CN103813786A - 用于局部递送的蛋白纳米载体 - Google Patents

Abstract

本发明包含纳米粒子组装体和用于制备纳米粒子组装体的方法和包含此组装体的组合物。本发明还包含使用本发明的所得纳米粒子作为递送装置将多种分子和细胞实体络合至该纳米粒子的方法。纳米粒子组装体可被用于多种应用，诸如治疗癌症、靶向肿瘤、减少药物的体内毒性、增加络合剂的体内疗效、保护络合剂抗降解、和增强药物或其他剂的水溶解性。

Description

用于局部递送的蛋白纳米载体

发明领域

本发明一般涉及药物递送技术，且更具体地涉及纳米粒子药物递送系统，包括用于使用疏水性的水不溶性蛋白制备此系统的方法，其中纳米粒子可包括谷醇溶蛋白以制备局部药物递送系统。

背景技术

玉米醇溶蛋白，是能够从玉米（corn）或玉蜀黍（maize）中分离出来的植物蛋白，属于由高含量的非极性氨基酸诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺组成的谷醇溶蛋白家族。玉米醇溶蛋白是无味、无毒、生物可降解及水不溶性的，并因此是对于许多应用有吸引力的成分。

已研究或使用玉米醇溶蛋白作为制药、医疗、食品、化妆品、粘合剂和包装工业中的聚合物。在食品和制药工业中，玉米醇溶蛋白已被用作例如薄膜涂层材料和形成诸如微米粒子或纳米粒子的粒子系统（美国专利号5,679,377(Bernstein等人)，通过引用整体并入本文；Liu等人,Biomaterials26(2005)109-115；Lopez和Murdan,J Microencapsulation23(2006)303-314；Zhong等人,Food Biophysics3(2008)186-190；Parris等人，J AgricFood Chemistry53(2005)4788-4792）。

已提出形成玉米醇溶蛋白粒子的多种方法。例如，美国专利号5,330,778(Stark；通过引用整体并入本文)描述了使用玉米醇溶蛋白使用pH改变制备微米粒子以形成玉米醇溶蛋白微米粒子的方法。然而，该方法制备具有较大的微米尺寸并具有宽的粒径分布的玉米醇溶蛋白粒子，其具有显著的缺点，例如，对于体内使用。用于人或动物应用的生物材料必须是安全及非免疫原性的。通常，当体内施用（例如，引入机体）粒子时，血液和组织中负责免疫识别并清除外来粒子的吞噬细胞可根据粒子的物理化学特征启动免疫应答。吞噬细胞的吞噬取决于外来粒子的粒径和表面疏水性二者。直径大于约500nm的粒子是高度倾向于吞噬作用。另外，具有疏水性的表面的粒子容易被吞噬细胞识别。例如，Lopez和Murdan报道了具有1.36±0.036μm直径的玉米醇溶蛋白微米球体是免疫原性的，因此，不适合作为药物、疫苗或其他治疗载体（Lopez和Murdan,J PharmPharmacol58(2006)769-774）。

因此，需要用于制备玉米醇溶蛋白粒子的新方法以使得粒子对治疗和美容应用有用。还需要用于以安全并有效的方式递送重要的治疗剂和美容剂的新的治疗载体以便克服与皮肤渗入、保留、稳定性、皮肤刺激、和小囊靶向（follicular targeting）相关的挑战。

发明概述

申请人已研制了视黄醇和相关化合物的基于谷醇溶蛋白的新的纳米粒子局部制剂。已使用谷醇溶蛋白的蛋白研制了纳米粒子，所述谷醇溶蛋白的蛋白诸如玉米醇溶蛋白，一种衍生自疏水性植物蛋白的蛋白。由于玉米醇溶蛋白具有与皮肤角蛋白相似的特征，其被用作测试用于局部制剂的赋形剂的皮肤刺激的模型蛋白（玉米醇溶蛋白测试）。由于其与皮肤角蛋白的相似性，玉米醇溶蛋白纳米载体是用于疏水性和亲水性化合物的极佳的递送媒介物（vehicle），例如，通过应用至皮肤。

因此，本发明提供了包含谷醇溶蛋白的蛋白和治疗或美容剂的纳米粒子，其中该纳米粒子是生物可降解的、生物相容的、及非免疫原性的，治疗或美容剂是类视黄醇或其酯，且该纳米粒子的直径小于约400nm。谷醇溶蛋白的蛋白可以是玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或其组合。在一个实施方案中，谷醇溶蛋白的蛋白是白玉米醇溶蛋白。在一些实施方案中，纳米粒子可包封亲水性或疏水性化合物。在其他实施方案中，纳米粒子可包封类视黄醇。

类视黄醇可以是，例如，视黄醇、13-反式-视黄酸（维甲酸）、13-顺式-视黄酸（异维甲酸）、9-顺式-视黄酸（阿利维A酸）、视黄醛、阿维A酯（etretnate）、阿维A、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄质或其组合。例如，类视黄醇可包括用(C₂-C₂₂)羧酸或脂肪酸酯化的视黄醇，诸如视黄醇乙酸酯或棕榈酸视黄酯。类视黄醇还可以是用直链或支链的(C₁-C₂₂)醇酯化的视黄酸。

纳米粒子中的类视黄醇可以是纳米粒子的谷醇溶蛋白的约0.01wt.%至约0.3wt.%。纳米粒子的直径可以约75nm至约300nm、约100nm至约280nm或约180nm至约220nm。

纳米粒子的表面可以是交联的，和/或纳米粒子的谷醇溶蛋白的蛋白可以是PEG化的。PEG化可包括用具有约3kDa至约220kDa或约4kDa至约20kDa的分子量的PEG PEG化。

在实施方案中，纳米粒子可络合至其他聚合物，包括但不限于，葡聚糖、β-酪蛋白、和阿拉伯胶。

纳米粒子可包封或在其表面吸附一种或多种另外的活性剂、诊断剂、显像剂或其组合。活性剂可以是抗氧化剂、抗炎剂、抗癌药物或自由基清除剂。

当制备纳米粒子时所使用的表面活性剂与磷脂的比可显著影响谷醇溶蛋白纳米粒子的稳定性并防止聚集。此外，磷脂和PLURONICS还可作为渗入增强剂以增强谷醇溶蛋白纳米粒子的皮肤渗入。另外，当制备纳米粒子时所使用的BHT或其他抗氧化剂的浓度可显著影响纳米粒子的稳定性，且BHT或其他抗氧化剂可位于纳米粒子的内部和/或纳米粒子的表面。

本发明还提供了包括多个如本文描述的纳米粒子的组合物，其中该组合物呈干的自由流动的、无色或白色、非吸湿性粉末的形式。本发明还提供了包含多个如本文描述的纳米粒子和药学上或美容上可接受的稀释剂、赋形剂、或载体的药物组合物或美容组合物。药物组合物或美容组合物可以是，例如，呈分散体、气雾剂制剂、凝胶、软膏、乳膏、洗剂或洗发剂的形式。在一些实施方案中，药物组合物或美容组合物可以呈水可去除的制剂的形式。

纳米粒子的多分散指数可以是约0.2至约0.5。纳米粒子可增强被包封的类视黄醇或其他被包封的剂的稳定性。

与不存在纳米粒子时施用类视黄醇至哺乳动物皮肤相比，当与哺乳动物皮肤接触时组合物可产生类视黄醇的较大的皮肤渗入和保留。纳米粒子的制剂对人的皮肤的刺激可以比以非纳米粒子制剂被施用至人皮肤的相同量的类视黄醇少。

本发明还提供了施用治疗剂至受试对象的方法，其包括施用药学上或美容上有效量的本文描述的纳米粒子组合物至患有皮肤疾病或皮肤病症的受试对象，从而治疗疾病或病症。可以用本文描述的组合物治疗的疾病或病症包括痤疮、牛皮癣、角质化疾患、皮肤色素减退和皮肤恶性肿瘤（皮肤癌和黑色素瘤）。纳米粒子组合物还可被用于促进创伤愈合，和减少皱纹、脂肪团的出现和/或光老化的影响。组合物可提供类视黄醇的延长的释放，例如，经过一天或几天（例如，一周）的过程。

在一个实施方案中，本发明提供了增强类视黄醇化学稳定性的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封类视黄醇，从而增强类视黄醇的化学稳定性。

在另外的实施方案中，本发明提供了增加类视黄醇的储存期的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中配制类视黄醇。

在另外的实施方案中，本发明提供了增强类视黄醇水溶解性的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封类视黄醇，从而增强类视黄醇的水分散性。

在另外的实施方案中，本发明提供了增强类视黄醇水分散性的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封类视黄醇，从而增强类视黄醇的水分散性。

在另外的实施方案中，本发明提供了提供类视黄醇从组合物缓释的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封类视黄醇并将哺乳动物皮肤与被包封的化合物接触，其中类视黄醇经过约1小时至约14天的时间段从纳米粒子释放。

在另外的实施方案中，本发明提供了以非免疫原性且生物相容的制剂向需要其的受试对象或样品施用类视黄醇的方法，其包括将受试对象或样品与如本文描述的纳米粒子或如本文描述的组合物接触，从而向受试对象或样品提供非免疫原性且生物相容的制剂。

在另外的实施方案中，本发明提供了增加类视黄醇的皮肤渗入的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封类视黄醇并将哺乳动物皮肤与包含纳米粒子的组合物接触，从而与不存在纳米粒子时类视黄醇的皮肤渗入相比，增加了类视黄醇的皮肤渗入。

在另外的实施方案中，本发明提供了增强例如皮肤肿瘤的药物积累的方法，包括被包封在如本文描述的纳米粒子中，并向需要其的受试对象施用多个纳米粒子，其中被包封的药物在肿瘤处积累比在不存在纳米粒子时被施用至受试对象的药物更大的程度，其中肿瘤是皮肤癌且施用是局部的。在一个实施方案中，治疗剂（例如，细胞、抗体、激素、蛋白、肽、生长因子、核酸和类似物）可被吸附、络合或缀合至纳米粒子的表面。

在另外的实施方案中，本发明提供了减少药物在哺乳动物中不具有肿瘤的组织中的积累的方法，其包括在如本文描述的纳米粒子中包封药物、并向患有皮肤癌肿瘤的受试对象施用多个纳米粒子，其中该施用是局部的且被包封的治疗剂在不具有肿瘤的组织中的积累比不存在纳米粒子时被施用至受试对象的治疗剂程度更小。

在另外的实施方案中，本发明提供了增加治疗剂（例如，类视黄醇）的治疗或美容疗效的方法，其包括向受试对象施用多个如本文描述的纳米粒子，其中与不存在纳米粒子时施用的治疗剂相比，该治疗剂的疗效是增加的。

在另外的实施方案中，本发明提供了减少治疗剂的毒性的方法，其包括向受试对象施用多个如本文描述的纳米粒子，其中与不存在纳米粒子时被施用的治疗剂的毒性相比，该治疗剂的毒性是减少的。

在又另外的实施方案中，本发明提供了降低局部施用的类视黄醇的皮肤刺激等级的方法，其包括向受试对象施用多个如本文描述的纳米粒子，其中与不存在纳米粒子时施用的视黄醇相比，该视黄醇的皮肤刺激等级被降低。

附图简述

下面的附图形成本说明书的部分并被包括以进一步说明本发明的某些实施方案或多个方面。在某些情况下，可通过参考附图结合本文呈现的详述最佳地理解本发明的实施方案。描述和附图可能突出本发明的某个特定实施例或某个方面，然而，本领域的技术人员将理解实施例或方面的部分可与本发明其他实施例或方面结合使用。

图1通过流程图说明根据一个实施方案，形成空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。在这个和其他图中所列举的特定的量是用于说明特定的实施方案，且如将被本领域技术人员容易认识的是可应用许多变化至本文描述的程序。

图2通过流程图说明根据一个实施方案，形成装载6,7羟基香豆素的纳米粒子的步骤。

图3说明根据一个实施方案，使用控制pH的纳米沉淀法制备由β-酪蛋白和阿拉伯胶稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的步骤。

图4说明根据一个实施方案，制备由葡聚糖接枝的β-酪蛋白稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的步骤。

图5描绘了玉米醇溶蛋白纳米粒子的多个电子显微术显微照片。图5（a）是空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的扫描电子显微照片。显示粒子是球形的并具有光滑的表面。（标尺表示1mm=1.76μm）。

图5（b）是空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的透射电子显微照片。（标尺表示1mm=8.038nm）。

图5（c）是装载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子的扫描电子显微照片。（标尺表示1mm=0.87μm）。

图5（d）是装载6,7-羟基香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子的透射电子显微照片。（标尺表示1mm=8.04nm）。

图6描绘了空气中轻敲模式下空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的原子力显微术（AFM）图像。从左至右分别为具有14.19nm、22.2V和45°的z-分划尺的代表性样品的高度（图6（a））、振幅（图6（b））和物相图像（图6（c））。扫描尺寸为1.14×1.14gm。AFM中测量的50个粒子的平均粒径为185nm。

图7是说明根据一个实施方案，缓冲液的类型在冷冻干燥之前和之后对装载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径的影响的图。与使用磷酸盐缓冲液相比，在沉淀方法中使用柠檬酸盐缓冲液在冷冻干燥之后一致产生较小尺寸的纳米粒子（*p<0.05）。图上的每一个点都表示平均值±SD（n=3）。柠檬酸盐缓冲液由去离子水中的柠檬酸（0.0153g/L）和柠檬酸钠（2.91g/L）组成。磷酸盐缓冲液由去离子水中的磷酸氢二钠（1.44g/L）、磷酸二氢钾（0.25g/L）和氯化钠（10g/L）组成。两种缓冲液都被用于保持第二水相处于pH7.4。

图8说明在磷酸盐缓冲的生理盐水（pH7.4）中装载6,7-羟基香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放曲线。将通过实施例2中描述的方法制备的装载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子（10mg/mL）放置在透析膜中（SPECTRAPOR^TM，分子量5000Da)并在不存在（非酶促）或存在（酶促）胰蛋白酶（10mg/mL）时在磷酸盐缓冲的生理盐水（pH7.4）中孵育。将乙醇（20%v/v）添加至介质中以保持下沉条件，并使用叠氮化钠（0.005%w/v）作为抗微生物剂。将溶液保持在37℃的50rpm下的水平水浴摇床中。持续7天在不同的时间点将等份的透析液（1mL）移出并用新鲜的培养基代替以保持下沉条件。使用荧光光谱测定法（λ_max=490nm；λ_cm=520nm）分析透析液中香豆素从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放。每一个数据点都是三次实验的平均值（±SD）。与非酶促释放相比，酶促释放在所有的时间点都较高（p<0.05）。

图9说明粒径对猪多形核细胞摄入玉米醇溶蛋白纳米粒子的影响。该图显示了在存在玉米醇溶蛋白粒子和阳性对照酵母聚糖时鲁米诺化学发光（超过90分钟）曲线下面积的百分数。每一个实验都是四次实验的平均（±SEM）。与其他组相比，较小粒子中的摄入显著较低（p<0.05）。

图10分别说明了玉米醇溶蛋白粒子的初次和加强皮下注射之后第三周和第五周测量的抗玉米醇溶蛋白抗体（光学密度）。每一个值都表示平均值±SEM（n=4）。与生理盐水组相比，初次和加强效价二者都是统计不显著的（p>0.05）。将生理盐水中粗的玉米醇溶蛋白悬浮液或玉米醇溶蛋白粒子（相当于100μg/50μL）皮下注射入雌性BALB/C小鼠。从眼窝丛取血并使用小鼠ELISA试剂盒测量被稀释的血清（1/16）中抗玉米醇溶蛋白抗体水平。

图11是说明黄玉米醇溶蛋白（Y）和白玉米醇溶蛋白（W）对表示为使用二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）测定处理4小时后的线粒体脱氢酶的相对活性的猪肠上皮细胞（IPEC-J2细胞）（以20,000细胞/孔）的细胞活性的影响的图。不具有任何处理的板被用作对照并被认为是100%有活性的。将玉米醇溶蛋白粉末溶解在55%v/v乙醇中并随后在无血清培养基中从5mg/mL的原液制备稀释液。在无处理的情况下，黄玉米醇溶蛋白和白玉米醇溶蛋白二者在所有的浓度下都与对照没有显著差异（*p<0.05）。每一个数据点都是三次实验的平均值±SEM。

图12通过流程图说明根据一个实施方案，用于制备交联的空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的方法。

图13是说明玉米醇溶蛋白纳米粒子的交联程度作为交联剂的函数持续24小时的图。使用TNBS测定确定交联程度。所使用的交联剂为：戊二醛（GTA）（500μL的25%w/v的原液溶液）、1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺（EDC）（0.6%w/v）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（0.6%w/v）。所使用的京尼平的浓度为0.05%w/v。“空白”表示不具有任何交联剂的玉米醇溶蛋白纳米粒子。数据是两次实验的平均值。

图14通过流程图说明根据一个实施方案，用于制备装载若丹明-123的交联的玉米醇溶蛋白纳米粒子的方法。

图15说明在柠檬酸盐缓冲液pH2中若丹明-123从玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放曲线。结果表示平均值±SEM（n=4）。NCS=未交联的粒子；CS=交联的粒子。若丹明从交联的纳米粒子的释放显著（p>0.05）低于未交联的纳米粒子。将通过本文描述的方法制备的装载若丹明的玉米醇溶蛋白纳米粒子（20mg）放置在透析膜中（SPECTRAPOR^TM，分子量10,000Da)并在10mL的柠檬酸盐缓冲液（pH2）中孵育。将溶液保持在37℃的处于100rpm下的水平水浴摇床中。超过48小时在不同的时间点将等份的透析液（1mL）移出并用新鲜的培养基代替以保持下沉条件。使用荧光光谱测定法（λ_max=485nm；λ_cm=530nm）分析透析液中若丹明从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放（*指示在p<0.05时差异显著）。

图16说明处于pH2的胃蛋白酶存在时若丹明-123从玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放曲线。结果表示平均值±SEM（n=4）。NCS=未交联的粒子；CS=交联的粒子。药物从交联的纳米粒子的释放显著（p>0.05）低于未交联的纳米粒子。将通过本文描述的方法制备的装载若丹明-123的玉米醇溶蛋白纳米粒子（20mg）放置在透析膜中（SPECTRAPOR^TM，分子量10,000Da）并在10mL包含3.2mg/mL的胃蛋白酶的柠檬酸盐缓冲液（pH2）中孵育。将溶液保持在37℃的100rpm下的水平水浴摇床中。超过48小时在不同的时间点将等份的透析液（1mL）移出并用新鲜的培养基代替以保持下沉条件。使用荧光光谱测定法（λ_max=20485nm；λ_cm=530nm）分析透析液中若丹明-123从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放（*指示在p<0.05时差异显著）。

图17在流程图中说明根据一个实施方案，用于制备空白的PEG化的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般方法。

图18是说明PEG化的纳米粒子的强度加权尺寸分布的图。x-轴显示以nm计的粒径且y-轴对应强度。PEG化的玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径为131±1nm（n=3），具有0.282±0.01的多分散指数（PDI）（n=3）。

图19通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。在图19、23-26和42中，BHT指的是丁基羟基甲苯（2,6-二-叔丁基4-甲基苯酚）。

图20从左至右说明游离的视黄醇和装载视黄醇的纳米粒子的水分散性。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图21说明在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量视黄醇的浓度（平均值±SEM；n=3）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图22从左至右说明游离的视黄醇和冷冻干燥的视黄醇纳米粒子。该图显示了纯的视黄醇的吸湿性且视黄醇纳米粒子是非吸湿的自由流动的粉末。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图23说明当储存在环境光线下时装载视黄醇的纳米粒子的固态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇纳米粒子保持在透明的玻璃小瓶中并暴露于室内光线一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量不同时间点的剩余视黄醇（平均值±SD；n=3）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图24说明当储存在不存在光时装载视黄醇的纳米粒子的固态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇纳米粒子保持在透明的玻璃小瓶中并储存在暗箱中一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量不同时间点的剩余视黄醇（平均值±SD；n=3）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图25说明当储存在正常的室内光线下时装载视黄醇的纳米粒子的液态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中并储存在室内光线下的透明玻璃小瓶中一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量不同时间点的剩余视黄醇（平均值±SD；n=3）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图26说明当储存在暗箱中避光保存时装载视黄醇的纳米粒子的液态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中并储存在暗箱中的透明玻璃小瓶中一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量不同时间点的剩余视黄醇（平均值±SD；n=3）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图27说明用游离的视黄醇和被包封在玉米醇溶蛋白纳米粒子中的视黄醇处理后，在48小时结束时猪皮中和接纳介质中的被应用的视黄醇的百分数。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的或被包封的视黄醇的分散体装载在供应室中。在研究结束时，通过使用³H标记的视黄醇的放射化学方法测量皮肤和接纳室中的视黄醇浓度。用0.1M氢氧化钠消化皮肤以确定视黄醇浓度。（平均值±SD；n=6）。使用如图19中描述的方法制备纳米粒子。

图28说明用游离的视黄醇和被包封在纳米粒子中的视黄醇处理后，在48小时结束时猪皮中和接纳介质中的被应用的视黄醇的百分数。将切下的猪表皮（Epi）放置在垂直扩散池的两个室之间。在第二组实验中，将角质层（SC）从猪表皮移出并随后物理放置（被夹在）猪表皮上（Sand）并被用于研究。将游离的视黄醇或视黄醇纳米粒子应用在皮肤上并将研究进行48小时。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的或被包封的视黄醇分散体装载在供应室中。在研究结束时，通过使用³H标记的视黄醇的放射化学方法测量皮肤和接纳室中的视黄醇浓度。

图29说明在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中若丹明123从玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放。使用表8-1中描述的方法制备纳米粒子。

图30说明6小时后游离的若丹明123（10μg）和若丹明纳米粒子（相当于10μg的若丹明123）在经皮片的猪皮中的渗入。

图31说明6小时处理后来自游离的若丹明123（10μg）和被包封在玉米醇溶蛋白纳米粒子中的若丹明123（相当于10μg的若丹明123）在经皮片的猪皮中的荧光像素。对于角质层（SC），将来自共聚焦显微图像的0-20μm的XZ光学切片用于定量荧光像素，及对于表皮，将来自共聚焦显微图像的20-100μm的XZ光学切片用于定量荧光像素。使用表8-1中描述的方法制备纳米粒子。

图32通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备装载FITC的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图33说明6小时后游离FITC（10μg）和FITC纳米粒子（相当于10μg）在经皮片的猪皮中的渗入。将皮肤冷冻切片并在荧光显微镜下观察。

图34说明6小时处理后来自游离的FITC（10μg）和被包封在玉米醇溶蛋白纳米粒子中的FITC（相当于10μg）在经皮片的猪皮中的荧光像素。对于角质层（SC），将来自共聚焦显微图像的0-20μm的XZ光学切片用于定量荧光像素，和对于表皮，将来自共聚焦显微图像的20-100μm的XZ光学切片用于定量荧光像素。

图35通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备装载5-氟尿嘧啶的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图36说明接纳介质中被应用的5-氟尿嘧啶（5FU）的百分数。

图37示意性说明玉米醇溶蛋白-酪蛋白核壳纳米粒子的形成。

图38通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用β-酪蛋白稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图39通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用β-酪蛋白稳定的装载尼罗红的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图40说明磷酸盐缓冲液（pH7.4）中尼罗红从玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子的体外释放。

图41说明6小时处理后游离的尼罗红（10μg）和被包封在玉米醇溶蛋白酪蛋白纳米粒子（NP）中的尼罗红在猪皮中的皮肤渗透。通过从皮肤内1-100μm深将皮肤光学切片通过共聚焦激光扫描显微术分析皮肤。使用IMAGEJ软件定量角质层（0-20μm）和有活力的（viable）表皮（20-100μm）中的荧光强度。

图42通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用酪蛋白稳定的装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图43说明储存在室温和40℃一个月时间段的具有铝箔覆盖的玻璃小瓶中的视黄醇纳米粒子乳膏制剂的稳定性。定期将等份的制剂移出并使用HPLC分析视黄醇的含量。在室温中制剂保持稳定并没有显示任何显著的降解。每一个值都是平均值±SD；n=3。使用图19中描述的方法制备纳米粒子。

图44说明游离的视黄醇（实心圆形）和视黄醇纳米粒子（实心方形）从pH7.4的乳膏制剂中的体外释放。将放置在垂直扩散池的透析膜（MWCO8000-10000Da）中的约40mg的乳膏用于释放研究且接纳介质由pH7.4的缓冲液组成。从接纳介质中收集样品并通过使用³H视黄醇的放射化学方法分析样品。每一个数据点都表示平均值±SD（n=3）。使用图19中描述的方法制备纳米粒子。

图45说明视黄醇乳膏制剂在人皮肤中的体外皮肤渗入。切下的人皮肤被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将游离的或被包封在纳米粒子乳膏制剂中的视黄醇装载在供应室中。制剂被应用6小时并随后将制剂去除并继续渗入研究48小时。在研究结束时，通过使用³H标记的视黄醇的放射化学方法测量皮肤和接纳室中的视黄醇浓度。用0.1M氢氧化钠消化皮肤以确定视黄醇浓度。（平均值±SD；n=3）。使用图19中描述的方法制备纳米粒子。

图46说明在应用游离的和纳米粒子包封制剂的视黄醇后，小鼠中的经表皮水分丢失（TEWL）值。每天将制剂应用在SKH-1无毛小鼠的背部持续5天。在应用制剂之前每天使用TEWA计（Delfin）测量TEWL值。TEWL的增加是皮肤刺激的量度且如从图中可以看出的，被包封在纳米粒子中的视黄醇没有显示皮肤刺激并堪比阴性对照（无处理）。另一方面，游离的视黄醇乳膏显示皮肤刺激。十二烷基硫酸钠（SLS），已知的皮肤刺激剂，被用作阳性对照。值为平均值±SD（n=3）。使用图19中描述的方法制备纳米粒子。

图47说明在SKH-1无毛的小鼠中处理6小时后，游离的和纳米粒子包封的视黄醇的体内局部生物利用率。乳膏制剂被施用在异氟烷麻醉下的小鼠的背部。处死动物后，使用SCOTCH TAPE胶带剥离皮肤以移出角质层（SC）。通过使用³H视黄醇的化学放射分析方法确定皮肤（SC和表皮/真皮）和血液中的视黄醇的量。如可以看出的，纳米粒子包封的视黄醇保留在皮肤中没有被系统性的吸收进入血液。值为平均值±SD（n=3）。使用图19中描述的方法制备纳米粒子。

图48说明用FITC缀合的玉米醇溶蛋白纳米粒子处理6小时后，猪皮的共聚焦XZ和XYZ图像（0-100μm深）。如从这幅图（右图）中可以看出的，玉米醇溶蛋白纳米粒子主要定位在毛囊中。从左图看也是明显的，其中在从表面至皮肤内100μm深的条痕中观察到荧光。

图49通过流程图说明根据一个实施方案，包封牛血清白蛋白（BSA）的一般步骤。

图50通过流程图说明根据一个实施方案，吸附富含血小板血浆（PRP）的一般步骤。

发明详述

已研制了用于局部递送视黄醇穿过皮肤用于治疗多种皮肤病症和毛囊疾患的新的纳米载体。此类病症的示例包括但不限于痤疮、牛皮癣、角质化疾患、皮肤色素减退和皮肤恶性肿瘤（皮肤癌和黑色素瘤）、并用于创伤愈合和光老化（Orfanos等人,Drug53:358-388,1997）。例如，本文描述的纳米粒子可被用于递送蛋白药物且纳米粒子可与针对IL-8的抗体或结合至细胞间黏附分子-1的mRNA的反义寡核苷酸一起被使用。其他示例包括细胞组成诸如富含血小板血浆（PRP），其可被用于给予多种生长因子以选择组织，和小分子诸如类视黄醇。

视黄醇（维生素A）和其衍生物（类视黄醇）参与机体内的多种生物学功能，包括表皮细胞生长和分化、视力、免疫调节和抗炎作用（Summer,J Nutr138:1835-1839,2008）。特别地，视黄醇和其衍生物被广泛用于治疗多种皮肤病症包括痤疮、牛皮癣、角质化疾患、皮肤色素减退、和皮肤恶性肿瘤（皮肤癌和黑色素瘤）及用于创伤愈合和光老化（Orfanos等人,Drug53:358-388,1997）。视黄醇还被用于美容制剂中以减少皱纹并治疗脂肪团（Orfanos等人，Drug53:358-388,1997）。然而，视黄醇用于美容和皮肤病学应用的用途被其差的理化性质和潜在的皮肤刺激严重限制（Melo等人，J Control Release138:32-39,2009；Kim等人，Toxicol Lett146:65-73,2003）。

视黄醇是亲脂性分子（Log P6.20），具有差的水溶解性和有限的皮肤渗透性。此外，它在光和水分存在时是高度不稳定的（见美国专利号5,851,538（Froix等人），通过引用整体并入本文）。视黄醇的局部应用造成严重的局部刺激，表现为轻度红斑和角质层剥离，在使用者中导致不顺应性（Kim等人，Toxicol Lett146:65-73,2003）。申请人通过在用于局部应用的基于蛋白的新的纳米载体中包封视黄醇已成功解决视黄醇的递送问题。

如本文描述的，新的纳米载体已从玉米蛋白玉米醇溶蛋白中被研制出。玉米醇溶蛋白显示与皮肤角蛋白相似的疏水性（Deo等人，Langmuir19:5083-5088,2003）并因此是用于皮肤应用的有前景的载体。由于玉米醇溶蛋白是疏水性的，因此它可被用于在如本文描述的纳米粒子内包封疏水性的类视黄醇，且玉米醇溶蛋白可被用于包封疏水性的类视黄醇以提供类视黄醇的水可去除的制剂。

纳米粒子在用于不同局部应用的视黄醇制剂选择中提供了灵活性。申请人已经制备了约100nm至约300nm尺寸范围的装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子，具有76%-100%的包封率。装载视黄醇的纳米粒子呈180-220nm的尺寸范围，具有79%-91%的包封率。在纳米载体中包封视黄醇导致水可分散的制剂。

玉米醇溶蛋白纳米粒子显著增强了视黄醇抗水分和光诱导的降解的固态和液态稳定性。视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放持续直至一周。玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批准的具有与皮肤角蛋白相似的特征的蛋白聚合物，从而是皮肤相容的纳米载体。与游离的视黄醇水分散体相比，纳米粒子还增强了视黄醇的皮肤渗入。玉米醇溶蛋白纳米粒子可被用于在皮肤层中保留视黄醇用于美容和皮肤病学应用。

纳米载体的一个独特的方面是纳米粒子处理视黄醇的局部递送的多个市场挑战的能力。这些挑战包括提供1）视黄醇的水溶性的和水可分散的制剂，2）视黄醇抗光和水分诱导的降解的增强的稳定性，3）视黄醇的自由流动、无色的且不吸湿的粉末，4）视黄醇的缓释制剂，5）视黄醇的较高的皮肤渗入和较高的皮肤渗入和6）视黄醇的无刺激性制剂。

在纳米粒子中包封后显著增强了视黄醇的水分散性。视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放可以是持续的，导致应用的较低的剂量和减少的频率。在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封视黄醇显著增强了视黄醇制剂的储存期。玉米醇溶蛋白纳米粒子增加了固体和半固体制剂中视黄醇的流动性和分散性。由于视黄醇是吸湿的粘性粉末，在纳米粒子中包封视黄醇能够克服与视黄醇相关的困难的处理和加工问题。

角质层（SC）是皮肤的顶层，而皮肤的较深层包括有活力的表皮和真皮。玉米醇溶蛋白纳米粒子可增强皮肤渗入和视黄醇在皮肤层中的保留用于美容和皮肤病学应用。在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封视黄醇掩盖了视黄醇的黄色颜色。这改善了视黄醇制剂的美学诉求并防止黄色染色。冷冻干燥的玉米醇溶蛋白纳米粒子可容易被并入多种局部制剂基质中，诸如凝胶、乳膏、洗剂和软膏。

用切下的猪皮实施皮肤渗入研究，其与人皮肤在许多重要的方面是相似的（Simon和Maibach,Skin Pharmacol.Appl.Physiol.13:229-234,2000.)。小鼠中的体内研究进一步说明纳米粒子减少视黄醇的皮肤刺激的能力。使用纳米粒子代替现有的商业制剂的优势包括：

1.增溶。视黄醇是水不溶性的疏水性化合物。在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封的视黄醇是水可分散的。因此纳米粒子可被用于开发用于局部应用的水洗型视黄醇制剂。通常水洗型制剂优选用于美容和皮肤病学应用。

2.稳定。存在水分和光时，视黄醇是高度不稳定的。这限制了视黄醇制剂的储存期和在应用过程中制剂的效力。在纳米粒子中包封视黄醇可显著增强视黄醇制剂的稳定性和储存期。

3.缓释。视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放可以是持续的。释放可持续直至一周。这减少了应用视黄醇的剂量和频率。

4.皮肤渗入和保留。视黄醇具有差的皮肤渗入的特性。纳米粒子导致视黄醇增强的皮肤渗入。使用纳米粒子可将视黄醇保留在皮肤层中用于多种皮肤病学/美容应用。

5.药用化妆品应用。装载视黄醇的纳米粒子可被用于美容应用诸如抗衰老、抗皱纹和脂肪团的治疗。

6.皮肤病学应用。装载视黄醇的纳米粒子可被用于多种皮肤病症诸如牛皮癣、痤疮、创伤治愈和皮肤恶性肿瘤，诸如皮肤癌和黑色素瘤。

7.有效并安全的制剂。使用装载视黄醇的纳米粒子导致更有效的治疗。此外，在纳米粒子中包封视黄醇可显著减少由视黄醇造成的皮肤刺激。视黄醇的皮肤刺激是视黄醇不符合美容和皮肤病学应用的主要问题。

8.用于包封其他类视黄醇的平台技术。多种类视黄醇包括视黄醇、视黄酸和它们的衍生物（诸如脂肪酸酯），可被包封在谷醇溶蛋白纳米粒子中用于美容和皮肤病学应用。适于包封的多种类视黄醇的示例包括，但不限于，视黄醇、视黄酸（诸如13-反式-视黄酸和/或13-顺式-视黄酸）、视黄醛、维甲酸、异维甲酸、阿维A酯、阿维A、视黄醇乙酸酯、棕榈酸视黄酯和类胡萝卜素诸如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素和玉米黄质。

9.组合治疗。视黄醇纳米粒子可与其他药物一起被并入其他产品中，诸如防晒、抗牛皮癣、抗痤疮和抗皮肤癌产品。由于视黄醇是被包封的，其将防止与其他剂的相互作用。其他剂诸如抗氧化剂、自由基清除剂、抗炎剂也可与视黄醇一起被包封在纳米粒子中。此类剂可包括，但不限于，维生素E和其衍生物诸如生育酚乙酸酯，维生素C和其衍生物诸如抗坏血酸棕榈酸酯、绿树提取物、芦荟、辅酶Q10、对苯二酚、透明质酸、透明质酸钠、红没药醇、乙醇酸、乳酸、β羟基丁酸、水杨酸、10-羟基癸酸、阿魏酸、泛醇、生物的（biotic）、熊果苷、槲皮素、橘皮苷和其组合。

定义

如本文所用的，列举的术语具有下面的含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有如本领域技术人员将理解的它们的通常含义。此通常含义可通过参考技术词典获得，诸如Hawley's Condensed ChemicalDictionary第14版,R.J.Lewis,John Wiley&Sons著,New York,N.Y.,2001。

本说明书中提及的“一个实施方案”、“实施方案”等，表明描述的实施方案可包括特定的方面、特征、结构、部分或表征，但不是每个实施方案都必然包括该方面、特征、结构、部分或表征。此外，此类短语可以，但不必然，指的是本说明书的其他部分中所涉及的相同的实施方案。此外，当描述与实施方案有关的特定的方面、特征、结构、部分或表征时，用其他实施方案影响此方面、特征、结构、部分或表征或将此方面、特征、结构、部分或表征与其他实施方案联系在本领域技术人员的知识内，无论是否明确被描述。

术语“包含（comprising）”、“包括（including）”、“具有”、“包含（containing）”、“特征为”和其语法上等同物，是不排除另外的、未列举的要素或方法步骤的包含或开放式术语，但也包括更具限制性的术语“由…组成”和“基本上由…组成”。

单数形式“一个（a）”、“一个（an）”和“该（the）”包括复数指代对象，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提及“化合物”（例如，药物）包括多个此类化合物，所以化合物X包括多个化合物X。作为另外的示例，提及“纳米粒子”可包括多个此类纳米粒子，且提及“分子”是提及多个分子、和其等同物。进一步注意的是权利要求可以被撰写为排除任何任选的要素。如此，该申明意图用作使用与权利要求要素的列举有关的排除性的术语诸如“单独地”、“仅仅”和类似的术语或使用“否定（negative）”限制的前期基础。

术语“和/或”指的是与该术语相关的条目的任一条目（item）、条目的任何组合、或所有条目。短语“一个或多个”容易被本领域技术人员理解，特别是当在上下文中阅读它的用法时。例如，苯基环的一个或多个取代基指的是一个至五个、或一个至四个，例如如果苯基环是被双取代的话。

术语“约（about）”或“约（approximately）”指的是合理地接近、或比所列举的数或量稍高或稍低。因此，术语“约”可以指特定值的±5%、±10%、±20%或±25%的变化。例如，一些实施方案中“约50%”可携带从45%至55%的变化。关于整数范围，术语“约”可包括大于和/或小于所列举的整数的一个或两个整数。除非本文另有说明，术语“约”意图包括在单个组分、组合物或实施方案的功能方面等同的值，例如，重量百分数，临近所列举的范围。另外，除非本文另有说明，所列举的范围（例如，重量百分数或碳基团）包括范围内每个特定值或身份（identity）。

将被技术人员理解的是，所有的数字，包括表示许多组分的量、特性诸如分子量、反应条件等等的那些，是近似值并被理解为在一切情况下任选被术语“约”修饰。这些值可取决于本领域技术人员利用本文描述的教导旨在获得所期望的特性而不同。同样被理解的是此类值固有地包含必然来源于在它们的各自的测试测量中发现的标准差的可变性。

如将被本领域技术人员理解的是，出于任何和所有的目的，特别是根据提供的书面描述，本文所列举的所有范围还包含任何和所有可能的子范围和其子范围的组合，和组成范围的单个值，特别是整数值。所列举的范围（例如，重量百分数或碳基团）包括范围内的每一个特定值、整数、小数或身份。任何所列出的范围可容易被认为作为充分描述并使相同的范围能够分解为至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份或十等份。作为非限制性示例，本文讨论的每一个范围都可容易被分解为下部三分之一、中部三分之一和上部三分之一，等。

还将被本领域技术人员理解的是，所有语言诸如“直到”、“至少”、“大于”、“小于”、“超过”、“或多个”和类似的语言，包括所列举的数量且此类术语指的是能够如以上讨论的被随后分解为子范围的范围。以相同的方式，本文列举的所有比还包括落入较宽的比内的所有子比。因此，所列举的自由基、取代基的特定的值和范围，仅用于说明；它们不排除其他被定义的值或在自由基和取代基的被定义的范围内的其他值。

本领域技术人员还将容易认识到，当以共同的方式将成员集合在一起时，诸如马库什组，本发明不仅包含所列出作为整体的整个组，而且还单独包含该组的每一个成员和主要组的所有可能的亚组。另外，为了所有目的，本发明不仅包括主要组，还包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明因此设想明确排除所列举的组的任何一个或多个成员。因此，限制性条款可适用于任何公开的类别或实施方案，据此任何一个或多个所列举的要素、物质或实施方案可从此类别或实施方案中被排除，例如，如在明确否定限制中所使用的。

术语“玉米醇溶蛋白”指的是谷醇溶蛋白的蛋白类的成员。在多种谷物诸如玉米、小麦、大麦、水稻和高粱、及其他植物和动物中发现谷醇溶蛋白。谷醇溶蛋白的其他示例包括麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。在本文描述的多个实施方案中，这些谷醇溶蛋白可更换为玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白由高比例的非极性氨基酸诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺组成，并具有约22-27kDa的分子量（Shukla,Zein:the industrial proteinfrom corn.Ind Crops Prod13,171-92;2001)，并可以是具有不同分子量的三种不同的蛋白的混合物。玉米醇溶蛋白的典型的样品可具有约20%亮氨酸、10%脯氨酸、21%-26%谷氨酰胺、5%天冬酰胺和10%丙氨酸，因此其氨基酸组成的至少约61%是疏水性氨基酸。这些疏水性氨基酸使得蛋白是水不溶性的。玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批准的GRAS聚合物（Fed.Register(1985)50:8997-8999)。

玉米醇溶蛋白可从玉米蛋白粉中被加工为粉末。纯的玉米醇溶蛋白是无气味的、无味的、水不溶性的并可食用的，这些特性使得其成为用于加工食品和药品的重要成分。用于分离、加工和使用玉米醇溶蛋白的方法是本领域已知的。见例如，Lawton,Cereal Chem2002,79(1):1-18，和WO2009/137112（Perumal等人），其通过引用整体并入本文。玉米醇溶蛋白的“等级”指的是玉米醇溶蛋白的多种类型或形式，包括通过多种方法衍生的白玉米醇溶蛋白和黄白玉米醇溶蛋白，诸如美国专利号5,254,673（Cook等人）中公开的，其内容通过引用并入本文。

术语“生物相容的”指的是当体内施用至受试对象时涉及到的聚合物或缀合物不会造成或引起显著的负面影响。可能的负面影响的示例包括，但不限于，严重发炎和/或过度或不良免疫应答和毒性。玉米醇溶蛋白是生物相容的成分。

术语“纳米粒子”通常已知指在至少一个维度不超过1000nm的粒子。然而，通过本发明方法形成的纳米粒子将具有如本文所定义的特定值的直径。另外，使用术语“纳米粒子”还通常指的是空白纳米粒子和装载分子并通过本发明方法形成的纳米粒子。如本文所用的，除非另外定义（即，图11），“空白纳米粒子”指的是不具有用纳米粒子形成的或与纳米粒子缀合的所选择的粒子、分子或物质的纳米粒子。

术语“直径”当在纳米粒子的尺寸的上下文中使用时，指的是穿过粒子的质心的线的粒子的平均线性尺寸。例如，可通过取粒子沿着坐标系的三个正交轴的厚度的平均值，且一个轴与粒子的最长尺寸匹配，提供非球形的粒子的直径的可接受的近似值。

术语“水醇溶剂”指的是包括水和醇系溶剂二者，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丁醇（包括正丁醇、仲丁醇（仲丁醇（sec-butanol））、异丁醇和叔丁醇）的溶剂体系。常见的水醇溶剂体系包括水中50%、70%、90%和92%的乙醇。

术语“接触”指的是触碰（touching）、使接触或引起直接或近距离的临近的行为，包括在细胞或分子水平，例如引起生理反应、化学反应或物理改变，例如，在溶液中、在反应混合物中，体外或体内。

术语“体内”指的是在受试对象的机体内部，诸如患者的机体内部，并包括通过多种方式包括但不限于口的、静脉内的、瘤内的、瘤周的、腹膜内的、肠胃外的、皮下的、局部的、眼睛的、肺部和鼻腔途径的施用的纳米粒子的施用。

术语“体外”指的是受试对象或患者的机体外部的环境。

术语“原位”指的是原来位置；没有被移动或转移至另外的位置。

术语“缔合”指的是货物或货物分子络合至本公开内容的纳米粒子，并包括但不限于，缀合（共价或非共价的）至粒子的表面或内部、吸附和包封。

术语“络合”，包括其语法上的变化形式，指的是多种细胞或分子实体与本公开内容的纳米粒子的结合。

术语“施用（administered）”或“施用（administration）”，当在纳米粒子的治疗和诊断用途的上下文中使用时，指的是并包括为了例如递送治疗剂至靶向位点的目的引入所选择量的纳米粒子进入体内或体外环境。

“有效量”指的是有效治疗疾病、疾患和/或病症、或引起所列举的效果的量。例如，有效的量可以是有效减少被治疗的病症或症状的进展或严重程度的量。治疗上有效量的确定充分在本领域技术人员的能力范围内。术语“有效量”意在包括本文描述的空白或装载药物的纳米载体（即，纳米粒子），例如，有效治疗或预防宿主的疾病或疾患或有效治疗疾病或疾患的症状的量。因此，“有效量”通常指的是提供预期效果的量。

术语“治疗（treating）”、“治疗（treat）”和“治疗（treatment）”可包括（i）预防疾病、病理或医疗病症免于形成（例如，预防（prophylaxis））；（ii）抑制疾病、病理或医疗病症或阻止其发展；（iii）减轻疾病、病理或医疗病症；和/或（iv）消弱与疾病、病理或医疗病症相关的症状。因此，术语“治疗（treat）”、“治疗（treatment）”和“治疗（treating）”可延及预防（prophylaxis）并可包括预防（prevent）、预防（prevention）、预防（preventing）、减少、停止或逆转被治疗的病症或症状的进展或严重程度。如此，术语“治疗”可包括医疗、治疗和/或预防施用，视情况而定。

术语“受试对象”或“患者”都是指或指的是个体复杂生物体，例如，人或非人动物。

术语“抑制（inhibit）”、“抑制（inhibiting）”和“抑制（inhibition）”指的是减慢、停止或逆转疾病、感染、病症或细胞组的生长或进展。与在不存在治疗或接触时发生的生长或进展相比，抑制可大于例如约20%、40%、60%、80%、90%、95%或99%。

术语“治疗剂”和涉及治疗或医疗功能的相似的术语指的是可有益影响受试对象中的疾病或病症的发生、进程和/或一个或多个症状的提及的分子、大分子、药物或其他物质，并可与纳米粒子联合制造用于治疗疾病或其他病症的药剂。用于在本文描述的纳米粒子中包封或吸附在纳米粒子上的适合的治疗剂包括疏水性治疗剂，诸如，但不限于，类视黄醇、诸如视黄醇和其酯和视黄醇的衍生物，诸如视黄酸和视黄醛、小分子、抗体、核酸、蛋白、激素、受体、配体、细胞（例如，富含血小板血浆（PRP））、生长因子、细胞提取物和类似物。

术语“治疗剂”和涉及治疗或医疗功能的相似的术语指的是可有益影响受试对象中的疾病或病症的发生、进程和/或一个或多个症状的提及的分子、大分子、药物或其他物质，并可与纳米粒子联合制造用于治疗疾病或其他病症的药剂。

视黄醇（C₂₀H₃₀O；286.45g/mol）是具有重要生物活性的二萜醇（diterpenoid alcohol）。视黄醇具有61-63℃的熔点、3100单位/mg的活性和6.2的Log P。视黄醇几乎不溶于水，溶于或部分溶于乙醇，并与氯仿、乙醚和汽油（petroleum spirit）是可混溶的。视黄醇是用于多种皮肤病症包括光老化、痤疮、创伤愈合、黄褐斑牛皮癣、皮肤癌、黑色素瘤和其他皮肤病症的药用化妆品/治疗剂（Orfanos等人,Drug53:358-388,1997）。视黄醇具有差的水溶解性和差的光稳定性（Melo等人，J Control Release138:32-39,2009；美国专利号5,851,538（Froix等人），通过引用整体并入本文）。另外，它还造成皮肤刺激（Kim等人，Toxicol Lett146:65-73,2003）。纳米粒子和制备方法

本发明提供了可从疏水性的水不溶性蛋白诸如谷醇溶蛋白，例如，玉米醇溶蛋白形成的纳米粒子。可采用纳米粒子以提供缺少在使用较大尺寸的纳米粒子或微米粒子时经历的免疫原性的纳米粒子制剂，所述较大尺寸的纳米粒子或微米粒子包括例如从疏水性的水不溶性蛋白形成的那些。可通过控制粒子的尺寸和粒径的范围实现纳米粒子的非免疫原性的作用。

图1通过流程图说明根据一个实施方案，制备非免疫原性纳米粒子的一般步骤。所使用的特定的量是为了说明，且如将被本领域技术人员容易认识的是可应用许多变化形式至本文描述的程序。在该方法的初始步骤或阶段中，将水不溶性蛋白（0.4%至1.25%w/v）溶解在水醇溶剂中（例如，乙醇和去离子水的组合）。溶剂的组成，例如可以是90%:10%v/v或92%:8%v/v的乙醇与水。关于其中所选择的分子待被包封在纳米粒子中的方法，将待被包封的分子（0.03%至0.3%w/v）添加至第一水相的溶液中。待被包封的分子可以是蛋白聚合物的约50%w/w。

可改变溶液的pH，例如，通过添加0.01N NaOH或0.01N HC1将溶液的pH引至约pH6和约pH7之间。如果在添加酸性分子诸如视黄酸之后或通过碱性分子改变了水的pH，可将pH重新调节至pH6-7。可处理第一相的溶液，例如，通过探头超声处理，以有助于蛋白的溶解。

在该方法的后续步骤中，可将初始步骤或阶段的水溶液添加至缓冲剂，任选在超声波剪切的情况下。柠檬酸盐缓冲液是适合的缓冲液。用于第二水相的缓冲剂的选择对于在纳米粒子形成过程中保持pH和对于所形成的纳米粒子后续的冷冻干燥是重要的，如本公开内容中随后描述的。如果不使用缓冲液，或者如果，例如，使用0.1N HC1调节第二水相溶液的pH，那么所制备的粒子倾向比用柠檬酸盐缓冲液所制备的粒子要大，且粒子倾向显示较宽的尺寸范围。使用柠檬酸盐缓冲液制备一些最小的粒子直径尺寸，诸如约100nm。使用其他缓冲液可制备处于约100nm至约300nm的相同或相似直径尺寸范围的粒子，但在冷冻干燥步骤之后，已知使用其他缓冲剂所形成的纳米粒子的平均尺寸增加两至三倍。

第二水相溶液的pH可被调节至约pH6.8和约pH7.4之间以获得预期尺寸的纳米粒子。如果pH处于该范围之外，粒径倾向变得较大，且所制备的粒子的多分散指数（PDI）变得较高。PDI是粒子在不同尺寸范围的分布的量度。该方法因此可使用蛋白诸如玉米醇溶蛋白在水醇溶液和具有靠近玉米醇溶蛋白的等电点（即，pI5至9）的约6.8至约7.4的所选择的pH的水溶液中的溶解度差异。

可在高超声波剪切下或在高压匀质化下或超声波剪切和高压匀质化二者的组合下执行向第二水相溶液中添加缓冲剂。超声能量和超声波剪切的持续时间对处于预期直径尺寸范围的粒子的形成可以是特别重要的。例如，可从0.6kW/h至1.39kW/h、持续时间约2至10分钟、具有从5至10秒的持续时间和从1至5秒的暂停时间的脉冲，实施超声波剪切能量。超声波处理对处于预期尺寸范围的粒子的制备可以是重要的。当采用高压匀质化时，可使用0.1mm和0.25mm之间的孔口尺寸、及在5000至40,000psi的压力时持续5至10分钟之间的时间段实施处理。

第二相的缓冲剂优选还可包含以所选择的比的表面活性剂和磷脂。表面活性剂与磷脂的比可以约2:1%w/w，其产生高度适合的结果。比还可以为1:0.5%w/w或1:1%w/w或1:2%w/w。值得注意的是，表面活性剂和磷脂的组合是稳定所制备的粒子期望的并有助于防止粒子的聚集。

表面活性剂可以是，例如，泊洛沙姆（poloxamer），诸如

F68，且磷脂可以是卵磷脂。可被用于本方法的其他表面活性剂包括其他非离子表面活性剂诸如泊洛沙姆（

）、聚氧乙烯烷基醚（BRIJ）、山梨醇酐酯（SPAN）、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯（吐温）和离子表面活性剂诸如二辛基磺化琥珀酸钠、十二烷基硫酸钠、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、N-溴化十二烷基三甲胺和/或聚合物诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。可被用于本方法的其他磷脂包括非离子和带电荷的脂质或磷脂，诸如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（1,2-dioleoy1-3-trimethyl ammonium propane）、酪蛋白或其组合。

已发现以所选择的比的泊洛沙姆和卵磷脂（例如，0.9%w/w:0.45%w/w）的组合产生处于约100nm至约300nm的预期的直径尺寸范围的纳米粒子。发现单独使用表面活性剂或磷脂通常导致在预期的直径尺寸范围之外的较大的粒径。然而，根据本文描述的方法使用表面活性剂或磷脂可导致非免疫原性的预期尺寸的纳米粒子。

在实施方案中，使用控制pH的纳米沉淀法通过酪蛋白和阿拉伯胶可稳定玉米醇溶蛋白纳米粒子。在另外的实施方案中，使用DMSO可将玉米醇溶蛋白纳米粒子与葡聚糖络合以制备玉米醇溶蛋白-葡聚糖纳米粒子。

在应用超声波剪切或/或高压匀质化至第二相的溶液之后，可搅拌混合物以蒸发乙醇或其他溶剂以形成纳米粒子。在一个实施方案中，可在室温（～23℃）下，通过例如机械搅拌器以从约300rpm至约500rpm的速率执行搅拌约1至6小时或约数小时。

随后为了从任何残留的物质中分离纳米粒子的目的，可使纳米粒子经受超速离心过滤。取决于被包封的分子或药物或取决于纳米粒子的特定的处理诸如PEG化，可使用截留分子量为约5kDa（或具有高于或低于约5kDa的截留分子量的其他合适的过滤器）并处于2kDa和40kDa之间的离心过滤器实施超速离心。超速离心的时间可不同，例如，从约20分钟至约50分钟。随后可将冷冻保护剂添加至纳米粒子。例如，可添加2%w/v海藻糖作为冷冻保护剂。还可使用其他低温-或冻干-保护剂，诸如糖类、包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、ficoll、甜菜碱或多元醇诸如甘露醇或山梨醇。纳米粒子可被保持在，例如-80℃以形成固体团块，其随后可通过诸如在高真空下的冷冻状态中干燥纳米粒子被冷冻干燥。如将被本领域技术人员容易认识的，超声能量的持续时间、表面活性剂的类型、表面活性剂的浓度和缓冲液可根据预期的参数而不同。

因此，本文描述的纳米粒子的粒子直径尺寸的范围可小于约400nm或小于约300nm。在一些实施方案中，粒子直径尺寸的范围是约100nm至约300nm或约75nm至约300nm。尽管以直径的方式讨论了尺寸，纳米粒子并不必然是完美的球形形状，尽管可实现纳米粒子的球形形状并可典型为一些实施方案。可测量粒子的相对侧之间的尺寸，例如从相对侧横跨粒子的最大尺寸，或从相对侧横跨粒子的平均最大尺寸和从相对侧横跨粒子的平均最小尺寸。

用于纳米粒子的水不溶性疏水性蛋白可源自多种来源，包括植物、动物和合成的来源。在一些实施方案中，蛋白可来自谷醇溶蛋白家族，其由高含量的疏水性氨基酸诸如，例如，脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺组成。这些疏水性氨基酸使得蛋白是水不溶性的。谷醇溶蛋白可在多种谷物诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱及其他植物和动物来源中被发现。适合的谷醇溶蛋白的一些示例包括，但不限于，玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。

在一些实施方案中，白玉米醇溶蛋白可被用于制备合适的纳米粒子，诸如具有约100nm至约400nm直径的纳米粒子。黄玉米醇溶蛋白可产生具有相对较大的直径尺寸的粒子，并还可产生具有较宽的粒子直径尺寸分布的粒子。黄玉米醇溶蛋白中的色素可影响黄玉米醇溶蛋白的溶解性和使用黄玉米醇溶蛋白的纳米粒子的形成。

本文描述了制备具有比否则可能的通常小的直径尺寸和窄的直径尺寸范围的纳米粒子的方法。可使用一种或多种特定等级的基础（base）蛋白诸如玉米醇溶蛋白通过执行pH-控制的纳米沉淀工艺，并通过使用被选择获得给予纳米粒子非免疫原性的纳米粒子尺寸和直径的缓冲液、表面活性剂和磷脂的多种组合制备这些较小的纳米粒子。

纳米粒子可与多个“货物”或“货物分子”一起被制备。例如，具有不同理化性质的粒子或剂可被添加至蛋白纳米粒子的制备中以提供被纳米粒子包封的、吸附的、络合的和/或缀合的物质。粒子可捕获小的亲水性分子、小的疏水性分子和/或大分子。可获得约60%至约80%或更大的包封率。纳米粒子可在体外或体内环境中提供被包封的分子一至七天、或一至两周的持续递送。在一些实施方案中（例如，蛋白/抗体和类似物），货物可被吸附/络合/缀合至纳米粒子的表面。

在实施方案中，货物或货物分子是药学物质。适于与本发明的纳米粒子一起使用作为被包封的货物或货物分子、被络合的或缀合的货物分子或被吸附的货物分子的此类物质包括，用于受试对象的诊断或治疗处理的体内或体外使用的可与纳米粒子缔合而不明显干扰纳米粒子的物理完整性的任何物质，例如：药物，诸如抗生素、镇痛药、抗高血压药物、强心剂、类固醇和类似物，诸如扑热息痛、阿昔洛韦、美法兰、阿米卡星、氨苄青霉素、阿司匹林、比生群、博莱霉素、新制癌菌素、苯丁酸氮芥、羟基香豆素、氯霉素、阿糖胞苷、道诺霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、氟尿嘧啶、紫杉醇、吉西他滨、庆大霉素、布洛芬、卡那霉素、甲丙氨酯、氨甲喋呤、诺消灵、制霉菌素、安可平、苯巴比妥、多粘菌素、普罗布考、丙卡巴肼、利福平、链霉素、壮观霉素、金刚烷胺、硫鸟嘌呤、妥布霉素、甲氧苄啶和valbanl；毒素，诸如白喉毒素、白树毒素、外毒素A、相思豆毒素、蒴莲根毒素、蓖麻毒素或其毒性片段；金属离子，诸如碱金属和碱土金属；放射性核素，诸如从锕系元素或镧系元素或其他相似的过渡元素或从其他元素产生的放射性核素，诸如⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁸²Rb、⁸⁹Sr、⁸⁸Y、⁹⁰Y、⁹⁹mTc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴⁰Ba、¹⁴⁰La、¹⁴⁹Pm、¹⁵³Sm、⁵⁹Gd、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir和¹⁹⁹Au；信号产生物，其包括由于其的存在导致可检测并可测量的微扰系统的任何事物，诸如发荧光实体、磷光实体和放射物；信号反射物，诸如顺磁实体，例如，Fe、Gd或Mn；螯合金属，诸如以上给出的任何金属，不论它们是否是放射性的，当与螯合剂缔合时；信号吸收物，诸如近红外、造影剂（诸如显像剂和MRI剂）和电子束遮光剂，例如，Fe、Gd或Mn；抗体，包括单克隆或多克隆抗体和抗独特型抗体；抗体片段；适体；激素；生物反应修饰剂诸如白介素、干扰素、病毒和病毒片段；诊断遮光剂；和荧光部分。货物分子包括清除剂诸如螯合剂、抗原、抗体、适体或能够选择性清除治疗剂或诊断剂的任何部分。

在其他实施方案中，货物或货物分子是农业物质。适于与如本文描述的纳米粒子一起使用的此类物质包括，用于体内或体外治疗、诊断或应用至植物或非哺乳动物（包括微生物）的能够与纳米粒子缔合（即，包封、缀合或吸附）而不明显干扰纳米粒子的物理完整性的任何物质。例如，货物分子可以是毒素，诸如白喉毒素、白树毒素、外毒素A、相思豆毒素、蒴莲根毒素、蓖麻毒素或其毒性片段；金属离子，诸如碱金属和碱土金属；放射性核素，诸如从锕系元素或镧系元素或其他相似的过渡元素或从其他元素产生的放射性核素，诸如⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁸²Rb、⁸⁹Sr、⁸⁸Y、⁹⁰Y、⁹⁹mTc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴⁰Ba、¹⁴⁰La、¹⁴⁹Pm、¹⁵³Sm、⁵⁹Gd、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir和¹⁹⁹Au；信号产生物，其包括由于其的存在导致可检测并可测量的微扰系统的任何事物，诸如发荧光实体、磷光实体和放射物；信号反射物，诸如顺磁实体，例如，Fe、Gd或Mn；信号吸收物，诸如造影剂和电子束遮光剂，例如，Fe、Gd或Mn；激素；生物反应修饰剂，诸如赤霉素、细胞分裂素、生长素、乙烯、脱落酸、病毒和病毒片段、质粒、质体；杀虫剂，包括抗菌剂、除藻剂、arithelmetics、杀螨剂、杀昆虫剂、引诱剂、驱虫剂、除草剂和/或杀真菌剂，诸如乙酰甲胺磷、三氟羧草醚、甲草胺、阿特拉津、苯菌灵、苯达松、克菌丹、呋喃丹、氯化苦、毒死蜱、氯氰草津（chlorsulfuron cyanazine）、三环锡、氯氰菊酯、2,4-二氯苯氧乙酸、茅草枯、麦草畏、禾草灵、除虫脲、地乐酚、草藻灭、福美铁、吡氟禾草灵、草甘膦、氟吡甲禾灵、马拉硫磷、抑草生；二甲戊灵、扑灭司林、毒莠定、毒草安、敌稗、稀禾定、双硫磷、特丁磷、氟乐灵、嗪胺灵、代森锌等等。货物或货物分子包括清除剂诸如螯合剂、螯合金属（不论他们是否是放射性的）或能够选择性清除农业剂的任何部分。

在另外的实施方案中，货物或货物分子是免疫增强剂。适于与如描述的纳米粒子一起使用的此类物质包括将提高免疫应答的能够与纳米粒子缔合（即，被包封、被缀合或被吸附）而不明显干扰纳米粒子的物理完整性的任何抗原、半抗原、有机部分或有机化合物或无机化合物。例如，携带的物质可以是用于抗疟（美国专利号4,735,799，通过引用整体并入本文）、霍乱（美国专利号4,751,064，通过引用整体并入本文）和尿路感染（美国专利号4,740,585，通过引用整体并入本文）的疫苗的制备的合成的肽，用于制备抗菌疫苗（美国专利号4,695,624，通过引用整体并入本文）的细菌多糖、和用于预防疾病诸如AIDS和肝炎的抗病毒疫苗的制备的病毒蛋白或病毒颗粒。

使用这些纳米粒子作为用于免疫增强剂的载体避免了与被用于对辅助载体给予大分子结构的常规已知的传统聚合物结构或合成的聚合物缀合物相关的容量和结构方面含糊（ambiguity）的缺点。使用这些纳米粒子作为用于免疫增强剂的载体允许了缀合物的尺寸、形状和表面组成的控制。这些选择允许抗原呈递至生物体的优化，因此导致具有比使用传统佐剂大的选择性和高的亲和力的抗体。连接多个抗原肽或基团至纳米粒子也可以是可取的，诸如T-细胞和B-细胞表位二者的附着。此设计将导致改进的疫苗。

缀合能够引起免疫应答的杀虫剂或污染物，诸如包含氨基甲酸盐、三嗪或有机磷酸盐组分的杀虫剂或污染物至纳米粒子也可以是可取的。可通过标准程序纯化针对预期的杀虫剂或污染物所制备的抗体，在适合的支持物上固定并被用于环境中或生物体中的杀虫剂或污染物的后续检测。

在实施方案中，货物或货物分子包括除了农业或药学物质之外的能够与这些纳米粒子缔合而不明显干扰纳米粒子的物理完整性的任何物质，例如：金属离子，诸如碱金属和碱土金属；信号产生物，其包括由于其的存在导致可检测且可测量的微扰系统的任何事物，诸如发荧光实体、磷光实体、红外、近红外和放射物；信号反射物，诸如顺磁实体，例如，Fe、Gd或Mn；信号吸收物，诸如造影剂和电子束遮光剂，例如，Fe、Gd或Mn；信息素部分；香料部分；染料部分；和类似的部分。货物分子包括清除剂诸如螯合剂或能够选择性清除多种剂的任何部分。

货物或货物分子可以是生物活性剂。如本文所用的，“生物活性的”指的是能够检测、鉴定、抑制、治疗、催化、控制、杀死、增强或修饰靶实体诸如蛋白、糖蛋白、脂蛋白、脂质、受体、疾病靶向位点或靶细胞、靶组织、靶生物体[例如，微生物、植物或动物（包括哺乳动物诸如人）]或其他靶部分的活性实体，诸如细胞（例如，干细胞、富含血小板血浆，包括干细胞或细胞培养物的微环境/支架）、分子、原子、离子和/或其他实体。还被包含作为生物活性剂的是在基因治疗、siRNA、诊断、分析、修饰、激活、反义、沉默、诊断性状和序列和类似的领域中具有广泛应用性的遗传物质（为任何种类，不论是寡核苷酸、片段或合成的序列）。这些货物分子包括实现遗传物质的细胞转染和生物利用率，包含纳米粒子和遗传物质的络合物并使得该络合物适于待被转染的细胞。

这些纳米粒子可被用于多种体内、离体或体外诊断或治疗应用。一些示例是疾病的治疗，诸如癌症、自身免疫病、遗传缺陷、中枢神经系统紊乱、传染病和心脏疾患，诊断用途诸如放射免疫分析、电子显微术、PCR、酶联免疫吸附测定、核磁共振波谱法、对比成像、免疫闪烁成像术，和递送杀虫剂，诸如除草剂、杀菌剂、驱虫剂、引诱剂、抗菌剂或其他毒素。还包括非遗传物质，诸如生长因子、激素、趋化因子、细胞因子、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、粒细胞集落刺激因子和其他蛋白或任何这些蛋白的片段、抗病毒剂。

本发明还提供了治疗用和/或美容用纳米粒子，诸如包含活性剂（药物）或美容剂的纳米粒子。纳米粒子可提供剂的靶向递送和释放的时序控制。剂可以是，例如，有效治疗皮肤病症或疾患的剂，除了本文描述的剂之外，例如，视黄醇或视黄酸、抗体、寡核苷酸、细胞制剂和类似的。

本发明还提供了用于制备本文描述的纳米粒子的试剂盒。试剂盒可包含所选择的量的以下：水溶性蛋白、一种或多种缓冲剂、一种或多种表面活性剂、用于溶解蛋白的水醇溶剂或其组合。试剂盒还可包括一种或多种磷脂，磷脂的量可足够提供磷脂与表面活性剂的所选择的比。

本发明因此提供了包封多种剂的纳米粒子和制备它们的方法。在一个实施方案中，该方法可用于制备非免疫原性纳米粒子。该方法可包括：提供疏水性水不溶性蛋白；用水醇溶剂溶解该蛋白以提供第一水相溶液；在存在表面活性剂和磷脂时添加缓冲剂至第一水相溶液以产生具有约pH6.8和约pH7.4之间的pH的第二水相溶液；处理第二水相溶液以实现分散体内的粒子直径尺寸的减少；蒸发任何残留溶剂以制备具有小于约400nm的直径尺寸的纳米粒子。随后可离心纳米粒子用于分离和收集。

本方法可包括在离心之后冷冻干燥纳米粒子。本方法还可包括在限制暴露纳米粒子至大气压力的条件下储存纳米粒子。基础蛋白可以是，例如，所选择的等级的玉米醇溶蛋白，诸如白玉米醇溶蛋白。

缓冲剂可以是柠檬酸盐缓冲液。表面活性剂可以是泊洛沙姆且磷脂可以是卵磷脂。表面活性剂和磷脂的比可以是约2:1。处理第二水相溶液以实现粒子直径尺寸的减少可进一步包括使纳米粒子经受超声波剪切、高压匀质化或其组合。对于其他纳米粒子制备，例如，表面活性剂可以不存在（例如，β-酪蛋白-葡聚糖纳米粒子或玉米醇溶蛋白-β-酪蛋白-阿拉伯胶纳米粒子）或可使用其他表面活性剂（例如，其中除了非离子表面活性剂之外使用十二烷基硫酸钠以制备玉米醇溶蛋白纳米粒子）。

该方法可包括将分子添加至第一水相溶液形成中的蛋白用于纳米粒子包封。分子可以是被选择用于施用至受试对象的治疗物质，以提供治疗活性、非免疫原性的纳米粒子。蛋白还可以是PEG化的和/或交联的。

本发明还提供了包含通过将治疗分子包封在疏水性、水不溶性蛋白中形成的非免疫原性纳米粒子的治疗组合物，该纳米粒子具有小于约400nm的直径。在一些实施方案中，粒子直径尺寸为约100nm至约400nm或约100nm至约300nm。本发明还提供了包含治疗剂的非免疫原性纳米粒子的药物治疗的量，该纳米粒子具有小于约400nm的平均直径。纳米粒子可被用于制造用于治疗遭受或处于遭受风险的受试对象的疾病或病症的药剂，该疾病或病症可被治疗剂治疗（即，需要其）。

蛋白、聚合物和纳米粒子组分的变化

还可制备本文描述的玉米醇溶蛋白纳米粒子的变化形式。例如，其他疏水性谷醇溶蛋白的蛋白诸如麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白可代替玉米醇溶蛋白被用作纳米粒子形成的蛋白。因此，可与本文描述的玉米醇溶蛋白纳米粒子相似地制备并使用麦醇溶蛋白纳米粒子、大麦醇溶蛋白纳米粒子和高粱醇溶蛋白纳米粒子。

另外，纳米粒子的蛋白可缀合至部分诸如PEG以修饰纳米粒子的表面。表面修饰部分可以是PEG部分或其他水溶性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙醇酸（PGA）、聚乙烯醇（PVA）、壳聚糖、葡聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）、聚唾液酸（PSA）、聚丙烯酸（PAA）和类似的聚合物。这些水溶性聚合物可缀合至任何疏水性谷醇溶蛋白的蛋白，诸如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白以形成纳米粒子的表面修饰。

相似地，疏水性聚合物可被络合、混合或缀合至谷醇溶蛋白纳米粒子。此类聚合物可包括，例如，聚己酸内酯、乳酸乙醇酸共聚物、聚环氧丙烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、精胺、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚丙烯酸酯（例如，聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸二甲氨乙酯和类似的聚合物）。天然的聚合物也可被络合、混合或缀合至谷醇溶蛋白纳米粒子，所述天然的聚合物诸如其他蛋白聚合物（白蛋白、酪蛋白、明胶和类似的天然聚合物）和碳水化合聚合物诸如壳聚糖、葡聚糖、阿拉伯胶、葡聚糖-接枝酪蛋白、海藻酸盐或其组合。同样地，脂肪酸也可被混合、络合或缀合至谷醇溶蛋白纳米粒子表面。此类脂肪酸的示例可包括硬脂酸、软脂酸、磷脂酰乙醇胺和/或油酸。这些聚合物和/或脂肪酸可缀合至任何疏水性谷醇溶蛋白的蛋白，诸如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白以形成表面被修饰的纳米粒子。

由于玉米醇溶蛋白是蛋白，认识到在纳米粒子的形成中使用玉米醇溶蛋白的另外的优势是在于，玉米醇溶蛋白具有能够被用于附着靶配体、显像剂、药物和用于药物靶向特定组织的其他聚合物和其他生物医学应用的大量的表面官能团。对谷醇溶蛋白疏水性核或纳米粒子表面可作出其他或另外的修饰。这些可包括向纳米粒子缀合刺激响应元件，诸如聚甲基丙烯酸羟乙酯以制备pH敏感的纳米粒子或聚(N-异丙基丙烯酰胺)以制备热敏纳米粒子。另外，例如，可使用交联剂诸如戊二醛、京尼平、柠檬酸、聚唾液酸（PSA）和类似的交联剂交联谷醇溶蛋白纳米粒子以控制药物释放并增加药物包封产量和效率。

使用本文描述的方法形成的玉米醇溶蛋白纳米粒子在机体外具有特别重要的用途，例如，用于药物的局部施用。例如，装载药物的玉米醇溶蛋白纳米粒子可被用于包封并缓释例如美容和制药行业感兴趣的分子。谷醇溶蛋白纳米粒子可被用于保护分子免受不利环境因素诸如水分、氧化、光和类似的因素，并还可减少患者对特定药物的皮肤敏感性。如本文描述的，谷醇溶蛋白还可与其他天然的和合成的聚合物组合以设计具有用于多种局部应用的独特性质的新的纳米粒子。

纳米粒子的药物制剂

本文描述的纳米粒子可被用于制备治疗药物组合物。纳米粒子可以以水分散体或作为冷冻干燥的纳米粒子的干粉形式被添加至组合物。纳米粒子可被配制为药物组合物并以多种形式施用至哺乳动物宿主，诸如人患者。该形式可特定适应于所选择的施用途径，诸如局部施用。

本文描述的纳米粒子可与药学上可接受的媒介物诸如惰性稀释剂或已知的局部载体组合被局部施用。局部组合物和制剂典型包含至少0.1wt.%的活性治疗剂或诊断剂。组合物和制剂中剂的重量百分数可不同并还可适宜地是给出的单位剂型的重量的从约2%至约60%。此包含纳米粒子的治疗有用的组合物中的活性化合物的量是使得可获得有效剂量水平的。分散体、气雾剂制剂、凝胶、软膏、乳膏、洗剂、洗发剂和类似物还可包含一种或多种以下的：黏合剂诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶。除了以上类型的物质之外，单位剂型可包括液态载体，诸如植物油或聚乙二醇。可存在多种其他物质以修饰单位剂型的物理形态。除了对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂之外，局部制剂可包含纳米粒子并任选包含染料以添加颜色。在制备单位制剂中所使用的任何物质以所采用的量应该是药学上可接受的并是基本上无毒的。另外，纳米粒子分散体或冷冻干燥的纳米粒子可被包含入另外的缓释制剂和设备中。

可在任选与缓冲液混合的水中或在其他药学上可接受的溶剂或其混合物中制备纳米粒子分散体。在储存和使用的一般条件下，制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。在制造和储存条件下的最终剂型应该是无菌的、液体的并稳定的。液态载体或媒介物可以是液态分散介质，包括例如，水、乙醇、多元醇（例如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇和类似的液态分散介质）、植物油、无毒甘油基酯和其适合的混合物。可由多种抗细菌和抗真菌剂带来防止微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞（thiomersal）和类似物。在许多情况下，将优选在一些制剂中包括等渗剂，例如，糖类、缓冲液或氯化钠。

可通过将纳米粒子以所需的量并入具有按照所需要的以上列举的多种其他成分的合适的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌溶液。在无菌粉末用于制备无菌溶液的情况下，制备的方法可包括真空干燥技术和冷冻干燥技术，其产生纳米粒子加存在于先前无菌过滤的溶液、凝胶、乳膏、洗剂、软膏和类似物中的任何另外的所需成分的粉末。

关于局部给药，将纳米粒子作为组合物或制剂施用至皮肤将通常是理想的，例如，与皮肤病学上可接受的载体组合，其可以是固体、液体、凝胶、乳膏、软膏、或糊剂。有用的固体载体包括磨碎的固体诸如滑石、黏土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝和类似的固体载体。有用的液体载体包括水或水-乙醇/乙二醇/二甲基亚砜（DMSO）共混物，其中纳米粒子可以以有效的水平被分散，任选具有无毒表面活性剂的帮助。可添加佐剂诸如芳香剂和另外的抗菌剂以为约定的用途优化性质。可从用于浸透绷带和其他敷料剂的吸水垫应用液体组合物，或使用泵型或气雾剂喷射器喷在患处。

增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质也可被采用与液态载体一起形成可涂开的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等等，用于直接应用至使用者的皮肤。

用于递送活性剂（例如，装载剂的纳米粒子）至皮肤的皮肤病用组合物的示例是本领域已知的；例如，见美国专利号4,608,392（Jacquet等人）、4,992,478（Geria）、4,559,157（Smith等人）和4,820,508（Wortzman），每一个都通过引用整体并入本文。此类皮肤病用组合物可与本文描述的纳米粒子制剂一起组合被使用。

可通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性确定本文描述的装载药物的纳米粒子的有用的剂量。用于由小鼠和其他动物中的有效剂量至人有效剂量的推测的方法是本领域已知的；例如，见美国专利号4,938,949（Borch等人），通过引用整体并入本文。在治疗中使用所需的纳米粒子中装载化合物或活性盐、前体药物或其衍生物的量将不仅随着所选择的特定化合物或盐而不同，而且随着施用途径、被治疗的病症的性质和患者年纪及状态而不同，并将最终听凭监护医生或临床医生的决定。

装载治疗剂的纳米粒子可以以单位剂型方便地被施用，例如，每单位剂型包含5至1000mg/m²、方便地10至750mg/m²、最方便地，50至500mg/m²的活性成分。所需的剂量可方便地以单次剂量或作为以适当的时间间隔分开施用的剂量存在，例如，作为每天两次、三次、四次或多次的子剂量。子剂量本身例如，可进一步被分开为数个不连续的松散的间隔施用。

本文描述的装载药物的纳米粒子可以是有效的抗炎剂且与非纳米粒子包封的抗炎剂相比具有较高的疗效和/或减少的毒性。本发明提供了治疗哺乳动物中的炎症的治疗方法，其包括将有效量的本文描述的组合物或制剂施用至患有炎症（例如，皮肤的）的哺乳动物。哺乳动物包括灵长类动物、人、啮齿动物、犬、猫、牛、绵羊、马、猪、牛和类似的哺乳动物。

下面的实施例意在说明以上的本发明并不应被解释为使它的范围变窄。本领域技术人员将容易认识，实施例表明了可实行本发明的许多其他方式。应该理解的是可作出许多变化和修改同时保持在本发明范围内。

实施例

如下面的实施例中描述的制备和表征了根据多个实施方案的纳米粒子，诸如具有约75nm至约400nm的平均直径的纳米粒子。

实施例1.玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备

在第一水相中，将13.5mg的白玉米醇溶蛋白溶解在3mL乙醇和0.25mL水的混合物中。所使用的玉米醇溶蛋白的浓度或溶剂的组合是最佳的；然而，可通过修改玉米醇溶蛋白的浓度或溶剂组成制备呈预期的不同尺寸范围的纳米粒子。在应用探头超声处理持续约20秒的帮助下溶解玉米醇溶蛋白。随后在使用10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲持续10分钟的超声能量（1.39kW/h，37%振幅）恒定施加下，将第一水相所得溶液逐滴加入15mL具有pH7.4的柠檬酸盐缓冲液和卵磷脂（0.45%w/v）和

F68（0.9%w/v）的组合的溶液中。在超声波剪切处理过程中，将分散体保持在冰浴中以保持温度处于约10℃。随后于室温（～23℃）将分散体放置在处于300rpm至500rpm之间的磁力搅拌器上直至乙醇完全蒸发。在乙醇完全蒸发之后，纯化纳米粒子以去除任何残留物质和/或表面活性剂。

通过用去离子的pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有5000Da的截留分子量的离心过滤器以3950g超速离心50分钟实现纯化。将2%w/v海藻糖作为冷冻保护剂添加至4mL的玉米醇溶蛋白纳米粒子的所得水悬浮液（pH7.4柠檬酸盐缓冲液）中，并随后将纳米粒子保持在-80℃以形成固体团块。随后在-47℃并在60mTorr真空下将物质冷冻干燥12至14小时。随后将纳米粒子储存在10℃的冰箱中的干燥器中。见图1。WO2009/137112（Perumal等人）描述了制备玉米醇溶蛋白纳米粒子的另外的方法，其通过引用并入本文。

在可选的方法中，可由用于在高压下使分散体穿过用于减少粒径的窄的孔口的高压匀质器补充或代替第二相溶液的超声波剪切。当使用高浓度的玉米醇溶蛋白时，这对制备呈较小尺寸范围的纳米粒子是特别有用的。同样，高压匀质化可被用作制备玉米醇溶蛋白纳米粒子的规模放大方法。

在下面的实施例2中描述该方法的示例。

实施例2.使用高压匀质器制备玉米醇溶蛋白纳米粒子

将0.65%w/v白玉米醇溶蛋白的量溶解在6mL乙醇和0.50mL水的混合物中。改变第一水相的所得溶液的组成以获得约pH6至约pH7的预期pH。在应用探头超声处理持续约20秒的帮助下溶解玉米醇溶蛋白。随后在使用10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲持续2分钟超声能量（1.39kW/h，37%振幅）的恒定施加下，将第一水相所得溶液逐滴加入30mL具有pH7.4的柠檬酸盐缓冲液和卵磷脂（0.45%w/v）和

F68（0.9%w/v）的组合的溶液中。在超声波剪切处理过程中，将分散体保持在冰浴中以保持温度处于约10℃。随后于20,000psi将所得的粗悬浮液穿过具有0.1和0.25mm之间的孔口尺寸的高压匀质器（NANOUSA）持续5分钟。在高压匀质化处理过程中，使用冷却装置通过高压匀质器中的循环水将温度保持在约10℃。随后，将分散体保持在300至500r.p.m及室温下的磁力搅拌器上直至乙醇被完全蒸发。在完全蒸发之后，纯化纳米粒子以去除任何残留物质或表面活性剂。

通过用pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有5000Da的截留分子量的离心过滤器以3950g超速离心50分钟实现纯化。将四毫升的纳米粒子的水悬浮液（pH7.4柠檬酸盐缓冲液）与35mg的2%w/v海藻糖混合，并保持在-80℃以形成固体团块。随后在-47℃及60mTorr真空下将团块冷冻干燥12至14小时。

可将实施例1和2中描述的方法调整用于纳米粒子的形成，其中所选择的分子，诸如治疗药物被包封在纳米粒子内（例如，见图2）。如本文描述的，治疗药物可以是，例如，香豆素、视黄醇、视黄酸或其酯。

图3和4中可以看出玉米醇溶蛋白粒子制备的其他变化方式。在第一种方法中，使用控制pH的纳米沉淀法通过β-酪蛋白和阿拉伯胶稳定玉米醇溶蛋白粒子（见图3）。在第二种方法中，葡聚糖的还原端（醛）缀合至α–氨基酸酪蛋白。简言之，在烧杯中的20ml的柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）中将40mg的β-酪蛋白与100mg的葡聚糖（11kDa）混合。用铝箔覆盖烧杯并于70℃搅拌过夜。如图4中显示的使用葡聚糖-接枝β-酪蛋白作为稳定剂以制备玉米醇溶蛋白-葡聚糖-酪蛋白纳米粒子。

另外，可制备包含玉米醇溶蛋白和酪蛋白的纳米粒子（见下面的实施例11）。

玉米醇溶蛋白-葡聚糖纳米粒子。在另外的变化方式中，将50mg的玉米醇溶蛋白和葡聚糖（11kDa）溶解在10mL的二甲基亚砜（DMSO）中。于室温搅拌溶液24小时。搅拌之后，将溶液引入透析袋（截留分子量10,000）并对1升的蒸馏水透析2天，在该过程中的第一天，每两小时更换蒸馏水以完全去除有机溶剂。所得悬浮液用于分析或冷冻干燥。该方法依赖于蛋白与多糖的相互作用。

表2.1：被修饰的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征.

实施例3.包封剂的玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备

用于形成包封分子的纳米粒子的方法的示例如下。将以13.5mg量的白玉米醇溶蛋白溶解在3mL乙醇和0.25mL的0.01N NaOH的混合物中以调节pH在6和7之间。添加6.6mg的6,7羟基香豆素至溶液并使混合物经受探头超声处理持续20秒以确保溶解。在多个实施方案中，可用本文描述的约0.03mmol至约0.05mmol的不同的剂代替6,7-羟基香豆素，诸如视黄醇或其衍生物。在一些实施方案中，可采用约0.1%w/w至约2%w/w或约0.3%w/w至约1%w/w的活性剂，诸如视黄醇。在使用10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲持续10分钟的处于1.39kW/h和37%振幅的持续的超声波能量下，将所得溶液逐滴添加进入15mL包含67.5mg的卵磷脂和135mg的

F68的柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）中。在超声处理过程中，将溶液保持在冰浴中以保持温度大约10℃。随后在300rpm至500rpm之间并于室温（～23℃），将分散体放置在磁力搅拌器上直至乙醇完全被蒸发。在乙醇完全蒸发之后，纯化纳米粒子以去除任何过量的药物和/或表面活性剂。

通过用pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有5000Da的截留分子量的离心过滤器以3950g超速离心50分钟实现纯化。将四毫升的装载香豆素的纳米粒子的水悬浮液（pH7.4柠檬酸盐缓冲液）添加至35mg的海藻糖并保持在-80℃以形成固体团块。随后在-47℃及60mTorr真空下将固体团块冷冻干燥12至14小时。

已证明白玉米醇溶蛋白可被用作适合的基础蛋白。白玉米醇溶蛋白给出处于约100nm至约400nm的预期窄的尺寸范围的可重现的纳米粒子，而黄玉米醇溶蛋白给出具有较宽的粒径分布的较大的粒子。在下面表3-1和表3-2中说明该差异。表1提供了通过以上实施例1和实施例3的方法从黄玉米醇溶蛋白制造的纳米粒子的数据。显示了空白的和装载香豆素的纳米粒子二者。可以看出的是每一种的粒径分别约为460nm和610nm。通过比较，如下面表2中显示的，通过实施例1和实施例3的方法从白玉米醇溶蛋白制造的空白的和装载香豆素的纳米粒子是较小的。图5和6显示空白的和装载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米粒子的电子显微图像和原子力图像。

表3-1.

模型化合物粒径(nm)	多分散指数（PDI）	ζ电势（mV）	包封率(%)
				空白玉米醇溶蛋白纳米粒子460±63	0.46±0.06	-10.28±2	不适用
6,7-羟基香豆素610±123	0.62±0.08	-16.28±3	98±1.5

每一个值是三次实验的平均值±SD.

表3-2.

模型化合物	粒径(nm)	多分散指数(PDI)	ζ电势（mV）	包封率(%)
					空白玉米醇溶蛋白纳米粒子	224±20	0.31±0.06	-16±3	不适用
6,7-羟基香豆素	266±30	0.44±0.08	-11.34±1.8	62±17

每一个值是三次实验的平均值±SD.

黄玉米醇溶蛋白中的色素表现为影响玉米醇溶蛋白的溶解性及具有预期尺寸分布的纳米粒子的形成。已发现使用天然聚合物诸如蛋白制备一致处于预期的小尺寸范围内的粒子特别具有挑战性。然而，本文描述的方法则使用适合等级的蛋白制备一致处于预期尺寸范围的纳米粒子，所述适合等级的蛋白诸如白玉米醇溶蛋白。显著地，本文描述的方法可制备并已制备具有低至80nm至100nm的直径尺寸的纳米粒子。如以上实施例2中描述的，如果超声波剪切被高压匀质化部分代替，那么所得的空白纳米粒子的粒径也与以上表2中显示的粒径相似，即具有约220±15nm的粒径和0.4±0.07的PDI。

发现通过纳米沉淀方法制备的处于预期尺寸范围的纳米粒子的产量大于约60%。该方法是重要的，在于所制备的粒子具有处于小于约400nm的范围的直径的主要量度并典型具有约100nm至约300nm的相对窄的直径尺寸的分布，以避免当施用进入机体时的免疫原性反应。有利地，当使用猪血液体外检测时，处于约100nm至约400nm的直径尺寸范围的玉米醇溶蛋白纳米粒子，诸如通过本文描述的方法制备的，不会被吞噬细胞吞噬，而具有大于约400nm的直径尺寸的较大的粒子快速地被吞噬细胞吞噬。这表明，通过控制玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒子直径尺寸处于较小的尺寸范围避免了纳米粒子的吞噬作用。

小鼠中的免疫原性研究显示，具有约100nm至约400nm的直径的玉米醇溶蛋白纳米粒子是非免疫原性的，而具有大于约400nm直径的玉米醇溶蛋白纳米粒子产生显著的免疫应答（与生理盐水对照相比，抗-玉米醇溶蛋白抗体为2至4倍高）。这些结果显示，制备和使用具有小于约400nm直径的纳米粒子对避免由粒子的疏水性蛋白造成的任何显著的免疫原性是重要的。

通过控制本方法的第二水相溶液的pH部分实现控制纳米粒子的尺寸的能力。下面表3-3中的数据说明，在约6.8和约7.4之间的pH获得具有低PDI、较小尺寸的纳米粒子。

表3-3.

水相的pH	粒径(nm)	多分散指数
			1.5	362±24	0.392
3	291±15	0.45
			6.8	208±10	0.289
7.4	232±7	0.260
			10	256±20	0.317
12	368±10	0.438

每一个值是三次实验的平均值±SD

控制纳米粒子形成的尺寸中另外的重要因素是用于稳定纳米粒子并防止粒子聚集的表面活性剂和磷脂的组合。诸如以2:1比（例如，0.9%:0.45%，w/w）的泊洛沙姆和卵磷脂的组合产生处于预期尺寸范围的纳米粒子。如果单独使用表面活性剂或磷脂，则获得较大的粒子，如下面表3-4中的数据显示的。

表3-4.

每一个值是三次实验的平均值±SD。10*冷冻干燥导致粘性粉末。

用于第二水相的缓冲剂的选择不仅对纳米粒子形成过程中保持最适宜的pH是重要的，而且对后续的冷冻干燥也是重要的。例如，如果在第二水相溶液中不使用缓冲剂或如果使用0.1N HC1调节pH，则所得纳米粒子尺寸较大、具有较宽的尺寸范围或PDI。如图7中显示的，使用柠檬酸盐缓冲液提供了最小的粒径（109±12nm）。使用其他缓冲剂、特别是磷酸盐，导致在冷冻干燥之后玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径增加了2或3倍。

图7的图说明与在第二水相中使用柠檬酸盐缓冲液作为缓冲剂制备的纳米粒子相比，在来自第二水相的溶液中使用磷酸盐作为缓冲剂通过本方法制备的并在冷冻干燥之后获得的玉米醇溶蛋白纳米粒子产生大得多的粒子。磷酸盐缓冲液中粒径的增加可能是由于处于冷冻干燥温度时由pH降低造成的缓冲液的结晶和沉淀(Shalaev等人,Pharm Res19(2002)195-201)。使用柠檬酸盐缓冲液解决了该问题，其有效地对抗了在冷冻干燥温度期间pH的变化。玉米醇溶蛋白中的氨基可与柠檬酸交联，其还可稳定玉米醇溶蛋白纳米粒子（Reddy等人,Biotechnol.Prog.25(2009)139-146)。

值得注意的是，玉米醇溶蛋白是生物可降解的蛋白并也比合成的聚合物更生物相容。根据FDA标准（Wheat gluten,corn gluten and zein film:affirmation of GRAS status（小麦谷蛋白、玉米谷蛋白和玉米醇溶蛋白膜：GRAS地位的确认），Fed Register50(1985)8997-8999）将玉米醇溶蛋白列为GRAS（通常视为安全）聚合物。本文描述的方法因此适于制备具有被包封的不同理化性质的货物分子或药物的玉米醇溶蛋白纳米粒子。下面表3-5说明根据多个实施方案使用本文描述的方法可被纳米粒子包封的多种分子。可被用于纳米粒子包封的分子的数量或类型不限于本文记录的那些。

表3-5.

模型化合物	粒径(nm)	ζ电势	包封率（%）
				6,7-羟基香豆素	173±20	-16±3	68±6
阿霉素	171±45	-21±2	61±16
				葡聚糖FITC(4000Da)	89±12	-15±2	79±8
pDNA(GFP)	185±12	-17±0.4	86.2±3

每一个值是三次实验的平均值±SD。

因此，在控制粒径和免疫原性的情况下成功制备了以多种货物分子诸如6,7-羟基香豆素形成的纳米粒子。根据一个实施方案，以上描述了装载6,7-羟基香豆素粒子的制备的示例且图8中说明了其制品。

部分由于玉米醇溶蛋白纳米粒子的水不溶性使得粒子能够维持药物超过一段时间的释放，如本文描述所制备的玉米醇溶蛋白纳米粒子提供了被包封的分子或药物的有益的和/或有利的缓释。例如，图8描绘了根据以上实施例2中描述的方法制备的装载香豆素的纳米粒子的体外释放曲线。数据显示，药物体外缓释经过直至7天的时间段，观察到在存在酶时具有较高的释放速率。数据显示由药物离开纳米粒子的缓慢的扩散和玉米醇溶蛋白纳米粒子的缓慢的酶促分解介导玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放。被包封的药物的其他示例显示在初始爆发及之后的约24小时之后缓释的混合的顺序。

不同的被包封分子的药物释放曲线显示，玉米醇溶蛋白纳米粒子可被用作通过肠胃外的和非肠胃外的施用途径的通用且安全的药物递送媒介物，包括口服、颊的、经皮、经鼻、肺部和眼的途径的递送。许多其他分子、粒子和药物，包括但不限于，制药和美容物质（例如，维生素A（视黄醇）、微生物C和其衍生物诸如抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E和其衍生物诸如生育酚乙酸酯、辅酶Q10、米诺地尔、绿树提取物、芦荟、对苯二酚、透明质酸、透明质酸钠、红没药醇、乙醇酸、乳酸、β羟基丁酸、水杨酸、10-羟基癸酸、阿魏酸、泛醇、生物的（biotic）、熊果苷、槲皮素、橘皮苷和类似物或其组合）也可被包封用于治疗、诊断和美容应用或疗法。此外，由于通过本文描述的方法形成的纳米粒子的相对较小的尺寸，装载分子（例如，装载药物）的玉米醇溶蛋白纳米粒子可循环进入机体持续延长的时间段，而不被吞噬细胞识别并清除。

图9的数据说明当使用猪血液体外检测时，处于100-400nm尺寸范围的玉米醇溶蛋白纳米粒子不会被血液吞噬细胞吞噬，而处于>400nm的尺寸的较大粒子被吞噬细胞快速吞噬。因此，可以表明，通过控制玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径处于较小的尺寸范围避免了吞噬细胞的吞噬。小鼠中的免疫原性研究显示处于100nm至400nm尺寸范围的玉米醇溶蛋白纳米粒子是非免疫原性的。另一方面，如图10中显示的，与对照相比具有>400nm尺寸的玉米醇溶蛋白纳米粒子产生显著的免疫应答（两至四倍）。

使用猪肠上皮细胞（IPEC-J2）在细胞增殖研究中研究了用于制造纳米粒子的玉米醇溶蛋白的细胞毒性作用。图11中显示示例性的细胞毒性研究的结果。如与以任何浓度的缓冲液的对照处理相比，在白玉米醇溶蛋白和黄玉米醇溶蛋白之间没有观察到细胞毒性的显著程度。

实施例4.交联的纳米粒子

通过交联可进一步增强如本文描述所制备的纳米粒子的酶促稳定性。图12说明使用戊二醛作为交联剂的交联的空白玉米醇溶蛋白纳米粒子制备的一般方法。此制备的特定示例如下。

使用以上描述的纳米沉淀方法制备空白的玉米醇溶蛋白纳米粒子。在探头超声处理第二水相之后添加交联剂。进一步将纳米粒子孵育24小时。孵育结束时，使用离心过滤纯化纳米粒子并随后冷冻干燥纳米粒子。将白玉米醇溶蛋白（0.0135g）溶解在3mL乙醇和0.25mL水的混合物中。随后在使用10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲、处于1.39kW/h及37%振幅的超声能量持续10分钟的恒定施加下，将第一相溶液逐滴加入15mL具有pH7.4并包含0.45%w/v卵磷脂和F68（0.9%w/v）的组合的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程中，将溶液保持在冰浴中以保持温度约10℃。添加0.5mL的25%w/v的戊二醛至溶液并将溶液在37℃同时在300rpm至500rpm搅拌下孵育3至24小时。用10%w/v偏亚硫酸氢盐中和剩余的戊二醛。随后，将分散体放置在处于300rpm至500rpm及室温下的磁力搅拌器上直至乙醇被完全蒸发。在乙醇完全蒸发之后，纯化纳米粒子以去除残留物质。

通过用pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有5000Da的截留分子量的离心过滤器以3950g超速离心50分钟实现纯化。添加35mg的海藻糖至纳米粒子的水悬浮体中并将溶液保持在-80℃以形成固体团块。随后在-47℃及60mTorr真空下将物质冷冻干燥12至14小时。特别地，当在图12的方法中使用其他交联剂诸如EDC/NHS和京尼平时，反应时间可不同，从24至72小时。

参与交联三硝基苯磺酸（TNBS）的玉米醇溶蛋白中的表面氨基被用于在交联之前和之后评价玉米醇溶蛋白中的自由氨基。使用递增浓度的未交联的和交联的玉米醇溶蛋白对440nm波长处的吸光度产生标准曲线。使用下面的式计算交联效率：

%交联效率=[a-b/a]×100

其中a=未交联的玉米醇溶蛋白的浓度对吸光度的斜率，且b=交联的玉米醇溶蛋白的浓度对吸光度的斜率。用于构建标准曲线的玉米醇溶蛋白的浓度范围为0.357mg/mL至12mg/mL，且相关系数为0.9994。在图13中显示使用不同的交联剂的玉米醇溶蛋白纳米粒子中的交联程度。交联效率从约70%至约100%而不同。交联的程度可取决于交联剂通过改变反应时间至从约3小时至3天的范围而不同。此处显示的交联剂仅是示例且本文描述的方法不限于仅使用所公开的交联剂。可使用其他交联剂诸如多元羧酸（柠檬酸或1,2,3,4-丁烷四甲酸）。

实施例5.交联的包封若丹明的纳米粒子

以上的实施例说明了空白玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备，在包含特定分子的纳米粒子的形成中也可以实施交联。在纳米粒子中制备水溶性染料若丹明的特定示例如下（见图14）。本方法可被用于包封其他化合物诸如本文描述的视黄醇和相关化合物。

若丹明123具有380.82的分子量和1.2的LogP。它是微溶于水并完全溶于甲醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的绿色荧光染料。

将白玉米醇溶蛋白（0.0135g）溶解在3mL乙醇和0.25mL的水（0.25mL）的混合物中。添加0.0005g的若丹明-123至第一水溶液。在具有10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲、处于1.39kW/h及37%振幅的超声能量持续10分钟的恒定施加下，将所得溶液逐滴加入15mL具有pH7.4并包含0.0675g卵磷脂和（0.135g）

F68的组合的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程中，将溶液保持在冰浴中以保持温度约10℃。随后添加0.5mL的戊二醛（25%w/v）并于37℃同时在300rpm至500rpm搅拌下孵育3小时。用10%w/v焦亚硫酸钠中和剩余的交联剂。随后，于室温将分散体放置在300rpm至500rpm的磁力搅拌器上直至乙醇被完全蒸发。在乙醇完全蒸发之后，超速离心法纯化纳米粒子。

通过用pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有5000Da截留分子量的离心过滤器以3950g超速离心50分钟实现纯化。将35mg的海藻糖添加至装载若丹明的纳米粒子的水悬浮液（pH7.4柠檬酸盐缓冲液）中并将溶液保持在-80℃以形成固体团块，随后将其在-47℃及60mTorr真空下冷冻干燥12至14小时。

表5-1中显示未交联的和交联的（使用戊二醛作为交联剂）若丹明粒子的粒径、多分散指数和ζ电势。

表5-1

每一个值是三次实验的平均值（±SD）。

当玉米醇溶蛋白纳米粒子被交联时，处于pH2时的药物体外释放较慢（图15）并相似地酶促释放同样较慢（图16）。玉米醇溶蛋白纳米粒子表面的自由氨基的交联减少了粒径、减少了溶剂的接近（access）并减慢了纳米粒子的酶促降解。交联还显著降低了爆发的影响。因此，交联可进一步稳定纳米粒子并维持货物从纳米粒子的释放。

实施例6.PEG化的玉米醇溶蛋白纳米粒子

通过本文描述的方法制备的纳米粒子的治疗活性和效力可通过附着聚乙二醇（PEG）至纳米粒子被进一步增强。在PEG化附加的益处中有纳米粒子的循环半衰期的增加。如果直接缀合不是容易综合可行的话，PEG的另外的优势是其可作为连接靶配体、药物和显像剂至玉米醇溶蛋白纳米粒子的间隔区。

图17根据另外的实施方案说明用于制备PEG化的玉米醇溶蛋白纳米粒子的方法。PEG化的玉米醇溶蛋白用于制造纳米粒子的优势是，与非PEG化的玉米醇溶蛋白使用表面活性剂和磷脂的组合不同，其可仅使用表面活性剂诸如

F68被制造。形成PEG化的玉米醇溶蛋白纳米粒子的特定方法如下。

通过添加0.1g的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺酯（分子量5000Da）至5mL的90%乙醇中的0.1g的白玉米醇溶蛋白制备PEG化的玉米醇溶蛋白。将混合物在37℃孵育3-24小时。随后于室温在磁力搅拌器（磁力搅拌棒以100rpm搅拌）中对水透析（截留分子量10kDa）该溶液24小时以去除任何残留物质。随后将所得产物冷冻至-80℃，随后在-47℃以60mTorr的真空冷冻干燥12至14小时。下面表6-1中显示经过不同孵育时间段观察的PEG化效率，其中使用如以上描述的TNBS测定程序确定效率百分数。

可使用其他分子量的PEG，诸如从500Da至5000Da。相似地，还可使用PEG衍生物诸如甲氧基PEG-N-羟基琥珀酸酯或其他衍生物。

表6-1.

孵育时间(小时)	玉米醇溶蛋白：mPEG酯的比	PEG化效率（%）
			24	1:1	65
24	1:2	93
			3	1:1	52

将50毫克的PEG化的白玉米醇溶蛋白溶解在3mL乙醇和0.25mL去离子水的混合物中。随后在具有10秒持续时间和1秒暂停时间的脉冲、处于1.39kW/h及37%振幅的超声能量持续10分钟的恒定施加下，将包含PEG化的玉米醇溶蛋白的溶液逐滴加入15mL具有pH7.4并包含

F68(0.9%w/v)的柠檬酸盐缓冲液中。在超声处理过程中，将溶液保持在冰浴中以保持温度处于约10℃。随后，于室温将玉米醇溶蛋白悬浮液放置在处于300rpm至500rpm之间的磁力搅拌器上直至乙醇完全被蒸发。当蒸发完成时，纯化纳米粒子。

通过用pH7.4柠檬酸盐缓冲液反复洗涤并使用具有10000Da的截留分子量的离心过滤器以44,000g超速离心35分钟实现纯化。将30g的2%w/v的海藻糖添加至PEG化的玉米醇溶蛋白的纳米粒子的水悬浮液（pH7.4柠檬酸盐缓冲液）中并将溶液保持在-80℃以形成固体团块，随后在-47℃及60mTorr真空下将其冷冻干燥12至14小时。可使用如以上实施例2中公开的高压匀质化实施上面公开的PEG化处理。图18中显示PEG化的纳米粒子的尺寸分布。

实施例7.装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子

该实施例描述了装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备和表征，与视黄醇本身相比，使用玉米醇溶蛋白纳米粒子改进的视黄醇的溶解性、通过在玉米醇溶蛋白纳米粒子中的包封改进的视黄醇的稳定性、视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的缓释、玉米醇溶蛋白纳米粒子增强视黄醇的皮肤渗入和皮肤保留的能力、和视黄醇纳米粒子制剂缺少或减少的皮肤刺激。

1.装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备和表征。使用相分离方法制备玉米醇溶蛋白纳米粒子，其中将玉米醇溶蛋白、视黄醇和丁基羟基甲苯（BHT）（抗氧化剂）溶解于90%乙醇。将该溶液添加至包含卵磷脂和PLURONIC作为稳定剂的柠檬酸盐缓冲液（pH）中。蒸发乙醇以形成纳米粒子并随后通过离心分离纳米粒子，之后进行冷冻干燥。放射性标记的（³H）视黄醇与‘冷’视黄醇一起被用于分析。在一些实施方案中，可代替或与BHT组合被使用的其他适合的抗氧化剂包括维生素E、维生素C、谷胱甘肽、泛醌、辅酶Q-10、艾地苯醌、番茄红素、绿茶和水飞蓟素。

装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径为约170-290nm且包封率为76-100%。通过改变药物/聚合物的比和BHT浓度优化粒径和包封率。不存在BHT时，包封率<50%。表7-2提供了表征装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的数据。见图19提供制备装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的示例的流程图。

表7-1：使用相分离方法制备的装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征。

样品号	视黄醇（%w/w）	BHT	粒径（nm）	PDI	包封率（%）
						1	0.074	…	298.5±7.9	0.228±0.02	46.3±6.2
2	0.074	0.074	287.0±11.2	0.241±0.11	85.4±4.1
						3	0.148	0.296	221.7±9.6	0.289±0.07	75.5±3.9
4	0.074	0.148	189.5±10.1	0.433±0.09	96.2±3.3

结果是一式三份样品的代表（平均值±SD）；PDI=多分散指数。

2.视黄醇在水溶液中增加的溶解性/分散性。游离的视黄醇不可分散于水中并在试图分散该剂之后沉淀在小瓶的底部（图20）。另一方面，装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子容易分散于水中。在纳米粒子中包封之后显著增强了视黄醇在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的溶解性。磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的10μg/mL的视黄醇（视黄醇同等物）纳米粒子样品显示堪比于20%甲醇中l0μg/mL的游离视黄醇的UV吸光度（320nm）。在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中10μg/mL的视黄醇分散体中观察到非常低的吸光度。

3.视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放。在磷酸盐缓冲液生理盐水（PBS；pH7.4）中实施视黄醇从纳米粒子的释放研究。使用UV分光光度计在320nm处分析视黄醇的浓度，并一式三份实施释放研究。如在图21中显示的，视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米粒子的释放持续数天。

4.装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的稳定性。视黄醇是黄色颜色的粉末。它在环境条件下是吸湿的并快速变成粘性的。被包封的视黄醇是无色的并自由流动并是远远较少吸湿的（图22）。在图22中显示的视黄醇样品是亮黄色且纳米载体制剂是白色，说明包封掩盖了视黄醇的亮黄色颜色。纳米载体制剂还导致比纯的视黄醇更自由流动的粉末。

持续一周的时间段研究了环境条件下和黑暗中的视黄醇制剂的稳定性。持续一周还研究了视黄醇和装载视黄醇的纳米粒子（冷冻干燥的粉末）的固态稳定性。关于液态稳定性，将游离的视黄醇或装载视黄醇的纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中并持续一周使用UV分光光度方法（于320nm）测量视黄醇的浓度。发现视黄醇遵循一级动力学并测定了半衰期。获得下面的结果，如表7-2和7-3及图23-26中显示的。

玉米醇溶蛋白纳米粒子保护视黄醇抗光降解和水分引起的降解。与游离的视黄醇相比，固态和液态中的被包封的视黄醇显示增强的稳定性。包含BHT作为抗氧化剂进一步增强了被包封的视黄醇的稳定性。最终，通过在玉米醇溶蛋白纳米粒子中的包封显著增强了视黄醇的储存期。

表7-2：游离和被包封的视黄醇的固态稳定性.

物质	光（t1/2以小时计）	黑暗（t1/2以小时计）
			视黄醇固体	52.75	63
视黄醇纳米粒子	153	92.66
			具有BHT的视黄醇纳米粒子	346.5	1386

表7-3：游离和被包封的视黄醇在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的液态稳定性.

物质	光（t1/2以小时计）	黑暗（t1/2以小时计）
			视黄醇	16.11	20.83
视黄醇+BHT	35.25	43.42
			视黄醇纳米粒子	42	94.81
具有BHT的视黄醇纳米粒子	110.1	347

5.视黄醇和被包封的视黄醇的皮肤渗入。使用垂直扩散池用被切下的猪耳朵皮肤研究视黄醇和被包封的视黄醇的皮肤渗入。放射性标记的（³H）视黄醇与‘冷’视黄醇一起被用于该研究。使用放射化学分析评价48小时结束时皮肤匀浆和接纳介质中的视黄醇的量。重复实验6次（±SD）。如在图27中可以看出的，被包封的视黄醇导致皮肤中视黄醇较大的保留。游离的视黄醇和视黄醇纳米粒子的“皮肤中与接纳介质中的视黄醇”的比分别为3和11。结果显示纳米粒子导致了视黄醇在皮肤中的较大的保留。

概括地说，玉米醇溶蛋白纳米粒子显著增加了视黄醇的水溶解性和分散性。不像黄色、粘性并是吸湿的粉末的游离视黄醇，在纳米粒子中包封视黄醇导致自由流动的无色粉末。玉米醇溶蛋白纳米粒子有效维持了视黄醇的释放。通过在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封显著增强了视黄醇的光稳定性和水解稳定性，其通过添加BHT作为抗氧化剂被进一步增强，且玉米醇溶蛋白纳米粒子导致视黄醇的较高的皮肤保留。纳米粒子还可以减少视黄醇的皮肤刺激。

实施例8.装载若丹明123的未交联的玉米醇溶蛋白纳米粒子

下面的表8-1中提供了使用相分离方法制备装载若丹明123（0.0296%和0.0370%w/w）的未交联的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

表8-1.制备若丹明纳米粒子的相分离方法.

图29说明磷酸盐缓冲液（pH7.4）中若丹明123从玉米醇溶蛋白纳米粒子的体外释放。在这些研究中，使用装载0.0296%w/w的若丹明123的未交联的纳米粒子用于研究。通过荧光分光光度计以485nm的激发波长和530nm的发射波长测量了若丹明123的浓度（平均值±SEM；n=3）。

图30说明游离的若丹明123（10μg）和若丹明纳米粒子（相当于10μg的若丹明123）在经皮片的猪皮中6小时后的渗入。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的若丹明123和若丹明纳米粒子分散体装载在供应室中。在研究结束时，彻底洗涤皮肤以去除表面吸附的若丹明123并将皮肤放置在OCT流体中并在液氮中冷冻。随后使用低温切片机将皮肤切片并在荧光显微镜下观察。如从图30中可以看出的，与局限于皮肤表层（SC）的游离的若丹明相比，若丹明纳米粒子渗入较深的皮肤。

图31说明游离的若丹明123（10μg）和在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封的若丹明123（相当于10μg的若丹明123）在经皮片的猪皮中6小时后的渗入。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的或被包封的若丹明123分散体装载在供应室中。在研究结束时，彻底洗涤皮肤并使用共聚焦激光扫描显微术测量皮肤中的若丹明123荧光并使用不同皮肤层中的荧光像素强度定量（平均值±SE；n=3）。如从图31中可以看出的，若丹明纳米粒子的荧光强度显著较高。

实施例9.装载异硫氰酸荧光素（FITC）的玉米醇溶蛋白纳米粒子.

异硫氰酸荧光素（FITC）具有389.382的分子量和5.03的LogP。FITC是微溶于水（小于0.1mg/mL）并完全溶于乙醇、甲醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的荧光染料。

表9-1中显示使用乳化溶剂蒸发方法制备装载FITC的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征。

表9-1

FITC(5w/w)	粒径（nm）	PDI	包封率（%）
				0.0296	304.8±8.25	0.312±0.112	27.1±6.23

图32通过流程图说明根据一个实施方案，使用乳化溶剂蒸发方法制备装载FITC的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图33说明游离FITC（10μg）和FITC纳米粒子（相当于10μg）在经皮片的猪皮中6小时后的渗入。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的FITC和FITC纳米粒子分散体装载在单独的供应室中。在研究结束时，彻底洗涤皮肤以去除表面吸附的FITC并将皮肤放置在OCT流体中并在液氮中冷冻。随后使用低温切片机将皮肤切片并在荧光显微镜下观察。如从图33中可以看出的，与局限于皮肤表层（SC）的游离的FITC相比，FITC纳米粒子渗入较深的皮肤。

图34说明游离FITC（10μg）和在玉米醇溶蛋白纳米粒子中被包封的FITC（相当于10μg）在经皮片的猪皮中6小时后的渗入。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的或被包封的FITC分散体装载在供应室中。在研究结束时，彻底洗涤皮肤并使用共聚焦激光扫描显微术测量皮肤中的FITC浓度并使用不同皮肤层中的荧光像素强度定量（平均值±SE；n=3）。如图34中显示的，FITC纳米粒子在SC中的荧光强度较高。

实施例10.装载5-氟尿嘧啶(5-FU)的玉米醇溶蛋白纳米粒子.

5-氟尿嘧啶(5-FU)具有130.077的分子量和-0.89的LogP。5-FU部分溶于冷水和甲醇，完全溶于二甲基亚砜和二甲基甲酰胺，并不溶于二乙醚。

5-FU是亲水性药物（log P=-0.89）并是渗透穿过皮肤差的（Cornwell和Barry,Int J Pharm94,189-194,1993）。该药物用于治疗，例如，牛皮癣、癌变前的（光化性角化病）和恶性的（皮肤癌）皮肤病症（Tsuji和Sugai,Arch Dermatol105,208-212,1975；Goette,J Am Acad Dermatol4,633649,1981）。表10-1中显示使用乳化溶剂蒸发方法制备装载5-氟尿嘧啶的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征。

表10.1装载5-氟尿嘧啶的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征.

5-氟尿嘧啶(%w/w)	粒径（nm）	PDI	包封率（%）
				0.370	300.5±21.76	0.321±0.144	17.8±3.36

图35通过流程图说明根据一个实施方案，使用乳化溶剂蒸发方法制备装载5-氟尿嘧啶的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。

图36说明接纳介质中被应用的5-氟尿嘧啶（5-FU）的百分数。切下的经皮片的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将磷酸盐缓冲液（pH7.4）中游离的或被包封的5-FU分散体装载在供应室中。通过使用14C标记的5-FU的放射化学方法以不同的间隔测量接纳室中5-FU浓度（平均值±SE；n=3）。如从图36中可以看出的，玉米醇溶蛋白纳米粒子显著增强了5-FU的皮肤渗入。结果表明由于和卵磷脂的存在，玉米醇溶蛋白纳米粒子可用作皮肤渗入增强剂。

实施例11.玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子

已制备了新的玉米醇溶蛋白-酪蛋白核壳纳米粒子，其中疏水性的玉米醇溶蛋白形成核，而亲水性的牛奶蛋白β-酪蛋白形成亲水性的壳。还可使用其他疏水性谷醇溶蛋白诸如麦醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白代替玉米醇溶蛋白，且可使用其他酪蛋白诸如κ或γ酪蛋白或酪蛋白酸钠代替酪蛋白。该新的体系的优势包括，玉米醇溶蛋白和酪蛋白二者都是生物可降解的及生物相容的食物蛋白。酪蛋白是稳定玉米醇溶蛋白纳米粒子、防止聚集并形成较小尺寸的纳米粒子的两亲的表面活性剂。酪蛋白可有助于增加包封率并可有助于调节纳米粒子的药物释放特征。药物可被装载入疏水性的核、亲水性的壳或二者。

由于玉米醇溶蛋白和酪蛋白二者都是蛋白，它们具有用于表面修饰或核修饰的许多官能团。核和壳都可独立地被改变以用于不同的应用。例如，如本文描述的，核和/或壳可被交联。相似地，药物可络合和/或缀合至核和/或壳。

酪蛋白，作为两亲的蛋白，可与皮肤脂质相互作用以增强纳米粒子的皮肤渗入。图37示意性说明玉米醇溶蛋白-酪蛋白核壳纳米粒子的形成。图38通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用β-酪蛋白稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。表11-1说明使用相分离方法制备的、用β-酪蛋白稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的不同表征。关于玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备，使用柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）中0.05%-1.0%w/v范围的β-酪蛋白的浓度。

表11-1.用β-酪蛋白稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征

β-酪蛋白(%w/v)	粒径（nm）	PDI
			0.05	260.0	0.543
0.1	110.4	0.158
			0.15	112.6	0.170
0.2	115.2	0.143
			0.5	119.7	0.130
1.0	131.2	0.146

图39通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用β-酪蛋白稳定的装载尼罗红的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。表11-2说明使用相分离方法制备的，用β-酪蛋白稳定的装载尼罗红的玉米醇溶蛋白纳米粒子的不同表征。关于尼罗红纳米粒子的制备，尼罗红浓度从0.0066%-0.066%w/w的范围。使用β-酪蛋白的浓度为柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）中0.1%-0.2%。

表11-2.装载尼罗红的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征.

尼罗红(%w/w)	粒径（nm）	PDI	包封率（%）
				0.0066	116.3	0.150	71.6

图40说明在磷酸盐缓冲液（pH7.4）中尼罗红从玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子的体外释放。通过荧光分光光度计以559nm的激发波长和629nm的发射波长测量尼罗红的浓度（平均值±SEM；n=3）。图41说明游离的尼罗红和在玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子中包封的尼罗红的皮肤渗入。图42通过流程图说明根据一个实施方案，使用相分离方法制备用酪蛋白稳定的装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的一般步骤。表11-3说明使用相分离法制备的、用β-酪蛋白稳定的装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的不同表征。关于视黄醇纳米粒子的制备，考虑视黄醇浓度从0.006%-0.066%w/w的范围和等量的BHT浓度。使用柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）中0.1%-0.2%w/v范围的β-酪蛋白浓度。

表11-3.装载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的表征.

样品号	视黄醇(%w/w)	BHT(%w/w)	粒径（nm）	PDI	包封率（%）
						1	0.066	--	169.6	0.407	7.77
2	0.066	0.066	148.9	0.331	8.53

实施例12.在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封的视黄醇的乳膏制剂的制备

为了说明用于递送的皮肤制剂的商业开发的可行性，将商业膏基（MEDCO Labs）用于并入游离的视黄醇或在玉米醇溶蛋白纳米粒子中被包封的视黄醇。膏基包含硬脂醇（14%）、十六烷基酯蜡（3.5%）、单硬脂酸甘油酯（2%）、聚氧乙烯硬脂醚（3%）、山梨醇（10%）、棕榈酸异丙酯（2%）、对羟基苯甲酸甲酯（0.16%）、对羟基苯甲酸丙酯（0.4%）和纯化水（65%）。称重相当于0.1%w/w的视黄醇并转移至表面皿并通过几何稀释使用玻璃棒均匀混合。可使用其他制剂，包括但不限于，油-水乳膏、油包水乳膏、软膏、凝胶和类似物。将0.05μCi的³H视黄醇掺入混合物中并在乳膏中彻底混合。最后，将制备的乳膏制剂转移至玻璃小瓶并存储直到使用。

表12.1：视黄醇乳膏制剂

如从图43中可以看出的，在室温下被包封的制剂保持稳定并没有显示任何降解。另外，如从图45中可以看出的，视黄醇从纳米粒子的释放是持续的。如由图45中的数据所支持的，与游离的视黄醇相比，被包封的视黄醇在皮肤中保留了多得多的视黄醇。

如表11-2中列出的，使用处理组在SKH-1无毛小鼠中体内检测标准的对被包封的制剂的皮肤刺激。

表12-2：用于皮肤刺激研究的处理组

组	处理
		组1	对照（无处理）
组2	视黄醇乳膏
		组3	空白玉米醇溶蛋白纳米粒子乳膏
组4	视黄醇纳米粒子乳膏
		组5	十二烷基硫酸钠（SLS）乳膏

每天将视黄醇制剂（0.5g的0.1%w/v视黄醇等量物）应用至SKH-1无毛小鼠的背部持续五（5）天。在应用制剂之前，使用TEWA计（Delfin）每天测量经表皮水分丢失（TEWL）值。

图46说明包含被包封的视黄醇对游离的视黄醇的乳膏的经表皮水分丢失（TEWL）数据。TEWL的增加是皮肤刺激的量度并如图中可以看出的，在纳米粒子中被包封的视黄醇没有显示皮肤刺激并堪比阴性对照（无处理）。另一方面，游离的视黄醇乳膏显示皮肤刺激。十二烷基硫酸钠（SLS），已知的皮肤刺激剂，被用作阳性对照。

为了获得乳膏制剂的生物利用率数据，测量了SKH-1无毛小鼠中游离的和纳米粒子包封的视黄醇的体内局部生物利用率。如图47中可以看出的，纳米粒子包封的视黄醇保留在皮肤中，没有被系统性的吸收进入血液。实施例13.玉米醇溶蛋白纳米粒子的毛囊递送.

为了追踪玉米醇溶蛋白纳米粒子的皮肤转运，将荧光探针化学缀合至玉米醇溶蛋白。将2mg的异硫氰酸荧光素（FITC）、4mg的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和2.94mg的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于5ml的90%乙醇并在搅拌下孵育3小时。随后，添加玉米醇溶蛋白(50mg)并孵育3小时。随后对水透析混合物约8至10小时。最后，将分散体冷冻干燥。通过NMR波谱学确认玉米醇溶蛋白-FITC的缀合。此外，使用如图1中说明的方法制备纳米粒子。还实施了玉米醇溶蛋白-FITC缀合的纳米粒子的共聚焦研究。

将分散在100μl的PBS pH7.4中的玉米醇溶蛋白-FITC纳米粒子（相当于5μg的FITC）用于皮肤渗入研究。切下的猪皮被夹在垂直扩散池的两个室之间。将由磷酸盐缓冲液（pH7.4）组成的接纳介质维持在37℃并使用磁珠搅拌。将FITC标记的纳米粒子应用在皮肤上6小时。在研究结束时，洗涤皮肤并在共聚焦荧光显微术下观察。如图48中显示的，玉米醇溶蛋白纳米粒子主要定位在毛囊。此外，在所测量的波长下没有来自皮肤的自发荧光。这从左图看也是明显的，其中在从表面至皮肤内100μm深的条痕中观察到荧光。结果除了说明玉米醇溶蛋白纳米粒子的皮肤转运途径之外，还显示了其可被用于靶向毛囊以治疗多种毛囊疾病。这些疾病包括痤疮、脱发、皮脂溢性湿疹、毛囊炎和某些皮肤癌。考虑到视黄醇用于治疗痤疮的用途，在玉米醇溶蛋白纳米粒子中包封的视黄醇可靶向毛囊用于痤疮的有效治疗。

为了说明视黄醇的毛囊靶向性，使用了皮肤三明治模型。在三明治皮肤中（见图28），毛囊途径被夹在表皮上的SC阻断。与传统的皮肤表皮渗入研究相比，三明治皮肤模型中游离的视黄醇和纳米粒子包封的视黄醇二者被转运进入接纳室的视黄醇的量都是减少的。然而，从纳米粒子转运视黄醇的显著减少显示视黄醇微粒的显著部分被转运穿过毛囊。靶向视黄醇至毛囊中的疾病部位的毛囊靶向性是纳米粒子的额外的优势。

实施例14.玉米醇溶蛋白纳米粒子与皮肤脂质的相互作用.

为了解玉米醇溶蛋白纳米粒子与皮肤脂质的相互作用并检测其是否可作为皮肤渗入增强剂，实施了红外光谱学研究。将猪表皮固定在垂直扩散池中并于37℃用玉米醇溶蛋白纳米粒子处理24小时。在记录光谱之前，用WHATMAN滤纸吸干表皮。处理之前和之后记录了光谱。在NICOLET380ATR-FITR分光光度计（THERMO ELECTRON Corporation,Madison,WI）中以2cm^-1的分辨率将光谱记录在ZnSe上。每一个光谱为100次扫描的平均值。使用OMNIC软件分析了皮肤脂质的峰位置。

表14-1：用玉米醇溶蛋白纳米粒子处理之后皮肤脂质中的位移。

如图1中描述的制备玉米醇溶蛋白纳米粒子.

如从表14-1中可以看出的，脂质对称（2850cm^-1）峰和不对称（2920cm^-1）峰位移至较高的波数。脂质伸缩峰的位移显示与皮肤脂质的相互作用。与用缓冲液处理观察到的位移相比，该位移是显著的。这些结果显示玉米醇溶蛋白纳米粒子可作为渗入增强剂以促进皮肤渗入。不被理论束缚，渗入增强可能归因于制剂中的卵磷脂和PLURONIC表面活性剂。

实施例15.蛋白药物的包封/吸附.

关于蛋白药物的包封，修改了图1的方法（见图49）。由于第一相中的乙醇能够沉淀水溶性蛋白药物，因此用十二烷基硫酸钠代替乙醇以溶解玉米醇溶蛋白。图49和50中显示的方法被用于模型蛋白牛血清白蛋白（BSA，66kDa）和富含血小板血浆（PRP）的包封。

实施例16.富含血小板血浆（PRP）的制备.

使用新鲜的猪/绵羊血液以分离PRP。通过添加EDTA作为抗凝血剂收集血液。于20℃以2400rpm持续10min离心约10ml的血液。随后，将上清液（PRP和贫血小板血浆）收集到另外的管子中并于20℃以3600rpm持续15min离心上清液。将贫血小板血浆移出并收集管底的1ml血浆作为PRP。用自动细胞计数器通过用水稀释100倍的血浆实施血小板计数。

绵羊血液PRP计数：2.4×10⁸血小板/ml

猪血液PRP计数：2.34×10⁸血小板/ml

表16-1：包封蛋白的玉米醇溶蛋白粒子的表征.

PDI-多分散指数

使用槽式超声波发生器在1ml水中持续1分钟分散1mg的纳米粒子。用水将样品稀释100倍并使用NICOMP粒径分析仪测量粒径。

实施例17.吸附PRP至玉米醇溶蛋白纳米粒子上.

除了在第2水相中使用不同的稳定剂之外：单独使用0.1%吐温80或PLURONIC F68或酪蛋白，使用与如图1中描述相同的程序制备玉米醇溶蛋白纳米粒子。使用NICOMP粒径分析仪测量纳米粒子的粒径。

表17-1：使用不同的表面活性剂制备的玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径.

制备方法	尺寸（nm）	PDI
			纳米粒子（吐温80）	715.6	0.654
纳米粒子（PLURONIC F68+卵磷脂）	289.4	0.312
			纳米粒子（PLURONIC F68）	389.4	0.354
纳米粒子（酪蛋白）	153.4	0.239

在第二水相中使用在括号中给出的表面活性剂

将准确称量的玉米醇溶蛋白纳米粒子的量（200mg）放入小瓶中并添加0.6ml的PRP溶液和4.4ml的柠檬酸盐缓冲液（pH7.4）。随后于37℃在200rpm下将小瓶孵育2和6小时。在研究结束时，以15,000rpm持续10min离心分散体并使用血小板衍化生长因子（PDGF）特异性的ELISA试剂盒从粒状沉淀（pellet）测定吸附的PRP。

表17-2：被吸附到玉米醇溶蛋白纳米粒子上的PRP百分数作为孵育时间的函数

尽管不同的玉米醇溶蛋白纳米粒子之间的吸附能力没有显著差异，其中玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子显示最高的吸附。相似地，吸附随着孵育时间而增加但是不显著，因此2小时应该足够用于PRP吸附。

实施例18：PSA交联的ZC纳米粒子.

本研究的目的是提供基于疏水性核玉米醇溶蛋白和亲水性壳酪蛋白的壳交联的纳米粒子。聚唾液酸（PSA）是由α-2,8-连接的唾液酸单元组成的带负电荷的多糖的均聚物，具有11kDa的分子量。由于其与其他交联剂相比的生物相容性，聚唾液酸可被用于交联壳。

将EDC和NHS添加至PSA并溶解在10ml的去离子水中。于室温搅拌3min之后，添加玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子（使用如图39中公开的方法制备），并允许过夜进行反应。添加EDC以将PSA上的羧基转化为随后可与蛋白的伯胺相互作用的胺反应性（amine-reactive）NHS酯。离心溶液并冷冻干燥以制备预期交联的纳米粒子（玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米粒子）。

实施例19：PSA-玉米醇溶蛋白纳米载体.

本研究的目的是使用玉米醇溶蛋白作为核及亲水性的PSA作为壳以形成核-壳纳米载体。在这种情况下，将PSA化学缀合至玉米醇溶蛋白。使用高碘酸钠（NaIO₄）氧化PSA。将PSA和玉米醇溶蛋白混合物在黑暗中保持15min。用乙醇沉淀被氧化的PSA，随后通过离心及冷冻干燥用于进一步的使用。在存在2-甲基吡啶-硼烷作为还原催化剂时，在DMSO/水混合物中实施了醛式PSA与玉米醇溶蛋白的偶联反应。为了允许缀合反应，将混合物保持在磁力搅拌器下48小时。对水透析并冷冻干燥核-壳纳米载体。

实施例20.药物剂型

下面的制剂说明可被用于本文描述的纳米粒子制剂的治疗或美容施用的代表性的药物剂型，其可以是水分散体或冷冻干燥的粉末（在下文中被称为‘组合物X’）：

可通过药学领域众所周知的常规程序制备这些制剂。将被领会的是以上药物组合物可根据众所周知的制药技术而变化以适应不同量和类型的活性成分‘组合物X’。气雾剂制剂（vi）可与标准的、计量剂量气雾剂分配器联合起来使用。另外，特定的成分和比例是为了说明性的目的。根据感兴趣的剂型的预期特性变化，可改变成分为适合的等同物并可改变比例。

尽管参考公开的实施方案和实施例以上描述了特定的实施方案，此类实施方案仅是说明性的并不限制本发明的范围。根据本领域的普通技术可作出改变和修改，而不偏离本发明在根据所附权利要求书中所定义的本发明的较广泛的方面。

所有的出版物、专利和专利文件通过引用并入本文，如同通过引用个别并入。已参考多个特定的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应当理解的是可作出许多变化和修改同时保持在本发明的精神和范围内。

Claims (50)

1.一种纳米粒子，所述纳米粒子包含谷醇溶蛋白的蛋白、货物或货物分子、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和任选地磷脂、至少一种蛋白聚合物、至少一种多糖或至少一种合成的聚合物，其中所述纳米粒子是生物可降解的、生物相容的及非免疫原性的，且其中所述纳米粒子的直径小于约400nm。

2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述谷醇溶蛋白的蛋白包含白玉米醇溶蛋白、黄玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。

3.根据权利要求2所述的纳米粒子，其中所述货物或货物分子选自由以下组成的组：药学物质、治疗物质、美容物质、诊断剂、农业物质、免疫增强剂、生物活性剂和其组合。

4.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述货物分子是选自由以下组成的组的类视黄醇：视黄醇、13-反式-视黄酸（维甲酸）、13-顺式-视黄酸（异维甲酸）、9-顺式-视黄酸（阿利维A酸）、视黄醛、阿维A酯、阿维A、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄质和其组合，且其中所述纳米粒子还包含磷脂和泊洛沙姆非离子表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的纳米粒子，其中所述类视黄醇包含用(C₂-C₂₂)羧酸酯化的视黄醇。

6.根据权利要求5所述的纳米粒子，其中所述类视黄醇是视黄醇乙酸酯或棕榈酸视黄酯。

7.根据权利要求4所述的纳米粒子，其中所述类视黄醇包含用直链或支链(C₁-C₂₂)醇酯化的视黄酸。

8.根据权利要求4所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子中的类视黄醇是所述纳米粒子的谷醇溶蛋白的约0.01wt.%至约0.3wt.%。

9.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述货物分子为5-氟尿嘧啶。

10.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述货物是细胞、蛋白、核酸、抗体、生长因子或其组合。

11.根据权利要求10所述的纳米粒子，其中所述货物为富含血小板血浆，且其中所述货物被吸附至所述纳米粒子的表面。

12.根据权利要求10所述的纳米粒子，其中所述货物为抗体。

13.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子是交联的。

14.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子的所述谷醇溶蛋白的蛋白是PEG化的。

15.根据权利要求14所述的纳米粒子，其中所述PEG化包含用具有约3kDa至约220kDa的分子量的PEG的PEG化。

16.根据权利要求15所述的纳米粒子，其中所述PEG化包含用具有约4kDa至约20kDa的分子量的PEG的PEG化。

17.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子还包封一种或多种另外的生物活性剂、诊断剂、显像剂或其组合。

18.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子呈干的自由流动、无色或白色、非吸湿的粉末的形式。

19.根据权利要求18所述的纳米粒子，所述纳米粒子还包含类视黄醇和稀释剂、赋形剂或载体以形成药学上或美容上可接受的组合物。

20.根据权利要求19所述的纳米粒子，其中所述组合物呈分散体、气雾剂制剂、凝胶、软膏、乳膏、洗剂或洗发剂的形式。

21.根据权利要求19所述的药学或美容组合物，其中所述组合物呈局部制剂的形式。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子的多分散指数为约0.2至约0.5。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子增强所包封的类视黄醇的稳定性。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中与不存在所述纳米粒子时施用类视黄醇至哺乳动物皮肤相比，当与哺乳动物皮肤接触时所述纳米粒子凭借类视黄醇产生更大的皮肤渗入和保留。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的组合物，其中所述制剂对人皮肤的刺激比以非纳米粒子制剂被施用至人皮肤的相同量的类视黄醇少。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的组合物制备用于治疗皮肤疾病或皮肤病症的药剂的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病症包含痤疮、牛皮癣、角质化疾患、皮肤色素减退或皮肤恶性肿瘤（皮肤癌或黑色素瘤）。

28.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述治疗减少皱纹、光老化、脂肪团或愈合开放性创伤。

29.根据权利要求27或28中任一项所述的用途，其中所述组合物提供类视黄醇的延长的释放。

30.一种增强类视黄醇化学稳定性的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中包封类视黄醇，从而增强类视黄醇的化学稳定性。

31.一种增加类视黄醇储存期的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中配制类视黄醇。

32.一种增强类视黄醇水分散性的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中包封类视黄醇，从而增强类视黄醇的水溶解性。

33.一种提供类视黄醇从组合物缓释的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中包封类视黄醇，其中被包封的类视黄醇被用于制备其中所述类视黄醇经过约1小时至约14天时间段从所述纳米粒子释放的药剂。

34.一种增加类视黄醇的皮肤渗入的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中包封类视黄醇，其中被包封的类视黄醇被用于制备药剂，所述药剂与不存在所述纳米粒子时类视黄醇的皮肤渗入相比增加类视黄醇的皮肤渗入。

35.一种增强药物的肿瘤积累的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子中包封药物，其中被包封的药物被用于制备药剂，其中与不存在所述纳米粒子时的肿瘤积累相比所述药物在肿瘤中积累至更大的程度，其中所述肿瘤是皮肤癌肿瘤且所述施用是局部的。

36.一种减少不具有肿瘤的组织中药物积累的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或21-29中任一项所描述的纳米粒子中包封类视黄醇，其中被包封的类视黄醇被用于制备局部药剂，其中所述药物在不具有肿瘤的组织中积累比不存在所述纳米粒子时的程度更小。

37.一种减少类视黄醇毒性的方法，所述方法包含在如权利要求1-8或19-29中任一项所述的纳米粒子中包封类视黄醇，其中被包封的类视黄醇被用于制备与不存在所述纳米粒子时类视黄醇的毒性相比减少类视黄醇的毒性的药剂。

38.一种减少局部施用的类视黄醇的皮肤刺激等级的方法，所述方法包含包封多个如权利要求1-8或19-29中任一项所描述的纳米粒子，其中被包封的类视黄醇被用于制备与不存在所述纳米粒子时的类视黄醇相比类视黄醇的刺激等级被减少或消除的药剂。

39.一种制备纳米粒子的方法，所述方法包括：

将谷醇溶蛋白的蛋白溶解在水醇溶剂和缓冲液、有机溶剂、或阴离子表面活性剂和缓冲液中，其中所述缓冲液包含柠檬酸盐阴离子和至少一种非离子表面活性剂、至少一种磷脂、磷蛋白、至少一种多糖、磷蛋白-多糖缀合物、至少一种合成的聚合物或其组合，以形成沉淀物；

超声处理所述沉淀物；

离心剩余的水相以形成粒状沉淀；

从所述粒状沉淀形成水分散体，并任选添加冷冻保护剂；和

冷冻干燥所述分散体，

其中所得的纳米粒子具有小于约100nm至约225nm之间的粒径。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述溶解步骤包括将所述谷醇溶蛋白的蛋白溶解在水醇溶剂和包含柠檬酸盐阴离子的缓冲液中，且其中所述磷蛋白是β-酪蛋白且所述多糖是葡聚糖或阿拉伯胶。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述溶解步骤包括将所述谷醇溶蛋白的蛋白溶解在水醇溶剂和包含柠檬酸盐阴离子的缓冲液中，且其中所述磷蛋白-多糖缀合物是缀合至葡聚糖的β-酪蛋白。

42.根据权利要求39所述的方法，其中所述溶解步骤包括将所述谷醇溶蛋白的蛋白溶解在阴离子表面活性剂和包含柠檬酸盐阴离子的缓冲液中，其中所述阴离子表面活性剂选自由以下组成的组：二辛基磺化琥珀酸钠、十二烷基硫酸钠、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、N-溴化十二烷基三甲胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和其组合，且其中所述缓冲液包含非离子表面活性剂和磷脂，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、山梨醇酐酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯和其组合，且所述磷脂选自由以下组成的组：蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和其组合。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述磷脂可以用酪蛋白或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷代替。

44.根据权利要求39所述的方法，所述方法还包含在所述溶解步骤过程中包封货物或货物分子，其中所述货物分子选自由以下组成的组：治疗物质、美容物质、诊断剂、农业物质、免疫增强剂、生物活性剂和其组合。

45.根据权利要求39所述的方法，所述方法还包含将货物或货物分子吸附至所述纳米粒子的表面，其中所述货物或货物分子与所述谷醇溶蛋白的蛋白、包含柠檬酸盐阴离子的缓冲液和至少一种阴离子表面活性剂混合，其中所述缓冲液包含至少一种非离子表面活性剂和至少一种磷脂或磷蛋白，并且所述方法还包含在所述超声处理步骤之后针对水溶液透析所述纳米粒子。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述货物或货物分子是蛋白或细胞的混合物。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述货物是富含血小板血浆（PRP）。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述谷醇溶蛋白的蛋白包含黄玉米醇溶蛋白、白玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。

49.根据权利要求44所述的方法，其中所述货物分子是选自由以下组成的组的类视黄醇：视黄醇、13-反式-视黄酸（维甲酸）、13-顺式-视黄酸（异维甲酸）、9-顺式-视黄酸（阿利维A酸）、视黄醛、阿维A酯、阿维A、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄质和其组合，且其中所述纳米粒子还包含磷脂和泊洛沙姆非离子表面活性剂。

50.根据权利要求39所述的方法，其中所得纳米粒子是干的自由流动、无色或白色、非吸湿的粉末。

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