CN101804032B - 包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球制备方法，采用可生物降解高分子聚乳酸和生物无机材料纳米羟基磷灰石共同作为载体，采用单乳化溶剂挥发法(S/O/W)制备包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。采用不同的nHA/5-Fu质量比和不同的搅拌速度制备复合微球。所制得的微球球形规整，表面有多孔，微球大小分散均匀，而且可以控制；载药量达3.0％以上，包封率达70％以上；释药时间长，达到27天以上，具有显著的长效和缓释作用，克服了5-Fu制剂缓释时间短或包封率低的缺陷，有望用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及一种可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球包裹5-氟尿嘧啶的制备方法。
背景技术
5-氟尿嘧啶(5-Fu)能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成，起抗癌作用；而且又能以伪代谢物掺入RNA中从而抑制肿瘤细胞的增殖。它是近三十多年来临床最常用的抗癌药，对结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等均有较好的疗效，即使到目前为止，它仍然是一种不可替代的最有效抗肿瘤药物之一。一般以静脉注射或滴注给药，但对肿瘤细胞的选择性差、毒副作用大、代谢快、半衰期短，限制了使用剂量和周期。高分子载药微球是近年来发展起来的新剂型，可控释药物并延长药物的生物半衰期，减轻毒副作用，易于实现靶向或定位给药。国内外关于载5-Fu高分子微球报道很多，主要集中在壳聚糖、牛血清白蛋白、明胶、PLA、PLGA，但大部分都存在药物缓释时间短或包封率低等问题，如梁桂媛等采用乳化交联制备了5-Fu壳聚糖微球，粒度主要分布在3.5～6.5μm，药物大约半个小时完全释放(梁桂媛，方华丰，刘志伟，广东药学院学报，2000，16：7-10)；Zhu.L.Z等采用反乳液法制备了5-Fu的壳聚糖磁性纳米粒子，药物只能持续释放60～80h(Zhu.L.Z，Ma.J.W，et al，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2009，68：1-6)，因此需要继续研究更为理想的载体。
无机材料羟基磷灰石(HA)由于具有良好的生物相容性和生物活性而被广泛用作药物控释载体研究，然而这种载体只是通过吸附或机械混合的方式载药，释放时总是在初始阶段造成大量的突释，随后的释放速度很慢甚至没有，不能满足长效局部给药的目的。而聚合物微球具有方便的控制药物释放的优势，另外还能在一定程度上增强无机材料的机械性能。因此，无机材料/聚合物材料的复合微球能综合两种材料的长处，为长效控释给药提供的途径。
聚乳酸(PLA)由于具有良好的生物相容性和生物降解性而被广泛用作药物载体，但其有一个缺点是因降解产物呈酸性，PH值降低而易致发炎。生物陶瓷羟基磷灰石在水溶液中释放碱性离子，可以用来中和PLA降解产物的酸性，另外还可以提高材料的生物活性，因此可以用在PLA载体材料中引入HA解决酸性问题。目前关于PLA和HA共同作为载体报道较少，但PLA/nHA作为5-Fu载体并制成复合微球在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球制备方法。本发明通过如下技术方案实现：
包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球制备方法，具体步骤如下：将纳米羟基磷灰石(即nHA)和5-氟尿嘧啶(即5-Fu)的混合物加入到碱性溶液中，先超声混合，再磁力搅拌12～48h，冻干，得到白色冻干粉(即nHA-5-Fu)；将该白色冻干粉加入到含1～20％g/mL聚乳酸的挥发性有机溶剂中，1000～10000rpm高速搅拌1～10min，超声混合分散后，形成S/O乳液；再将S/O乳液倒入含0.1～4％g/ml甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以200～1000rpm磁力搅拌1～6h，使有机溶剂直至挥发完全；离心，洗涤，然后冻干，即得所述微球。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，复合微球中载体聚乳酸的分子量为1～10万。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，复合微球中纳米羟基磷灰石是采用模板法制备的，粒径为20～50nm。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述纳米羟基磷灰石和5-氟尿嘧啶质量比为1∶1～50∶1。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液，碱性溶液浓度为0.1～3mol/L。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述超声的频率均为40～100kHz。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述有机溶剂与甲基纤维素的去离子水溶液体积比为1∶10～1000。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述的挥发性有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、氯仿、或乙酸乙酯。
作为上述制备方法进一步改进的技术方案，所述微球颗粒于干燥状态下保存。
本发明相对于现有技术，具有如下优点和效果：
本发明采用可生物降解高分子聚乳酸(PLA)和生物无机材料纳米羟基磷灰石(nHA)共同作为载体，采用单乳化溶剂挥发法(S/O/W)制备包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球(PLA/nHA-5-Fu复合微球)。采用不同的nHA/5-Fu质量比和不同的搅拌速度制备复合微球。对微球性能的评价，表明微球球形规整，表面有多孔，微球大小分散均匀，而且可以控制；载药量较高(3.0％以上)，包封率高(70％以上)；释药时间长，达到27天以上，具有显著的长效和缓释作用。
由于纳米羟基磷灰石自身具有纳米材料的高比表面，易吸附5-Fu包裹在其表面。这两点是nHA吸附5-Fu的主要机制。PLA/nHA-5-Fu复合微球比PLA-5-Fu微球载药量高，其包封率达到86.78％，可见加入nHA极大的提高了微球对5-Fu的包封率。这主要是因为nHA对5-Fu存在强吸附作用，在微球制备过程中，药物不易扩散至水相中，减少了药物损失。
PLA/nHA-5-Fu微球和PLA-5-Fu微球都存在突释，这主要是由于部分药物分散微球内表面和外表面，极易释放出来。复合微球的药物突释效应较大是因为微球表面有吸附药物的nHA。突释过后，PLA/nHA-5-Fu微球的药物释放速率小于PLA-5-Fu微球，这主要是HA纳米粒子对5-Fu较强的吸附作用，使得复合微球药物缓释效果更好。
本发明提供一种载药量和包封率高的、并可长期缓释的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球包裹5-氟尿嘧啶的制备方法，利用纳米羟基磷灰石对5-Fu的高吸附性能和氢键作用，克服了5-Fu制剂缓释时间短或包封率低的缺陷，可用于治疗癌症。
附图说明
图1是实例1中纳米羟基磷灰石载药前后的透射电子显微镜图和扫描电子显微镜图。a，b，c分别为nHA的TEM照片、nHA-5-Fu的TEM和SEM照片。
图2是实例1中5-Fu和纳米羟基磷灰石载药前后的傅里叶红外光谱图，图中a，b，c分别为nHA，nHA载药，5-Fu的FTIR光谱图。
图3是实例1中制备的复合微球扫描电子显微镜图。
图4是实例1中复合微球的体外释放曲线。
具体实施方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的实施不限于此。
实例1
PLA/nHA-5Fu复合微球的制备：①nHA-5-Fu的制备：将0.3gnHA和60mg5-Fu加入到一定0.3mol/l的氢氧化钠水溶液中，先80kHz超声混合，再磁力搅拌24h，冻干，得到白色冻干粉nHA-5-Fu。②微球的制备：nHA-5-Fu冻干粉末加入到溶有1gPLA的10ml二氯甲烷溶液中，10000rpm高速搅拌1min，充分混合分散后，形成S/O乳液，再将上述混悬液迅速倒入200ml的0.4％(w/v，g/ml)乳化剂甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以400rpm磁力搅拌4h，使二氯甲烷直至挥发完全；静置4h后以10000rpm的速度离心，分离出沉淀，以去离子水洗涤三次，然后冻干，所得微球颗粒干燥状态下保存。微球载药量为3.8％(质量)，包封率为86.78％(质量)，平均粒径为219μm，在27天药物释放84.87％(质量)，药物释放初期存在一定突释效应。
由图1可知，从nHA的TEM照片观察，nHA的形状是无规则形，粒径在20-50nm，在PEG作用下分散均匀。载药后nHA粒径明显变大，这是因为5-Fu通过吸附，包裹在nHA表面。SEM显示nHA吸附药物后趋向于球形。
图2中a为nHA的红外光谱，472cm-1、565cm-1、602cm-1、962cm-1、1035cm-1对应的是PO4 3-的振动峰，在3572cm-1和630cm-1，是O-H的伸缩振动和弯曲振动峰[14]。图2中曲线c的光谱中，5-Fu的特征吸收峰为3072cm-1(N-H的伸缩振动峰)[15]，1660cm-1(C＝O和C＝C伸缩振动的重合吸收峰)，1245cm-1(C-N伸缩振动峰)，879cm-1(CF＝CH中的C-H的面外弯曲振动)。图2中b nHA载药的光谱中，在1641cm-1出现了5-Fu中的C＝O伸缩振动峰，在1253cm-1出现了5-Fu中的C-N伸缩振动峰，875cm-1出现了5-Fu中的CF＝CH中的C-H的面外弯曲振动峰，这些峰都存在一定的位移；另外，3572cm-1和630cm-1是O-H的伸缩振动和弯曲振动峰，这与nHA的红外光谱重合，但5-Fu在3072cm-1处N-H的伸缩振动峰消失。这些峰的位移或消失是由于5-Fu与nHA之间形成氢键造成的。
由图3看出PLA/nHA复合微球粒径大约为100～300μm，有的孔稍大或表面存在少量的缺损，表面较粗糙，这是因为微球表面吸附nHA造成的。
PLA-5-Fu微球和PLA/nHA-5-Fu微球在第1d后释放药物分别为9.13％和15.67％，存在较大的突释。突释过后，PLA/nHA-5-Fu微球的药物释放速率小于PLA-5-Fu微球，第27d时PLA-5-Fu微球药物释放99.87％，PLA/nHA-5-Fuw微球为84.87％，这说明两种微球都能达到长期缓释效果，但复合微球药物释放速度慢于单纯PLA微球。
PLA/nHA-5-Fu微球在第1d后释放药物为15.67％，存在较大的突释。突释过后，PLA/nHA-5-Fu微球的药物释放速率减缓，第27d时，PLA/nHA-5-Fuw微球药物累积释放为84.87％，这说明复合微球都能达到长期缓释效果。
实例2
PLA/nHA-5Fu复合微球的制备：①nHA-5-Fu的制备：将0.3gnHA和30mg5-Fu加入到3mol/l的氢氧化钾水溶液中，先100kHz超声混合，再磁力搅拌24h，冻干，得到白色冻干粉nHA-5-Fu。②微球的制备：nHA-5-Fu冻干粉末加入到溶有1gPLA的10ml二氯甲烷溶液中，5000rpm高速搅拌1min，充分混合分散后，形成S/O乳液，再将上述混悬液迅速倒入500ml的0.1％(w/v，g/ml)乳化剂甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以600rpm磁力搅拌4h，使二氯甲烷直至挥发完全；静置4h后以10000rpm的速度离心，分离出沉淀，以去离子水洗涤三次，然后冻干，所得微球颗粒干燥状态下保存。微球载药量为5.3％，包封率为74.2％，平均粒径为178μm，在27天药物释放81.87％，药物释放初期存在一定突释效应。
实例3
PLA/nHA-5Fu复合微球的制备：①nHA-5-Fu的制备：将0.1gnHA和60mg5-Fu加入到0.1mol/l的氢氧化钠水溶液中，先40kHz超声混合，再磁力搅拌24h，冻干，得到白色冻干粉nHA-5-Fu。②微球的制备：nHA-5-Fu冻干粉末加入到溶有1gPLA的10ml二氯甲烷溶液中，1000rpm高速搅拌1min，充分混合分散后，形成S/O乳液，再将上述混悬液迅速倒入100ml的3.0％(w/v，g/ml)乳化剂甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以1000rpm磁力搅拌4h，使二氯甲烷直至挥发完全；静置4h后以10000rpm的速度离心，分离出沉淀，以去离子水洗涤三次，然后冻干，所得微球颗粒干燥状态下保存。微球载药量为3.0％，包封率为89.67％，平均粒径为140μm，在27天药物释放78.87％，药物释放初期存在一定突释效应。
实例4
PLA/nHA-5Fu复合微球的制备：①nHA-5-Fu的制备：将0.15gnHA和60mg5-Fu加入到1.0mol/l的氢氧化钠水溶液中，先60KHz超声混合，再磁力搅拌24h，冻干，得到白色冻干粉nHA-5-Fu。②微球的制备：nHA-5-Fu冻干粉末加入到溶有1gPLA的10ml二氯甲烷溶液中，8000rpm高速搅拌1min，充分混合分散后，形成S/O乳液，再将上述混悬液迅速倒入1000ml的1.0％(w/v，g/ml)乳化剂甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以600rpm磁力搅拌4h，使二氯甲烷直至挥发完全；静置4h后以10000rpm的速度离心，分离出沉淀，以去离子水洗涤三次，然后冻干，所得微球颗粒干燥状态下保存。微球载药量为4.6％，包封率为92.77％，平均粒径为195μm，在27天药物释放89.87％，药物释放初期存在一定突释效应。
Claims (4)
1.包裹5-氟尿嘧啶的可生物降解性聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球制备方法，其特征在于：将纳米羟基磷灰石和5-氟尿嘧啶的混合物加入到碱性溶液中，先超声混合，再磁力搅拌12～48h，冻干，得到白色冻干粉；将该白色冻干粉加入到含1～20％g/mL聚乳酸的挥发性有机溶剂中，1000～10000rpm高速搅拌1～10min，超声混合分散后，形成S/O乳液；再将S/O乳液倒入含0.1～4％g/ml甲基纤维素的去离子水溶液中，得到S/O/W乳液，以200～1000rpm磁力搅拌1～6h，使有机溶剂直至挥发完全；离心，洗涤，然后冻干，即得所述微球；复合微球中载体聚乳酸的分子量为1～10万；复合微球中纳米羟基磷灰石是采用模板法制备的，粒径为20～50nm；所述纳米羟基磷灰石和5-氟尿嘧啶质量比为1∶1～50∶1；所述有机溶剂与甲基纤维素的去离子水溶液体积比为1∶10～1000；所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液，碱性溶液浓度为0.1～3mol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述超声的频率均为40～100kHz。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的挥发性有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、氯仿、或乙酸乙酯。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述微球颗粒于干燥状态下保存。
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