法、パルス照射により局所的にラジカルを発生させ架橋する方法などが知られている。生体高分子の特質を生かした方法として、還元剤により、タンパク質分子内のジスルフィド結合を切断し、酸化剤により、分子間でジスルフィド結合を再結合する方法が知られている。通常この方法は、パーマネントウェーブなどのバルクもしくは含水した生体高分子中で行われるものであり（例えば、特許文献５）、タンパクナノ粒子内での架橋結合の形成は知られていない。更に、有機溶媒中に分散したナノ粒子での架橋反応は知られていない。

Y.Matsumura and H. Maeda, Cancer Res., 46, 6387(1986) Y.Mizumura et al., Jap.J.Cancer Res., 93, 1237(2002) 西田光広、フレグランスジャーナル、11月、17（2005） C.Coester et al., J. Microencapsulation, 17, 189(2000) 特開２００２−３０８７２８公報特表２００５−５００３０４号公報特表２００１−５０２７２１号公報特開２００４−２４４４２０公報特開平５−１１７１３４号公報

本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、界面活性剤や合成高分子を使用することなく、生体適合性の高い材料を用いた安全性の高いナノ粒子を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、化学架橋剤を使用することなく架橋した安全性の高いナノ粒子を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる、水不溶性タンパク質ナノ粒子を作製できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる、水不溶性タンパク質ナノ粒子が提供される。

好ましくは、本発明のタンパク質ナノ粒子は、少なくとも１種の活性成分をさらに含む。
好ましくは、本発明のタンパク質ナノ粒子は、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する。

好ましくは、活性成分は、化粧品用成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である。
好ましくは、化粧品用成分は保湿剤、美白剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分はビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分は制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、又は抗炎症剤である。

好ましくは、平均粒子サイズは１０〜１０００ｎｍである。
好ましくは、タンパク質はアルブミン、オバルブミン、トランスフェリン、又はグロブリンである。

好ましくは、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％のリン脂質が添加されている。
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性又はアニオン性多糖が添加されている。

好ましくは、タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質又はアニオン性タンパク質が添加されている。
好ましくは、タンパク質を酸化剤で処理する工程を、有機溶媒中に分散したタンパク質ナノ粒子を酸化剤で処理することによって行う。

本発明の別の側面によれば、上記した本発明のタンパク質ナノ粒子を含む、薬物送達剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる、水不溶性タンパク質ナノ粒子の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに有機溶媒中に分散した該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる、水不溶性タンパク質ナノ粒子の製造方法が提供される。

本発明のタンパク質ナノ粒子においては、界面活性剤や合成高分子を使用することなく、生体適合性の高いタンパク質を用いているため、生体に対する安全性が高い。また、本発明のタンパク質ナノ粒子では、化学架橋剤を使用することなく、結合の組換えによってジスルフィド結合による架橋を形成しているため、生体に対する安全性が高い。

以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
本発明のタンパク質ナノ粒子は、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られることを特徴とする。

なお、タンパク質を酸化剤で処理することによって、タンパク質分子間のジスルフィド結合、および部分的に分子内のジスルフィド結合が再形成されることにより、タンパク質ナノ粒子が架橋され、水に不溶化するものと考えられる。また、本発明のタンパク質ナノ粒子は、磁気応答性粒子は含まないものである。

本発明で用いるタンパク質の種類はジスルフィド結合を有するタンパクであれば特に制限されないが、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、ヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。その中で好ましいものは、アルブミン、グロブリン、トランスフェリンである。

本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる

本発明で用いる還元剤の具体例としては、ジチオトレイトール、チオグリコール酸またはチオグリコール酸アンモニウムなどのチオグリコール酸塩、システイン、システイン塩酸塩などのシステイン酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオンなどのシステイン誘導体、チオグリコール酸モノグリセリン、システアミン、チオ乳酸、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メルカプトエタノールなどを挙げることができるが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。

本発明で用いる還元剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる

本発明で用いる還元剤の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することができるが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度を添加することができる。

タンパク質を還元剤で処理する還元反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、５分から７２時間反応することができ、好ましくは、１０分から１２時間反応することができる。

還元反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から４０℃で反応することができる。

本発明で用いる酸化剤の具体例としては、酸素、過酸化水素、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウムなどの臭素酸塩、過ほう酸塩、過炭酸ナトリウムなどを挙げることができるが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。酸素としては、空気中の酸素を使用することができる。即ち、酸化剤として酸素を使用する場合には、タンパク質ナノ粒子を含む分散液を空気中で攪拌することによって、タンパク質を酸素で処理することができる。本発明に用いられる酸化剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明で用いる酸化剤の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来るが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度を添加することができる。

タンパク質を酸化剤で処理する酸化反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、５分から７２時間反応することができ、好ましくは、１０分から１２時間反応することができる。

酸化反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から６０℃で反応することができる。

本発明のナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜５００ｎｍであり、特に好ましくは１００〜５００ｎｍである。上記したようなナノオーダーのサイズを有することにより、本発明のナノ粒子は、毛細血管などの微細な部位にも到達することが可能になる。

本発明のタンパク質ナノ粒子は、好ましくは、少なくとも１種以上の活性成分を含むことができる。活性成分の量は特に限定されないが、一般的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有させることができる。

本発明において、活性成分はタンパク質ナノ粒子形成時に添加してもよいし、タンパク質ナノ粒子作成後に添加してもよい。

本発明に用いられる活性成分は、保湿剤、美白剤、アンチエイジング剤などの化粧品用成分、ビタミン、抗酸化剤などの機能性食品用成分、制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、抗炎症剤などの医薬品成分である。

本発明に用いられる保湿剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲンなどが挙げられる。

本発明に用いられる美白剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＣ、アルブチン、ハイドロキノン、コウジ酸、ルシノール、エラグ酸などが挙げられる。

本発明に用いられるアンチエイジング剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。レチノイン酸、レチノール、ビタミンＣ、カイネチン、β-カロテン、アスタキサンチン、トレチノインなどが挙げられる。

本発明に用いられる抗酸化剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ、カイネチン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０など。

本発明に用いられる制癌剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。フッ化ピリミジン系代謝拮抗薬（５-フルオロウラシル（5FU）やテガフール、ドキシフルリジン、カペシタビンなど）；抗生物質（マイトマイシン（MMC）やアドリアシン（DXR）など）；プリン代謝拮抗薬（メソトレキサートなどの葉酸代謝拮抗薬、メルカプトプリンなど）；ビタミンAの活性代謝物（ヒドロキシカルバミドなどの代謝拮抗薬、トレチノインやタミバロテンなど）；分子標的薬（ハーセプチンやメシル酸イマチニブなど）；白金製剤（ブリプラチンやランダ（CDDP）、パラプラチン（CBDC）、エルプラット（Oxa）、アクプラなど）；植物アルカロイド薬（トポテシンやカンプト（CPT）、タキソール（PTX）、タキソテール（DTX）、エトポシドなど）；アルキル化剤（ブスルファンやシクロホスファミド、イホマイドなど）；抗男性ホルモン薬（ビカルタミドやフルタミドなど）；女性ホルモン薬（ホスフェストロールや酢酸クロルマジノン、リン酸エストラムスチンなど）；LH-RH薬（リュープリンやゾラデックスなど）；抗エストロゲン薬（クエン酸タモキシフェンやクエン酸トレミフェンなど）；アロマターゼ阻害薬（塩酸ファドロゾールやアナストロゾール、エキセメスタンなど）；黄体ホルモン薬（酢酸メドロキシプロゲステロンなど）；BCGなどが挙げられるが、これに限定されない。

本発明に用いられる抗アレルギー剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クロモグリク酸ナトリウムやトラニラストなどのメディエーター遊離抑制薬、フマル酸ケトチフェンや塩酸アゼラスチンなどのヒスタミンH1-措抗薬、塩酸オザグレルなどのトロンボキサン阻害薬、プランルカストなどのロイコトリエン拮抗薬、トシル酸スプラタストなどが挙げられる。

本発明に用いられる活性物質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明のタンパク質ナノ粒子は、特許文献特開平６−７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７−１９３に記載の方法に準じて作製することができるが、架橋方法としてグルタルアルデヒドの代わりにジスルフィド結合により架橋することができる。

また、本発明においては、タンパク質を酸化剤で処理する工程を、有機溶媒中に分散したタンパク質ナノ粒子を酸化剤で処理することが好ましい。ここで用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、アセトン、THFなどの水溶性有機溶媒が好ましい。

本発明に用いることができるリン脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。

本発明に用いることができるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられる。

本発明に用いることができるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられる。

本発明に用いることができるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシンなどが挙げられる。

本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられる。

本発明のタンパク質ナノ粒子は、その中に活性成分を含むことができ、そのような活性成分を含むタンパク質ナノ粒子は、疾患部位に投与して用いることができる。即ち、本発明のタンパク質ナノ粒子は、薬物送達剤として有用である。

本発明のタンパク質ナノ粒子の投与方法として好ましいものは、経皮・経粘膜吸収、血管・体腔内・リンパへの注射が挙げられる。より好ましくは経皮・経粘膜吸収が挙げられる。

本発明のタンパク質ナノ粒子の投与量は、活性成分の種類及び使用量、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができ、好ましくは、２０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
アルブミン２０ｍｇを５ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および１０mM ＥＤＴＡを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、ジチオトレイトール２０ｍｇを加えて混合、室温で２時間還元する。ゲルろ過精製し、得られたアルブミン溶液に、ポリリジン２mg、下記構造を有する活性物質モデルを０．４mgを混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、２００nmであった。

（架橋度の評価方法）
ゲルろ過性精製後、タンパク質呈色試薬Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio Rad製)を用いて、アルブミン濃度を検量し、ＳＨの理論量を計算した。ＳＨ基呈色試薬ＤＴＮＢ（同仁化学研究所製）を用いて、グルタチオンを標品として検量線を引き、エタノール分散直後のアルブミンナノ粒子中のＳＨ基を定量したところ、上記アルブミン量から算出した理論量とほぼ一致し、ジスルフィド結合が定量的に還元されたことがわかった。空気中、３時間攪拌した後、再びアルブミンナノ粒子中のＳＨ基を定量し、攪拌前後のＳＨ基の量を比較したところ、空気酸化によって７２％のジスルフィド架橋が生成したことが確認された。

実施例２
アルブミン２０ｍｇを５ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および１０mM EDTAを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、ジチオトレイトール２０ｍｇを加えて混合、室温で２時間還元する。ゲルろ過精製し、得られたアルブミン溶液に、コンドロイチン硫酸−Ｃを２ｍｇ、アドリアマイシンを０．４mgを混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、２００nmであった。また、実施例１と同様にして、架橋度を評価した結果、７０％以上の架橋が確認された。

実施例３
トランスフェリン２０ｍｇを５ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および１０mM ＥＤＴＡを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、ジチオトレイトール２０ｍｇを加えて混合、室温で2時間還元する。ゲルろ過精製し、得られたトランスフェリン溶液に、アルブチンを０．４mgを混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋されたトランスフェリンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、１５０nmであった。また、実施例１と同様にして、架橋度を評価した結果、７０％以上の架橋が確認された。

実施例４
グロブリン２０ｇｍを５ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および１０mM EDTAを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、ジチオトレイトール２０ｍｇを加えて混合、室温で２時間還元する。ゲルろ過精製し、得られたアルブミン溶液に、ダイキトサン２mg、実施例１で使用したものと同じ活性物質モデルを０．４mgを混合する。前記溶液１mLとダイキトサン１ｍｇを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いてエタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋したグロブリンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、２００nmであった。また、実施例１と同様にして、架橋度を評価した結果、７０％以上の架橋が確認された。

実施例５
アルブミン２０ｍｇを５ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および１０mM EDTAを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、ジチオトレイトール２０ｍｇを加えて混合、室温で２時間還元する。ゲルろ過精製し、得られたアルブミン溶液２．５ｍLに塩酸を加え、pH２.５に調整し、アドリアマイシンを０．４mg添加する。この溶液を攪拌子ながらアセトン４ｍLを滴下した後、空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、１００nmであった。また、実施例１と同様にして、架橋度を評価した結果、７０％以上の架橋が確認された。

Claims

トランスフェリンを還元剤で処理してトランスフェリン分子内のジスルフィド結合を切断した後、該トランスフェリンのナノ粒子を形成し、さらに該トランスフェリンを酸化剤で処理することにより得られ、トランスフェリンの重量に対して、０.１〜１００重量％のリン脂質が添加されている、水不溶性トランスフェリンナノ粒子。
トランスフェリンを還元剤で処理してトランスフェリン分子内のジスルフィド結合を切断した後、該トランスフェリンのナノ粒子を形成し、さらに該トランスフェリンを酸化剤で処理することにより得られ、トランスフェリンの重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性又はアニオン性多糖が添加されている、水不溶性トランスフェリンナノ粒子。
トランスフェリンを還元剤で処理してトランスフェリン分子内のジスルフィド結合を切断した後、該トランスフェリンのナノ粒子を形成し、さらに該トランスフェリンを酸化剤で処理することにより得られ、トランスフェリンの重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質又はアニオン性タンパク質が添加されている、水不溶性トランスフェリンナノ粒子。
トランスフェリンを還元剤で処理してトランスフェリン分子内のジスルフィド結合を切断した後、該トランスフェリンのナノ粒子を形成し、さらに該トランスフェリンを酸化剤で処理することにより得られ、トランスフェリンを酸化剤で処理する工程を、有機溶媒中に分散したトランスフェリンナノ粒子を酸化剤で処理することによって行う、水不溶性トランスフェリンナノ粒子。
有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、アセトン又はＴＨＦである、請求項４に記載の水不溶性トランスフェリンナノ粒子。
少なくとも１種の活性成分をさらに含む、請求項１から５の何れか１項に記載のトランスフェリンナノ粒子。
トランスフェリンの重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する、請求項６に記載のトランスフェリンナノ粒子。
活性成分が、化粧品用成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である、請求項６又は７に記載のトランスフェリンナノ粒子。
化粧品用成分が保湿剤、美白剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分がビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分が制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、又は抗炎症剤である、請求項８に記載のトランスフェリンナノ粒子。
平均粒子サイズが１０〜１０００ｎｍである、請求項１から９の何れかに記載のトランスフェリンナノ粒子。
請求項１から１０の何れかに記載のトランスフェリンナノ粒子を含む、薬物送達剤。
トランスフェリンを還元剤で処理してトランスフェリン分子内のジスルフィド結合を切断した後、該トランスフェリンのナノ粒子を形成し、さらに有機溶媒中に分散した該トランスフェリンを酸化剤で処理することにより得られる、水不溶性トランスフェリンナノ粒子の製造方法。