KR20140041453A - 국소적 전달을 위한 단백질 나노 캐리어 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노 입자 어셈블리 및 나노 입자를 제조하기 위한 방법 및 국소용의 또는 피부 적용에서의 용도를 위한 그러한 나노 입자를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 추가적으로 결과로서 얻어지는 본 발명의 나노 입자를 전달 디바이스로 사용하는, 상기 나노 입자에 대하여 여러 가지 분자 및 세포성 성분들을 복합체화하는 방법을 포함한다. 상기 나노 입자는, 암을 처치하는 것, 종양을 타겟팅하는 것, 생체 내에서의 약물의 독성을 감소시키는 것, 생체 내에서 복합체화된 물질의 효능을 증가시키는 것, 분해에 대항하여 복합체화된 물질을 보호하는 것, 약물의 피부 침투성 및 보유성을 증가시키는 것, 및 약물 또는 다른 물질의 수 용해도/분산성을 향상시키는 것과 같은, 다양한 적용을 위하여 사용될 수 있다.

Description

국소적 전달을 위한 단백질 나노 캐리어{PROTEIN NANOCARRIERS FOR TOPICAL DELIVERY}

본 발명은 일반적으로 약물 전달 기술에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 나노입자 약물 전달 시스템에 관한 것이며, 소수성 수 불용성 단백질을 사용하여 그러한 시스템을 제조하는 방법을 포함하고, 여기서 나노 입자는 국소적 약물 전달 시스템 (topical drug delivery system)을 제조하는 프롤아민을 포함할 수 있다.

콘 (corn) 또는 옥수수 (maize) 로부터 분리되는 식물성 단백질인, 자인(zein)은 많은 양의 비-극성 아미노산, 예를들면 프롤린, 글루타민 및 아스파라긴, 을 포함하는 프롤아민의 과 (family)에 속한다. 자인은 무색의, 비-독성이며, 생분해성이고 또한 수-불용성이며, 따라서 수많은 적용에 대하여 매력적인 성분이다.

자인은 약제학적, 의학적, 식품, 화장용, 접착제 및 패키징 산업에서의 고분자로서 조사되어져 오거나 또는 사용되어져 왔다. 식품 및 약제학적 산업에서, 자인은 예를들면, 필름-코팅 물질에 대해 및 마이크로 입자 또는 나노 입자와 같은 입자성 시스템을 형성하는데 있어서 사용되어 왔다 (미국 특허 번호 5,679,377 (번스타인 외(Bernstein et al.)), 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되는; 리우 외(Liu et al.), 바이오머티리얼즈 (Biomaterials) 26 (2005) 109-115; 로페즈 및 머단 (Lopez and Murdan), 저널 오브 마이크로엔캡슐레이션 (J Microencapsulation) 23 (2006) 303-314; 종 외(Zhong et al.), 푸드 바이오피직스 (Food Biophysics) 3 (2008) 186-190; 패리스 외 (Parris et al.), 저널 오브 푸드 케미스트리 (J Agric Food Chemistry) 53 (2005) 4788-4792).

자인 입자를 형성하는 다양한 방법들이 제안되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 번호 5,330,778 (스타크 (Stark); 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되는) 는 자인 마이크로 입자를 형성하기 위하여 pH 변화를 이용하여 자인을 사용하는 마이크로 입자를 제조하기 위한 방법을 기재하고 있다. 상기 방법은 그러나 보다 큰 마이크론 크기를 갖는 및 넓은 범위의 입자 크기 분산을 갖는 자인 입자를 생산하며, 이는 심각한 단점, 예를 들면, 생체 내에서의 사용에 대해, 을 갖는다. 인간의 또는 동물에의 적용을 위해 사용되는 바이오 물질은 안전성이며 및 비-면역성이어야 한다. 일반적으로, 입자의 생체 내로의 투여에 따라 (예를들면 신체 내로의 도입), 혈액 및 조직 내 식세포 (phagocytic cells), 이들은 외부 입자에 대한 면역적인 인식 및 제거를 책임지는 것인데, 각 입자의 물리화학적 특성에 따라 면역 반응을 개시할 수 있다. 식세포에 의한 섭취는 입자 크기 및 외부 입자의 표면 소수성 양자에 의존적이다. 직경이 약 500 nm 보다 큰 입자는 식세포 작용 (phagocytosis)을 매우 당하기 쉽다. 부가적으로, 소수성 표면을 갖는 입자는 식세포에 의해 용이하게 인식된다. 예를 들면, 로페즈 및 머단 (Lopez and Murdan) 은 직경 1.36 ±0.036 ㎛ 을 갖는 자인 마이크로 스피어 (microspheres) 는 면역성이며 또한 결과적으로, 약물, 백신 또는 다른 치료용 캐리어로서 적합하지 않다고 보고하였다 (로페즈 및 머단 (Lopez and Murdan), 저널 오브 팜 파마콜 (J Pharm Pharmacol) 58 (2006) 769-774).

따라서, 치료용 및 화장용 적용을 위해 유용한 입자를 제공하는 자인 입자를 제조하기 위한 신규한 방법이 요구된다. 또한 안전한 및 효과적인 방법으로 중요한 치료용 및 화장용 물질의 전달을 위한 새로운 치료용 캐리어가 요구되고 있으며, 이것은 피부 침투성, 보유성, 안정성, 피부 자극, 및 모낭 타겟팅과 연관된 문제점들을 극복하기 위한 것이다.

출원인들은 레티놀 및 관련된 화합물의 나노 입자성 국소적 사용을 위한 제형을 기반으로 하는 신규한 프롤아민을 개발하였다. 나노 입자는 자인, 즉 소수성 식물성 단백질로부터 유도된 단백질과 같은 프롤아민 단백질을 사용하여 개발되었다. 자인은 피부 케라틴과 유사한 특성을 가지고 있기 때문에, 그것은 국소적 제형에서 사용되는 부형제들의 피부 자극을 테스트하기 위한 모델 단백질로서 사용된다 (자인 테스트). 그것의 피부 케라틴과의 유사성으로 인하여, 자인 나노 캐리어는 예를 들면, 피부에 대한 적용을 통한, 소수성 및 친수성 화합물에 대한 탁월한 전달 운반체이다.

따라서, 본 발명은 프롤아민 단백질 및 치료용 또는 화장용 물질을 포함하는 나노 입자를 제공하며, 여기서 상기 나노 입자는 생분해성이고, 생체 적합성이며, 또한 비-면역성이고, 상기 치료용 또는 화장용 물질은 레티노이드 또는 그것의 에스테르이고, 또한 상기 나노 입자의 직경은 약 400 nm 보다 작다. 프롤아민 단백질은 자인(zein), 글리아딘(gliadin), 호르데인(hordein), 카피린(kafirin), 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 프롤아민 단백질은 백색 자인이다. 어떤 실시예에서, 상기 나노 입자는 친수성 또는 소수성 화합물을 캡슐화할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 나노 입자는 레티노이드를 캡슐화할 수 있다.

레티노이드는, 예를 들면, 레티놀(retinol), 13-트랜스-레티노산(트레티노인)(13-trans-retinoic acid (tretinoin)), 13-시스-레티노산(이소트레티노인)(13-cis-retinoic acid (isotretinoin)), 9-시스-레티노산(알리트레티노인)(9-cis-retinoic acid (alitretinoin)), 레티날데히드(retinaldehyde), 에트레트네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 알파-카로틴(α-carotene), 베타-카로틴(β-carotene), 감마-카로틴(γ-carotene), 베타-크립토산틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 제아크산틴(zeaxanthin), 또는 이들의 조합일 수 있다.

예를 들면, 레티노이드는 (C₂-C₂₂) 카르복실 산 또는 지방산으로 에스테르화된 레티놀, 예를 들면 레티닐 아세테이트 (retinyl acetate) 또는 레티닐 팔미테이트 (retinyl palmitate)를 포함할 수 있다. 상기 레티노이드는 또한 직선 체인 또는 분지된 (C₁-C₂₂) 알콜에 의해 에스테르화된 레티노산 (retinoic acid)일 수 있다.

나노 입자 내의 레티노이드는 나노 입자의 프롤아민의 약 0.01 중량% 내지 약 0.3 중량 % 일 수 있다. 나노 입자의 직경은 약 75 nm 내지 약 300 nm, 약 100 nm 내지 약 280 nm, 또는 약 180 nm 내지 약 220 nm 일 수 있다.

나노 입자의 표면은 교차 결합될 수 있고, 및/또한 나노 입자의 프롤아민 단백질은 PEG화될 수 있다. 상기 PEG화는 약 3 kDa 내지 약 220 kDa, 또는 약 4 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가지는 PEG 로 PEG 화하는 것을 포함할 수 있다.

실시예들에서, 상기 나노 입자는 다른 고분자들, 이에 제한되는 것은 아니나, 덱스트란 (dextran), β-카세인 (β-casein), 및 검 아라비카 (gum Arabica)를 포함하는, 에 대하여 복합체화 될 수 있다 (complexed).

나노 입자는 그것의 표면 상에서 하나 또는 초과의 부가적인 활성 물질들, 진단용 물질, 이미징 물질, 또는 이들의 조합을 캡슐화하거나 또는 흡수할 수 있다. 상기 활성 물질은 항산화제, 항-염증제, 항암 약물, 또는 자유-래디컬 스캐빈저 (free-radical scavenger)일 수 있다.

나노 입자를 제조할 때에 사용되는 인지질 (phospholipid)에 대한 계면활성제의 비율은 프롤아민 나노 입자의 안정성에 현저하게 영향을 끼칠 수 있고 또한 응집을 방지할 수 있다. 더우기, 인지질 및 플루로닉 (PLURONICS) 은 또한 프롤아민의 피부 침투성을 증가시키는 침투 인핸서 (penetration enhancers) 로서 작용할 수 있다. 부가적으로, 나노 입자를 제조할 때에 사용되는 BHT 또는 다른 항산화제의 농도는 나노 입자의 안정성에 현저하게 영향을 끼칠 수 있고, 또한 BHT 또는 다른 항산화제는 나노 입자의 내부에 및/또는 나노 입자 표면 상에 위치될 수 있다.

본 발명은 또한 여기 기재된 복수 개의 나노 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 건조된 자유롭게 흐르는, 무색의 또는 백색의, 비-흡습성의 파우더의 형태이다. 본 발명은 나아가 여기 기재된 복수 개의 나노 입자 및 약제학적으로 또는 화장용으로서 허용 가능한 희석제, 부형제, 또는 다른 캐리어를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 또는 화장용 조성물은 예를 들면, 분산물, 에어로졸 제형, 젤, 연고, 크림, 로션, 또는 샴푸의 형태일 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 약제학적 또는 화장용 조성물은 물 제거 가능한 제형의 형태일 수 있다.

나노 입자의 다분산 지수 (polydispersity index)는 약 0.2 내지 약 0.5 일 수 있다. 나노 입자는 캡슐화된 레티노이드 또는 다른 캡슐화된 물질의 안정성을 향상시킬 수 있다.

조성물은 나노 입자의 부재 하에서 포유류의 피부에 대한 레티노이드의 투여와 비교할 때, 포유류 피부와의 접촉에 있어서 레티노이드에 의한 더 큰 피부 침투성 및 보유성의 효과를 가져올 수 있다. 나노 입자의 제형은 비-나노 입자 제형으로서 인간 피부에 대해 투여되는 레티노이드의 동일한 양보다 인간 피부에 대해 덜 자극적일 수 있다.

본 발명은 또한 피부 질병 또는 피부 질환으로부터 고통 받고 있는 대상에 대하여 여기 기재된 나노 입자 조성물의 약제학적으로 또는 화장용으로 효과적인 양을 투여함으로써, 그에 따라 상기 질병 또는 질환을 처치하는 것을 포함하는 대상에 대해 치료용의 물질을 투여하는 방법을 제공한다. 여기 기재된 조성물에 의해 처치되는 질병 또는 질환은 여드름, 건선(psoriasis), 각질화(keratinization disorders), 피부 변색(skin discoloration), 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies) (피부 암 및 악성 흑색종(melanoma))을 포함한다. 나노 입자 조성물은 또한 상처 치료 (wound healing)를 촉진하는데 있어서, 및 주름, 셀룰라이트, 및/또는 광노화 (photoaging)의 효과를 감소시키는데 있어서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 레티노이드의 연장된 방출, 예를 들면, 하루 또는 수 일 (예를 들면, 일 주일)의 경로를 통하여, 을 제공할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 그에 따라 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시킨다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 제형화하는 것을 포함하는 레티노이드의 품질 수명 (shelf-life)를 증가시키는 방법을 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 수 용해도 (the water solubility)를 향상시키는 방법을 제공하며, 그에 따라 레티노이드의 수 분산성 (water dispersibility)을 향상시킨다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 수 분상성 (water dispersibility)을 향상시키는 방법을 제공하며, 그에 따라 레티노이드의 수 분산성 (water dispersibility)을 향상시킨다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하고 및 상기 캡슐화된 레티노이드를 포유류에 접촉시키는 것을 포함하는 조성물로부터 레티노이드의 지속되는 방출을 제공하는 방법을 제공하며, 여기서 레티노이드는 약 1 시간 내지 약 14 일의 기간에 걸쳐 나노 입자로부터 방출된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 또는 여기 기재된 조성물로 대상이나 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 그것의 필요에 의해 대상 또는 샘플에 대해 비-면역성의 및 생체 적합성의 제형으로서 레티노이드를 투여하는 방법을 제공하며, 그에 따라 대상 또는 샘플에 대해 비-면역성의 및 생체 적합성의 제형을 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하고 및 상기 나노 입자를 포함하는 조성물을 포유류의 피부에 접촉시키는 것을 포함하는 레티노이드의 피부 침투성을 증가시키는 방법을 제공하며, 이에 따라 상기 나노 입자의 부재 하에 레티노이드의 피부 침투성과 비교할 때 레티노이드의 피부 침투성을 증가시킨다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 캡슐화된 것을 포함하는 약물의 향상된 축적, 예를 들면, 피부의 종양, 을 위한 방법을 제공하며, 및 그것의 필요에 의해 대상에 대하여 복수 개의 나노 입자를 투여하는 것으로, 여기서 상기 캡슐화된 약물은 나노 입자의 부재 하에 대상에 대해 투여된 약물보다 더 큰 정도로 종양에 축적되고, 상기 종양은 피부 암 종양이고 또한 상기 투여는 국소적인 것이다. 일 실시예에서, 치료용 물질 (예를 들면, 세포, 항체, 호르몬, 단백질, 펩타이드, 성장 인자, 핵산, 및 기타 등등)은 나노 입자의 표면에 대해 흡수되거나, 복합체화 되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 나노 입자 내에 약물을 캡슐화하는 것 및 피부 암 종양을 가지고 있는 대상에 대해 복수 개의 상기 나노 입자를 투여하는 것을 포함하는 포유류 내의 비-종양 포함 조직에서의 약물 축적을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 투여는 국소적이며, 상기 캡슐화된 치료용 물질은 나노 입자의 부재 하에서 대상에 대해 투여되는 치료용 물질보다 더 적은 정도로 비-종양 포함 조직 내에 축적된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 대상에 대하여 여기 기재된 복수 개의 나노 입자를 투여하는 것을 포함하는 치료용 물질 (예를 들면, 레티노이드) 의 치료용으로서의 또는 화장용으로서의 효능을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 치료용 물질의 효능은 상기 나노 입자의 부재 하에서의 치료용 물질의 투여와 비교할 때 증가된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 대상에 대하여 여기 기재된 복수 개의 나노 입자를 투여하는 것을 포함하는 치료용 물질의 독성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 치료용 물질의 독성은 상기 나노 입자의 부재 하에 투여되는 치료용 물질의 독성과 비교할 때 감소된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 대상에 대하여 여기 기재된 복수 개의 나노 입자를 투여하는 것을 포함하는 국소적으로 적용된 레티노이드의 피부 자극 정도 (rating) 를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 레티노이드의 피부 자극 정도는 상기 나노 입자의 부재 하에서의 레티노이드의 투여와 비교할 때 감소된다.

후속되는 도면들은 명세서의 일부를 형성하며 또한 나아가 어떤 실시예들 또는 본 발명의 다양성을 개시하기 위하여 포함된 것이다. 어떤 경우에서, 본 발명의 실시예들은 여기 개시된 구체적인 상세한 설명과 결합하는 후속하는 도면들을 참조하는 것에 의해 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 후속하는 도면들은 어떤 구체적인 실시예, 또는 본 발명의 어떤 관점을 강조할 수 있지만, 단, 본 기술 분야에서 숙련된 기술자는 상기 실시예 또는 관점의 일부가 본 발명의 다른 실시예 또는 관점과 결합되는데에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 블랭크 자인 나노 입자를 형성하는 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 본 기술 분야에서의 숙련된 자에 의해 용이하게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 및 다른 도면들에서 언급된 구체적인 양은 특정한 실시예의 도시를 위한 것이며, 또한 많은 변형들이 여기 기재된 과정들에 대해 적용될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 6, 7 하이드록시 코우마린 (6,7 hydroxy coumarin) 로드된 나노 입자를 형성하는 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, pH 조절된 나노 침전 (pH controlled nanoprecipitation)을 이용하여 β-카세인 및 검 아라빅에 의해 안정화되는 자인 나노 입자의 제조를 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, β-카세인 그래프트된 덱스트란 (β-casein grafted dextran)에 의해 안정화되는 자인 나노 입자의 제조를 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 5는 자인 나노 입자의 다양한 전자 현미경 사진을 보여준다. 도 5(a)는 블랭크 자인 나노 입자의 주사 전자 현미경 사진 (scanning electron microphotograph)이다. 상기 입자들은 구형이며 또한 매끄러운 표면을 갖는 것으로 보여진다. (스케일은 1 mm =1.76 ㎛을 나타낸다).
도 5(b)는 블랭크 자인 나노 입자의 투과 전자 현미경 사진 (transmission electron microphotograph)이다. (스케일은 1 mm =8.038 nm을 나타낸다).
도 5(c)는 코우마린 로드된 자인 나노 입자의 주사 전자 현미경 사진 (scanning electron microphotograph)이다. (스케일은 1 mm =0.87 ㎛을 나타낸다).
도 5(d)는 6, 7-하이드록시 코우마린 (6,7-hydroxy coumarin) 로드된 자인 나노 입자의 투과 전자 현미경 사진 (transmission electron microphotograph)이다. (스케일은 1 mm =8.04 nm을 나타낸다).
도 6은 공기 중에서 탭핑 모드에서의 블랭크 자인 나노 입자의 원자력 현미경 (atomic force microscopy (AFM)) 이미지를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 z-스케일 14.19 nm, 22.2 V, 및 45°를 갖는 대표적인 샘플의 높이(height) (도 6(a)), 진폭(amplitude) (도 6(b)), 및 상(phase) (도 6(c)) 이미지들이다. 스캔 크기는 1.14 x 1.14 gm이다. AFM 에서 측정되는 50 입자 수 중에서의 평균 입자 크기는 185 nm이다.
도 7은 동결 건조 이전 및 이후에 있어, 본 발명의 일 실시예에 따른 코우마린 로드된 자인 나노 입자의 입자 크기에 대한 버퍼 유형의 영향을 보여주는 그래프이다. 포스페이트 버퍼의 사용과 비교할 때 침전 방법에서 시트레이트 버퍼를 사용하는 것은 동결 건조를 후속하는 더 작은 크기의 나노 입자를 지속적으로 생산하는 것이다. (* p<0.05). 그래프 상의 각각의 포인트는 평균 ±SD (n=3)을 나타낸다. 시트레이트 버퍼는 탈이온수 내의 시트르산 (0.0153 g/L) 및 소듐 시트레이트 (2.91 g/L) 으로 이루어졌다. 포스페이트 버퍼는 탈이온수 내의 이중 염기성 소듐 포스페이트 (dibasic sodium phosphate)(1.44 g/L), 및 단일 염기성 소듐 포스페이트 (monobasic sodium phosphate)(0.25 g/L) 및 소듐 클로라이드 (10 g/L) 으로 이루어졌다. 양 버퍼들은 모두 pH 7.4에서의 제 2 수성 상을 유지하기 위하여 사용되었다.
도 8은 포스페이트 버퍼화된 식염수 (pH 7.4) 내의 6, 7-하이드록시 코우마린 (6,7-hydroxy coumarin) 로드된 자인 나노 입자의 생체 외에서의 방출 프로파일을 도시한 것이다. 실시예 2에 기재된 방법에 의해 제조되는 코우마린 로드된 자인 나노 입자 (10 mg/mL) 은 투석 멤브레인 (SPECTRAPOR^TM, M.wt. 5000 Da) 내에 놓여졌고 또한 트립신 (10 mg/mL)의 부재 (비-효소적) 또는 존재 (효소적) 하의 포스페이트 버퍼 식염수 (pH 7.4) 내에서 인큐베이트되었다. 에탄올 (20% v/v) 이 싱크 컨디션 (sink conditions)을 유지하기 위해 매개에 대해 부가되었고, 또한 소듐 아지드 (sodium azide) (0.005% w/v) 가 항-박테리아제로서 사용되었다. 상기 용액은 수평의 50 rpm 에서의 쉐이커 워터 배쓰 (horizontal shaker waterbath) 내에서 37 ℃로 유지되었다. 투석물의 일 알리쿼트 (1 mL)가 다른 시간 포인트들에서 7 일 동안 제거되었고 또한 싱크 컨디션을 유지하기 위하여 신선한 매개로 대체되었다. 투석물은 형광 분광기 (spectrofluorimetry) (λ_max= 490nm; λ_cm= 520 nm)를 사용하여 자인 나노 입자로부터 방출되는 코우마린에 대해 분석되었다. 각각의 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균이다 (±SD). 모든 시간 포인트들에서 효소적 방출은 비-효소적 방출과 비교할 때 더 높다 (p<0.05).
도 9는 돼지 다형핵구 세포 (porcine polymorpho-nuclear cells)에 의한 자인 나노 입자의 섭취에 대한 입자 크기의 영향을 도시한 것이다. 도면은 자인 입자의 존재 하에서의 및 포지티브 대조군 자이모산 (zymosan) 에서 루미날 화학 발광 (luminal chemiluminescence)에 대한 커브 아래 퍼센트 영역을 보여준다 (90 분에 걸친). 각각의 실험은 네 번의 실험의 평균이다 (±SEM). 다른 그룹들과 비교할 때 섭취는 더 작은 입자에서 현저하게 낮아졌다 (p<0.05).
도 10은 각각 자인 입자의 프라이머리 및 부스터 피하로의 주사 (primary and booster subcutaneous injections) 세 번째 및 다섯 번째 주 경과 후에 측정된 항-자인 항체를 도시한 것이다 (광학 밀도). 각각의 값은 평균 ± SEM (n=4)로서 나타내어진다. 프라이머리 및 부스터 타이트레 (titres)는 식염수 그룹과 비교할 때 실질적으로 중요하지 않았다 (p>0.05). 거친 자인 현탁물 또는 식염수 내 자인 입자 (100 ㎍/ 50μL에 상당하는) 은 암컷 BALB/C 마우스에 대해 피하로 주사되었다. 혈액은 오비탈 플렉서스(orbital plexus)로부터 빼내어졌고 및 희석된 혈청 (1/16) 내에서의 항-자인 항체 레벨은 마우스 ELISA 키트를 이용하여 측정되었다.
도 11은 디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 분석법 (dimethylthiazol-2-y1-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay)을 사용하여 처치의 네 시간 후에 미토콘드리아의 탈수소 효소 (mitochondrial dehydrogenase)의 상대적인 활성으로 표현되는 돼지 창자 상피 세포 (porcine intestinal epithelial cells) (IPEC-J2 cells) (20,000 세포 수/웰 에서의) 의 세포 생존능에 대한 황색 자인 (Y) 및 백색 자인 (W)의 영향을 도시한 그래프이다. 어떠한 처치도 포함하지 않는 플레이트가 대조군으로서 사용되었고 또한 100 % 생존 가능한 것으로 간주되었다. 자인 파우더는 55 %v/v 에탄올에 용해되었고 또한 후속적인 희석이 혈청-프리 매개 내에서의 5 mg/L 스톡으로부터 수행되었다. 모든 농도에서, 황색 및 백색 양자는 어떠한 처치도 포함하지 않는 대조군으로부터 현저하게 다르지 않다 (*p<0.05). 각각의 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균 ±SEM이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 플로우 차트의 수단에 의해 교차-결합된 블랭크 자인 나노 입자의 제조를 위한 방법을 도시한 것이다.
도 13은 24 시간 동안 교차-결합하는 물질의 성능으로서 자인 나노 입자의 교차-결합의 정도를 나타내는 그래프이다. 교차-결합의 정도는 TNBS 분석법을 사용하여 결정되었다. 사용된 교차-결합 물질은: 글루타르알데히드 (Glutaraldehyde (GTA)) (500 μL 의 25% w/v 스톡 용액), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보이미드 (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide (EDC)) (0.6% w/v), 및 N-하이드록실 숙신이미드 (N-hydroxyl succinimide (NHS)) (0.6% w/v) 였다. 사용된 게니핀의 농도는 0.05 % w/v였다. "블랭크" 는 어떠한 교차-결합 물질도 포함하지 않는 자인 나노 입자를 나타낸다. 데이터는 두 번의 실험의 평균이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 플로우 차트의 수단에 의해 로다민-123 (rhodamine-123)-로드된 교차-결합된 자인 나노 입자의 제조를 위한 방법을 도시한 것이다.
도 15는 생체 외에서 시트레이트 버퍼 pH 2 내에서의 자인 나노 입자로부터 로다민-123 (rhodamine-123)의 방출 프로파일을 도시한 것이다. 결과들은 평균 ± SEM (n=4)를 나타낸다. NCS= 비-교차 결합된 입자; CS= 교차 결합된 입자. 교차-결합된 나노 입자로부터의 로다민 방출은 비 교차-결합된 나노 입자보다 현저하게 낮았다 (p>0.05). 여기에 기재된 방법에 의해 제조된 로다민-로드된 자인 나노 입자 (20 mg)은 투석 멤브레인 (SPECTRAPOR^TM, M.wt. 10,000 Da) 에 놓여졌고, 또한 시트레이트 버퍼 (pH 2) 10 mL 내에서 인큐베이트 되었다. 용액은 수평의 100 rpm 에서의 쉐이커 워터 베쓰 (horizontal shaker waterbath) 내에서 37 ℃로 유지되었다. 투석물의 일 알리쿼트 (1 mL)가 다른 시간 포인트들에서 48 시간에 걸쳐 제거되었고 또한 싱크 컨디션을 유지하기 위하여 신선한 매개로 대체되었다. 투석물은 형광 분광기 (spectrofluorimetry) (λ_max= 485nm; λ_cm= 530 nm)를 사용하여 자인 나노 입자로부터 방출되는 로다민에 대해 분석되었다. (* 는 p<0.05에서 차이가 현저하다는 것을 나타낸다).
도 16은 생체 외에서 pH 2에서 펩신 (pepsin) 의 존재 하에서의 자인 나노 입자로부터 로다민-123 (rhodamine-123)의 방출 프로파일을 도시한 것이다. 결과들은 평균 ± SEM (n=4)를 나타낸다. NCS= 비-교차 결합된 입자; CS= 교차 결합된 입자. 교차-결합된 나노 입자로부터 약물 방출은 비 교차-결합된 나노 입자보다 현저하게 낮았다 (p>0.05). 여기에 기재된 방법에 의해 제조된 로다민-로드된 자인 나노 입자 (20 mg)은 투석 멤브레인 (SPECTRAPOR^TM, M.wt. 10,000 Da) 에 놓여졌고, 또한 3.2 mg/mL의 펩신을 함유하는 시트레이트 버퍼 (pH 2) 10 mL 내에서 인큐베이트 되었다. 용액은 수평의 100 rpm 에서의 쉐이커 워터 베쓰 (horizontal shaker waterbath) 내에서 37 ℃로 유지되었다. 투석물의 일 알리쿼트 (1 mL)가 다른 시간 포인트들에서 48 시간에 걸쳐 제거되었고 또한 싱크 컨디션을 유지하기 위하여 신선한 매개로 대체되었다. 투석물은 형광 분광기 (spectrofluorimetry) (λ_max= 20 485nm; λ_cm= 530 nm)를 사용하여 자인 나노 입자로부터 방출되는 로다민-123 에 대해 분석되었다. (* 는 p<0.05에서 차이가 현저하다는 것을 나타낸다).
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플로우 차트의 수단에 의해 블랭크 PEG화된 자인 나노 입자의 제조를 위한 방법을 도시한 것이다.
도 18은 PEG화된 나노 입자의 강도 가중 크기 분포 (intensity weighted size distribution)를 도시하는 그래프이다. x-축은 nm 단위의 입자 크기를 보여주고 및 y-축은 강도에 대응한다. PEG화된 자인 나노 입자의 입자 크기는 131 ±1 nm (n=3)이고, 다분산 지수 (Polydispersity Index (PDI) )는 0.282 ±0.01 (n=3)이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 상 분리 방법 (phase separation method)을 사용하는 레티놀 로드된 자인 나노 입자를 제조하는 일반적인 과정을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 도 19, 23-26, 및 42 에서, BHT는 부틸레이트 하이드록시톨루엔 (butylated hydroxyltoluene)(2,6-디-터트-부틸-4-메틸페놀 (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol))을 의미한다.
도 20은 왼쪽에서 오른쪽으로 자유 레티놀 및 레티놀 로드된 나노 입자의 수 분산성을 도시한 것이다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 21은 생체 외에서 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 자인 나노 입자로부터 레티놀의 방출을 도시한 것이다. 레티놀 농도는 UV-비져블 광 분광기 (UV-visible spectrophotometry)를 사용하여 320 nm (평균 ±SEM; n=3) 측정되었다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 22는 왼쪽에서 오른쪽으로 자유 레티놀 및 동결 건조된 레티놀 나노 입자를 도시한 것이다. 도면은 순수한 레티놀의 흡습성 성질을 보여주며 또한 레티놀 나노 입자가 비-흡습성의 자유롭게 흐르는 파우더인 것을 보여준다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 23은 주변 광 하에 저장되어 있을 때에 레티놀 로드된 나노 입자의 고체 상태에서의 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자는 깨끗한 유리 바이엘 내에 보관되었고 또한 일 주일 동안 실내 등에 대해 노출되었다. 다른 시간 포인트들에서 잔존하는 레티놀은 UV-비져블 광 분광기 (UV-visible spectrophotometry)를 사용하여 320 nm (평균 ± SD; n=3) 측정되었다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 24는 빛의 부재 하에 저장되어 있을 때에 레티놀 로드된 나노 입자의 고체 상태에서의 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자는 깨끗한 유리 바이엘 내에 보관되었고 또한 일 주일 동안 어두운 캐비넷 안에 보관되었다. 다른 시간 포인트들에서 잔존하는 레티놀은 UV-비져블 광 분광기 (UV-visible spectrophotometry)를 사용하여 320 nm (평균 ±SD; n=3) 측정되었다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 25는 보통의 광 하에 저장되어 있을 때에 레티놀 로드된 나노 입자의 액체 상태에서의 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에 분산되어 있고 또한 일 주일 동안 깨끗한 유리 바이엘 내에 실내 등에서 저장되었다. 다른 시간 포인트들에서 잔존하는 레티놀은 UV-비져블 광 분광기 (UV-visible spectrophotometry)를 사용하여 320 nm (평균 ±SD; n=3) 측정되었다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 26은 어두운 캐비넷 내에서 빛으로부터 차단되어 저장되어 있을 때에 레티놀 로드된 나노 입자의 액체 상태에서의 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에 분산되어 있고 또한 일 주일 동안 깨끗한 유리 바이엘 내에 어두운 캐비넷 안에 저장되었다. 다른 시간 포인트들에서 잔존하는 레티놀은 UV-비져블 광 분광기 (UV-visible spectrophotometry)를 사용하여 320 nm (평균 ±SD; n=3) 측정되었다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 27은 자유 레티놀 및 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀로 처치한 후 돼지 피부 내에서 및 수용체 매개 내에서 48 시간의 종결 시점에서 적용된 레티놀의 퍼센트를 도시한 것이다. 절개된 돼지 피부는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 로 이루어졌으며 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 또는 캡슐화된 레티놀 분산물은 도너 챔버 내에 로딩되었다. 실험의 종결 시점에서, 피부 및 수용체 구획에서의 레티놀 농도가 ³H 표지된 레티놀을 사용하는 방사 화학적 방법 (radiochemical method)을 사용하여 측정되었다. 레티놀 농도를 측정하기 위하여 피부는 0.1M 소듐 하이드록사이드를 사용하여 분해되었다(평균 ±SD; n=6). 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 28은 자유 레티놀 및 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀로 처치한 후 돼지 피부 내에서 및 수용체 매개 내에서 48 시간의 종결 시점에서 적용된 레티놀의 퍼센트를 도시한 것이다. 절개된 돼지 표피 (Epi)는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 놓여졌다. 제 2의 실험 세트에서, 각질층 (stratum corneum (SC))이 돼지 표피로부터 제거되었으며 또한 다음으로 돼지 표피 위에 물리적으로 놓여졌으며(샌드위치된) (Sand) 또한 실험에 사용되었다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자는 피부 위로 적용되었고 또한 실험은 48 시간 동안 수행되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 로 이루어졌으며 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 또는 캡슐화된 레티놀 분산물은 도너 챔버 내에 로딩되었다. 실험의 종결 시점에서, 피부 및 수용체 구획에서의 레티놀 농도가 ³H 표지된 레티놀을 사용하는 방사 화학적 방법 (radiochemical method)을 사용하여 측정되었다.
도 29는 생체 외에서의 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자인 나노 입자로부터 로다민 123의 방출을 도시한 것이다. 나노 입자는 표 8-1에 기재된 방법으로 사용하여 제조되었다.
도 30은 돼지의 분절된 피부 (porcine dermatomed skin) 에서 6 시간 후에 자유 로다민 123 (10 ㎍) 및 로다민 나노 입자 (10 ㎍의 로다민 123에 상당하는)의 침투성을 도시한 것이다.
도 31은 돼지의 분절된 피부 (porcine dermatomed skin) 에서 처치 6 시간 후에 자유 로다민 123 (10 ㎍) 및 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 로다민 123 (10 ㎍의 로다민 123에 상당하는)의 형광 픽셀을 도시한 것이다. 각질층(SC) 0-20 ㎛에 대하여 및 표피 20-100 ㎛에 대하여 공초점 현미경 이미지 (confocal microscopic images)로부터 광학적 섹션이 형광 픽셀을 정량화하기 위하여 사용되었다. 나노 입자는 표 8-1에 기재된 방법으로 사용하여 제조되었다.
도 32는 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 FITC 로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다.
도 33은 6 시간 후에 돼지의 분절된 피부 (porcine dermatomed skin) 로의 자유 FITC (10 ㎍) 및 FITC 나노 입자 (10 ㎍에 상당하는)의 침투성을 도시한 것이다. 피부는 냉각 절개 (cryosectioned)되었으며 또한 형광 현미경 (fluorescence microscope) 하에서 관찰되었다.
도 34는 돼지의 분절된 피부 (porcine dermatomed skin) 에서 처치 6 시간 후에 자유 FITC (10 ㎍) 및 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 FITC (10 ㎍에 상당하는)의 형광 픽셀을 도시한 것이다. 각질층(SC) 0-20 ㎛에 대하여 및 표피 20-100 ㎛에 대하여 공초점 현미경 이미지 (confocal microscopic images)로부터의 XZ 광학적 섹션이 형광 픽셀을 정량화하기 위하여 사용되었다.
도 35는 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 5-플루오로우라실 (5- fluorouracil) 로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다.
도 36은 수용체 매개 내에서의 적용된 5-플루오로우라실 (5- fluorouracil (5 FU)) 의 퍼센트를 도시한 것이다.
도 37은 자인-카세인 코어 쉘 나노 입자의 형성을 도시한 것이다.
도 38은 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 β-카세인으로 안정화된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다.
도 39는 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 β-카세인으로 안정화된 닐 레드 로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다.
도 40은 생체 외에서의 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 자인-카세인 나노 입자로부터 닐 레드의 방출을 도시한 것이다.
도 41은 돼지의 분절된 피부 (porcine dermatomed skin) 에서 처치 6 시간 후에 자유 닐 레드 (10 ㎍) 및 자인 카세인 나노 입자 (NP) 내에 캡슐화된 닐 레드의 피부 침투성을 도시한 것이다. 피부는 공초점 레이저 스캐닝 마이크로스코피 (confocal laser scanning microscopy)에 의하여 1-100 ㎛ 깊이의 피부 내부로부터의 피부를 광학적으로 분할하는 것 (sectioning)에 의하여 분석되었다. 각질층 (0-20 ㎛) 및 활성 표피 (20-100 ㎛)에서의 형광 강도가 IMAGEJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.
도 42는 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 카세인으로 안정화된 레티놀 로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다.
도 43은 알루미늄 포일로 커버된 글래스 바이셀 내에서 한 달의 기간 동안 실온 및 40 ℃에서 저장된 레티놀 나노 입자 크림 제형의 안정성을 도시한 것이다. 정기적인 간격으로 제형의 일 알리쿼트가 제거되었으며 또한 HPLC를 레티놀 함량이 사용하여 분석되었다. 제형은 안정하게 잔존하였고 또한 실온에서 어떠한 현저한 분해도 보이지 않았다. 각각의 값은 평균 ±SD; n=3이다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 44는 생체 외에서 pH 7.4 의 크림 제형으로부터 자유 레티놀 (채워진 써클) 및 레티놀 나노 입자 (채워진 스퀘어)의 방출을 나타낸 것이다. 약 40 mg의 크림이 수직의 디퓨젼 셀 내에 놓여졌고 투석 멤브레인 (dialysis membrane) (MWCO 8000-10000 Da)이 방출 연구를 위해 사용되었으며 또한 수용체 매개는 pH 7.4 버퍼로 이루어졌다. 샘플들이 수용체 매개로부터 수집되었고 또한 ³H 레티놀을 사용하는 방사 화학적 방법 (radiochemical method)에 의하여 분석되었다. 각각의 데이터 포인트는 평균 ±SD; n=3이다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 45는 생체 외에서 인간 피부에서의 레티놀 크림 제형의 피부 침투성을 도시한 것이다. 절개된 인간의 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 로 이루어졌으며 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 나노 입자 크림 제형 내의 자유 또는 캡슐화된 레티놀은 도너 챔버 내에 로딩되었다. 제형은 6 시간 동안 적용되었고 또한 다음으로 제형이 제거되었으며 침투성 조사가 48 시간 동안 지속되었다. 실험의 종결 시점에서, 피부 및 수용체 구획에서의 레티놀 농도가 ³H 표지된 레티놀을 사용하는 방사 화학적 방법 (radiochemical method)을 사용하여 측정되었다. 레티놀 농도를 측정하기 위하여 피부는 0.1M 소듐 하이드록사이드를 사용하여 분해되었다(평균 ±SD; n=3). 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 46은 자유 및 나노 입자 캡슐화된 레티놀 제형의 적용 후에 쥐에서의 피부 수분 손실(transepidermal water loss (TEWL)) 값들을 도시한 것이다. 제형들이 5 일 동안 매일 SKH-1 헤어리스 마우스의 등에 대해 적용되었다. 경표피 수분 손실(Transepidermal Water Loss (TEWL)) 값이 TEWA 미터 (Delfin)을 사용하여 매일 제형의 적용 전에 측정되었다. TEWA에서의 증가는 피부 자극의 척도이며 또한 도면에서 보여지는 바와 같이, 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀은 어떠한 피부 자극도 보이지 않았고 네거티브 대조군 (즉, 처치 없음)에 비교될 만 하였다. 다른 한편, 자유 레티놀 크림은 피부 자극을 보였다. 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate) (SLS), 피부 자극제로서 알려져 있는, 는 포지티브 대조군으로서 사용되었다. 값들은 평균 ±SD (n=3) 이다. 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 47은 SKH-1 헤어리스 쥐에서의 6 시간 동안 처치 후 자유 및 나노 입자 캡슐화된 레티놀의 생체 내에서의 국소적 생물학적 가용능(topical bioavailability)을 도시한 것이다. 크림 제형들이 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia) 하에 마우스의 등 피부에 대해 적용되었다. 동물을 안락사시킨 후에, 피부가 스카치 테이프 (SCOTCH TAPE)를 사용하여 테이프-스트립핑되었고 각질층을 제거하였다. 피부 (각질층 및 표피/진피) 및 혈액에서의 레티놀의 양이 방사 화학적 분석법에 의한 ³H 레티놀을 사용하여 측정되었다. 보여지는 바와 같이, 나노 입자 캡슐화된 레티놀은 혈액 내로의 어떠한 시스템적인 흡수 없이 피부 내에 보유되었다. 값들은 평균 ± SD이다 (n =3). 상기 나노 입자는 도 19에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다.
도 48은 FITC 컨쥬게이트된 자인 나노 입자로의 처치 6 시간 후에 돼지 피부의 공초점 XZ 및 XYZ 이미지 (0-100 ㎛ 깊이)를 도시한 것이다. 본 도면에서 보여지는 바와 같이 (오른쪽 패널), 자인 나노 입자는 주로 헤어 모낭에 국지화되었다. 이것은 또한 피부의 표면으로부터 100 ㎛ 깊이 까지의 스트릭(streak) 에서 형광성이 관찰되는 왼쪽 패널로부터 명백하다.
도 49는 일 실시예에 따른, 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin (BSA))의 캡슐화를 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다.
도 50은 일 실시예에 따른, 흡수 혈소판 풍부 플라즈마 (platelet rich plasma (PRP)) 를 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다.

다양한 피부 과학적 질환들 및 모낭성 장애를 처치하기 위해 피부를 통과하는 레티놀의 국소적인 전달을 위한 신규한 나노 캐리어가 개발되었다. 그러한 질환들의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 여드름, 건선(psoriasis), 각질화(keratinization disorders), 피부 변색(skin discoloration), 및 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies) (피부 암 및 악성 흑색종(melanoma)) 뿐만 아니라, 상처 치료 (wound healing) 및 광노화 (photoaging) 를 포함한다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 예를 들면, 여기 기재된 나노 입자는 단백질 약물의 전달을 위해 사용될 수 있으며 또한 나노 입자는 IL-8 또는 세포 간 부착 분자 -1 mRNA (intercellular adhesion molecule-1 mRNA)에 대해 결합하는 반 감각 올리고핵산염 (anti-sense oligonucleotides)으로 유도되는 항체와 함께 사용될 수 있다. 다른 예들은 혈소판 풍부 플라즈마 (platelet rich plasma (PRP))와 같은 세포 조성물을 포함하며, 이는 조직을 선택하는 다양한 성장 인자, 및 레티노이드와 같은 작은 분자를 조정하는데 있어서 사용될 수 있다.

레티놀 (비타민 A) 및 그것의 유도체들 (레티노이드)은 표피 세포의 성장 및 분화, 시력 (vision), 면역조절 (immumomodulatory) 및 항-염증 효과(anti-inflammatory effects)를 포함하는 신체 내에서의 다양한 생물학적 기능에 관여된다 (서머(Summer), J Nutr 138:1835-1839, 2008). 특히, 레티놀 및 그것의 유도체들은 여드름, 건선, 액취증 (keratinization disorders), 피부 변색 (skin discoloration), 및 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies) (피부 암 및 악성 흑색종(melanoma))을 포함하는 다양한 피부 과학적 질환을 처치하기 위하여, 및 상처 치료 및 광노화(photoaging)에 대해 광범위하게 사용된다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 레티놀은 또한 주름을 감소시키고 및 셀룰라이트를 처치하기 위하여 화장용 제형으로 사용된다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 그러나 화장용 및 피부 과학적인 적용을 위한 레티놀의 사용은 그것의 열악한 물리화학적 특성들 및 피부 자극(irritation) 가능성에 의하여 심각하게 제한된다 (멜로 외(Melo et al.), 저널 오브 컨트롤 릴리즈(J Control Release) 138:32-39, 2009; 김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003).

레티놀

레티놀은 친유성 분자 (Log P 6.20)이며, 열악한 수 용해도 및 제한된 피부 침투성을 갖는다. 나아가, 그것은 빛 및 습기의 존재 하에 매우 불안정하다 (그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 5,851,538 (프로익스 외(Froix et al.))를 참조하라). 레티놀의 국소적 적용은 마일드 홍반(erythema) 및 각질층 벗겨짐 (stratum corneum peeling) 으로 나타나는 심각한 국지적 자극(irritation)을 유발하고, 사용자들 사이에서 비-컴플라이언스(non-compliance )를 유도한다 (김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003). 출원인들은 국소적 적용을 위하여 레티놀을 신규한 단백질 기반의 나노 캐리어 내로 캡슐화하는 것에 의해 레티놀의 상기 전달 문제를 성공적으로 해결하였다.

신규한 나노 캐리어가 여기 기재된 바와 같이 옥수수 단백질 자인으로부터 개발되었다. 자인은 피부 케라틴에 대하여 소수성을 나타내며 (데오 외 (Deo et al.), 랑뮈어 (Langmuir) 19:5083-5088, 2003) 또한 따라서 피부 적용에 대하여 유망한 캐리어이다. 자인이 소수성이기 때문에, 그것은 여기 기재된 바와 같이 나노 입자 내부에 소수성의 레티노이드를 캡슐화하는데 있어서 사용될 수 있고, 또한 자인은 레티노이드의 물 제거 가능한 제형을 제공하기 위하여 소수성 레티노이드를 캡슐화하는데 있어 사용될 수 있다.

나노 입자는 다양한 국소적 적용을 위한 레티놀 제형의 선택에 있어서 유연성을 제공한다. 출원인들은 76-100 %의 캡슐화 효율을 가지고 약 100 nm 내지 약 300 nm 의 크기 범위를 갖는 레티놀 로드된 자인 나노 입자를 제조하였다. 레티놀 로드된 나노 입자는 79-91 %의 캡슐화 효율을 가지고 180-220 nm 의 크기 범위를 갖는다. 나노 캐리어 내로의 레티놀의 캡슐화는 수 분산성 제형의 결과를 가져왔다.

자인 나노 입자는 습기 및 빛이 유발하는 분해에 대하여 레티놀의 고체 상태 및 액체 상태에서의 안정성을 현저하게 향상시켰다. 레티놀 방출은 자인 나노 입자로부터 최대 일 주일 지속되었다. 자인은 피부 케라틴과 유사한 특성을 갖는 생분해 가능한 US-FDA 승인된 단백질 고분자로서 또한 따라서 이것은 피부 적합성 나노 캐리어이다. 나노 입자는 또한 자유 레티놀 수성 분산물과 비교할 때 레티놀의 피부 침투성을 향상시켰다. 자인 나노 입자는 화장용의 및 피부 과학적인 적용을 위하여 피부 층 내에 레티놀을 보유시키는 데에 사용될 수 있다.

나노 캐리어의 독특한 점은 레티놀의 국소적 전달을 위한 복합적인 시장의(market) 도전을 해소하는 나노 입자의 능력이다. 이러한 도전은 1) 레티놀의 수 용해성 및 수 분산 가능한 제형, 2) 빛 및 습기가 유발하는 분해에 대항하는 레티놀의 향상된 안정성, 3) 레티놀의 자유롭게 흐르는, 무색 및 비-흡습성(non-hygroscopic) 파우더, 4) 레티놀의 서방성 제형, 5) 레티놀의 더 높은 피부 침투성 및 더 높은 피부 침투성, 및 6) 레티놀의 비-자극성 제형을 제공하는 것을 포함한다.

레티놀 수 분산성은 나노 입자 내에서의 캡슐화 후에 현저하게 증가된다. 상기 레티놀 방출은 자인 나노 입자로부터 지속될 수 있으며 이는 더 낮은 용량 및 적용에 있어서 감소된 주기를 유도한다. 자인 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀 제형의 품질 수명(shelf-life)을 현저하게 증가시킨다. 자인 나노 입자는 고체 및 세미-고체 제형에서의 레티놀의 흐름성 및 분산성을 증가시킨다. 레티놀이 흡습성의 스티키(sticky)한 파우더이기 때문에, 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀과 관련된 어려운 핸들링 및 프로세싱 문제점들을 해소할 수 있다.

각질층 (stratum corneum (SC))은 피부의 최상층이며 반면 피부의 더 깊숙한 층들은 활성 표피 (viable epidermis) 및 진피 (dermis)를 포함한다. 자인 나노 입자는 화장용 및 피부 과학적인 적용을 위한 피부 층에서의 레티놀의 피부 침투성및 보유성을 향상시킬 수 있다.

자인 나노 입자는 화장용 및 피부 과학적 적용에 대하여 피부의 층에서의 레티놀의 피부 침투 및 보유력을 향상시킬 수 있다. 자인 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀의 황색을 덮는다. 이것은 레티놀 제형의 심미적 어필(appeal)을 향상시키고 또한 황색의 스테이닝(staining)을 방지한다. 동결 건조된 자인 나노 입자는 젤, 크림, 로션 및 연고와 같은 다양한 국소적 제형 매트릭스 내로 용이하게 혼입될 수 있다.

피부 침투에 대한 연구는 많은 중요한 관점에서 인간의 피부와 유사한 절개된 돼지 피부에 의해 수행되었다 (시몬 및 마이바흐 (Simon and Maibach), 스킨 파마콜 어플라이 피지올 (Skin Pharmacol Appl Physiol) 13:229-234, 2000). 쥐에서의 생체 내 연구는 나아가 나노 입자의 레티놀 피부 자극을 감소 시키는 능력을 보여준다. 현재의 상업적인 제형을 대신하여 나노 입자를 사용하는 것의 장점들은 하기를 포함한다:

1. 용해도.

레티놀은 수 불용성 소수성 화합물이다. 자인 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 수 분산성이다. 따라서 나노 입자는 국소적 적용을 위한 수 세척 가능한 레티놀 제형을 개발하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로 수 세척 가능한 제형은 화장용 및 피부 과학적 적용을 위하여 선호된다.

2. 안정성.

레티놀은 습기 및 빛의 존재 하에 매우 불안정하다. 이것은 레티놀 제형의 품질 수명 및 적용의 기간 동안 제형의 효능을 제한한다. 자인 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀 제형의 안정성 및 품질 수명을 현저하게 향상시킬 수 ㅇ있다.

3. 서방성.

레티놀 방출은 자인 나노 입자로부터 지속될 수 있다. 방출은 최대 일주일동안 지속될 수 있다. 이것은 레티놀의 적용의 용량 및 주기를 감소시킨다.

4. 피부 침투성 및 보유성.

레티놀은 열악한 피부 침투 특성을 갖는다. 나노 입자는 향상된 레티놀의 피부 침투성을 유도한다. 레티놀은 다양한 피부 과학적인/화장용으로서의 적용을 위하여 나노 입자를 사용하여 피부의 층들에 보유될 수 있다.

5. 화장품 용으로서의 적용.

레티놀 로드된 나노 입자는 항-노화, 항-주름, 및 셀룰라이트의 처치와 같은 화장용으로서의 적용을 위해 사용될 수 있다.

6. 피부 과학적인 적용.

레티놀 로드된 나노 입자는 건선, 여드름, 상처 치료 및 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies), 예를 들면 피부 암 및 악성 흑색종(melanoma)와 같은 다양한 피부 과학적 질환에 대하여 사용될 수 있다.

7. 효과적이고 안전한 제형.

레티놀 로드된 나노 입자의 사용은 더욱 효과적인 처치의 결과를 가져온다. 나아가, 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀에 의해 유발되는 피부 자극을 현저하게 감소시킬 수 있다. 레티놀의 피부 자극은 레티놀의 화장용으로서 및 피부 과학적인 적용에 대한 비-컴플라이언스(non-compliance)에서의 주요한 문제점이다.

8. 다른 레티노이드의 캡슐화를 위한 플랫폼 기술.

레티놀, 레티노산(retinoic acid), 및 그들의 유도체 (지방산 에스테르와 같은)를 포함하는 다양한 레티노이드가, 화장용 및 피부 과학적 적용을 위하여 프롤아민 나노 입자 내로 캡슐화될 수 있다. 캡슐화를 위해 적합한 다양한 레티노이드의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 레티놀, 레티노산 (예를들면 13-트랜스-레티노산(13-trans-retinoic acid) 및/또는 13-시스-레티노산(13-cis-retinoic acid)), 레틴알데히드(retinaldehyde), 트레티노인(tretinoin), 이소트레티노인 (isotretinoin), 에트레네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 레티닐 아세테니트 (retinyl acetate), 레티닐 팔미테니트(retinyl palmitate), 및 α-카로틴(α-carotene), β-카로틴(β-carotene), γ-카로틴(γ-carotene), β-크립토잔틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 및 제아크산틴(zeaxanthin)과 같은 카로테노이드(carotenoids)를 포함한다.

9. 병용 치료법.

레티놀 나노 입자는 다른 약물과 함께 다른 제품, 예를 들면 썬 크림, 항-건선(anti-psoriatic), 항-여드름 및 피부-암 제품 내로 혼입될 수 있다. 레티놀은 캡슐화되기 때문에 그것은 다른 물질과의 상호 작용을 방지할 수 있다. 다른 물질, 예를 들면 항-산화, 자유-래디컬 스캐빈져(free-radical scavengers), 항-염증 약물이 또한 나노 입자 내로 레티놀과 함께 캡슐화될 수 있다. 그러한 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 비타민 E 및 그것의 유도체, 예를 들면 토코페릴 아세테이트 (tocopheryl acetate), 비타민 C 및 그것의 유도체, 예를 들면 아스코빌 팔미테이트 (ascorbyl palmitate), 그린 티 추출물 (green tree extract), 알로에 베라 (aloe vera), 코엔자임 Q10 (Coenzyme Q10), 하이드로퀴놀린 (hydroquinone), 하이알루론산 (hyaluronic acid), 소듐 하이알루로네이트 (sodium hyaluronate), 바이사볼올 (bisabolol), 글리코산 (glycolic acid), 락트산 (lactic acid), 베타 하이드록시부타논 산 (beta hydroxybutanoic acid), 살리실산 (salicylic acid), 10-하이드록시 데카논산 (10-hydroxy decanoic acid), 페럴산 (ferulic acid), 판테테놀 (pantethenol), 비오틱 (biotic), 아르부틴 (arbutin), 퀘르세틴 (quercetin), 헤스페리딘 (hesperidin), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

정의

여기서 사용된 바와 같은, 언급된 용어들은 하기의 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 모든 다른 용어들 및 구절들은 본 기술 분야의 숙련된 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 그러한 통상적인 의미는 기술적 사전, 홀리스 컨덴스드 케미컬 딕셔너리 14th 에디션(Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition), R.J. 루이스에 의함(R.J. Lewis), 존 윌리 & 손스(John Wiley & Sons), 뉴욕(New York), N.Y., 2001과 같은, 을 참조함으로써 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 "하나의 실시예(one embodiment)", "일 실시예(an embodiment)", 등의 의미는 기재된 실시예가 특정한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성을 포함할 수 있음을 의미하고, 그러나 모든 실시예가 반드시 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성을 포함하는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 더우기, 그러한 구절들은, 반드시 그러한 것은 아니나, 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 동일한 실시예를 의미할 수 있다. 나아가, 특정한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성이 실시예와 연관되어 기재되었을 때에, 분명하게 기재되어 있든 아니든 간에, 그러한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성이 다른 실시예들에 영향을 끼치거나 또는 연관시키는 것은 본 기술 분야에서 숙련된 자의 지식 범위 내이다.

용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "가지는(having)", "함유하는(containing)", "에 의해 특징지어지는(by characterized)", 및 문법적으로 이들과 동등한 것들은, 부가적인, 비언급된 요소들 또는 방법 과정들을 배제하지 않는 포함적인 또는 개방형-종결 용어이며, 한편 또한 더욱 제한적인 용어들 "구성되는(consisting of) 및 "필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 을 포함한다.

단수의 형태 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 본문에서 분명하게 다르게 기재하기 않는 한 복수의 의미를 포함한다. 따라서, 예를들면, "하나의 화합물(a compound)"(즉, 약물)에 대한 의미는 복수 개의 그러한 화합물들을 포함하고, 따라서 화합물 X는 복수 개의 화합물 X를 포함한다. 부가적인 예들로서, "하나의 나노 입자 (a nanoparticle)"에 대한 의미는 복수 개의 그러한 나노 입자들을 포함할 수 있고, 또한 "분자(molecule)"에 대한 의미는 복수 개의 분자들 및 그의 등가물들에 대한 의미일 수 있다. 나아가 청구항들은 어떠한 선택적인 요소를 배제하기 위하여 드래프트될 수 있음에 주목한다. 이에 따라, 이러한 선언은 청구항 요소들의 언급 및 "네거티브적인" 제한의 사용과 연관되어, "단지 (solely)", "단지 (only)", 및 이와 같은 것과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 사건적 기반으로서 기여하도록 의도된다.

용어 "및/또는 (and/or)"은 그 아이템들의 어떤 하나, 그 아이템들의 어떤 조합, 또는 이러한 용어가 연관되어 있는 아이템들의 모두를 의미한다. 구절 "하나 또는 초과의(one or more)"는 본 기술 분야에서 숙련된 기술자에 의해, 특히 그것사용되는 본문에서 읽힐 때에 충분히 이해된다. 예를들면, 페닐 링에 대한 하나 또는 초과의 치환체는, 예를들면 페닐 링이 이중 치환된다면 하나 내지 다섯 개의, 또는 하나 내지 네 개를 의미한다.

용어 "약 (about)" 또는 "대략적으로 (approximately)"는 언급된 숫자 또는 양에 합리적으로 근접한, 또는 그보다 약간 많거나 또는 적은 것을 의미한다. 따라서, 용어 "약 (about)"은 구체적인 값의 ±5%, ±10%, ±20%, 또는 ±25% 의 다양한 것을 의미할 수 있다. 예를들면, "약 50 (about 50)" 퍼센트는 어떤 실시예들에서 45 부터 55 퍼센트까지의 다양성을 의미할 수 있다. 정수의 범위에 대하여, 용어 "약(about)" 은 언급된 정수보다 크거나 및/또는 작은 하나 또는 두 개의 정수들을 포함할 수 있다. 여기에서 다르게 기재되지 않는 한, 용어 "약(about)" 은 개별적인 구성, 조성, 또는 실시예의 기능성에 관한 용어에서 등가적인 언급된 범위에 근접하는 값들, 즉 무게 퍼센트들, 을 포함하도록 의도될 수 있다. 부가적으로, 여기에서 다르게 기재되지 않는 한, 언급된 범위 (예컨데, 무게 퍼센트들 또는 탄소 그룹들)는 그 범위 내의 각각의 구체적인 값 또는 성분을 포함한다.

숙련된 기술자들에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건들, 및 이와 같은 것을 표현하는 것들을 포함하는, 모든 숫자들은 근접한 것이고 또한 용어 "약(about)" 에 의해 모든 예들 내에서 선택적으로 변형될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 값들은 여기에서의 기재들의 가르침을 이용하여 본 기술 분야의 숙련된 자들에 의해 획득되는 것이 요구되는 바람직한 특성들에 따라 변화할 수 있다. 또한 그러한 값들은 고유하게 그들의 대표적인 테스팅 측정들에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 도출되는 가변성을 포함한다는 것 또한 이해된다.

본 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 이해되는 바와 같이, 어떤 및 모든 목적을 위하여, 특히 기재된 기술을 제공하는 점에 있어서, 여기 언급된 모든 범위들은 또한 어떤 및 모든 가능한 하위 범위들 및 그들의 하위 범위들의 조합들 및 그 범위를 구성하는 개별적인 값들, 특히 정수 값들을 포함한다. 언급된 범위 (예컨데, 무게 퍼센트들 또는 카본 그룹들) 는 그 범위 내에서의 각각의 구체적인 값, 정수, 소수점, 또는 성분을 포함한다. 리스트된 어떤 범위는 적어도 동일한 이분의 일, 삼분의 일, 사분의 일, 오분의 일, 또는 십분의 일로 쪼개지는 동일한 범위를 충분히 기재하는 것 또는 가능한 것으로서 용이하게 이해될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 여기 기재된 각각의 범위는 하부의 삼분의 일, 중간의 삼분의 일, 상부의 삼분의 일 등으로 용이하게 나뉘어질 수 있다.

본 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 또한 이해될 것과 같이, "최대(up to)", "적어도(at least)", "보다 큰(greater than)", "보다 적은(less than)", "보다 많은(more than)", "또는 초과의(or more)" 및 기타 등등과 같은 모든 언어는 언급된 숫자를 포함하며, 또한 그러한 용어들은 앞서 논의된 바와 같이 하위 범위들로 후속적으로 나누어질 수 있는 범위들을 의미한다. 동일한 방법으로, 여기에서 언급된 모든 비율들은 또한 더 넓은 비율 내로 떨어지는 모든 하위 비율들을 포함한다. 따라서, 래디컬들, 치환체들, 및 범위들에 대하여 언급된 구체적인 값들은 단지 예시를 위한 것이고; 그들은 래디컬들 및 치환체들에 대해 정의된 범위들 내의 다른 정의된 값들 또는 다른 값들을 배제하지 않는다.

본 기술 분야에서 숙련된 자는 또한 구성원들이 보통의 방법, 예를들면 마쿠쉬 그룹(Markush group), 으로 함께 그룹화되었을 때에, 본 발명은 전체적으로 리스트화된 모든 그룹 뿐만 아니라, 그 그룹의 각각의 구성원을 개별적으로 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹들을 포함한다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 부가적으로, 모든 목적을 위하여, 본 발명은 주요 그룹 뿐만 아니라, 그 그룹 구성원들의 하나 또는 초과가 결여된 주요 그룹을 포함한다. 본 발명은 따라서 언급된 그룹의 어떤 하나 또는 초과의 구성원들의 명백한 배제를 예상한다. 따라서, 단서들이 개시된 카테고리들 또는 실시예들의 어떤 것에 대하여 적용될 수 있으며 그에 의해 언급된 요소들, 종류들, 또는 실시예들의 하나 또는 초과의 어떤 것이, 예를들면, 명백한 네거티브적인 제한에서 사용되는 바와 같이, 그러한 카테고리 또는 실시예로부터 배제될 수 있다.

용어 "자인(zein)"은 프롤아민 단백질 류(class)의 구성원을 의미한다. 프롤아민은 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 및 수수와 같은 다양한 곡식들, 및 다른 식물들 및 동물들 내에서 발견된다. 프롤아민의 다른 예들은 글리아딘, 호르데인 및 카피린을 포함한다. 이러한 프롤아민은 여기 기재된 다양한 실시예에서 자인을 대신하여 교체될 수 있다. 자인은 높은 비율의 비-극성 아미노산, 예를 들면 프롤린, 글루타민 및 아스파라긴, 을 포함하며, 또한 약 22-27 kDa의 분자량을 갖고(슐카(Shukla), 자인: 옥수수로부터의 산업적 단백질(Zein: the industrial protein from corn). Ind. Crops. Prod. 13, 171-92 ; 2001), 또한 분자량을 변화시키는 것을 포함하는 세 개의 구분된 단백질의 혼합물일 수 있다. 자인의 전형적인 샘플은 대략적으로 20 % 류신, 10 % 프롤린, 21-26 % 글루타민, 5 % 아스파라긴, 및 10 % 알라닌을 포함하며, 이에 따라 적어도 약 61 %의 그것의 아미노산 조성이 소수성 아미노산이다. 이러한 소수성 아미노산들은 단백질에 수 불용성을 부여한다. 자인은 생분해성 US-FDA 승인된 GRAS 고분자(Fed. Register (1985) 50:8997-8999)이다.

자인은 옥수수 글루텐 밀(meal) 로부터 파우더로서 제조될 수 있다. 순수한 자인은 그것에 가공된 식품들 및 제약들을 위한 중요한 성분을 부여하는 특성인, 무취의, 무미의, 수-불용성의, 또한 식용 가능한 것이다. 자인을 분리하고, 처리하고, 및 사용하는 방법들은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를들면 로톤(Lawton), 시리얼 켐(Cereal Chem) 2002, 79(1): 1-18, 및 WO 2009/137112 (퍼루말 외(Perumal et al.))를 참조하라, 이들은 참조로서 여기 포함된다. 자인의 "등급(grade)"은, 그 내용이 참조로서 여기 포함되는 미국 특허 번호 5,254,673(쿡 외(Cook et al.))에 개시된 바와 같이, 다양한 수단들에 의해 유도되는, 백색 자인 및 황색 자인을 포함하는, 자인의 유형 및 형태의 다양성을 의미한다.

용어 "생체 적합성(biocompatible)"은 고분자 또는 언급된 컨쥬게이트가 대상에 대하여 생체 내로 투여되었을 때에 현저한 부정적인 영향을 유발하거나 또는 가져오지 않음을 의미한다. 가능한 부정적인 효과들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 과도한 염증성 및/또는 과도한 또는 부정적인 면역 반응성, 및 독성을 포함한다. 자인 및 폴리에틸렌 글리콜은 생체 적합성 성분들이다.

용어 "나노 입자 (nanoparticle)"은 적어도 하나의 크기 (one dimension) 내에서 100 nm 보다 크지 않은 입자를 의미하는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 의해 형성되는 나노 입자는 여기 정의된 바와 같은 구체적인 값의 직경을 가질 것이다. 나아가, 용어 "나노 입자 (nanoparticle)"의 사용은 또한 일반적으로 블랭크 나노 입자 및 분자로 로드된 또한 본 발명의 방법에 의해 형성된 나노 입자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 다르게 정의되지 않는 한 (예를 들면, 도 11), "블랭크 나노 입자"은 선택된 입자, 그 나노 입자과 함께 형성되거나 또는 컨쥬게이트를 이루는 분자 또는 물질을 포함하지 않는 나노 입자를 의미한다.

용어 "직경 (diameter)"은 나노 입자 크기에 대해서 사용될 때에 그 입자의 무게 중심을 관통하는 라인(선)에 대하여 입자의 선형적인 크기를 의미하는 것으로 이해된다. 비-구형의 입자의 직경에 대해서는 허용 가능한 근접 값이 주어질 것이며, 예를 들면, 그 입자의 가장 큰 크기로 정렬된 축들 중의 하나와 함께, 코디네이트 시스템의 세 개의 수직하는 축들을 따르는 입자 두께의 평균을 취하는 것이다.

용어 "하이드로알콜성 용매(hydroalcoholic solvent)"는 물 및 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, 또는 부탄올(1-부탄올, 2-부탄올 (sec-부탄올), iso-부탄올, 및 tert-부탄올을 포함하는)과 같은, 알콜성 용매 양자를 포함하는 용매 시스템을 의미한다. 통상의 하이드로알콜성 용매 시스템은 물 속에 50%, 70%, 90%, 및 92% 에탄올을 포함한다.

용어 "접촉하는 (contacting)"은 세포적 또는 분자적 수준을 포함하여, 터치하는 것, 접촉을 이루는 것, 또는 즉각적인 또는 가깝게 근접함을 가져오는 동작을 의미하며, 예를 들면, 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화, 예를 들면, 용액 내에서, 반응 혼합물 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서, 를 가져오는 것이다.

용어 "생체 내 (in vivo)" 는 대상의 몸, 예를 들면 환자의 그것과 같은, 에 대하여 또는 그 내부에서를 의미하며 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 투여에 있어서 경구로의의(oral), 구강으로의(buccal), 정맥으로의(intravenous), 종양 내부로의 (intratumorally), 종양 주변으로의 (peritumorally), 복강 내의 (intraperitoneal), 비경구의(parenteral), 피하로의(subcutaneous), 국소적으로의(topical), 눈으로의(ocular), 폐로의(pulmonary) 및 코로의(nasal) 경로들을 포함하는 다양한 수단에 의한 나노 입자의 투여를 포함한다.

용어 "생체 외(in vitro)" 는 대상 또는 환자의 몸의 외부의 환경을 의미한다.

용어 "인 시츄 (in situ)"는 고유의 위치; 다른 위치로 움직여지거나 이동된 것이 아닌 것을 의미한다.

용어 "연관되는 것 (associating)"은 본 개시의 나노 입자에 대한 카고 또는 카고 분자의 복합체화를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 입자의 표면 또는 내부 영역에 대한 컨쥬게이션 (공유 결합적인 또는 비-공유 결합적인), 흡착, 및 캡슐화를 포함한다.

용어 "복합체화 (complexing)", 그것의 문법적인 다양성을 포함하는, 는 본 개시의 나노 입자과 함께 다양한 세포적 또는 분자적 성분들의 결합을 의미한다.

용어 "투여된(administered)" 또는 "투여(administration)"는 나노 입자에 대하여 치료학적으로 및 진단상 용도로서의 문맥 내에서 사용될 때에, 예를 들면 타겟화된 사이트에 대하여 치료용 물질을 전달하는 목적을 위하여 선택된 양의 나노 입자의 생체 내에서의 또는 생체 외에서의 환경으로의 도입을 의미하고 또한 포함한다.

"유효량(effective amount)"은 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하기 위해, 또는 언급된 효과를 가져오기 위해 유효량을 의미한다. 예로서, 유효량은 처치되는 질환 또는 증상의 전개 또는 심각성을 감소시키기 위해 유효량일 수 있다. 치료학적으로 유효량의 정의는 본 기술 분야에서 숙련된 자들의 능력 범위 내에서 잘 알려져 있다. 용어 "유효량(effective amount)"은 예를 들면 호스트 내에서, 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 또는 질병 또는 장애의 증상을 치료하기 위해 효과적인, 블랭크 또는 여기 기재된 약물 로드된 나노 캐리어 (즉, 나노 입자)의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "유효량"은 일반적으로 바람직한 효과를 제공하는 양을 의미한다.

용어 "처치하는(treating)", "처치하다(treat)" 및 "처치(treatment)"는 (i) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환이 발생하는 것을 예방하는 것(예를들면, 질병예방(prophylaxis)); (ii) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환을 저해시키는 것 또는 그것의 발전을 억누르는 것; (iii) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환을 완화시키는 것; 및/또는 (iv) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환과 관련된 증상들을 없애는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "처치하다(treat)", "처치(treatment)", 및 "처치하는(treating)"은 질병예방(prophylaxis)에 대하여 확대될 수 있고 또한 처치되는 질환 또는 증상들의 발전 또는 심각성을 예방하는 것, 예방, 예방하는, 낮추는, 중지시키는 또는 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 이에 따라, 용어 "처치(treatment)"는 의학적, 치료학적 투여 양자를, 및/또는 적합하다면 예방적(prophylactic) 투여를 포함할 수 있다.

용어 "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 양자 모두 개별적인 복합체적 기관, 예를들면, 인간 또는 비인간적 동물을 의미한다.

용어 "저해하다(inhibit)", "저해하는(inhibiting)", 및 "저해(inhibition)"는 질병, 감염, 질환, 또는 세포 그룹의 성장 또는 발전을 늦추는 것, 중단시키는 것, 또는 역전시키는 것을 의미한다. 저해는 예를들면, 처치 또는 접촉의 부재 하에서 발생하는 성장 또는 발전과 비교할 때 약 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%보다 클 수 있다.

용어 "치료용 물질(therapeutic agent)", 및 치료학적 또는 의학적인 기능을 의미하는 유사한 용어들은 언급된 분자, 거대분자, 약물 또는 다른 물질이 대상 내에서의 질병 또는 질환의 개시, 경로 및/또는 하나 또는 초과의 증상들에 대하여 긍정적으로 영향을 끼칠 수 있는 것 및 질병 또는 다른 질환을 처치하기 위한 의약(medicaments)의 제조에서 나노 입자과의 컨쥬게이션에 사용될 수 있는 것을 의미한다. 여기 기재된 나노 입자 내로의 캡슐화 또는 그것 상에서의 흡수를 위한 적합한 치료용 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 레티노이드, 예를 들면 레티놀 및 그것의 에스테르, 및 레티놀의 유도체, 예를 들면 레티노산 및 레티날, 작은 분자들, 항체들, 핵산, 단백질, 호르몬, 수용체, 리간드, 세포 (예를 들면, 혈소판 풍부 플라즈마 (platelet rich plasma (PRP)), 성장 인자, 세포 추출물, 및 기타 등등과 같은 소수성 치료용 물질을 포함한다.

용어 "치료용 물질(therapeutic agent)", 및 치료학적 또는 의학적인 기능을 의미하는 유사한 용어들은 언급된 분자, 거대분자, 약물 또는 다른 물질이 대상 내에서의 질병 또는 질환의 개시, 경로 및/또는 하나 또는 초과의 증상들에 대하여 긍정적으로 영향을 끼칠 수 있는 것 및 질병 또는 다른 질환을 처치하기 위한 의약(medicaments)의 제조에서 나노 입자과의 컨쥬게이션에 사용될 수 있는 것을 의미한다.

레티놀 (C₂₀H₃₀O; 286.45 g/몰) 은 중요한 생물학적 활성을 갖는 디터페노이드 알콜 (diterpenoid alcohol)이다. 레티놀은 61-63 ℃의 녹는 점, 3100 유닛/mg의 활성, 및 6.2의 Log P를 갖는다. 레티놀은 실질적으로 물 속에서 불용성이고, 에탄올에서 용해성 또는 부분적으로 용해성이며, 또한 클로로포름, 에테르 및 석유 스피릿(petroleum spirits)과 함께 혼합된다(miscible). 레티놀은 광노화, 여드름, 상처 치료, 기미 건선(melasma psoriasis), 피부 암, 악색 흑색종 (melanoma) 및 다른 피부 질환들을 포함하는 다양한 피부 질환들에 대하여 사용되는 코스메슈티컬(cosmecutical)/치료용 물질이다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 레티놀은 열악한 수 용해성 및 열악한 광 안정성을 갖는다 (멜로 외(Melo et al.), 저널 오브 컨트롤 릴리즈(J Control Release) 138:32-39, 2009 ; 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 5,851,538 (프로익스 외(Froix et al.)). 이에 더하여, 그것은 또한 피부 자극을 유발한다 (김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003).

나노 입자 및 제조를 위한 방법

본 발명은 프롤아민과 같은 소수성 수 불용성 단백질, 예를 들면 자인, 으로부터 형성될 수 있는 나노 입자를 제공한다. 상기 나노 입자는 더 큰 크기의 나노 입자 또는 마이크로 입자의 사용에서 경험되는, 예를 들면 소수성 수-불용성 단백질로부터 형성되는 것들을 포함하는, 면역성이 결여된 나노 입자 제형을 제공하는데 있어서 사용될 수 있다. 나노 입자의 비-면역성의 효과는 입자의 크기 뿐만 아니라 입자 크기의 범위를 조절하는 것에 의해 달성될 수 있다.

도 1은 일 실시예에 따른, 비-면역성 나노 입자를 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 사용된 구체적인 양은 예시를 위해 사용되었고, 또한 본 기술 분야에서 숙련자 자에 의해 충분히 인식될 것인 바와 같이, 많은 변형들이 여기 기재된 과정들에 대하여 적용될 수 있다. 상기 방법의 개시적 단계 또는 상태에서, 수-불용성 단백질 (0.4 내지 1.25 % w/v)이 하이드로알콜성 용매 (예를 들면, 에탄올 및 탈이온수의 조합) 내에 용해된다. 상기 용매의 조성물은, 예를 들면, 알콜 대 물 90 %: 10 % v/v 또는 92 % :8 % v/v일 수 있다. 선택된 분자가 나노 입자 내에 캡슐화되는 방법에 대하여, 캡슐화되는 분자 (0.03 내지 0.3% w/v) 가 이러한 제 1 수성 상의 용액에 대하여 첨가된다. 캡슐화되는 분자는 대략적으로 단백질 고분자의 50 % w/w 일 수 있다.

상기 용액의 pH는 예를 들면, 0.01 N NaOH 또는 0.01 N HC1의 첨가에 의하여 약 pH 6 및 약 pH 7 사이로 용액의 pH를 가져오기 위하여 조정될 수 있다. 상기 물 pH가 산성의 분자, 예를 들면 레티노산의 첨가 후에 변한다면, 또는 염기성 분자에 의하여, pH는 pH 6-7로 재조정될 수 있다. 제 1 상의 용액은 예를 들면 프로브 초음파 처리에 의하여, 처리될 수 있으며, 단백질의 용해를 돕는다.

상기 방법에 대한 후속적인 과정에서, 개시적 단계 또는 상의 수성 용액이 버퍼링 물질에 대하여, 선택적으로 초음파 전단 (ultrasonic shear) 하에, 첨가될 수 있다. 시트레이트 버퍼는 적합한 버퍼이다. 제 2 의 수성 상을 위해 사용되는 버퍼링 물질의 선택은, 나노 입자 형성 기간 동안에 pH를 유지하는 것을 위하여 및 본 개시 내에서 나중에 기재될 것인 바와 같이, 형성된 나노 입자의 후속적인 동결 건조를 위하여 중요하다. 아무런 버퍼도 사용되지 않는다면, 또는 예를 들면 0.1 N HCl이 제 2 수성 상 용액의 pH를 조정하는데 있어서 사용된다면, 제조되는 입자는 시트레이트 버퍼를 사용하여 제조되는 것들보다 더 커지는 경향이 있고, 또한 그러한 입자는 더 넓은 범위의 크기 범위를 나타낼 것이다. 시트레이트 버퍼의 사용은 이른 바 가장 작은 입자 직경 크기, 예를 들면 대략적으로 100 nm 를 생산한다. 다른 버퍼의 사용은 대략적으로 100 nm 내지 대략적으로 300 nm의 동일한 또는 유사한 직경 크기 범위를 갖는 입자를 생산할 것이며, 그러나 동결 건조의 단계 후에, 다른 버퍼링 물질을 사용하여 형성된 나노 입자의 평균 크기는 2 내지 3 배로 증가되는 것으로 알려져 있다.

상기 제 2 수성 상 용액의 pH는 바람직한 크기의 나노 입자를 수득하기 위하여 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.4 사이로 조정될 수 있다. 상기 pH가 이러한 범위 밖의 것이라면, 입자 크기는 더 커질 것이고, 또한 제조되는 입자의 다분산 지수 (PDI)는 더 높아질 것이다. 상기 PDI는 다른 크기 범위 내에서의 입자의 분포에 대한 측정이다. 상기 방법은 따라서 대략적으로 6.8 내지 대략적으로 7.4의 선택된 pH를 갖는 하이드로알콜성 용매 및 수성 용액 내에서의 자인과 같은 단백질의 용해도 차이를 이용할 수 있으며, 자인의 등전점 (isoelectric point) (즉, pI 5 내지 9)으로 근접한다.

상기 제 2 수성 상 용액에 대한 버퍼링 물질의 첨가는 높은 초음파 전단 하에 또는 높은 압력의 균질화 하에서, 또는 양자 초음파 전단 및 높은 압력의 균질화의 조합으로 수행될 수 있다. 초음파 에너지 및 초음파 전단의 지속은 바람직한 직경 크기 범위를 갖는 입자의 형성에 있어 특히 중요한 것일 수 있다. 초음파 전단의 에너지는 예를 들면, 0.6 kW/h 부터 1.39 kW/h 까지의, 5 부터 10 초 까지의 온-타임 및 1 부터 5 초 까지의 오프-타임을 갖는 펄스를 가지고 대략적으로 2 내지 10 분의 지속 시간 동안 수행될 수 있다. 초음파 처리를 하는 것은 바람직한범위를 갖는 입자의 제조에 있어 중요할 것이다. 높은 압력의 균질화를 사용할 때에, 상기 프로세스는 0.1 mm 및 0.25 mm 사이의 오리피스 (orifice) 크기를 사용하고, 5000 부터 40,000 psi의 압력에서 5 내지 10 분 사이의 시간의 기간 동안 수행될 수 있다.

제 2 상의 버퍼링 물질은 또한 바람직하게 계면활성제 및 인지질을 선택된 비율로 포함할 수 있다. 인지질에 대한 계면활성제의 비율은 대략적으로 2:1% w/w일 수 있고, 이것은 매우 적합한 결과물을 제조한다. 상기 비율은 또한 1:0.5% w/w 또는 1:1% w/w 또는 1:2% w/w일 수 있다. 중요하게도, 계면활성제 및 인지질의 조합은 제조되는 입자를 안정화시키고 또한 그 입자의 응집을 예방하는 것을 돕는데 있어서 바람직하다.

상기 계면활성제는 예를 들면 PLURONIC®F68와 같은 폴록사머 (poloxamer)일 수 있고, 또한 인지질은 레시틴 (lecithin)일 수 있다. 상기 방법에서 사용될 수 있는 다른 계면활성제는 폴록사머 (PLURONIC®), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (polyoxyethylene alkyl ethers) (Brij)), 소르비탄 에테르 (sorbitan esters (Span)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 패티 애시드 에테르 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (Tween))와 같은 다른 비이온성 계면활성제, 및 소듐 디옥틸 설포숙시네이트 (sodium dioctyl sulfosuccinate), 소듐 라우릴 설페이트 (sodium lauryl sulfate), 벤즈알코니움 클로라이드 (benzalkonium chloride), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (cetyl trimethyl ammonium bromide), N-도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 (N-dodecyl trimethyl ammonium bromide)와 같은 이온성 계면활성제, 및/또는 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)과 같은 고분자를 포함한다. 상기 방법에서 사용될 수 있는 다른 인지질은 비-이온성의 및 하전된 지질 또는 인지질로서, 예를 들면 에그 레시틴 (egg lecithin), 소이 레시틴 (soy lecithin), 포스파티딜 클로린 (phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine), 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄 프로판 (1,2-dioleoy1-3-trimethyl ammonium propane), 카세인 (casein), 또는 이들의 조합을 포함한다.

선택된 범위 내에서의 폴록사머 및 레시틴의 조합 (예를 들면, 0.9% w/w:0.45% w/w)은 약 100 nm 내지 약 300 nm의 바람직한 직경 크기 범위를 갖는 나노 입자를 제조하는 것으로 밝혀졌다. 계면활성제 또는 인지질 중 어느 하나의 단독 사용은 일반적으로 상기 바람직한 크기 범위 밖의 더 큰 입자 크기의 결과를 가져오는 것으로 알려졌다. 그러나, 여기 기재된 방법에 따르면 계면활성제 또는 인지질 중 어느 것의 사용도 비-면역성을 위한 바람직한 크기의 나노 입자의 결과를 가져올 수 있다.

실시예에서, 자인 나노 입자는 카세인 및 검 아라비카 (gum Arabica)에 의하여 안정화될 수 있다. 다른 실시예에서, 자인 나노 입자는 자인-덱스트란 나노 입자를 제조하기 위하여 DMSO를 사용하여 덱스트란과 복합체화 될 수 있다.

상기 제 2 상의 용액에 대하여 초음파 전단 또는/또는 높은 압력의 균질화의 적용 후에, 그 혼합물은 에탄올 또는 다른 용매를 증발시키기 위하여 교반될 수 있고 나노 입자를 형성한다. 일 실시예에서, 상기 교반하는 것은 예를 들면 기계적 스터러에 의해, 대략적으로 300 rpm 부터 대략적으로 500 rpm의 속도로 실온 (-23 ℃)에서 대략적으로 1 내지 6 시간 동안, 또는 몇 시간 수행될 수 있다.

나노 입자는 그런 다음 어떠한 잔여 물질로부터 나노 입자를 분리하는 목적을 위하여 원심 분리적 여과 하에 놓여질 수 있다. 원심 분리는 5 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 원심 분리 필터 (또는 5 kDa 보다 더 높은 또는 더 낮은 분자량 컷-오프를 갖는 다른 적합한 필터)를 사용하여, 캡슐화되는 분자 또는 약물에 따라, 또는 PEG화와 같은 나노 입자의 특정한 처리에 따라 2 kDa 및 40 kDa의 사이에서 수행될 수 있다. 원심 분리의 시간은 예를 들면 약 20 부터 약 50 분으로 달라질 수 있다. 저온 보호 물질 (cryoprotectant)이 다음으로 상기 나노 입자에 대하여 더해질 수 있다. 예를 들면, 2% w/v의 트레할로스 (trehalose)가 저온 보호 물질로서 첨가될 수 있다. 슈거, 글루코스, 수크로스, 락토스, 피콜 (ficoll), 베타인 (betaine), 또는 만니톨 (mannitol) 이나 소르비톨(sorbitol)과 같은 포올 (poyols)과 같은 다른 저온- (cryo-) 또는 동결- 건조 보호제 (lyo-protectants)가 또한 사용될 수 있다. 나노 입자는 고체 케이크를 형성하기 위하여 예를 들면 -80 ℃에서 유지될 수 있으며, 이것은 다음으로 나노 입자를 동결 상태에서 높은 진공 하에서 건조시키는 것에 의하는 것과 같이 동결 건조될 수 있다. 본 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 충분히 인식될 것인 바와 같이, 초음파 처리 에너지의 지속, 계면활성제의 유형, 계면활성제의 농도, 및 버퍼는 바람직한 변수에 따라 달라질 수 있다.

따라서, 여기 기재된 나노 입자의 입자 직경 크기의 범위는 대략적으로 400 nm 보다 작을 수 있거나, 또는 대략적을 300 nm 보다 작을 수 있다. 어떤 실시예에서, 입자 직경 크기의 범위는 대략적으로 100 nm 내지 대략적으로 300 nm, 또는 대략적으로 75 nm 내지 대략적으로 300 nm이다. 크기가 직경의 단위로 논의된 반면, 나노 입자는, 나노 입자의 구형의 모양이 달성될 수 있고 또한 어떤 실시예의 전형적인 것일 수 있음에도 불구하고, 형태에 있어서 반드시 완벽하게 구형일 필요는 없다. 크기는 예를 들면 대향하는 사이드로부터 입자를 가로지르는 가장 큰 크기, 또는 대향하는 사이드로부터 입자를 가로지르는 가장 큰 크기 및 대향하는 사이드로부터 입자를 가로지르는 가장 작은 크기의 평균과 같이 입자의 대향하는 사이드들 사이에서 측정될 수 있다.

상기 나노 입자를 위해 사용되는 수-불용성 소수성 단백질은 식물, 동물 및 합성의 소스를 포함하는 다양한 소스로부터 유도될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 단백질은 프롤아민의 과(family)로부터 일 수 있으며, 이것은 높은 양의 소수성 아미노산, 예를 들면 프롤린, 글루타민 및 아스파라긴을 포함하는 것이다. 이러한 소수성 아미노산은 상기 단백질에 대하여 수-불용성을 부여한다. 프롤아민은 다양한 곡식들, 예를 들면 콘, 밀, 보리, 쌀, 수수 및 다른 식물들 및 동물 소스로부터 발견될 수 있다. 적합한 프롤아민에 대한 어떤 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 자인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린을 포함한다.

어떤 실시예에서, 백색 자인, 예를 들면 약 100 nm 내지 약 400 nm의 직경을갖는 것들, 이 적합한 나노 입자를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 황색 자인은 상대적으로 큰 직경 크기를 갖는 입자를 제조할 수 있고, 또한 더 넓은 범위의 입자 직경 크기 분산를 갖는 입자를 제조할 수 있다. 황색 자인에서의 피그먼트가 황색 자인의 용해성 및 황색 자인을 사용하는 나노 입자의 형성에 영향을 미칠 수 있다.

일반적으로, 그렇지 않을 경우 가능한 것보다 더 작은 직경 크기 및 더 좁은 직경 크기 범위를 갖는 나노 입자를 제조하는 방법이 여기 기재된다. 이러한 더 작은 나노 입자는 하나 또는 초과의 특정한 그레이드의 염기성 단백질, 예를 들면 자인과 같은, 을 사용하는 pH-조절된 나노 침전 프로세스를 시행하거나, 및 상기 나노 입자에 대하여 비-면역성을 부여하는 나노 입자 크기 및 직경을 달성하기 위하여 선택되는 버퍼, 계면활성제, 및 인지질의 다양한 조합을 이용하는 것에 의해 제조될 수 있다.

나노 입자는 광범위한 다양성을 갖는 "카고 (cargo)" 또는 "카고 분자 (cargo molecules)"와 함께 제조될 수 있다. 예를 들면, 다양한 물리 화학적 특성을 갖는 입자 (particles) 또는 물질 (agents)이 단백질 나노 입자의 제조에서 부가될 수 있고, 나노 입자에 의해 캡슐화되거나, 흡착되거나, 복합체화되거나 및/또는 컨쥬게이트화된 물질을 제공한다. 상기 입자들은 작은 친수성 분자들, 작은 소수성 분자들, 및/또는 거대 분자들을 트랩할 수 있다. 대략적으로 60 % 내지 대략적으로 80 % 또는 초과의 캡슐화 효율이 달성될 수 있다. 상기 나노 입자는 캡슐화된 분자의 1 내지 7일, 또는 1 내지 2 주일, 생체 외 또는 생체 내 환경에서 지속되는 전달을 제공할 수 있다. 어떤 실시예들에서 (예를 들면, 단백질/항체 및 기타 등등), 카고는 나노 입자의 표면에 대하여 흡착되거나/복합체화되거나/컨쥬게이트화될 수 있다.

실시예들에서, 카고 또는 카고 분자들은 약제학적인 물질들이다. 캡슐화되는 카고 또는 카고 분자, 복합체화되거나 또는 컨쥬게이트화되는 카고 분자 또는 흡착되는 카고 분자로서 본 발명의 나노 입자과 함께 사용되기에 적합한 그러한 물질들은, 나노 입자의 물리적인 집합 (integrity)에 상당한 정도로 충격을 주는 일 없이 그 나노 입자과 함께 결합될 수 있는 진단용으로 또는 대상의 치료학적인 처치용으로서의 생체 내에서의 또는 생체 외에서의 사용을 위한 어떠한 물질을 포함하며, 예를 들면: 항생제 (antibiotics), 진통제 (analgesics), 혈압 상승제 (hypertensives), 강심제 (cardiotonics), 아세트아미노펜 (acetaminophen), 아시클로비아 (acyclovir), 알케란 (alkeran), 아미카신 (amikacin), 암피실린 (ampicillin), 아스피린 (aspirin), 비스안트레인 (bisantrene), 블레오마이신 (bleomycin), 네오카디오스타틴 (neocardiostatin), 클로로암부실 (chloroambucil), 하이드록시코우마린 (hydroxycoumarin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 사이타라빈 (cytarabine), 다우노마이신 (daunomycin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 플루오로우라실 (fluorouracil), 탁솔 (taxol), 겜시타빈 (gemcitabine), 겐타마이신 (gentamycin), 이부프로펜 (ibuprofen), 카나마이신 (kanamycin), 메프로바메이트 (meprobamate), 메토트레세이트 (methotrexate), 노반트론(novantrone), 나이스타틴 (nystatin), 온코빈 (oncovin), 페노바비탈 (phenobarbital), 폴리믹신 (polymyxin), 프로부톨 (probucol), 프로카르바비진 (procarbabizine), 리프암핀 (rifampin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 스펙티노마이신 (spectinomycin), 심메트렐 (symmetrel), 디오구아닌 (thioguanine), 토브라마이신 (tobramycin), 트리메토프림 (trimethoprim), 및 발반을 (valbanl)과 같은 스테로이드제 (steroids) 및 기타 등등과 같은 약물; 디프테리아 독소 (diphtheria toxin), 겔로닌 (gelonin), 엑소톡신 A (exotoxin A), 아브린 (abrin), 모데신 (modeccin), 리신 (ricin), 또는 그들의 유독성 파편들 (toxic fragments)과 같은 독소; 알칼리 (alkali) 및 알카라인-어쓰 메탈 (alkaline-earth metals)과 같은 메탈 이온; 악티나이드 (actinides) 또는 란타나이드 (lanthanides) 또는 다른 유사한 전이 원소로부터 또는 ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁸²Rb, ⁸⁹Sr, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁹⁹mTc, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴⁰Ba, ¹⁴⁰La, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ⁵⁹Gd, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁴Ir, 및 ¹⁹⁹Au과 같은 다른 원소들로부터 제조되는 것들과 같은 방사성 핵종 (radionuclides); 그것의 존재로 인하여 검출 가능한 및 측정 가능한 시스템의 교란의 결과를 가져오는 어떤 것을 포함하는 신호 발생제 (signal generators)로서, 예를 들면 형광 물질 (fluorescing entities), 인광 물질 (phosphorescence entities) 및 방사성 물질 (radiation); 상자성 물질 (paramagnetic entities)과 같은 신호 반사제 (signal reflectors), 예를 들면, Fe, Gd, 또는 Mn; 상기 주어진 메탈 중 어느 것과 같은 킬레이트화되는 메탈 (chelated metal), 킬런트 (chelant)와 결합되었을 때에 그들이 방사능 활성이든 아니든 상관없이; 근 적외선 (near infared), 대조제 (contrast agents) (예를 들면 이미징 물질 (imaging agents) 및 MRI 물질 (MRI agents)) 및 전자 빔 오파시피어 (electron beam opacifiers), 예를 들면, Fe, Gd 또는 Mn와 같은 신호 흡수제 (signal absorbers); 모노클로날 (monoclonal) 또는 폴리클로날 (polyclonal) 항체 및 항-요오드 타입 항체 (anti-idiotype antibodies)를 포함하는 항체 (antibodies); 항체 파편 (antibody fragments); 압타머 (aptamers); 호르몬 (hormones); 인터루킨 (interleukins), 인터페론 (interferons), 바이러스 (viruses) 및 바이러스성 프레그먼트 (viral fragments)와 같은 생물적 반응 조절자 (biological response modifiers); 진단용 오파시피어 (diagnostic opacifiers); 및 형광성 조각들 (fluorescent moieties)이다. 카고 분자는 킬런트 (chelants)와 같은 스캐빈저 물질 (scavenging agents), 항원, 항체, 압타머 (aptamers), 또는 치료용의 또는 진단용 물질을 선택적으로 청소할 수 있는 (scavenging) 어떤 파편들을 포함한다.

다른 실시예에서, 카고 또는 카고 분자는 농업적 물질이다. 여기 기재된 바와 같은 나노 입자과 함께 사용에 적합한 그러한 물질은 나노 입자의 물리적인 집합 (integrity)에 상당한 정도로 충격을 주는 일 없이 그 나노 입자과 함께 결합될 수 있는 (캡슐화되는, 복합체화되거나 또는 흡착될 수 있는) 식물 또는 비-포유류 (미생물을 포함하는) 에 대하여 생체 내에서의 또는 생체 외에서의 처치, 진단, 또는 적용을 위한 어떤 물질을 포함한다. 예를 들면: 그러한 카고 분자는 디프테리아 독소 (diphtheria toxin), 겔로닌 (gelonin), 엑소톡신 A (exotoxin A), 아브린 (abrin), 모데신 (modeccin), 리신 (ricin), 또는 그들의 유독성 파편들 (toxic fragments)과 같은 독소; 알칼리 (alkali) 및 알카라인-어쓰 메탈 (alkaline-earth metals)과 같은 메탈 이온; 악티나이드 (actinides) 또는 란타나이드 (lanthanides) 또는 다른 유사한 전이 원소로부터 또는 ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁸²Rb, ⁸⁹Sr, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁹⁹mTc, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴⁰Ba, ¹⁴⁰La, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ⁵⁹Gd, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁴Ir, 및 ¹⁹⁹Au과 같은 다른 원소들로부터 제조되는 것들과 같은 방사성 핵종 (radionuclides); 그것의 존재로 인하여 검출 가능한 및 측정 가능한 시스템의 교란의 결과를 가져오는 어떤 것을 포함하는 신호 발생제 (signal generators)로서, 예를 들면 형광 물질 (fluorescing entities), 인광 물질 (phosphorescence entities) 및 방사성 물질 (radiation); 상자성 물질 (paramagnetic entities)과 같은 신호 반사제 (signal reflectors), 예를 들면, Fe, Gd, 또는 Mn; 대조제 (contrast agents) 및 전자 빔 오파시피어 (electron beam opacifiers), 예를 들면 Fe, Gd, 또는 Mn과 같은 신호 흡수제 (signal absorbers); 호르몬 (hormones); 깁베릴린스 (gibberellins), 사이토카인 (cytokinins), 옥신 (auxins), 에틸렌 (ethylene), 아브시스 산 (abscisic acid), 바이러스 및 바이러스성 파편 (viruses and viral fragments), 플라스미드 (plasmids), 플라스티드 (plastids)와 같은 생물적 반응 조절자 (biological response modifiers); 항균 물질 (antimicrobials), 살조제 (algicides), 아리셀메틱스 (arithelmetics), 살비제 (acaricides), 살충제 (insecticides), 유인제 (attractants), 리펠런드 (repellants), 제초제 (herbicides) 및/또는 항곰팡이제 (fungicides), 예를 들면 아세페이트 (acephate), 아시플루오펜 (acifluorfen), 알라클로어 (alachlor), 아트라진 (atrazine), 베노밀 (benomyl), 벤타존 (bentazon), 캡탄 (captan), 카르보퓨란 (carbofuran), 클로로피크린 (chloropicrin), 클로로피리포스 (chlorpyrifos), 글로어술포론 (chlorsulfuron), 시아나진 (cyanazine), 시헥사틴 (cyhexatin), 사이페르미트린 (cypermithrin), 2,4- 디클로로페녹시아세트산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 달라폰 (dalapon), 디캄바 (dicamba), 디클로폽메틸 (diclofop methyl), 디플루벤주론 (diflubenzuron), 디노셉 (dinoseb), 엔도탈 (endothall), 페르밤 (ferbam), 플루아지폽 (fluazifop), 글리포세이트 (glyphosate), 할록시폽 (haloxyfop), 말라티온 (malathion), 나프탈람 (naptalam); 펜디메탈린 (pendimethalin), 페르메트린 (permethrin), 피클로람 (picloram), 프로파클로어 (propachlor), 프로판일 (propanil), 세톡시딘 (sethoxydin), 테메포스 (temephos), 테르부포스 (terbufos), 트리플루랄린 (trifluralin), 트리포린 (triforine), 지넵 (zineb)을 포함하는 살충제 (pesticides), 및 기타 등등일 수 있다. 카고 또는 카고 분자는 킬런트 (chelants), 킬레이트화되는 메탈 (그들이 방사능 활성이든 아니든 상관없이) 와 같은 스캐빈저 물질 (scavenging agents) 또는 농업적 물질을 선택적으로 청소할 수 있는 (scavenging) 어떤 파편들을 포함한다.

다른 실시예에서, 카고 또는 카고 분자는 면역-가능성 있는 물질 (immuno-potentiating agents)이다. 기재된 바와 같은 나노 입자과 함께 사용하기에 적합한 그러한 물질은 나노 입자의 물리적인 집합 (integrity)에 상당한 정도로 충격을 주는 일 없이 상기 나노 입자과 결합될 수 있는(즉, 캡슐화되거나, 컨쥬게이트되거나 또는 흡착될 수 있는) 면역-반응을 일으킬 수 있는 어떤 항원, 햅텐, 유기적 조각 또는 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 예를 들면, 운반된 물질은 말라리아 (그것의 전체로서 참조에 의해 여기에 포함되는, 미국 특허 번호 4,735,799), 콜레라 (그것의 전체로서 참조에 의해 여기에 포함되는, 미국 특허 번호 4,751,064) 및 요로 감염증 (urinary tract infections) (그것의 전체로서 참조에 의해 여기에 포함되는, 미국 특허 번호 4,740,585) 에 대한 백신의 생산을 위해 사용되는 합성의 펩타이드, 항균성 백신을 생산하기 위한 박테리아성 폴리사카라이드 (그것의 전체로서 참조에 의해 여기에 포함되는, 미국 특허 번호 4,695,624) 및 AIDS 및 간염 (hepatitis)과 같은 질병의 예방을 위한 항바이러스성 백신의 생상을 위한 바이러스성 단백질 또는 바이러스성 입자일 수 있다.

이러한 나노 입자의 면역-가능성 있는 물질에 대한 캐리어로서의 사용은 아쥬반트 캐리어에 대해 거대 분자 구조를 제공하기 위해 사용되는 통상적으로 알려져 있는 고전적인 고분자 구조물 또는 합성의 고분자 컨쥬게이트와 관련된 효능 및 구조에서의 불분명함이라는 단점을 제거한다. 이러한 나노 입자의 면역-가능성 있는 물질에 대한 캐리어로서의 사용은, 컨쥬게이트의 크기, 형태 및 표면 조성의 컨트롤을 허용한다. 이러한 선택 사항은 유기체에 대한 항원 제시 (presentaion)의 최적화를 허용하며, 따라서 통상적인 아쥬반트의 사용의 경우보다 훨씬 높은 선택성이 있는 및 훨씬 높은 친화도를 갖는 항체의 결과를 가져온다. 또한 T-세포 및 B-세포 에피토프 (epitopes) 양자의 부착과 같은, 다중성 항원성 펩타이드 또는 그룹을 나노 입자에 대해 연결시키는 것이 바람직할 것이다. 그러한 디자인은 진보된 백신의 결과를 가져올 것이다.

또한 카르바메이트 (carbamate), 트리아진 또는 유기포스페이트 구성물 (organophosphate constituents)을 함유하는 것들과 같은, 면역 반응을 일으킬 수 있는 살충제 또는 오염원 (pollutants)을 나노 입자에 대하여 컨쥬게이트시키는 것이 바람직할 것이다. 바람직한 살충제 또는 오염원에 대하여 제조되는 항체는 표준화된 프로세스에 의해 정제될 수 있고, 적합한 서포트 상에서 고정될 수 있으며 또한 환경에서의 또는 유기체에서의 살충제 또는 오염원의 후속적인 검출을 위하여 사용될 수 있다.

실시예에서, 카고 또는 카고 분자는 나노 입자의 물리적인 집합 (integrity)에 상당한 정도로 충격을 주는 일 없이 상기 나노 입자과 결합될 수 있는 농업적 또는 약제학적 물질 이외의 어떤 물질을 포함하며, 예를 들면: 알칼리 (alkali) 및 알카라인-어쓰 메탈 (alkaline-earth metals)과 같은 메탈 이온; 그것의 존재로 인하여 검출 가능한 및 측정 가능한 시스템의 교란의 결과를 가져오는 어떤 것을 포함하는 신호 발생제 (signal generators)로서, 예를 들면 형광 물질 (fluorescing entities), 인광 물질 (phosphorescence entities), 적외선, 근 적외선, 및 방사성 물질 (radiation); 상자성 물질 (paramagnetic entities)과 같은 신호 반사제 (signal reflectors), 예를 들면, Fe, Gd, 또는 Mn; 대조제 (contrast agents) 및 전자 빔 오파시피어 (electron beam opacifiers), 예를 들면, Fe, Gd 또는 Mn와 같은 신호 흡수제 (signal absorbers); 페로몬 조각 (pheromone moieties); 방향제 조각 (fragrance moieties); 염료 조각 (dye moieties); 및 기타 등등이다. 카고 분자는 킬런트 (chelants) 와 같은 스캐빈저 물질 (scavenging agents) 또는 다양한 물질들을 선택적으로 청소할 수 있는 (scavenging) 어떤 파편들을 포함한다.

카고 또는 카고 분자는 생물적 활성 물질 (bioactive agents)일 수 있다. 여기서 사용되는 바와 같이, "생물적 활성 (bioactive)"은 세포 (예를 들면, 줄기 세포, 혈소판 풍부 플라즈마, 줄기 세포 또는 세포 배양물을 위한 미세 환경/스캐폴드 (scaffold)를 포함하는), 분자, 원자, 이온 및/또는 단백질, 당 단백질, 지질 단백질, 지질, 수용체, 타겟화된 질병 사이트 또는 타겟화된 세포, 타겟화된 기관, 타겟화된 유기체 [예를 들면, 미생물, 식물 또는 동물 (인간과 같은 포유류를 포함하는)] 또는 다른 타겟화된 조각과 같은 타겟화된 성분을 검출하는 것, 파악하는 것, 저해하는 것, 처치하는 것, 촉매화하는 것, 조절하는 것, 죽이는 것, 증진시키는 것 또는 변형시키는 것이 가능한 다른 성분과 같은 활성 성분을 의미한다. 또한 생물적 활성 물질로서 포함되는 것은 유전자 치료, siRNA, 진단, 분석, 변형, 활성화, 안티-센스 (anti-sense), 사일런실 (silencing), 트레이트 (trait) 및 시퀀스 진단의 분야, 기타 등등에서 광범위하게 적용 가능한 유전 물질 (올리고뉴클레오티드, 프레그먼트(fragments), 또는 합성의 시퀀스이든 어떤 종류의) 이다. 이러한 카고 분자들은 나노 입자과 유전 물질의 복합체를 포함하는 및 트랜스펙트되는 (transfected) 세포에 대해 적용 가능한 이러한 복합체를 만드는 유전 물질의 세포 트랜스펙션 (cell transfection) 및 생체 적합성에 영향을 미치는 것을 포함한다.

이러한 나노 입자는 다양한 생체 내(in vivo), 생체 외 (ex vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서의 진단적 또는 치료학적 적용에서 사용될 수 있다. 어떤 예들은 암, 자가면역 질환 (autoimmune disease), 유전적 결함 (genetic defects), 중앙 신경 시스템 장애 (central nervous system disorders), 감염성 질병 (infectious diseases) 및 심장 장애 (cardiac disorders)와 같은 질병의 처치, 방사선 면역 분석법 (radioimmunossays), 전자 현미경 (electron microscopy), PCR, 효소 관련된 면역흡착제 분석법 (enzyme linked immunoadsorbent assays), 핵자기 공명스펙트로스코피 (nuclear magnetic resonance spectroscopy), 대조 이미징 (contrast imaging), 이뮤노사인토그래피 (immunoscintography)와 같은 진단적 용도, 및 제초제 (herbicides), 항곰팡이제 (fungicides), 리펠런드 (repellants), 유인제 (attractants), 항균제 (antimicrobials) 또는 다른 독소와 같은 살충제 (pesticides)를 전달하는 것이다. 비-유전성 물질, 예를 들면 성장 인자. 호르몬, 키모카인 (chemokines), 사이토카인 (cytokines), 인터루킨 (interleukins), 인터페론 (interferons), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 과립성 백혈구 콜로니 자극 인자 (granulocyte colony stimulating factor), 및 이들 어떤 것의 다른 단백질 또는 파편, 항생제가 또한 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 활성 물질 (약물) 또는 화장용 물질을 함유하는 나노 입자과 같은 치료용의 및/또는 화장용 나노 입자를 제공한다. 상기 나노 입자는 타겟화된 전달 및 약물의 방출에 대한 일시적인 조절을 제공할 수 있다. 상기 물질은 예를 들면, 피부 질환 또는 장애를 처치하는데 있어서 효과적인 물질로서, 예를 들면, 레티놀 또는 레티노산, 항체, 올리고뉴클레오디드, 세포 제형 (cell formulations), 및 여기 기재된 다른 물질 중에서의 기타의 것일 수 있다.

본 발명은 또한 여기 기재된 나노 입자의 제조를 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 선택된 양의 수-용해성 단백질, 하나 또는 초과의 버퍼링 물질, 하나 또는 초과의 계면활성제, 단백질을 용해시키기 위한 하이드로알콜성 용매, 또는 이들의 조합을 함유한다. 상기 키트는 또한 하나 또는 초과의 인지질을 포함하며, 이들의 양은 계면활성제에 대한 인지질의 선택된 비율을 제공하기에 충분할 것이다.

본 발명은 따라서 다양한 물질을 캡슐화하는 나노 입자 및 그들을 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 방법은 비-면역성 나노 입자를 생산하기 위한 것일 수 있다. 상기 방법은 소수성 수-불용성 단백질을 제공하는 것; 상기 단백질을 하이드로알콜성 용매에 용해시켜 제 1 수성 상 용액을 제공하는 것; 계면활성제 및 인지질의 존재 하에 상기 제 1 수성 상 용액에 대하여 버퍼링 물질을 첨가하여 대략적으로 pH 6.8 및 대략적으로 pH 7.4 사이의 pH 를 갖는 제 2 수성 상 용액을 제조하는 것; 상기 제 2 수성 상 용액을 프로세싱하여 분산물 내의 입자의 직경 크기에서의 감소의 결과를 가져오는 것; 어떤 잔여 용매를 증발하여 대략적으로 400 nm 보다 작은 직경 크기를 갖는 나노 입자를 제조하는 것을 포함할 수 있다. 다음으로 상기 나노 입자는 분리 및 수집을 위하여 원심분리 될 수 있다.

상기 방법은 원심분리에 후속적으로 나노 입자를 동결 건조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 나아가 대기압의 압력에 대하여 나노 입자의 노출을 제한하는 환경 하에서 나노 입자를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 염기성 단백질은 예를 들면, 선택된 등급의 자인, 예를 들면 백색 자인일 수 있다.

상기 버퍼링 물질은 시트레이트 버퍼일 수 있다. 상기 계면활성제는 폴록사머 (poloxamer) 일 수 있으며 상기 인지질은 레시틴 (lecithin)일 수 있다. 인지질에 대한 계면활성제의 비율은 약 2:1일 수 있다. 입자의 직경 크기에서의 감소의 결과를 가져오는 상기 제 2 수성 상 용액의 프로세싱은 추가적으로 초음파 전단, 높은 압력의 균질화, 또는 이들의 조합을 나노 입자에 대해 실시하는 것을 포함할 수 있다. 다른 나노 입자 제조에 대하여, 예를 들면, 계면활성제가 결여될 수 있고 (예를 들면, β-카세인-덱스트란 나노 입자 또는 자인-β-카세인-검 아라비카 나노 입자) 또는 다른 계면활성제가 사용될 수 있다 (예를 들면, 자인 나노 입자를 제조하기 위하여 비-이온성 계면활성제에 부가적으로 소듐 라우릴 설페이트 (sodium lauryl sulfate)가 사용되는 경우).

본 발명은 상기 제 1 수성 상 용액의 제형에 있는 단백질에 대하여 나노 입자 캡슐화를 위한 분자를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 분자는 대상에 대한 투여를 위해 선택되는 치료용 물질일 수 있으며, 치료학적으로-활성인, 비-면역성의 나노 입자를 제공한다. 상기 단백질은 PEG화된 및/또는 교차-결합된 것일 수 있다.

본 발명은 나아가 소수성의, 수 불용성 단백질 내로의 치료용 분자의 캡슐화에 의해 형성되는 비-면역성의 나노 입자를 포함하는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 입자는 약 400 nm 보다 작은 직경을 갖는다. 어떤 실시예에서, 상기 입자의 직경은 약 100 nm 내지 400 nm, 또는 약 100 nm 내지 약300 nm 이다. 본 발명은 또한 치료용 물질을 포함하는 약제학적으로 치료를 위한 양의 비-면역성 나노 입자를 제공하며, 상기 나노 입자는 약 400 nm 보다 작은 평균 직경을 갖는다. 나노 입자는 치료용 물질에 의해 처치될 수 있는 (즉, 그것의 필요에 의해) 질병 또는 질환으로부터 고통 받고 있거나, 또는 고통 받을 위험에 처한 대상에서의 질병 또는 질환의 처치에 있어서의 사용을 위한 의약의 제조를 위하여 사용될 수 있다.

단백질, 고분자 및 나노 입자 성분의 변형물

여기 기재되는 자인 나노 입자의 변형물들이 또한 제조될 수 있다. 예를 들면, 자인을 대신하여, 다른 소수성 프롤아민 단백질, 예를 들면 글리아딘, 호르데인 및 카피린이 나노 입자 형성을 위한 단백질로서 사용될 수 있다. 이에 따라, 글리아딘 나노 입자, 호르데인 나노 입자, 및 카피린 나노 입자가 여기 기재된 자인 나노 입자과 유사하게 제조되고 또한 사용될 수 있다.

부가적으로, 나노 입자의 단백질은 그 나노 입자의 표면을 변형시키기 위하여 PEG와 같은 조각 (moieties)에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다. 표면을 변형시키는 조각은 PEG 조각 또는 다른 수 용해성 고분자, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone (PVP)), 폴리글리코산 (polyglycolic acid (PGA)), 폴리비닐 알콜 (polyvinyl alcohol (PVA)), 키토산 덱스트란 (chitosan, dextran), 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine (PEI)), 폴리살리실 산 (polysialic acid (PSA)), 폴리아크릴 산 (polyacrylic acid (PAA)), 및 기타 등등일 수 있다. 이러한 수 용해성 고분자는 소수성 프롤아민 단백질, 자인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린의 어느 것에 대하여 컨쥬게이트될 수 있어, 나노 입자의 표면 변형을 형성한다.

이와 유사하게, 소수성 고분자는 프롤아민 나노 입자에 대하여 복합체화되거나, 혼합되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 그러한 고분자는 예를 들면, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리 락트산-코-글리코산(poly lactic acid-co-glycolic acid), 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide), 폴리아스파르테이트(polyaspartate), 폴리굴타메이트(polygultamate), 스페르민(spermine), 폴리라이신(polylysine), 폴리에틸렌 이민 (polyethylene imine) 또는 폴리아크릴레이트(polyacrylates) (예를들면, 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리디메틸아미노 에틸 아크릴레이트( polydimethylamino ethyl acrylate) 및 기타 등등)을 포함할 수 있다. 다른 단백질 고분자 (알부민, 카세인, 젤라틴, 및 기타 등등) 및 키토산, 덱스트란, 검 아라비카, 덱스트란-그래프트된 카세인, 알지네이트 또는 이들의 조합과 같은 탄수화물 고분자와 같은 천연의 고분자가 또한 프롤아민 나노 입자에 대하여 복합체화되거나, 혼합되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 마찬가지로, 지방산이 프롤아민 나노 입자의 표면에 대하여 혼합되거나, 복합체화되거나 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 그러한 지방산의 예들은 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 포스파디틸에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 및/또는 올레산(oleic acid)을 포함할 수 있다. 이러한 고분자들 및/또는 지방산은 자인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린과 같은 소수성 프롤아민 단백질의 어느 것에 대하여 컨쥬게이트 될 수 있어, 표면 변형된 나노 입자를 형성한다.

자인이 단백질이기 때문에, 나노 입자의 형성에 있어서 자인을 사용하는 것의 추가적인 장점은 자인이 더 많은 수의 표면 기능적 그룹들, 이들은 타겟팅 리간드, 이미징 약물, 약물 및 특정 조직에 대하여 약물을 타겟팅하기 위한 다른 고분자를 부착하는데 있어서 또한 다른 생의학적 적용들에 대하여 사용될 수 있는, 을 포함하고 있다는 점에서 이해된다. 다른 또는 추가적인 변형들이 상기 프롤아민 소수성 코어에 대하여 또는 나노 입자 표면에 대하여 수행될 수 있다. 이러한 변형들은 pH 민감성 나노 입자를 제조하기 위하여 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(polyhydroxyethylmethacrylate), 또는 열 민감성의 나노 입자를 제조하기 위하여 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly (N-isopropylacrylamide))와 같은 자극 반응성 성분(stimuli responsive elements)을 나노 입자에 대해 컨쥬게이트시키는 것을 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 프롤아민 나노 입자는 약물 방출을 조절하기 위하여 및 약물 캡슐화 수율 및 효율을 향상시키기 위하여 예를들면, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 게니핀(genipin), 시트르산(citric acid), 폴리살리실 산 (polysialic acid (PSA)), 및 기타 등등과 같은 교차-결합제(cross-linkers)를 사용하여 교차 결합될 수 있다.

여기 기재된 방법을 사용하여 형성된 자인 나노 입자는 특히 신체 외에서의 중요한 용도, 예를 들면 약물의 국소적 투여를 위한, 를 갖는다. 예를 들면, 약물 로드된 자인 나노 입자는 관심의 분자, 예를 들면 화장품 및 약제학적 산업을 위해, 를 캡슐화하고 그것의 방출을 조절하는데 있어서 사용될 수 있다. 상기 프롤아민 나노 입자는 습기, 산화, 빛, 및 기타 등등과 같은 부정적인 환경적 요소들로부터 분자를 보호하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 특정 약물에 대한 환자의 피부 민감성을 감소시킬 수 있다. 프롤아민은 또한 다른 천연의 및 합성의 고분자와 결합할 수 있어서 여기 기재된 바와 같이 다양한 국소적 적용을 위한 독특한 특성을 갖는 신규한 나노 입자를 디자인할 수 있다.

나노 입자의 약제학적 제형

여기 기재된 나노 입자는 치료용의 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 나노 입자는 수성의 분산물의 형태로서 조성물에 대하여 첨가될 수 있거나 또는 동결 건조된 나노 입자의 건조 파우더로서 첨가될 수 있다. 상기 나노 입자는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며 또한 포유류 호스트, 예를 들면 다양한 형태의 인간 환자, 에 대하여 투여될 수 있다. 그러한 제형은 구체적으로 선택된 경로로의 투여, 예를 들면 국소적 투여, 에 대하여 적합하도록 맞추어질 수 있다.

여기 기재된 나노 입자는 약제학적으로 허용되는 운반체, 예를 들면 불활성 희석제 또는 알려져 있는 국소적 캐리어와 함께 결합된 형태로 투여될 수 있다. 국소적 조성물 및 조제물은 전형적으로 적어도 0.1 중량%의 활성의 치료용 또는 진단용 물질을 포함한다. 조성물 및 조제물 내에서의 물질의 중량 퍼센트는 달라질 수 있으며 또한 통상적으로 주어진 단위 용량 형태의 약 2 % 부터 약 60 % 까지일 수 있다. 나노 입자를 포함하는 그러한 치료용으로서 유용한 조성물 내에서의 활성 화합물의 양은 효과적인 용량 수준이 얻어질 수 있을 그 정도이다. 분산물, 에어로졸 제형, 젤, 연고, 크림, 로션, 샴푸 및 기타의 것이 또한 하나 또는 초과의 하기의 것을 함유할 수 있다: 검 트라가칸쓰 (gum tragacanth), 아카시아 (acacia), 콘 스타치 (corn starch) 또는 젤라틴 (gelatin)과 같은 바인더. 단위 용량 형태, 상기 유형의 물질에 부가적으로, 는 액상의 캐리어, 예를 들면 식물성 오일 또는 폴리에틸 글리콜을 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 단위 용량 형태의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 국소적 제형은 나노 입자, 보존제로서 메틸 및 프로필 파라벤에 부가적으로, 및 선택적으로 색상을 부가하기 위한 염료를 함유할 수 있다. 단위 용량 형태를 제조하는데 있어서 사용되는 어떤 물질은 약제학적으로 허용 가능하여야 하며 및 사용되는 양에 있어서 실질적으로 비-독성이어야 한다. 부가적으로 나노 입자의 분산물 또는 동결 건조된 나노 입자는 부가적인 지속적-방출 조제물 및 장치 내로 혼입될 수 있다.

나노 입자의 분산물은 물, 선택적으로 버퍼와 함께 혼합된, 속에서, 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 용매, 또는 그들의 혼합물 내로 제조될 수 있다. 저장 및 사용에 있어서의 보통의 조건 하에서, 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위하여 보존제를 함유할 수 있다. 최종적인 용량 형태는 제조 및 저장의 환경 하에서 살균의, 유동성이며 안정된 것이어야 한다. 액상의 캐리어 또는 운반체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타의 것), 식물성 오일, 비독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 액상의 분산물 매개일 수 있다. 미생물의 활동을 방지하는 것은 다양한 항박테리아성 및 항곰팡이성 물질, 예를 들면, 파라벤, 플로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티오메르살 (thiomersal), 및 기타의 것에 의하여 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 어떤 제형 내에 등장성 물질(isotonic agents), 예를들면 슈거, 버퍼, 또는 소듐 클로라이드, 을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

살균 용액은 나노 입자를 요구되는 양으로 적합한 용매 내에 필요에 의해 앞서 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 혼입시키고, 후속적으로 여과 살균에 의하여 제조될 수 있다. 살균 용액의 제조를 위한 살균 파우더의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함할 수 있고, 이것은 나노 입자에 더하여 미리 살균-여과된 용액, 젤, 크림, 로션, 연고, 및 기타의 것 내에 존재하는 어떤 부가적인 바람직한 성분의 파우더를 수득한다.

국소적인 투여를 위하여, 조성물 또는 제형으로서, 예를 들면 피부 과학적으로 허용 가능한 캐리어, 그것은 고체, 액체, 젤, 크림, 연고, 또는 페이스트일 수 있는, 와 조합하여, 피부에 대하여 나노 입자를 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 유용한 고체 캐리어는 미세하게 분쇄된 고체, 예를 들면 탈크(talc), 클레이(clay), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 실리카(silica), 알루미나(alumina), 및 기타 등등을 포함한다. 유용한 액상의 캐리어들은 물, 또는 물-알콜/글리콜/디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide (DMSO) 혼합물을 포함하며, 그 안에서 나노 입자는 선택적으로 비-독성의 계면활성제의 보조에 의해 효과적인 수준으로 분산될 수 있다. 향수(fragrances)와 같은 아쥬반트(adjuvants) 및 부가적인 항균성 물질이 주어진 용도를 위한 특성을 최적화하기 위하여 첨가될 수 있다. 유동성 조성물은 밴드 또는 다른 드레싱 (dressings)을 스며들게 하기 위해(impregnate) 사용되는 흡수성 패드(absorbent pads)에 의해 적용될 수 있거나, 또는 펌프-타입 또는 에어로졸 스프레이를 사용하여 효과가 미치는 부위에 대하여 분무될 수 있다.

합성 고분자, 지방산, 지방산염 및 에스테르, 지방 알콜, 변형된 셀룰로오스, 또는 변형된 미네랄 물질과 같은 증점제(thickeners)가 또한 사용자의 피부에 대해 직접적인 적용을 위하여 잘 퍼지는(spreadable) 페이스트, 젤, 연고, 비누, 및 기타 등등을 형성하기 위해 액상의 캐리어와 함께 사용될 수 있다.

피부에 대하여 활성 물질들(예를 들면, 물질 로드된 나노 입자)을 전달하기 위한 피부 과학적인 조성물의 예들은 본 기술 분야에서 알려져 있다; 예를들면, 그들의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,608,392 (자크퀘트 외(Jacquet et al.)), 4,992,478 (게리아(Geria)), 4,559,157 (스미스 외(Smith et al.)), 및 4,820,508 (워츠만(Wortzman))를 참조하라. 그러한 피부 과학적인 조성물들은 여기 기재된 나노 입자 제형들과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

여기 기재된 약물 로드된 나노 입자의 유용한 용량은 그들의 생체 외 활성도 및 동물 모델에서의 생체 내 활성도를 비교하는 것에 의하여 결정될 수 있다. 쥐, 및 다른 동물들에서의 효과적인 용량에 대한 인간으로의 외삽을 위한 방법이 본 기술 분야에서 알려져 있다; 예를 들면, 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,938,949 (보치 외(Borch et al.))를 참조하라. 처치에서의 용도를 위하여 요구되는 나노 입자 내로 로드되는; 화합물, 또는 활성 염, 프로드러그, 또는 그들의 유도체의 양은 특정한 화합물 또는 선택된 염에 의해서 뿐만 아니라, 투여의 경로, 처치되는 질환의 성질, 및 환자의 나이 및 상태에 의해서도 달라질 것이고, 또한 궁극적으로 참여하는 의사 또는 임상 의사의 재량에 의할 것이다.

치료용 물질 로드된 나노 입자는 바람직하게 단위 용량 형태로서, 예를들면, 5 내지 1000 mg/m², 바람직하게 10 내지 750 mg/m², 가장 바람직하게 50 내지 500 mg/m² 의 단위 용량 형태 당 활성 성분을 함유하는 것으로서 투여될 수 있다. 바람직한 용량은 바람직하게 단독 용량으로서 또는 적당한 간격으로 투여되는 나뉘어진 용량으로서, 예를 들면 하루에 두 번, 세 번, 네 번 또는 초과의 하위-용량들로서, 표현될 수 있다. 하위-용량 그 자체는, 예를 들면 별개의 여유롭게 간격이 나뉘어진 투여의 수로, 더욱 나뉘어질 수 있다.

여기 기재된 약물 로드된 나노 입자는 효과적인 항-염증성 물질일 수 있으며 또한 더 높은 효능(potency) 및/또는 비-나노 입자 캡슐화된 항-염증성 물질과 비교할 때에 감소된 독성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명은 포유류에서 염증을 처치하는 치료상의 방법을 제공하며, 이는 염증 (예를 들면, 피부의) 을 포함하고 있는 포유류에 대하여 유효량의 여기 기재된 조성물 또는 제형을 투여하는 것을 포함한다. 포유류는 영장류(primate), 인간, 설치류(rodent), 개(canine), 고양이(feline), 소(bovine), 양(ovine), 말(equine), 돼지(swine), 염소(caprine), 소(bovine) 및 기타 등등을 포함한다.

하기의 예들은 상기 방법을 도시하기 위한 것으로 의도되며 또한 그것의 범위를 좁히는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 기술 분야에서 숙련된 자는 그 실시예들이 본 발명이 실행될 수 있는 많은 다른 방법을 제시한다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 수많은 다양성 및 변형이 이루어질 수 있으며 한편 본 발명의 범위 내에 잔존한다.

실시예

다양한 실시예를 따르는 나노 입자, 예를 들면 약 75 nm 내지 약 400 nm의 평균 직경을 갖는 것, 이 하기의 예들에서 기재되는 바와 같이 제조되고 또한 특성이 파악될 것이다.

실시예 1. 자인 나노 입자의 제조

제 1 수성 상에, 13.5 mg의 백색 자인이 3 mL 의 에탄올 및 0.25 mL의 물의 혼합물 내에 용해되었다. 사용된 자인 또는 용매 조합의 농도는 최적화되었고; 그러나 바람직한 다른 크기 범위 내에서의 나노 입자는 자인 농도 또는 용매 조성물을 변형시키는 것에 의하여 제조될 수 있다. 상기 자인의 용해는 약 20 초 동안의 프로브 초음파 적용에 의하여 도움을 받을 수 있다. 제 1 수성 상의 결과적인 용액은 다음으로 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 초음파 에너지 (1.39 kW/h, 37 % 진폭) 의 10 분 동안의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 15 mL의 시트레이트 버퍼, pH 7.4의, 및 레시틴 (0.45 % w/w)과 PLURONIC®F68 (0.9 % w/v)의 조합의 용액에 대하여 첨가되었다. 초음파 전단 가공 (ultrasonic shearing process) 동안에, 분산물은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 상기 분산물은 다음으로 에탄올이 완전히 증발될 때까지 실온에서 (-23 ℃) 300 rpm 내지 500 rpm 사이의 마그네틱 스터바 상에 놓여졌다. 에탄올의 완전한 증발 후에, 나노 입자는 어떠한 잔여 물질 및/또는 표면의 활성 물질을 제거하기 위하여 정제되었다.

정제는 탈이온화된 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 50 분 동안 3950 g에서 5000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하여 원심 분리하는 것에 의해 달성되었다. 4 mL의 결과로서 얻어지는 자인 나노 입자의 수성의 현탁물 (pH 7.4 시트레이트 버퍼)에 대하여 2 % w/v의 트레할로스 (trehalos)가 저온 보호 물질 (cryoprotectant)로서 첨가되었고, 상기 나노 입자는 다음으로 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었다. 물질은 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다. 나노 입자는 다음으로 데시케이터 안에서 10 ℃의 냉장고 내에 보관되었다. 도 1을 참조하라. 자인 나노 입자를 제조하기 위한 부가적인 방법들이 참조에 의해 여기에 포함되는 WO 2009/137112 (페루말 외 (Perumal et al.))에 기재되어 있다.

대안적인 방법에서, 상기 제 2 상 용액의 초음파 전단 처리는 입자 크기를 감소시키기 위하여 좁은 오라피스 (orifice) 를 통하여 높은 압력 하에서 분산물을 통과시키는 것에 의하는 높은 압력 균질화 (high pressure homogenizer) 에 의해 대체될 수 있다. 이것은 더 높은 농도의 자인이 사용될 때에 더 작은 크기 범위에서의 나노 입자를 생산하는데 있어 특별히 유용하다. 또한, 높은 압력의 균질화는 자인 나노 입자를 제조하기 위하여 스케일-업 (scale-up) 방법으로서 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예가 하기 실시예 2에 기재되어 있다.

실시예 2. 높은 압력의 균질화를 이용하는 자인 나노 입자 제조

0.65 %w/v의 백색 자인의 양이 6 mL 의 에탄올 및 0.50 mL의 물의 혼합물 내에 용해되었다. 제 1 수성 상의 결과적으로 얻어지는 용액의 조성은 약 pH 6 내지 약 pH 7의 바람직한 pH를 얻기 위하여 변화되었다. 자인의 용해는 약 20 초 동안의 프로브 초음파 처리의 적용으로 보조되었다. 상기 제 1 수성 상의 결과적인 용액은 다음으로 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 초음파 에너지 (1.39 kW/h, 37 % 진폭) 의 2 분 동안의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 30 mL의 시트레이트 버퍼, pH 7.4를 갖는, 또한 레시틴 (0.45 % w/w)과 PLURONIC®F68 (0.9 % w/v)의 조합을 포함하는 용액에 대하여 첨가되었다. 초음파 전단 가공 (ultrasonic shearing process) 의 과정 동안에, 분산물은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 상기 결과로서 얻어지는 거친 현탁물은 다음으로 20,000 psi 에서 5 분 동안 0.1 및 0.25 mm 사이의 오리피스 크기를 갖는 높은 압력의 균질화기 (high pressure homogenizer) (Nano Debee® USA) 를 관통하도록 패쓰되었다. 높은 압력의 균질화 과정 동안에 칠러 (chiller)를 사용하여 높은 압력의 균질화기 내부의 물을 순환시키는 것에 의하여 온도는 대략적으로 10 ℃로 유지되었다. 후속적으로 분산물은 에탄올이 완전히 증발할 때까지 실온에서 300 내지 500 rpm에서의 마그네틱 스터바 상에 유지되었다. 에탄올의 완전한 증발 후에, 나노 입자는 어떠한 잔여 물질 및/또는 표면의 활성 물질을 제거하기 위하여 정제되었다.

정제는 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 50 분 동안 3950 g에서 5000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하여 원심분리하는 것에 의해 달성되었다. 4 mL의 결과로서 얻어지는 나노 입자의 수성의 현탁물 (pH 7.4 시트레이트 버퍼)은 2 % w/v의 트레할로스 (trehalos) 35 mg과 함께 혼합되었고, 또한 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었다. 상기 케이크는 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다.

실시예 1 및 2에서 기재된 방법은 선택된 분자, 예를 들면 치료용 약물과 같은, 가 나노 입자 내부에 캡슐화되어 있는 나노 입자의 형성을 위해 조정될 수 있다 (도 2 를 참조하라). 상기 치료용 약물은 여기에 기재된 바와 같이 예를 들면, 코우마린, 레티놀, 레티노산, 또는 이들의 에스테르 일 수 있다.

자인 입자 제조에 대한 다른 변형들이 도 3 및 4에서 보여질 수 있다. 제 1 방법에서, 자인 입자는 pH 조정된 나노 침전 (pH controlled nanoprecipitation)을 사용하여 β-카세인 및 검 아라비카에 의해 안정화된다 (도 3을 참조하라). 제 2의 방법에서, 덱스트란의 리듀싱 말단 (reducing end) (알데히드)은 α-아미노산 카세인에 대하여 컨쥬게이트된다. 간단히 설명하면, 40 mg의 β-카세인이 비이커 내의 20 ml의 시트레이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서 100 mg의 덱스트란 (11 kDa) 과 함께 혼합되었다. 상기 비이커는 알루미늄 포일로 커버되었고 하룻 밤 동안 70 ℃에서 교반되었다. 도 4에서 보여지는 바와 같이 덱스트란-그래프트화된 β-카세인은 자인-덱스트란-카세인 나노 입자를 제조하기 위한 안정화제로서 사용되었다.

이에 더하여, 나노 입자는 자인 및 카세인을 포함하도록 제조될 수 있다 (하기 실시예 11을 참조하라).

자인-덱스트란 나노 입자. 추가적인 변형에서, 50 mg의 자인 및 덱스트란 (11 kDa)이 10 mL의 디메틸 술폭사이드 (Dimethyl sulfoxide (DMSO)) 내에 용해되었다. 상기 용액은 실온에서 24 시간 동안 교반되었다. 교반 후에, 용액은 투석 백 (분자량 컷 오프 10,000) 내로 도입되었고 및 2 일 동안 1 리터의 증류된 물에 대하여 투석되었으며 그 동안 여기서 상기 증류된 물은 유기 용매를 완전하게 제거하기 위하여 제 1 일 동안 매 2 시간 마다 교체되었다. 결과로서 얻어지는 현탁물은 분석을 위해 사용되었거나 또는 동결 건조되었다. 이 방법은 폴리사카라이드와 단백질의 상호 작용을 필요로 한다.

[표 2-1]

실시예 3. 자인 나노 입자를 캡슐화하는 물질의 제조

분자-캡슐화된 나노 입자의 예는 하기와 같다. 13.5 mg 양의 백색 자인이 3 mL 에탄올 및 pH를 6 및 7 사이로 조정하기 위한 0.25 mL의 0.01 N NaOH 의 혼합물 내에 용해되었다. 상기 용액에 대하여 6.6 mg의 6,7 하이드록시코우마린 (6,7-hydroxycoumarin)을 첨가하였고 또한 그 혼합물은 용해를 분명히 하기 위하여 20 초 동안 프로브 초음파 처리되었다. 다양한 환경에서, 상기 6,7 하이드록시코우마린 (6,7-hydroxycoumarin)은 약 0.03 mmol 내지 약 0.05 mmol의 여기 기재된 다른 물질, 예를 들면 레티놀 또는 그것의 유도체로 대체될 수 있다. 어떤 실시예에서, 약 0.1 % w/w 내지 약 2 % w/w, 또는 약 0.3 % w/w 내지 약 1 % w/w의 활성 물질, 예를 들면 레티놀이 사용될 수 있다. 결과로서 얻어지는 용액은 10 분 동안 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 1.39 kW/h 에서의 및 37 % 진폭의 초음파 에너지의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 67.5 mg의 레시틴 및 135 mg의 PLURONIC®F68을 함유하는 15 mL의 시트레이트 버퍼 (pH 7.4)에 대하여 첨가되었다. 초음파 프로세스 동안에, 상기 용액은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 후속적으로 상기 분산물은 에탄올이 완전히 증발될 때까지 실온에서 300 rpm 내지 500 rpm 사이의 마그네틱 스터바 상에 놓여졌다. 에탄올의 완전한 증발에 이어서, 나노 입자는 어떠한 과량의 약물 및/또는 표면의 활성 물질을 제거하기 위하여 정제되었다.

정제는 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 50 분 동안 3950 g에서 5000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하여 원심분리하는 것에 의해 달성되었다. 4 mL의 코우마린-로드된 나노 입자의 수성의 현탁물 (pH 7.4 시트레이트 버퍼)에 대하여 35 mg의 트레할로스 (trehalos)가 첨가되었고, 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었다. 상기 고체 케이크는 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다.

백색 자인이 적당한 염기성 단백질로서 사용될 수 있음이 보여졌다. 백색 자인은 대략적으로 100 nm 내지 대략적으로 400 nm 의 바람직한 좁은 크기 범위에 있는 재생산 가능한 나노 입자를 제공하며, 반면 황색 자인은 더 넓은 입자 크기 분산도를 갖는 더 큰 입자들을 제공한다. 이러한 차이점은 표 3-1 및 표 3-2에 나타나 있다. 표 1은 상기 실시예 1 및 실시예 3의 방법에 의하여 황색 자인으로부터 만들어진 나노 입자들의 데이터를 제공한다. 블랭크 및 코우마린-로드된 나노 입자 양자가 보여진다. 각각의 입자 크기는 각각 대략적으로 460 nm 및 610 nm 인 것이 보여질 수 있다. 비교에 의해, 하기 표 2에서 보여지는 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 3의 방법에 의하여 백색 자인으로부터 만들어진 블랭크 및 코우마린-로드된 나노 입자는 더 작다. 도 5 및 6은 블랭크 및 코우마린-로드된 나노 입자의 전자 현미경 (electron microscopic) 및 원자력 현미경 (atomic force)의 이미지를 보여준다.

[표 3-1]

[표 3-2]

황색 자인 내의 피그먼트는 자인의 용해도 및 바람직한 크기 분포를 갖는 나노 입자의 형성에 영향을 미친다. 특히 일관적으로 바람직한 작은 크기 범위 내에 있는 천연의 고분자, 예를 들면 단백질을 사용하여 입자를 제조하는 것이 특히 어려운 일이라는 것이 알려져 있다. 그러나, 여기 기재된 방법은 백색 자인과 같은 적합한 등급의 단백질을 사용하여 바람직한 크기 범위 내에서 일관적으로 나노 입자를 제조한다. 현저하게도, 여기 기재된 방법은 80 nm 내지 100 nm와 같이 낮은 직경 크기를 갖는 나노 입자를 제조할 수 있고, 또한 제조하였다. 만약 실시예 2에 기재된 바와 같이, 초음파 전단의 일부가 높은 압력의 균질화에 의해 대체된다면, 결과로서 얻어지는 블랭크 나노 입자의 입자 크기는 상기 표 2에서 보여지는 입자 크기와 또한 유사할 것이며, 즉 대략적으로 220 ± 15 nm 의 입자 크기 및 PDI 0.4 ± 0.07를 가질 것이다.

나노 입자 침전 방법에 의해 제조되며 바람직한 크기 범위 내에 있는 나노 입자의 수득율 (yield)은 대략적으로 60 % 보다 큰 것으로 밝혀졌다. 상기 방법은 제조된 입자가 대략적으로 400 nm 보다 작은 범위에서 주로 측정되는 직경을 가지며, 또한 전형적으로 대략적으로 100 nm 내지 대략적으로 300 nm 의 상대적으로 좁은 직경 크기 분산도를 가지고, 신체 내로 투여되었을 때레 면역 반응이 회피된다는 점에서 의미있다. 유리하게도, 대략적으로 100 nm 내지 대략적으로 400 nm 의 직경 크기 범위 내의 자인 나노 입자는, 예를 들면 여기에 기재된 방법에 의해 제조되는, 식세포 (phagocytic cells)에 의해 섭취되지 않는 반면, 대략적으로 400 nm 보다 큰 직경 크기의 더 큰 입자들은 돼지 혈액을 사용하는 생체 외에서 테스트 되었을 때 식세포에 의해 빠르게 섭취된다. 이것은 나노 입자 식세포 작용 (phagocytosis)이 자인 나노 입자의 입자 직경 크기를 더 작은 크기 범위 내에 있도록 조절하는 것에 의해 회피된다는 것을 나타낸다.

쥐에서의 면역원성 (Immunogenicity) 연구는 직경에 있어서 약 100 내지 약 400 nm의 자인 나노 입자가 비-면역성이며, 반면 약 400 nm 보다 큰 직경을 갖는 자인 나노 입자는 현저한 면역 반응을 일으켰다 (항-자인 항체가 식염수 대조군과 비교할 때 2 내지 4 배 높았다)는 것을 보여 주었다. 이러한 결과는 약 400 nm 보다 작은 직경을 갖는 나노 입자를 제조하고 또한 사용하는 것이 입자의 소수성 단백질에 의해 유발되는 어떠한 현저한 면역원성을 제거하는 데 있어서 중요하다는 것을 보여준다.

나노 입자의 크기를 조절하는 것을 가능하게 하는 것은 상기 방법의 제 2 수성 상 용액의 pH를 조절하는 것에 의해 부분적으로 달성된다. 하기의 표 3-3에서의 데이터는 더 작은 크기의 나노 입자로서, 낮은 PDI를 가지는 것이 약 6.8 내지 약 7.4의 pH에서 달성된다는 것을 보여준다.

[표 3-3]

나노 입자 형성에 있어 크기를 조절하는데 있어서의 추가적인 요소는 나노 입자를 안정화시키고 입자의 응집을 방지하기 위하여 사용되는 계면활성제와 인지질의 조합이다. 폴록사머와 레시틴의 조합, 예를 들면 2:1 비율 (예를 들면, 0.9: 0.45 % w/w)에서의, 은 바람직한 크기 범위 내의 나노 입자를 제조한다. 만약 계면활성제 또는 인지질의 어느 것이 단독으로 사용된다면, 하기 표 3-4의 데이트에 의해 나타나는 바와 같이 큰 입자들이 얻어진다.

[표 3-4]

상기 제 2 수성 상에 대하여 버퍼링 물질을 선택하는 것은 나노 입자의 형성의 과정 동안에 최적의 pH를 유지시키는 점에 있어서 중요할 뿐만 아니라, 후속적인 동결 건조를 위하여 또한 중요하다. 예를 들면, 만약 어떠한 버퍼링 물질도 제 2 수성 상 용액에 대해 사용되지 않는다면, 또는 0.1 N NaOH 가 pH를 조정하기 위하여 사용된다면, 결과적인 나노 입자는 크기에 있어서 더 크고, 더 넓은 크기 범위 또는 PDI를 갖게 된다. 도 7 에서 보여지는 바와 같이, 시트레이트 버퍼의 사용은 더 작은 입자 크기 (109 ± 12 nm)를 제공한다. 다른 버퍼링 물질들, 특히 포스페이트의 사용은 동결 건조 후에 두 배 내지 세 배로 증가되는 자인 나노 입자의 입자 크기의 결과를 가져온다.

도 7의 그래프는 제 2 수성 상으로부터의 용액 내 버퍼링 물질로서 포스페이트를 사용하는 방법에 의해 제조된 및 동결 건조 후에 얻어진 자인 나노 입자가 제 2 수성 상 내에서의 버퍼링 물질로서 시트레이트를 사용하여 제조된 나노 입자과 비교할 때 더 큰 입자들을 제조했다는 것을 나타낸다. 포스페이트 버퍼 내에서의 입자 크기 증가는 pH 강하에 의해 유발되는 동결 건조 온도에서 버퍼의 결정화 및 침전으로 인한 것일 수 있다 (레디 외 (Reddy et al.), 바이오테크놀. 프로. (Biotechnol. Pro.) 25 (2009) 139-146). 이러한 문제점은 시트레이트 버퍼를 사용하는 것에 의하여 해소되며, 그것은 동결 건조 온도 동안 pH 에서의 변화에 대해 효과적으로 저항한다. 자인 내의 아미노 그룹들은 시트르산에 의하여 교차-결합되며, 이것은 또한 자인 나노 입자를 안정화시킬 수 있다 (레디 외(Reddy et al.), 바이오테크놀. 프로그. (Biotechnol. Prog.) 25 (2009) 139-146).

자인이 생분해성 단백질이고 또한 합성의 고분자 보다 더욱 생체 적합성이라는 것은 주목할 만한 것이다. 자인은 FDA 표준에 의해 GRAS (일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (Generally Regarded As Safe) 고분자로 리스트되어 있다 (백색 글루텐, 콘 글루텐 및 자인 필름 (Wheat gluten, corn gluten and zein film): GRAS 단계의 확인 (affirmation of GRAS status), Fed Register 50(1985) 8997-8999). 여기 기재된 방법은 따라서 다른 물리 화학적 특성을 갖는 캡슐화된 카고 분자 또는 약물을 포함하는 자인 나노 입자를 제조하는데 있어 적합하다. 하기 표 3-5는 다양한 실시예에 따른 여기 기재된 방법을 사용하여 나노 입자에 의해 캡슐화될 수 있는 다양한 분자들을 나타낸 것이다. 나노 입자 캡슐화에서 사용될 수 있는 분자의 수 또는 유형은 여기 기재된 것들에 한정되는 것은 아니다.

[표 3-5]

따라서 다양한 카고 분자, 예를 들면, 6,7-하이드록시 코우마린, 와 함께 형성된 나노 입자는 입자 크기 및 면역원성에 대한 조절에 의해 성공적으로 제조되었다. 6,7-하이드록시 코우마린-로드된 입자의 제조에 대한 예는 상기 기재되었고 또한 일 실시예에 따른 그것의 제조 방법은 도 8 에 도시되었다.

여기 기재된 바와 같이 제조된 자인 나노 입자는 부분적으로 자인 나노 입자의 수 불용성으로 인하여 캡슐화된 분자 및 약물에 대해 유용한 및/또는 유리한 지속되는 방출을 제공하며, 이것은 입자가 일정한 시간의 기간에 걸쳐 약물 방출을 지속시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 도 8은 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조된 코우마린-로드된 나노 입자의 생체 외에서의 방출 프로파일을 도시한 것이다. 이 데이터는 생체 외에서, 최대 7 일의 기간에 걸쳐, 엔자임의 존재 하에서 관찰되는 더 높은 방출 속도를 갖는, 지속되는 약물의 방출이 존재한다는 것을 보여준다. 상기 데이터는 자인 나노 입자 방출이 나노 입자 외부로의 약물의 느린 확산 및 자인 나노 입자의 느린 효소적 브레이크 다운 (breakdown)에 의해 조정된다는 것을 보여준다. 캡슐화된 약물에 대한 다른 예들은 대략적으로 24 시간 후에 지속된 방출에 의해 후속되는 개시적 분출 (burst)을 포함하는 혼합된 수준 (order) 의 것을 보여주었다.

다양한 캡슐화된 분자에 대한 약물 방출 프로파일은 자인 나노 입자가 경구로의(oral), 구강으로의 (buccal), 경피로의 (transdermal), 코로의 (nasal), 폐로의 (pulmonary) 및 눈으로의 (ocular) 전달 경로를 포함하는, 경구적 및 비경구적 경로의 투여에 의해 다방면으로 또한 안전한 약물 전달 운반체로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 많은 다른 분자들, 입자들 및 약물은 또한 캡슐화될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 치료용의, 진단용의 및 미용용으로의 적용 또는 치료를 위한 약제학적 및 화장용 물질들 (예를 들면, 비타민 A (레티놀), 비타민 C 및 아스코르빌 팔미테이트 (ascorbyl palmitate)와 같은 그것의 유도체, 비타민 E 및 토코페릴 아세테이트 (tocopheryl acetate)와 같은 그것의 유도체, 코엔자임 Q10 (Coenzyme Q10), 미녹시딜 (minoxidil), 그린 티 추출물 (green tree extract), 알로에 베라 (aloe vera), 하이드로퀴놀린 (hydroquinone), 하이알우론산 (hyaluronic acid), 소듐 하이알우로네이트 (sodium hyaluronate), 바이사볼올 (bisabolol), 글리코산 (glycolic acid), 락트산 (lactic acid), 베타 하이드록시부타논 산 (beta hydroxybutanoic acid), 살리실산 (salicylic acid), 10-하이드록시 데카논산 (10-hydroxy decanoic acid), 페럴산 (ferulic acid), 판테테놀 (pantethenol), 비오틱 (biotic), 아르부틴 (arbutin), 퀘르세틴 (quercetin), 헤스페리딘 (hesperidin), 및 이와 같은 것, 또는 이들의 조합) 을 포함한다. 나아가, 여기 기재된 방법에 의해 형성된 나노 입자의 상대적으로 더 작은 크기로 인하여, 분자-로드된 (예를 들면, 약물-로드된) 자인 나노 입자는 신체 내에서 연장된 기간 동안 식세포에 의한 인식 및 제거됨 없이 순환할 수 있다.

도 9의 데이터는 100-400 nm의 크기 범위 내에 있는 자인 나노 입자가 혈액 식세포에 의해 섭취되지 않으며, 반면 >400 nm의 크기를 가진 더 큰 입자는 생체 외에서 돼지 피부를 사용하여 테스트 되었을 때 식세포에 의해 빠르게 섭취된다는 것을 보여준다. 따라서 식세포적 섭취는 더 작은 크기 범위 내로 자인 나노 입자의 입자 크기를 조절하는 것에 의하여 회피된다는 것을 알 수 있다. 쥐에서의 면역원성 (Immunogenicity) 연구는 100 nm 내지 400 nm의 크기 범위 내의 자인 나노 입자가 비-면역성이라는 것을 보여주었다. 다른 한편, 도 10에서 보여지는 바와 같이, 크기 > 400 nm 를 갖는 자인 나노 입자는 대조군과 비교할 때 현저한 면역 반응을 일으켰다 (2 내지 4 배).

나노 입자를 제조하기 위하여 사용되는 자인의 세포 독성 효과는 돼지의 장내 상피 세포 (intestinal epithelial cells ) (IPEC-12)를 사용하는 세포 증식 연구에서 조사되었다. 예시적인 세포 독성 연구의 결과는 도 11에서 보여진다. 어떤 농도에서의 버퍼에 의해 처리된 대조군과 비교할 때 백색 자인 및 황색 자인 사이에서 세포 독성에 있어서의 어떠한 현저한 수준의 것이 관찰되지 않았다.

실시예 4. 교차 결합된 나노 입자

여기 기재된 바와 같이 제조된 나노 입자의 효소적 안정성은 교차 결합에 의하여 더욱 증진될 수 있다. 도 12는 교차-결합제로서 글루타르알데히드 (glutaraldehye) 를 사용하여 교차 결합된 블랭크 자인 나노 입자의 제조를 위한 일반적인 방법을 도시한 것이다. 그러한 제조에 대한 구체적인 예는 하기와 같다.

블랭크 자인 나노 입자가 상기 기재된 나노 침전의 방법을 사용하여 제조되었다. 교차 결합제가 제 2 수성 상에 대한 프로브 초음파 처리에 후속하여 첨가되었다. 나노 입자는 24 시간 동안 추가로 인큐베이트 되었다. 인큐베이션 시간의 종결 시점에서, 나노 입자는 원심 분리 여과를 사용하여 정제되었고 또한 다음으로 동결 건조되었다. 백색 자인 (0.0135 g)이 3 mL의 에탄올 및 0.25 mL의 물의 혼합물 내에 용해되었다. 제 1 상 용액이 다음으로 10 분 동안 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 1.39 kW/h 에서의 및 37 % 진폭의 초음파 에너지의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 pH 7.4을 가지고 레시틴 (0.45 % w/v)과 PLURONIC®F68 (0.9 % w/v)의 조합을 함유하는 15 mL의 시트레이트 버퍼에 대하여 첨가되었다. 초음파 프로세스 동안에, 상기 용액은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 용액에 대하여 0.5 mL의 25 % w/v 글루타르알데히드 (glutaraldehye)가 첨가되었고 그 용액은 300 내지 500 rpm에서의 교반과 함께 37 ℃에서 3 내지 24 시간 동안 인큐베이트되었다. 후속적으로, 상기 분산물은 에탄올이 완전히 증발될 때까지 실온에서 300 rpm 내지 500 rpm 사이의 마그네틱 스터바 상에 놓여졌다. 에탄올의 완전한 증발 후에, 나노 입자는 잔여 물질을 제거하기 위하여 정제되었다.

정제는 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 50 분 동안 3950 g에서 5000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하는 원심분리에 의해 달성되었다. 나노 입자의 수성의 현탁물에 대하여 35 mg의 트레할로스 (trehalos)가 첨가되었고, 그 용액은 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었다. 상기 물질은 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다. 분명하게도, 다른 교차-결합제, 예를 들면 EDC/NHS 및 게니핀에 대하여, 도 12의 방법에서 사용될 때에, 반응 시간은 24 내지 72시간으로 변할 수 있다.

자인에서의 표면 아미노산이 교차-결합에 관여된다. 트리니트로 벤젠 술폰산 (Trinitro benzene sulfonic acid (TNBS))이 교차 결합 이전 및 이후의 자인에서의 자유 아미노 그룹을 측정하기 위하여 사용되었다. 표준화 커브가 증가하는 비-교차 결합된 및 교차-결합된 자인의 농도 대 (versus) 440 nm 파장에서의 흡광도에 의해 생성되었다. 교차 결합하는 효율은 하기의 식을 사용하여 계산되었다.

교차 결합의 효율 % = [a-b/a] x100

여기서 a = 비-교차 결합된 자인의 농도 대 흡광도의 기울기, 및 b = 교차 결합된 자인의 농도 대 흡광도의 기울기. 표준화 커브를 만들기 위해 사용되는 자인의 농도 범위는 0.357 mg/mL 내지 12 mg/mL이고, 또한 상관 계수는 0.9994이다. 다른 교차 결합제를 사용하는 자인 나노 입자 내에서의 교차-결합하는 정도가 도 13에서 보여진다. 교차 결합의 효율은 대략적으로 70 % 부터 대략적으로 100 % 까지 달라졌다. 교차-결합하는 정도는 교차 결합제에 의존적으로 대략적으로 3 시간 부터 3 일 까지에 이르도록 반응 시간을 변화시키는 것에 의해 달라질 수 있다. 여기서 보여지는 교차 결합제는 단지 예들이며 또한 여기 기재된 방법은 단지 개시된 교차-결합제의 사용에 제한되지 않는다. 폴리카르복실 산 (시트르산 또는 1,2,3,4-부탄테트라카르복시산 (butanetetracarboxylic acid)) 과 같은 다른 교차 결합제가 사용될 수 있다.

실시예 5. 교차결합된 로다민-캡슐화된 나노 입자

상기 예는 블랭크 자인 나노 입자의 제조를 보여주었고, 교차-결합은 구체적인 분자를 함유하는 나노 입자의 제조에 있어서 또한 수행될 수 있다. 로다민,수 용해성 염료, 을 제조하는 구체적인 예가 하기와 같다 (도 14를 참조하라). 이 방법은 다른 화합물, 예를 들면 레티놀 및 여기 기재된 관련된 화합물을 캡슐화하기 위해서 사용될 수 있다.

로다민 123 (Rhodamine 123)은 380.82 의 분자량 및 1.2의 Log P를 갖는다. 이것은 녹색의 형광 염료이고 물에 대하여 약간 용해성이며 메탄올, 디메틸 술폭사이드 및 디메틸포름아미드에 대해 완전히 용해성이다.

로다민

백색 자인 (0.0135 g)이 3 mL의 에탄올 및 0.25 mL의 물의 혼합물 (0.25 mL) 내에 용해되었다. 제 1 수성 용액에 대하여 0.0005 g의 로다민-123이 첨가되었다. 결과적인 용액은 10 분 동안 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 1.39 kW/h 에서의 및 37 % 진폭의 초음파 에너지의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 pH 7.4을 가지고 0.0675 g의 레시틴 및 (0.135 g)의 PLURONIC®F68의 조합을 함유하는 15 mL의 시트레이트 버퍼에 대하여 첨가되었다. 초음파 프로세스 동안에, 상기 용액은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 다음으로 0.5 mL의 글루타르알데히드 (glutaraldehye) (25 % w/v)가 첨가되었고 또한 300 내지 500 rpm에서의 교반과 함께 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이트되었다. 남아있는 교차 결합제는 10 % w/v 소듐 메타비설페이트 (metabisulfite)로 중화되었다. 후속적으로, 상기 분산물은 에탄올이 완전히 증발될 때까지 실온에서 300 rpm 내지 500 rpm 사이의 마그네틱 스터바 상에 놓여졌다. 에탄올의 완전한 증발 후에, 나노 입자는 원심분리 정제되었다.

정제는 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 50 분 동안 3950 g에서 5000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하는 원심분리에 의해 달성되었다. 로다민-로드된 나노 입자의 수성의 현탁물 (pH 7.4 시트레이트 버퍼) 에 대하여 35 mg의 트레할로스 (trehalos)가 첨가되었고, 또한 그 용액은 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었으며, 상기 물질은 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다.

비-교차 결합된 및 교차-결합된 (교차 결합제로서 글루타르알데히드 (glutaraldehye)를 사용하여) 로다민 입자의 입자 크기, 다분산 지수 및 제타 포텐셜이 표 5-1에서 보여진다.

[표 5-1]

pH 2에서 생체 외에서의 약물 방출은 자인 나노 입자가 교차 결합되었을 때에 더 느려지며 (도 15), 또한 유사하게도 효소적 방출은 또한 더 느렸다 (도 16). 자인 나노 입자의 표면에서의 자유 아미노 그룹의 교차-결합은 입자의 크기를 감소시키고, 용매의 접근을 감소 시키며, 또한 나노 입자의 효소적 분해를 늦추었다. 교차 결합은 또한 분출 효과 (burst effect)를 감소시켰다. 따라서 교차 결합은 나노 입자를 더욱 안정화 시켰고 또한 나노 입자로부터의 카고 방출을 지속시킬 수 있다.

실시예 6. PEG화된 자인 나노 입자

여기 기재된 방법에 의해 제조된 나노 입자의 치료적 활성 및 효율은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 상기 나노 입자에 대하여 부착시키는 것에 의해 더욱 증진될 수 있다. PEG 화의 부가적인 이점 중에는 나노 입자의 순환 반감기에서의 증가가 있다. PEG의 부가적인 이점은 만약 직접적인 컨쥬게이션이 합성적으로 용이하게 구현될 만한 것이 아닌 경우에, 그것이 자인 나노 입자에 대하여 타겟팅 리간드, 약물 및 이미징 물질을 링크 시키기 위한 공간으로서 작용할 수 있다는 것이다.

도 17은 다른 실시예에 따른 PEG화된 자인 나노 입자를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 나노 입자를 제조하는데 있어서 PEG화된 자인의 장점은, 비-자인화된 자인에 대하여 계면활성제 및 인지질의 조합을 사용하는 것과 대조적으로, 그것이 PLURONIC®F68과 같은 계면활성제를 단독으로 사용하여 만들어질 수 있다는 점에 있다. PEG화된 자인 나노 입자를 형성하는 구체적인 방법은 하기와 같다.

PEG화된 자인은 5 mL의 90 % 에탄올 내에서 0.1 g의 백색 자인에 대해 0.1 g의 메톡시 PEG-숙신이미딜 숙시네이트 (methoxy PEG-succinimidyl succinate)(Mwt 5000 Da)를 첨가하는 것에 의하여 제조되었다. 상기 혼합물은 37 ℃에서 3-24 시간 동안 인큐베이트 되었다. 다음으로 용액은 어떤 잔여 물질을 제거하기 위하여 실온에서 24 시간 동안 마그네틱 스터러 (100 rpm에서 교반되는 마그네틱 스터바) 내에서 물에 대하여 투석되었다 (분자량 컷 오프 10 kDa). 결과로서 얻어지는 생성물은 다음으로 -80 ℃에서 동결 되었으며 -47 ℃에서 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조되었다. 다양한 인큐베이션 시간에 걸쳐 관찰되는 PEG화의 효율이 하기 표 6-1에서 보여지며, 여기서 효율 퍼센트는 상기에서 기재된 바와 같이 TNBS 분석법을 사용하여 결정되었다.

다른 분자량의 PEG들, 예를 들면 500 부터 5000 Da 까지의 것, 이 사용될 수 있다. 이와 유사하게 메톡시 PEG-N-하이드록실 숙시네이트 에스테르 (PEG-N-hydroxyl succinate ester)와 같은 PEG 유도체 또는 다른 유도체들이 또한 사용될 수 있다.

[표 6-1]

50 mg의 PEG화된 백색 자인이 3 mL 에탄올 및 0.25 mL 물의 혼합물 내에 용해되었다. PEG화된 자인 용액은 다음으로 10 분 동안 10 초의 온 타임 (on time) 및 1 초의 오프 타임 (off time) 펄스를 갖는 1.39 kW/h 에서의 및 37 % 진폭의 초음파 에너지의 지속적인 적용 하에 드롭-와이즈 (drop-wise)의 형태로 pH 7.4을 가지고 PLURONIC®F68 (0.9 % w/v)을 함유하는 15 mL의 시트레이트 버퍼에 대하여 첨가되었다. 초음파 프로세스 동안에, 상기 용액은 약 10 ℃로 온도를 유지시키기 위하여 아이스 배쓰 내에서 유지되었다. 후속적으로, 자인 현탁물은 에탄올이 완전히 증발될 때까지 실온에서 300 rpm 내지 500 rpm 사이의 마그네틱 스터바 상에 놓여졌다. 에탄올의 완전한 증발 후에, 나노 입자는 정제되었다.

정제는 pH 7.4 시트레이트 버퍼에 의한 반복된 세척을 하는 것 및 35 분 동안 44,000 g에서 10000 Da의 분자량 컷 오프의 원심 분리 여과기를 사용하는 원심분리에 의해 달성되었다. PEG화된 자인 나노 입자의 수성의 현탁물 (pH 7.4 시트레이트 버퍼) 에 대하여 30 g의 2 % w/v 트레할로스 (trehalos)가 첨가되었고, 또한 그 용액은 고체 케이트를 형성하기 위하여 -80 ℃에서 보관되었으며, 그것은 다음으로 -47 ℃에서 및 60 mTorr 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조 되었다. 상기 기재된 PEG화 과정은 상기 실시예 2에 개시된 바와 같이 높은 압력의 균질화를 사용하여 수행될 수 있다. PEG화된 나노 입자의 크기 분포가 도 18 에 보여진다.

실시예 7. 레티놀 로드된 자인 나노 입자

본 실시예는 레티놀 로드된 자인 나노 입자의 제조 및 그 특성, 레티놀 자체와 비교할 때 자인 나노 입자를 사용하는 레티놀의 향상된 용해도, 자인 나노 입자 내로 캡슐화시키는 것에 의한 레티놀의 향상된 안정성, 자인 나노 입자로부터 레티놀의 지속된 방출, 레티놀의 피부 침투성 및 피부 보유성을 향상시킬 수 있는 자인 나노 입자의 능력, 레티놀 나노 입자화 제형의 감소된 피부 자극성을 기재한다.

1. 레티놀 로드된 자인 나노 입자의 제조 및 특성.

자인 나노 입자는 자인, 레티놀 및 부틸레이티드 하이드록실 톨루엔 (butylated hydroxyl toluene (BHT)) (항 산화제) 이 90 % 에탄올 내에 용해되는 상 분리 방법을 사용하여 제조되었다. 이 용액은 안정화제로서 레시틴과 PLURONIC을 함유하는 시트레이트 버퍼 (pH)에 대하여 첨가되었다. 알콜이 증발되어 나노 입자가 형성되었고 또한 다음으로 나노 입자는 원심 분리에 의해 분리되었고 및 동결 건조에 의해 후속되었다. "콜드(cold)" 레티놀과 함께 방사선 표지된 (³H) 레티놀이 분석을 위해 사용되었다. 어떤 실시예들에서, 다른 적합한 항산화제로서 BHT를 대체하는 것 또는 그것과 조합하는 것이 사용될 수 있으며, 비타민 E, 비타민 C, 글루타치온 (glutathione), 유비퀴놀린 (ubiquinone), 코엔자임 Q-10 (coenzyme Q-10), 이데베논 (idebenone), 라이코펜 (lycopene), 그린 티 (green tea), 및 실리마린 (silymarin)을 포함한다.

레티놀 로드된 자인 나노 입자의 입자 크기는 약 170-290 nm이며 또한 캡슐화 효율은 76-100%였다. 입자 크기 및 캡슐화 효율은 약물/고분자 비율 및 BHT의 농도를 조정하는 것에 의해 최적화될 수 있다. BHT의 부재 하에서, 캡슐화 효율은 <50 % 였다. 표 7-2는 레티놀-로드된 나노 입자의 특성에 대한 데이터를 제공한다. 레티놀-로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 예를 제공하는 플로우 차트에 대해서는 도 19를 참조하라.

[표 7-1]

2. 수성 용액 내에서 레티놀의 증가된 용해도/분산성.

자유 레티놀은 물 속에서 분산성이 아니며 물질의 의도된 분산 후에 바이엘의 바닥에 정착된다 (도 20). 다른 한편, 레티놀 로드된 자인 나노 입자는 물 속에서 용이하게 분산되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 레티놀의 용해도는 나노 입자 내로의 캡슐화 후에 현저하게 향상되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 레티놀 (레티놀 상당량) 나노 입자의 샘플 10 ㎍/mL이 20 % 메탄올 내에서의 자유 레티놀 10 ㎍/mL에 대한 비교할 만한 UV 흡광도 (320 nm) 를 보여주었다. 매우 작은 흡광도가 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 레티놀의 분산물 10 ㎍/mL 에서 관찰되었다.

3. 자인 나노 입자로부터의 레티놀의 방출.

나노 입자로부터의 레티놀의 방출에 대한 연구가 포스페이트 버퍼 식염수 (PBS, pH 7.4) 내에서 수행되었다. 레티놀의 농도는 320 nm에서의 UV 분광 광도계를 사용하여 분석되었고, 또한 방출 연구는 세 번에 걸쳐 수행되었다. 레티놀 방출은 도 21에서 보여지는 바와 같이 자인 나노 입자로부터 수 일 동안 지속되었다.

4. 레티놀 로드된 자인 나노 입자의 안정성

레티놀은 황색의 파우더이다. 그것은 주변의 환경에서 흡습성이며 또한 빨리 스티기(sticky)해 진다. 캡슐화된 레티놀은 무색이며 자유롭게 흐르고, 또한 훨씬 작은 흡습성을 갖는다 (도 22). 도 22 에서 보여지는 레티놀 샘플은 밝은 황색이고 나노 캐리어 제형은 백색이며, 이는 캡슐화가 레티놀의 밝은 황색을 커버한다는 것을 나타낸다. 나노 캐리어 제형은 또한 순수한 레티놀보다 훨씬 자유롭게 흐르는 파우더의 결과를 가져온다.

주변의 환경 및 어두운 곳에서 레티놀 제형의 안정성이 일 주일의 기간에 걸쳐 연구되었다. 레티놀 및 레티놀 로드된 나노 입자 (동결 건조된 파우더) 의 고체상 안정성이 또한 일 주일에 걸쳐 연구되었다. 액체상 안정성에 대하여, 자유 레티놀 또는 레티놀 로드된 나노 입자가 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 분산되었고 또한 레티놀 농도는 UV 분광법 (320 nm)을 사용하여 일 주일 동안 측정되었다. 레티놀은 제 1차 동력학을 따르는 것으로 밝혀졌으며 반감기가 측정되었다. 하기의 결과들이 표 7-2 및 7-3 및 도 23-26 에서 보여지는 바와 같이 얻어졌다.

자인 나노 입자는 광 분해 및 습기가 유발하는 분해에 대하여 레티놀을 보호하였다. 고체 상태 및 액체 상태에서 캡슐화된 레티놀은 자유 레티놀과 비교할 때 향상된 안정성을 보였다. 산화 방지제로서의 BHT의 포함은 캡슐화된 레티놀의 안정성을 추가적으로 향상시켰다. 최종적으로, 레티놀의 품질-수명은 자인 나노 입자 내에서의 캡슐화에 의하여 현저하게 향상되었다.

[표 7-2]

[표 7-3]

5. 레티놀 및 캡슐화된 레티놀의 피부 침투성.

레티놀 및 캡슐화된 레티놀의 피부 침투성은 수직의 디퓨젼 셀(vertical diffusion cell)을 사용하여 절개된 돼지 귀 피부를 사용하여 연구되었다. '콜드(cold)' 레티놀과 함께 방사선 표지된 (³H) 레티놀이 본 연구에서 사용되었다. 48 시간의 종결 시점에서 피부 균질체 및 수용체 매개 내에서의 레티놀의 양은 방사 화학적 분석법을 사용하여 측정되었다. 이 실험은 6 회 반복되었다 (±SD). 도 27에서 보여지는 바와 같이, 캡슐화된 레티놀은 피부에서의 레티놀의 더 큰 보유성의 결과를 가져왔다. 자유 레티놀 및 레티놀 나노 입자에 대해서 "수용체에 대한 피부 내에서의 레티놀"의 비는 각각 3 및 11 이었다. 상기 결과들은 나노 입자가 레티놀의 피부 내에서의 더 큰 보유성의 결과를 가져왔다는 것을 보여준다.

요약하면, 자인 나노 입자는 레티놀의 수성 용해성 및 분산성을 현저하게 증가시켰다. 나노 입자 내로의 레티놀의 캡슐화는 황색의, 스티키하며, 또한 흡습성 파우더인 자유 레티놀과 다르게, 자유롭게 흐르는 무색의 파우더의 결과를 가져왔다. 자인 나노 입자는 효과적으로 레티놀의 방출을 지속시켰다. 레티놀의 광 안정성 및 가수 분해에 대한 안정성이 자인 나노나노 입자 내로 캡슐화시키는 것에 의해 현저하게 향상되었고, 이는 산화 방지제로서의 BHT의 첨가에 의해 더욱 향상되었으며, 또한 자인 나노 입자는 레티놀의 더 높은 피부 보유성의 결과를 가져왔다. 나노 입자는 또한 레티놀의 피부 자극을 감소시킬 수 있다.

실시예 8. 로다민 123 로드된 비 교차 결합된 자인 나노 입자.

상 분리 방법을 사용하여 로다민 123 ((0.0296 % 및 0.0370 % w/w) 로드된 비 교차 결합된 자인 나노 입자를 제조하기 위한 일반적인 과정들이 하기 표 8-1에 제공되었다.

[표 8-1]

도 29는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자인 나노 입자로부터 로다민 123의 생체 외에서의 방출을 도시한 것이다. 이러한 연구에서, 0.0296 % w/w의 로다민 123 로드된 비-교차 결합된 나노 입자들이 연구를 위하여 사용되었다. 로다민 123 농도가 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서의 형광 분광기에 의하여 측정되었다 (평균 ± SEM; n=3).

도 30은 자유 로다민 123 (10 ㎍)과 로다민 나노 입자 (10 ㎍의 로다민 123에 상당하는)의 6 시간 후의 돼지의 분절된 (dermatomed) 피부로의 침투성을 도시한 것이다. 절개된 (excised) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 로다민 123 및 로다민 나노 입자 분산물은 도너 챔버에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부는 표면에 흡착된 로다민 123을 제거하기 위하여 철저히 세척되었고 또한 피부는 OCT 플루이드 내에 놓여졌으며 액체 질소 내에서 동결되었다. 후에 피부는 크료톰 (cryotome)으로 분할되었으며 (sectioned) 형광 현미경 하에서 관찰되었다. 도 30으로부터 보여지는 바와 같이, 로다민 나노 입자는 피부의 최상 층 (SC)에서 제한되었던 자유 로다민과 비교할 때 더 깊은 피부 내로 침투하였다.

도 31은 자유 로다민 123 (10 ㎍)과 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 로다민 123 (10 ㎍의 로다민 123에 상당하는)의 6 시간 후의 돼지의 분절된 (dermatomed) 피부로의 침투성을 도시한 것이다. 절개된 (excised) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 및 캡슐화된 로다민 123 분산물은 도너 챔버에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부는 철저히 세척되었고 또한 피부에서의 로다민 123의 형광성이 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 사용하여 측정되었으며 피부의 다른 층들에서의 형광 픽셀 강도를 사용하여 정량화되었다 (평균 ±SE; n=3). 도 31에서 보여지는 바와 같이, 형광 강도는 로다민 나노 입자에 대하여 현저하게 더 높다.

실시예 9. 플루오로이소티오시아네이트 (Fluoroisothiocyanate (FITC))로드된 자인 나노 입자.

플루오로이소티오시아네이트 (Fluoroisothiocyanate (FITC))는 389.382의 분자량 및 5.03의 Log P 를 갖는다. FITC는 물 속에서 약간 용해성인 형광 염료이며 (0.1 mg/mL 보다 작은), 에탄올, 메탄올, 디메틸 술폭사이드 및 디메틸포름아미드 내에서 완전하게 용해성이다.

FITC

에멀젼 용매 증발 방법 (emulsion solvent evaporation method)을 사용하여 제조된 FITC-로드된 자인 나노 입자의 특성이 표 9-1에서 보여진다.

[표 9-1]

도 32는 일 실시예에 따른, 에멀젼 용매 증발 방법 (emulsion solvent evaporation method)을 사용하는 FITC-로드된 자인 나노 입자의 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의하여 도시한 것이다.

도 33은 자유 FITC (10 ㎍) 및 과 FITC 나노 입자 (10 ㎍ 에 상당하는)의 6 시간 후의 돼지의 분절된 (dermatomed) 피부로의 침투성을 도시한 것이다. 절개된 (excised) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 FITC 및 FITC 나노 입자 분산물은 분리된 도너 챔버에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부는 표면에 흡착된 FITC 를 제거하기 위하여 철저히 세척되었고 또한 피부는 OCT 플루이드 내에 놓여졌으며 액체 질소 내에서 동결되었다. 피부는 그런 다음 크료톰 (cryotome)으로 분할되었으며 (sectioned) 형광 현미경 하에서 관찰되었다. 도 33으로부터 보여지는 바와 같이, FITC 나노 입자는 피부의 최상 층 (SC)에서 제한되었던 자유 FITC와 비교할 때 더 깊은 피부 내로 침투하였다.

도 34는 자유 FITC (10 ㎍)과 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 FITC (10 ㎍에 상당하는)의 6 시간 후의 돼지의 분절된 (dermatomed) 피부로의 침투성을 도시한 것이다. 절개된 (excised) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 및 캡슐화된 FITC 분산물은 도너 챔버에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부는 철저히 세척되었고 또한 피부에서의 FITC의 농도가 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 사용하여 측정되었으며 피부의 다른 층들에서의 형광 픽셀 강도를 사용하여 정량화되었다 (평균 ±SE; n=3). 도 34에서 보여지는 바와 같이, 형광 강도는 SC 내의 FITC 나노 입자에 대하여 더 높다.

실시예 10. 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil (5-FU)) 로드된 자인 나노 입자.

5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil (5-FU)) 은 130.077의 분자량 및 -0.89의 Log P 를 갖는다. 5-FU 는 차가운 물 및 메탄올에서 부분적으로 용해성이고, 디메틸 술폭사이드 및 디메틸포름아미드 내에서 완전하게 용해성이며, 또한 디에틸 에테르 내에서 불용성이다.

5-FU 는 소수성 약물 (log P = -0.89)이며 또한 피부를 통과하는 것에 대하여 열악한 투과성이다 (콘 웰 및 배리(Cornwell and Barry), 인터내셔널 저널 오브 팜 (Int J Pharm) 94, 189-194, 1993). 상기 약물은 예를 들면, 건선, 악성이 되기 전의 (premalignant) 광선 각화증 (actinic keratosis) 및 악성의 (malignant) (피부 암) 피부 질환들 (츠지 및 수가이 (Tsuji and Sugai), 아크 더마톨 (Arch Dermatol) 105, 208-212, 1975; 고에트 (Goette), 저널 오브 아메리카 아카데미 더마톨 (J Am Acad Dermatol) 4, 633 649,1981). 에멀젼 용매 증발 방법을 사용하여 제조된 5-플루오로우라실-로드된 자인 나노 입자의 특성이 표 10-1에 보여진다.

[표 10-1]

도 35는 일 실시예에 따른, 에멀젼 용매 증발 방법을 사용하여 5-플루오로우라실 로드된 자인 나노 입자를 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의하여 도시한 것이다.

도 36은 수용체 매개 내에서의 적용된 5-플루오로우라실의 퍼센트를 도시한 것이다. 절개된 (excised) 피부 분절된 (dermatomed) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자유 및 캡슐화된 5-FU 분산물은 도너 챔버에 로딩되었다. 수용체 매개 내에서의 5-FU 농도는 ¹⁴C 표지된 5-FU를 사용하는 방사 화학적 방법에 의하여 다양한 간격들에서 측정되었다 (평균 ± SE; n=3). 도 36에서 보여지는 바와 같이, 자인 나노 입자는 5-FU의 피부 침투성을 현저하게 향상시켰다. 상기 결과는 자인 나노 입자가 플루로닉®(PLURONIC®) 및 레시틴의 존재로 인하여 피부 침투성 증진제로서 작용할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 11. 자인-카세인 나노 입자

신규한 자인-카세인 코어 쉘 나노 입자가 제조되었고, 여기서 소수성 자인이 코어를 형성하고, 반면 친수성 우유 단백질 β-카세인이 친수성 쉘을 형성하였다. 글리아딘, 카피린 및 호르데인과 같은 다른 소수성 프롤아민이 또한 자인을 대신하여 사용될 수 있으며, 카파 또는 감마 카세인 또는 소듐 카에시네이트 (sodium caesinate)와 같은 다른 카세인이 카세인을 대신하여 사용될 수 있다. 이러한 신규한 시스템의 유리한 점은 자인 및 카세인 양자가 생분해성이고 또한 생체 적합성의 식품 단백질이라는 점을 포함한다. 카세인은 친양쪽성 (amphiphilic) 계면활성제로서 자인 나노 입자를 안정화시키며, 응집을 막아주고, 또한 더 작은 크기의 나노 입자를 형성한다. 카세인은 캡슐화 효율을 증가시키는 것을 도울 수 있고 또한 나노입자의 약물 방출 특성을 조절하는 것을 도울 수 있다. 약물은 소수성 코어, 친수성 쉘 또는 양자 모두에 대해 로드될 수 있다.

자인 및 카세인 양자가 단백질이기 때문에, 그들은 표면 변형 또는 코어의 변형을 위한 수많은 기능성 그룹들을 포함한다. 상기 코어 및 쉘은 양자 모두 다양한 적용을 위해 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 코어 및/또는 쉘 중 어느 것도 여기 기재된 바와 같이 교차 결합될 수 있다. 이와 유사하게, 약물은 코어 및/또는 쉘에 대하여 복합체화되거나 및/도는 컨쥬게이트될 수 있다.

카세인, 친양쪽성 단백질인, 은 피부 지질과 함께 상호 작용할 수 있어 나노 입자의 피부 침투성을 증가시킬 수 있다. 도 37은 자인-카세인 코어 쉘 나노 입자의 형성을 대략적으로 도시한 것이다. 도 38은 일 실시예에 따른, 상 분리의 방법을 사용하여 β-카세인과 함께 안정화되는 자인 나노 입자를 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 표 11-1 은 상 분리의 방법을 사용하여 제조된, β-카세인과 함께 안정화된 자인 나노 입자의 여러 가지 특성들을 나타낸 것이다. 자인 나노 입자의 제조에 대하여, 상기 β-카세인의 농도는 시트레이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 0.05-1.0 % w/v의 범위에서 사용되었다.

[표 11-1]

도 39는 일 실시예에 따른, 상 분리의 방법을 사용하여 β-카세인과 함께 안정화되는 닐 레드 로드된 자인 나노 입자를 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 표 11-2 는 상 분리의 방법을 사용하여 제조된, β-카세인과 함께 안정화된 닐 레드 로드된 자인 나노 입자의 여러 가지 특성들을 나타낸 것이다. 닐 레드 나노 입자의 제조에 대하여, 상기 닐 레드의 농도는 0.0066-0.066% w/w 으로부터의 범위였다. 사용된 β-카세인 농도는 시트레이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서 0.1 %- 0.2 % w/v 였다.

[표 11-2]

도 40은 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내의 자인 나노 입자로부터 닐 레드의 생체 외에서의 방출을 도시한 것이다. 닐 레드의 농도는 559 nm의 여기 파장 및 629 nm의 방출 파장에서의 분광 형광계 (spectrofluorimeter)에 의하여 측정되었다 (평균 ± SEM; n=3). 도 41은 자유 닐 레드 및 자인-카세인 나노 입자 내에 캡슐화된 닐 레드의 피부 침투성을 도시한 것이다. 도 42는 일 실시예에 따른, 상 분리 방법을 사용하여 카세인으로 안정화된 레티놀 로드된 자인 나노 입자의 제조에 대한 일반적인 과정들을 플로우 차트 수단에 의하여 도시한 것이다. 표 11-3 은 상 분리의 방법을 사용하여 제조된, β-카세인과 함께 안정화된 레티놀-로드된 자인 나노 입자의 여러 가지 특성들을 나타낸 것이다. 레티놀 나노 입자의 제조에 대하여, 등가의 BHT의 농도를 포함하는 0.006-0.066% w/w 으로부터의 범위인 레티놀의 농도가 고려되었다. β-카세인 농도는 시트레이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서 0.1 %- 0.2 % w/v 범위 내에서 사용되었다.

[표 11-3]

실시예 12. 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀에 대한 크림 제형의 제조.

상업적인 개발을 위한 전달용으로서 피부 제형화의 구현 가능성을 보여주기 위하여, 상업적인 크림 베이스 (MEDCO Labs) 가 자유 레티놀 또는 자인 나노 입자 내로 캡슐화된 레티놀을 혼입하는데에 사용되었다. 크림 베이스는 스테아릴 알콜 (stearyl alcohol) (14 %), 세틸 에스테르 왁스 (cetyl esters waxes) (3.5 %), 글리세릴 모노스테아레이트 (glyceryl monostearate) (2 %), 폴리에틸렌 스테아릴 에테르 (polyyethylene stearyl ether) (3 %), 소르비톨 (sorbitol) (10 %), 이소프로필 팔미테이트 (isopropyl palmitate) (2 %), 메틸 파라벤 (methyl paraben) (0.16 %), 프로필 파라벤 (propyl paraben) (0.4 %) 및 순수한 물 (65 %)을 포함한다. 0.1 % w/w 상당의 레티놀이 무게 재어졌으며 또한 시계 접시로 이동되었고 기하학적인 희석 (geometric dilution)에 의한 유리 막대를 사용하여 균일하게 혼합되었다. 이에 제한되는 것은 아니나, 오일-워터 크림, 오일 크림 내 워터, 연고, 젤, 및 기타 등등을 포함하는 다른 제형이 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 ³H-레티놀의 0.05 μCi로 스파이크되었고(spiked) 또한 크림 내에서 격렬하게 혼합되었다. 최종적으로, 제조된 크림 제형은 유리 바이엘로 이동되었고 또한 사용 시까지 저장되었다.

[표 12-1]

도 43에서 보여질 수 있는 바와 같이, 캡슐화된 제형은 안정되게 유지되었고 또한 실온에서 어떠한 열화(degradation)도 보이지 않았다. 나아가, 도 45에서 보여질 수 있는 바와 같이, 나노 입자로부터 레티놀의 방출은 지속적이었다. 도 45의 데이터에 의해 지지되는 바와 같이, 더 많은 양의 레티놀이 자유 레티놀과 비교할 때 캡슐화된 레티놀에 의해 피부 내에 보유된다.

표준화 대 (vs.) 캡슐화된 제형의 피부 자극이 표 11-2에 목록화된 바와 같은 처치 그룹들을 사용하여 SKH-1 헤어리스 마우스에서 생체 내로 테스트되었다.

[표 12-2]

레티놀 크림 제형들 (0.1 % w/v 레티놀 상당의 0.5 g) 이 5 일 동안 매일 SKH-1 헤어리스 마우스의 등에 대해 적용되었다. 경표피 수분 손실(Transepidermal Water Loss (TEWL)) 값이 TEWA 미터 (Delfin)을 사용하여 매일 제형의 적용 전에 측정되었다.

도 46은 캡슐화된 레티놀 대 (versus) 자유 레티놀을 함유하는 크림 사이에서의 경표피 수분 손실(Transepidermal Water Loss (TEWL)) 데이터를 보여준다. TEWL에서의 증가는 피부 자극의 척도이며 또한 도면에서 보여지는 바와 같이, 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀은 어떠한 피부 자극도 보이지 않았고 네거티브 대조군 (즉, 처치 없음)에 비교될 만 하였다. 다른 한편 자유 레티놀 크림은 피부 자극을 보였다. 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate) (SLS), 피부 자극제로서 알려져 있는, 는 포지티브 대조군으로서 사용되었다.

크림 제형들에 대한 생물학적 가용능 (bioavailability) 데이터를 얻기 위하여, 자유 및 나노 입자 캡슐화된 레티놀의 생체 내에서의 국소적인 생물학적 가용능이 SKH-1 헤어리스 마우스에서 측정되었다. 도 47에서 보여지는 바와 같이, 나노 입자 캡슐화된 레티놀은 혈액 내로 어떠한 체계화된 흡수 없이 피부 내에 보유되었다.

실시예 13. 자인 나노 입자의 모낭으로의 전달.

자인 나노 입자의 피부 이송을 추적하기 위하여, 형광 프로브가 화학적으로 자인에 대하여 컨쥬게이트되었다. 2 mg의 플루오로이소티오시아네이트 (fluoroisothiocynate (FITC)), 4 mg의 1-(3-디메틸 아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC)), 및 2.94 mg의 N-하이드록시 숙신이미드 (N-hydroxy succinimide)가 5 mL의 90 % 에탄올 내에 용해되었고 또한 교반 하에 3 시간 동안 인큐베이트되었다. 후속적으로, 자인 (50 mg)이 첨가되었고 또한 3 시간 동안 인큐베이트되었다. 그런 후에 혼합물은 물에 대하여 약 8 내지 10 시간 동안 투석되었다. 최종적으로, 분산물은 동결 건조 되었다. 자인-FITC 의 컨쥬게이션은 NMR 스펙트로스코피에 의하여 확인되었다. 나아가, 나노 입자는 도 1에 도시된 바와 같은 방법을 사용하여 제조되었다. 자인-FITC 컨쥬게이트된 나노 입자의 공초점 연구가 또한 수행되었다.

100 μl의 PBS pH 7.4 내에 분산된 자인-FITC 나노 입자 (5 ㎍의 FITC 에 상당하는) 이 피부 침투 연구를 위하여 사용되었다. 절개된 (excised) 돼지 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 유지되는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. FITC 표지화된 나노 입자가 피부에 대하여 6 시간 동안 적용되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부는 세척되었고 또한 공초점 형광 현미경 하에서 관찰되었다. 도 48에서 보여지는 바와 같이, 자인 나노 입자는 주로 헤어 모낭으로 국지화 되었다. 나아가, 측정된 파장에서 피부로부터 어떠한 자가 형광 (autofluorescence)도 존재하지 않았다. 이것은 또한 형광성이 표면으로부터 100 ㎛ 깊이의 피부 내부에 이르기까지 연속된 부분(streaks)에서 관찰되는 왼쪽 패널로부터 명백하다. 자인 나노 파티크에 대한 피부 이송을 보여주는 것에 부가적으로 상기 결과들은 또한 그것이 다양한 모낭성 질병을 처치하기 위하여 헤어 모낭을 타겟화하기 위하여 사용될 수 있음을 보여준다. 이러한 것들은 여드름, 탈모, 지루성 습진 (seborrhetic eczema), 모낭염(follicullitis) 및 어떤 피부 암을 포함한다. 여드름의 처치를 위하여 레티놀의 사용을 가정하면, 자인 나노 입자 내에 캡슐화된 레티놀은 여드름의 효과적인 처치를 위하여 헤어 모낭에 대하여 타겟화될 수 있다.

레티놀의 모낭 타겟팅을 보여주기 위하여, 피부 샌드위치 모델이 사용되었다. 상기 샌드위치 피부에서 (도 28을 참조하라), 모낭으로의 경로는 표피 위로 샌드위치되어 있는 SC에 의하여 차단된다. 상기 샌드위치 피부 모델에서 수용체 부분으로 이동된 레티놀의 양은 통상적인 피부 표피 침투 연구와 비교할 때 자유 및 나노 입자 캡슐화된 레티놀 양자에 있어서 감소되었다. 그러나 나노 입자로부터 레티놀의 이동에서는 현저한 감소가 존재하였고 이는 레티놀 마이셀의 현저한 분획이 헤어 모낭을 관통하여 이동된 것을 나타낸다. 모낭 타겟팅은 헤어 모낭 내에서의 질병 사이트에 대하여 레티놀을 타겟팅하는 나노 입자의 추가된 장점이다.

실시예 14. 피부 지질과 자인 나노 입자의 상호 작용

피부 지질과 자인 나노 입자의 상호 작용 및 그것이 피부 침투 인핸서로서 작용할 수 있는지에 대한 테스트를 이해하기 위하여, 근-적외선 분광학 연구가 수행되었다. 돼지 표피가 수직의 디퓨젼 셀 내에 장착되었고 또한 37 ℃에서 자인 나노 입자로 24 시간 동안 처치되었다. 상기 표피는 스펙트럼을 기록하기 전에 WHATMAN 여과지로 건조 블랏팅 되었다 (dry blotted). 상기 스펙트럼은 처치 이전 및 이후에 기록되었다. 스펙트럼은 니콜렛 380 ATR-FITR 분광 광도계 (NICOLET 380 ATR-FITR spectrophotometer) (THERMO ELECTRON Corporation, 매디슨 (Madison), WI) 내에서 ZnSe 에 대하여 2 cm^-1 의 해상도로 기록되었다. 각 스펙트럼은 평균 100 스캔이었다. 피부 지질의 피크 포지션이 OMNIC 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.

[표 14-1]

표 14-1에서 보여지는 바와 같이, 지질 대칭적 (2850 cm^-1) 및 비대칭적 (2920 cm^-1) 피크들이 더 높은 파장 수 쪽으로 이동되었다. 지질 스트레칭 피크에서의 이동은 피부 지질과의 상호 작용을 나타낸다. 상기 이동은 버퍼 처치에 의해 관찰되는 이동과 비교할 때 현저하였다. 이러한 결과들은 자인 나노 입자가 피부 침투성을 증가시키는 침투 인핸서로서 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 이론에 의하여 구속되는 일 없이, 침투성 증진은 제형에서의 레시틴 및 PLURONIC 계면활성제에 기인하는 것일 수 있다.

실시예 15. 단백질 약물의 캡슐화/흡착성

단백질 약물의 캡슐화를 위하여, 도 1의 방법이 변형되었다 (도 49를 참조하라). 제 1 상에서의 에탄올이 수 용해성 단백질 약물을 침전시킬 수 있기 때문에, 자인을 용해시키기 위하여 에탄올은 소듐 라우릴 설페이트로 대체되었다. 도 49 및 50에서 보여지는 방법이 모델 단백질 소 혈청 알부민 (BSA, 66 kDa) 및 혈소판 풍부 플라즈마 (PRP) 의 캡슐화에 대하여 사용될 수 있었다.

실시예 16. 혈소판 풍부 플라즈마 (PRP) 의 제조.

신선한 돼지/양 혈액이 PRP를 분리하기 위하여 사용되었다. 혈액은 항-응고제로서 EDTA를 첨가하는 것에 의하여 수집되었다. 10 mL 정도의 혈액이 20 ℃ 에서 2400 rpm 으로 10 분 동안 원심 분리되었다. 그 후에, 상청액 (PRP 및 혈소판 부족 플라즈마) 이 다른 튜브 내로 수집되었으며 또한 20 ℃ 에서 3600 rpm 으로 15 분 동안 원심 분리되었다. 혈소판 부족 플라즈마가 제거되었으며 또한 튜브의 바닥에서 1 ml의 플라즈마가 PRP로서 수집되었다. 혈소판 카운트가 자동 세포 카운터 (automatic cell counter) 와 함께 물을 사용하여 플라즈마를 100 배 희석시키는 것에 의하여 수행되었다.

양 혈액 PRP 카운트 : 2.4 x 10⁸ 혈소판 수/ml

돼지 혈액 PRP 카운트 : 2.34 x 10⁸ 혈소판 수/ml

[표 16-1]

1 mg의 나노 입자가 1 분 동안의 배쓰 초음파 처리를 이용하여 1 ml의 물에 분산되었다. 샘플들은 물로 100 배 희석되었고 또한 입자 크기는 NICOMP 입자 크기 분석기 (NICOMP particle size analyzer)를 사용하여 측정되었다.

실시예 17. 자인 나노 입자에 대한 PRP 의 흡착

자인 나노 입자는 다른 안정화제가 제 2 수성 상에서 사용된다는 점을 제외하고 : 0.1% 트윈 80 (TWEEN 80) 또는 플루로닉 F68 (PLURONIC F68) 또는 카세인이 단독으로 사용되었다, 도 1 에 기재된 바와 같은 동일한 과정을 사용하여 제조되었다. 나노 입자의 입자 크기는 NICOMP 입자 크기 분석기 (NICOMP particle size analyzer)를 사용하여 측정되었다.

[표 17-1]

정확하게 칭량된 양의 자인 나노 입자 (200 mg)이 바이엘 내에 담겨졌고 또한 0.6 mL 의 PRP 용액 및 4.4 ml의 시트레이트 버퍼 (pH 7.4)가 첨가되었다. 그 후에 상기 바이엘은 37 ℃에서 200 rpm 으로 2 내지 6 시간 동안 인큐베이트 되었다. 연구의 종결 시점에서, 분산물은 15,000 rpm 으로 10 분 동안 원심 분리되었고 또한 펠렛 (pellet)으로부터 흡착된 PRP가 혈소판 유도된 성장 인자 (platelet derived growth factor (PDGF)) 에 대하여 특수화된 ELISA 키트를 사용하여 분석되었다.

[표 17-2]

다른 자인 나노 입자들 사이에서는 흡착의 능력에 있어 현저한 차이가 존재하지 않았지만, 반면 자인-카세인 나노 입자는 가장 높은 흡착성을 보여주었다. 이와 유사하게도, 인큐베이션 시간과 함께 증가되는 흡착성은 그러나 현저하지 않았고, 따라서 2 시간이 PRP 흡착에 대해 충분할 것이다.

실시예 18. PSA 교차 결합된 ZC 나노 입자.

본 작업의 목적은 소수성 코어 자인 및 친수성 쉘 카세인을 기반으로 하는 쉘 교차-결합된 나노 입자를 제공하는 것이다. 폴리 살리실산 (Polysialic acid (PSA))은 분자량 11 kDa을 갖는 α-2,8-링크된 시알 산 (α-2,8-linked sialic acid) 단위로 이루어진 네거티브하게 대전된 폴리사카라이드 호모폴리머이다. 폴리 살리실산은 다른 교차-결합제와 비교할 때 그것의 생체 적합성 때문에 교차-결합된 쉘에 대하여 사용될 수 있다.

EDC 및 NHS 가 PSA에 대해 부가되었으며 10 ml의 탈이온수 내에 용해되었다. 실온에서 3 분 동안 교반한 다음, 자인-카세인 나노 입자 (도 39에 기재된 방법을 사용하여 제조된) 이 부가되었고, 또한 반응이 하룻 밤 동안 진행되도록 하였다. EDC는 PSA 상의 카르복실 그룹들을 아민-반응성의 NHS 에스테르로 전환시키기 위해 첨가되며 이것은 그런 다음 단백질의 프라이머리 아민과 함께 상호 작용할 수 있다. 상기 용액은 원심 분리되고 또한 바람직한 교차-결합된 나노 입자 (자인-카세인 나노 입자)을 수득하기 위하여 동결 건조된다.

실시예 19. PSA-자인 나노 입자.

본 작업의 목적은 코어로서 자인 및 쉘로서 친수성 PSA를 사용하여 코어-쉘 나노 캐리어를 형성하는 것이다. 이 경우에서, PSA는 자인에 대하여 화학적으로 컨쥬게이트 된다. PSA는 소듐 메타페리오데이트 (sodium metaperiodate (NaIO₄)에 의해 산화된다. PSA 및 자인 혼합물은 15 분 동안 어두운 곳에서 보관되었다. 산화된 PSA는 알콜로 침전되었고 원심 분리에 의하여 후속되었으며 추가적인 용도를 위해 동결 건조 되었다. 자인과 알데히드성 PSA에 대한 커플링 반응은 환원 효소로서 2-피콜린-보란 (2-picoline-borane)의 존재 하에 DMSO/물 혼합물 내에서 수행되었다. 컨쥬게이션 반응을 위하여, 상기 혼합물은 마그네틱 스터러 하에서 48 시간 동안 유지되었다. 코어-쉘 나노 캐리어는 물에 대하여 투석되었고 또한 동결 건조되었다.

실시예 20. 약제학적 용량 형태

하기의 제형들은 여기 기재된 나노 입자 제형의 치료용의 또는 화장용으로서의 투여를 위해 사용될 수 있는 대표적인 약제학적 용량 형태들을 보여주며, 그것은 수성의 분산물 또는 동결 건조된 파우더일 수 있다 (이후로 "조성물 X" 로 표시되는).

이러한 제형들은 약제학 기술 분야에서 잘 알려져있는 통상적인 과정을 통하여 제조될 수 있다. 상기 약제학적 조성물들은 활성 성분 '조성물 X'의 양 및 유형을 다르게 제공하기 위하여 잘 알려져 있는 약제학적 기술에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 에어로졸 제형 (vi)는 표준의, 미터화된 용량의 에어로졸 디스펜서와 함께 컨쥬게이션 되어 사용될 수 있을 것이다. 부가적으로, 구체적인 성분들 및 조성들은 예시적인 목적을 위한 것이다. 관심의 용량 형태에 대한 바람직한 특성에 따라 성분들은 적합한 등가물로 대체될 수 있고 및 조성이 달라질 수 있다.

구체적인 실시예들이 위에서 개시된 실시예 및 예들을 참조로 하여 기재되었지만, 한편 그러한 실시예들은 단지 본 발명에 대한 예시적인 것이며 또한 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 변화 및 변형이 본 기술 분야에서 통상적인 기술에 따라 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 그것의 더욱 넓은 관점에서 하기의 청구항들에서 정의된 바에 따라 이루어질 수 있다.

모든 공개물들, 특허들, 및 특허 문서들은 개별적으로 참조로서 포함되는 것처럼 여기에 참조로서 포함된다. 본 발명은 다양한 구체적인 및 바람직한 실시예들 및 기술들을 참조로 하여 기재되었다. 그러나, 많은 변형 및 수정이 본 발명의 스피릿 및 범위 내에 존재하고 있으며 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (50)

1. 프롤아민 단백질, 카고 (cargo) 또는 카고 분자 (cargo molecule), 음이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 및 선택적으로 인지질, 적어도 하나의 단백질 고분자, 적어도 하나의 폴리사카라이드, 또는 적어도 하나의 합성 고분자를 포함하는 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 생분해성이고, 생체 적합성이며, 또한 비-면역성이고, 상기 나노 입자의 직경은 약 400 nm 미만인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
2. 제 1 항에서,
   상기 프롤아민 단백질은 백색 자인, 황색 자인, 글리아딘 (gliadin), 호르데인 (hordein), 또는 카피린 (kafirin) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
3. 제 2 항에서,
   상기 카고 및 카고 분자는 약제학적 물질, 치료용 물질, 화장용 물질, 진단용 물질, 농업적 물질 (agricultural material), 면역-가능성 물질 (immuno-potentiating agent), 생활성 물질 (bioactive agent), 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
4. 제 1 항에서,
   상기 카고 분자는 레티놀(retinol), 13-트랜스-레티노산(트레티노인)(13-trans-retinoic acid (tretinoin)), 13-시스-레티노산(이소트레티노인)(13-cis-retinoic acid (isotretinoin)), 9-시스-레티노산(알리트레티노인)(9-cis-retinoic acid (alitretinoin)), 레틴알데히드(retinaldehyde), 에트레트네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 알파-카로틴(α-carotene), 베타-카로틴(β-carotene), 감마-카로틴(γ-carotene), 베타-크립토산틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 제아크산틴(zeaxanthin), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 레티노이드 (retinoid)이고, 상기 나노 입자는 인지질 (phospholipid) 및 폴록사머 비이온성 계면활성제 (poloxamer nonionic surfactant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
5. 제 4 항에서,
   상기 레티노이드는 (C₂-C₂₂) 카르복실산으로 에스테르화된 레티놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
6. 제 5 항에서,
   상기 레티노이드는 레티닐 아세테이트 (retinyl acetate) 또는 레티닐 팔미테이트 (retinyl palmitate) 인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
7. 제 4 항에서,
   상기 레티노이드는 직쇄 또는 분지형 (C₁-C₂₂) 알콜로 에스테르화된 레티노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
8. 제 4 항에서,
   상기 나노 입자 내의 레티노이드는 나노 입자 중 프롤아민의 약 0.01 중량% 내지 약 0.3 중량%인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
9. 제 1 항에서,
   상기 카고 분자는 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
10. 제 1 항에서,
    상기 카고는 세포, 단백질, 핵산, 항체, 성장 인자, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
11. 제 10 항에서,
    상기 카고는 혈소판 풍부 플라즈마 (platelet rich plasma)이고, 상기 카고는 나노 입자의 표면에 대하여 흡착되는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
12. 제 10 항에서,
    상기 카고는 항체인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
13. 제 1 항에서,
    상기 나노 입자는 교차-결합된 것을 특징으로 하는 나노 입자.
14. 제 1 항에서,
    상기 나노 입자의 프롤아민 단백질은 PEG화 되는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
15. 제 14 항에서,
    상기 PEG화는 약 3 kDa 내지 약 220 kDa의 분자량을 갖는 PEG로 PEG화 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
16. 제 15 항에서,
    상기 PEG화는 약 4 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 갖는 PEG로 PEG화 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
17. 제 1 항에서,
    상기 나노 입자는 하나 이상의 부가적인 생활성 물질 (bioactive agent), 진단용 물질, 이미징 물질 (imaging agent), 또는 이들의 조합을 더 캡슐화하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
18. 제 1 항에서,
    상기 나노 입자는 건조된 자유롭게 흐르는, 무색의 또는 백색의, 비-흡습성 파우더의 형태인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
19. 제 18 항에서,
    약제학적으로 또는 화장용으로 허용 가능한 조성물을 형성하기 위하여 레티노이드 및 희석제, 부형제, 또는 캐리어를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
20. 제 19 항에서,
    상기 조성물은 분산물, 에어로졸 제형, 젤, 연고, 크림, 로션, 또는 샴푸의 형태인 것을 특징으로 하는 나노 입자.
21. 제 19 항에서,
    상기 조성물은 국소용 제형 (topical formulation)의 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 또는 화장용 조성물.
22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 것에서,
    상기 나노 입자의 다분산 지수 (polydispersity index)는 약 0.2 내지 약 0.5 인 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 것에서,
    상기 나노 입자는 캡슐화된 레티노이드의 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 것에서,
    상기 나노 입자는 포유류 피부와의 접촉 시 나노 입자의 부재 하에서 포유류의 피부에 대한 레티노이드의 투여와 비교할 때 레티노이드에 의한 더 큰 피부 침투성 및 보유성의 효과를 가져오는 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 것에서,
    상기 제형은 비-나노 입자 제형으로 인간 피부에 투여되는 동일한 양의 레티노이드보다 인간 피부에 대하여 덜 자극적인 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 피부 질병 또는 피부 질환의 처치를 위한 의약을 제조하기 위한 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 하나의 조성물의 용도.
27. 제 26 항에서,
    상기 질병 또는 질환은 여드름, 건선, 액취증 (keratinization disorders), 피부 변색 (skin discoloration), 또는 피부 악성 종양 (cutaneous malignancy) (피부 암 및 악성 흑색종(melanoma))을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
28. 제 26 항 또는 제 27 항에서,
    상기 처치는 주름, 광노화, 셀룰라이트를 감소시키는 것 또는 개방된 상처 (open wound)를 치료하는 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제 27 항 또는 제 28 항에서,
    상기 조성물은 레티노이드의 연장된 방출(prolonged release)을 제공하는 것을 특징으로 하는 용도.
30. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시키는 방법으로서, 그에 따라 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 제형화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 레티노이드의 품질 수명 (shelf-life)를 증가시키는 방법.
32. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 수 분산성을 향상시키는 방법으로서, 그에 따라 레티노이드의 수 용해도를 향상시키는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 조성물로부터 레티노이드의 서방성을 제공하는 방법으로서, 상기 캡슐화된 레티노이드는 레티노이드가 나노 입자로부터 약 1 시간 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 방출되는 의약을 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 피부 침투성을 증가시키는 방법으로서, 상기 캡슐화된 레티노이드는 나노 입자의 부재 하에서의 레티노이드의 피부 침투성과 비교할 때 레티노이드의 피부 침투성을 증가시키는 의약을 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 약물을 캡슐화하는 것을 포함하는 약물의 향상된 종양 축적 (tumor accumulation)을 위한 방법으로서, 상기 캡슐화된 약물은 나노 입자의 부재 하에서의 종양 축적과 비교할 때 약물이 더 큰 정도로 종양 내에 축적되는 의약을 제조하기 위하여 사용되고, 상기 종양은 피부 암 종양이며, 상기 투여는 국소적인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 21 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 비-종양 함유 조직 내에서의 감소된 약물 축적을 위한 방법으로서, 상기 캡슐화된 레티노이드는 나노 입자의 부재 하에서 보다 더 적은 정도로 약물이 비-종양 함유 조직 내에 축적되는 국소용 의약을 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자 내에 레티노이드를 캡슐화하는 것을 포함하는 레티노이드의 독성을 감소시키는 방법으로서, 상기 캡슐화된 레티노이드는 나노 입자의 부재 하에서의 레티노이드의 독성과 비교할 때 레티노이드의 독성이 감속된 의약을 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 1 항 내지 제 8 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 복수 개의 나노 입자를 캡슐화하는 것을 포함하는 국소적으로 적용되는 레티노이드의 피부 자극 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 캡슐화된 레티노이드는 나노 입자의 부재 하에서의 레티노이드와 비교할 때 레티노이드의 자극 수준 (rating)이 감속되거나 또는 사라진 의약을 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 소수성 용매 및 버퍼, 유기 용매, 또는 음이온성 계면활성제 및 버퍼 내에 프롤아민을 용해시키는 단계로, 상기 버퍼는 침전물을 형성하기 위하여 시트레이트 음이온 및 적어도 하나의 비이온성 계면활성제, 적어도 하나의 인지질 (phospholipid), 인단백질 (phosphoprotein), 적어도 하나의 폴리사카라이드, 인단백질-폴리사카라이드 컨쥬게이트, 적어도 하나의 합성 고분자, 또는 이들의 조합을 포함하고;
    상기 침전물을 초음파 처리하는 단계;
    펠렛을 형성하기 위하여 잔존하는 수성 상을 원심 분리하는 단계;
    상기 펠렛으로부터 수성 분산물을 형성하는 단계, 및 선택적으로 저온 보호 물질 (cryoprotectant)을 첨가하는 단계; 그리고
    상기 분산물을 동결 건조하는 단계
    를 포함하는 나노 입자를 제조하는 방법으로서,
    결과물로 얻은 나노 입자는 약 100 nm 미만 내지 약 225 nm의 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 입자를 제조하는 방법.
40. 제 39 항에서,
    상기 용해시키는 단계는 하이드로알콜성 용매 및 시트레이트 음이온을 포함하는 버퍼 내에 프롤아민 단백질을 용해시키는 단계를 포함하고, 또한 상기 인단백질은 β-카세인이고 및 상기 폴리사카라이드는 덱스트란 또는 검 아라비카 (gum Arabica)인 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 39 항에서,
    상기 용해시키는 단계는 하이드로알콜성 용매 및 시트레이트 음이온을 포함하는 버퍼 내에 프롤아민 단백질을 용해시키는 것을 포함하고, 또한 상기 인단백질-폴리사카라이드 컨쥬게이트는 덱스트란에 대해 컨쥬게이트된 β-카세인인 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 39 항에서,
    상기 용해시키는 단계는 음이온성 계면활성제 및 시트레이트 음이온을 포함하는 버퍼 내에 프롤아민 단백질을 용해시키는 단계를 포함하고, 상기 음이온성 계면활성제는 소듐 디옥틸 설포숙시네이트 (sodium dioctyl sulfosuccinate), 소듐 라우릴 설페이트 (sodium lauryl sulfate), 벤즈알코니움 클로라이드 (benzalkonium chloride), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (cetyl trimethyl ammonium bromide), N-도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 (N-dodecyl trimethyl ammonium bromide), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 버퍼는 비 이온성 계면활성제 및 인지질을 포함하고, 상기 비 이온성 계면활성제는 폴록사머 (poloxamers), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (polyoxyethylene alkyl ethers), 소르비탄 에테르 (sorbitan esters), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 패티 애시드 에테르 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 및 상기 인지질은 에그 레시틴 (egg lecithin), 소이 레시틴 (soy lecithin), 포스파티딜 클로린 (phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 42 항에서,
    상기 인지질은 카세인 또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄 프로판 (1,2-dioleoy1-3-trimethyl ammonium propane)에 의해 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 39 항에서,
    상기 용해시키는 단계 동안에 카고 또는 카고 분자를 캡슐화하는 단계를 더 포함하고, 상기 카고 분자는 치료용 물질, 화장용 물질, 진단용 물질, 농업적 물질 (agricultural material), 면역-가능성 물질 (immuno-potentiating agent), 생활성 물질 (bioactive agent), 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 39 항에서,
    상기 나노 입자의 표면에 대한 카고 또는 카고 분자의 흡착 단계를 더 포함하고, 상기 카고 또는 카고 분자는 프롤아민 단백질, 시트레이트 음이온 함유 버퍼, 및 적어도 하나의 음이온성 계면활성제와 함께 혼합되고, 상기 버퍼는 적어도 하나의 비 이온성 계면활성제 및 적어도 하나의 인지질 또는 인단백질을 포함하며, 또한 상기 초음파 처리 단계 후에 나노 입자를 수성 용액에 대하여 투석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 45 항에서,
    상기 카고 또는 카고 분자는 단백질 또는 세포의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 45 항에서,
    상기 카고는 혈소판 풍부 플라즈마 (platelet rich plasma (PRP)) 인 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 46 항에서,
    상기 프롤아민 단백질은 황색 자인, 백색 자인, 글리아딘, 호르데인, 또는 카피린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 44 항에서,
    상기 카고 분자는 레티놀(retinol), 13-트랜스-레티노산(트레티노인)(13-trans-retinoic acid (tretinoin)), 13-시스-레티노산(이소트레티노인)(13-cis-retinoic acid (isotretinoin)), 9-시스-레티노산(알리트레티노인)(9-cis-retinoic acid (alitretinoin)), 레틴알데히드(retinaldehyde), 에트레트네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 알파-카로틴(α-carotene), 베타-카로틴(β-carotene), 감마-카로틴(γ-carotene), 베타-크립토산틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 제아크산틴(zeaxanthin), 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 레티노이드 (retinoid)이고, 상기 나노 입자는 인지질 및 폴록사머 비 이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 39 항에서,
    결과적으로 얻어지는 나노 입자는 건조된 자유롭게 흐르는, 무색의 또는 백색의, 비-흡습성 파우더인 것을 특징으로 하는 방법.

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