CN103381146B - 双层缓控释纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双层缓控释纳米粒及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述的双层缓控释纳米粒，由乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内核与包覆在其外层的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖外壳构成，能够同时负载亲水性和亲脂性药物，药物包封率高，而且能够实现内外层药物的时序性释放，具有缓释、控释的效果，此外还具有粒径可控、粒径分布均匀、形态光滑圆整、稳定性和分散性好等优点。

Description

双层缓控释纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种缓控释纳米粒及其制备方法和应用，特别是涉及一种双层缓控释纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

纳米粒药物输送体系作为新型的药物载体，由于具有特殊的尺寸和结构，能够靶向定位地将药物输送到病灶局部或专一性地作用于靶细胞，并且能够维持药物缓慢释放、延长药物半衰期和减少毒副作用等，目前已广泛应用于生物医药领域。

乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是由羟基乙酸与乳酸聚合而成的高分子有机化合物，目前被认为是少数成熟的体内降解性生物材料之一。由于PLGA易于合成、质量稳定，并且具有良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性等优点，被大量用作纳米粒药物输送体系的骨架材料，用于延长药物的体内循环时间，增加药物的缓释效果，提高给药的生物利用度。然而，PLGA是人工合成的亲脂性多聚物材料，对水溶性药物的包封率低，而且与机体细胞缺少特异性结合，难以将药物输送到特定的靶器官；此外，PLGA有明显的突释效应，药物不能平稳地缓慢释放。由于上述的缺点，PLGA作为缓控释纳米粒骨架材料的应用具有一定局限性。

由两种不同的聚合物制备的具有核壳结构的双层微球药物输送体系，以一种聚合物作为内核，以另一种聚合物作为外层包覆在内核的外周，其通过利用两种聚合物不同的性能，特别是不同的降解性能，一方面能够运载两种不同的药物，另一方面还能克服单一聚合物骨架材料的缺陷，提高靶向性和药物释放效果。

中国发明专利CN101658497B公开了一种双重载药的复合微球及其制备方法，该复合微球具有球中球结构，其基体由位于内部的乳酸-羟基乙酸共聚物微球与位于外层的壳聚糖外壳构成，药物被包埋在内部微球和外壳中。壳聚糖（CS）是天然聚合物甲壳素脱乙酰基的产物，是一种碱性阳离子多糖，其作为药物载体具有如下的优势：（1）具有良好的生物相容性、生物可降解性以及可被吸收利用；（2）具有抗酸、抗菌消炎、抗溃疡和促进伤口愈合的能力，可阻止或减弱药物在胃中的刺激性；（3）壳聚糖微球表面有丰富的多糖链，能被特异性细胞或组织所识别，可靶向投递药物至病灶部位释放；（4）壳聚糖分子能影响细胞间F-肌动蛋白功能，打开细胞通道，有利于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力；（5）能以“被动机制”选择性地蓄积在肿瘤组织部位，抑制肿瘤细胞的生长，强化免疫系统。由此可见，与单层PLGA微球相比，由壳聚糖外壳与PLGA内核组成的复合微球具有更优的靶向性，能够同时运载亲水性药物和亲脂性药物，而且通过外层包裹能减少PLGA微球的突释效应。然而，采用壳聚糖作为外层制备复合微球的过程中，需要先将PLGA微球溶液加入阳离子的壳聚糖溶液中，然后通过加入阴离子交联剂与壳聚糖进行交联反应，从而使壳聚糖包覆在PLGA微球外层，该方法存在两方面问题：一、所制得的复合微球Zeta电势接近中性，在分散液中容易发生微球聚集，不利于作为静脉给药载体；二、外层的药物，特别是细胞因子等，容易变性从而失去活性。

中国发明专利CN101836961B公开了一种复合载药微球、盐酸米诺环素纳米缓释复合载药微球体系及其制备方法，在聚乳酸-羟基乙酸聚合物微球内部包埋了盐酸米诺环素，外面包覆了一种由聚乙二醇修饰的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐、O-羧甲基壳聚糖壳聚糖十八烷基季铵盐和胆固醇制备而成的阳离子高分子脂质体，形成一种核壳结构的复合载药微球体系。将脂质体包覆在PLGA微球外表面来制备复合载药微球体系，不仅使PLGA和阳离子高分子脂质体的优点得以保持，还增加了体系的亲水性，降低了毒性。然而，这种盐酸米诺环素纳米缓释复合载药微球体系在制备过程中，将PLGA微球分散在蒸馏水中，由于PLGA是亲脂性材料，且PLGA微球粒径较大，因此难于在蒸馏水中分散均匀成为均一体系，这会导致阳离子高分子脂质体在包覆的过程中不均匀。该专利的实验数据表明，包覆后的微球体系粒径没有突增，仅由原来的300nm增加为340.1nm，表明阳离子脂质体层较薄，与PLGA微球的空间较小，没有包载药物的空间，因而不适于作为包载两种及以上药物的缓释体系。

在肿瘤组织中，肿瘤细胞与血管内皮细胞始终相互共存、相互促进，抗肿瘤血管生成治疗与化疗联合可以同时靶向肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞，具有协同抗肿瘤作用，是今后肿瘤治疗的发展方向。由于肿瘤血管的生成过程是一种失去正常控制的无序状态，与正常血管相比，肿瘤新生血管的结构缺乏完整性，管壁薄弱，缺乏平滑肌及完整的基底膜结构；血管内皮细胞之间存在较大缝隙，通透性强；血管网结构紊乱，有大量的血管盲端、动静脉间短路及血管的局部膨出等，从而导致渗出增加及组织间高压，同时也易于癌细胞穿透而形成远处转移。抗肿瘤血管生成药物与化疗药物联合给药，一方面利用抗血管生成药物抑制肿瘤血管生成，另一方面可利用化疗药物杀伤肿瘤细胞，提高抗肿瘤治疗效果。然而，受现有药物载体的局限，抗肿瘤血管生成药物与化疗药物需要制备成不同的药物制剂，分开给药，难以达到最佳的治疗效果。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种易于制备、分散性和稳定性好的双层缓控释纳米粒。

本发明的另一个目的是提供所述的双层缓控释纳米粒的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述的双层缓控释纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种双层缓控释纳米粒，由乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒内核与包覆在其外层的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖（mPEG-g-CS）外壳构成。

在其中一个实施例中，PLGA纳米粒与mPEG-g-CS的质量比为1︰1～1︰20，优选为1︰3～1︰6；PLGA的分子量为3万～7万道尔顿；PLGA中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为1︰1～6︰1；mPEG-g-CS中，聚乙二醇单甲醚的分子量为1000～4000道尔顿，壳聚糖的分子量为5万～20万道尔顿；mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率为1%～15%，优选为6%～13%。

在其中一个实施例中，所述PLGA纳米粒内核的粒径为80nm～150nm，所述双层缓控释纳米粒的粒径为220nm～350nm。

在其中一个实施例中，所述PLGA纳米粒内核的Zeta电势为-24mV～-42mV；所述双层缓控释纳米粒的Zeta电势为20mV～46mV。

本发明所述的双层缓控释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）将PLGA溶于有机溶剂中，加入去离子水，超声乳化，形成水包油（W1/O）型初乳；

（2）将步骤（1）制得的水包油型初乳搅拌加入乳化剂水溶液中，持续搅拌至形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳，挥发有机溶剂进行固化，经过滤、干燥，得到PLGA纳米粒；

（3）取PLGA纳米粒，加入有机溶剂中分散均匀，另取mPEG-g-CS，加入酸溶液中溶解分散均匀，然后将两者混合，超声处理，透析，得到所述的双层缓控释纳米粒。

在步骤（1）中，PLGA溶于有机溶剂中的浓度为10mg/mL～100mg/mL；去离子水与有机溶剂的体积比为1︰2～1︰10；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟；所述的有机溶剂为二氯甲烷或氯仿等。

在步骤（2）中，所述的乳化剂为聚乙烯醇，乳化剂水溶液的质量浓度为0.5%～2.5%，乳化剂水溶液中还含有质量浓度为0.5%～3%的表面活性剂，所述的表面活性剂为吐温20、吐温80或泊洛沙姆188等。

在步骤（3）中，PLGA纳米粒与mPEG-g-CS的质量比为1︰1～1︰20，优选为1︰3～1︰6；PLGA纳米粒溶于有机溶剂浓度为5mg/mL～30mg/mL；mPEG-g-CS溶于酸溶液的浓度为10mg/mL～60mg/mL；所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿或二甲基亚砜等；所述的酸溶液为醋酸溶液、甲酸溶液或稀盐酸溶液等，酸溶液中的氢离子浓度为0.5mol/L～2.0mol/L；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟。

在其中一个实施例中，所述mPEG-g-CS的制备方法包括以下步骤：

（a）取壳聚糖（CS），加入甲酸溶液中，搅拌使之溶解；

（b）搅拌加入聚乙二醇单甲醚，然后搅拌加入甲醛溶液；

（c）用去离子水透析处理，然后冷冻干燥，制得所述的mPEG-g-CS。

在步骤（a）中，甲酸溶液的质量浓度为0.2%～2.0%，壳聚糖的甲酸溶液的浓度为50mg/mL～400mg/mL。

在步骤（b）中，聚乙二醇单甲醚与壳聚糖的质量比为1︰1～1︰12，甲醛溶液的质量浓度为2%～10%，甲醛溶液与甲酸溶液的体积比为1︰0.5～1︰4。

一种双层缓控释载药纳米粒，由本发明所述的双层缓控释纳米粒与硫酸长春新碱和多烯紫杉醇组成，其中，硫酸长春新碱包裹在所述的PLGA纳米粒内核中，多烯紫杉醇包裹在所述的PLGA纳米粒内核与所述的mPEG-g-CS外壳之间。

在其中一个实施例中，硫酸长春新碱与PLGA纳米粒的质量比为1︰5～1︰20，多烯紫杉醇与PLGA纳米粒的质量比为1︰4～1︰20。

本发明所述的双层缓控释载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

（A）将PLGA溶于有机溶剂中，加入硫酸长春新碱水溶液，超声乳化，形成水包油（W1/O）型初乳；

（B）将步骤（A）制得的水包油型初乳搅拌加入乳化剂水溶液中，持续搅拌至形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳，挥发有机溶剂进行固化，经过滤、干燥，得到含硫酸长春新碱的载药PLGA纳米粒；

（C）取载药PLGA纳米粒与多烯紫杉醇，加入有机溶剂中分散均匀，另取mPEG-g-CS，加入酸溶液中溶解分散均匀，然后将两者混合，超声处理，透析，得到所述的双层缓控释载药纳米粒。

在步骤（A）中，硫酸长春新碱与PLGA的质量比为1︰5～1︰20；PLGA溶于有机溶剂中的浓度为10mg/mL～100mg/mL；硫酸长春新碱水溶液的浓度为20mg/mL～50mg/mL；硫酸长春新碱水溶液与有机溶剂的体积比为1︰2～1︰10；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟；所述的有机溶剂为二氯甲烷或氯仿等。

在步骤（B）中，所述的乳化剂为聚乙烯醇，乳化剂水溶液的质量浓度为0.5%～2.5%，乳化剂水溶液中还含有质量浓度为0.5%～3%的表面活性剂，所述的表面活性剂为吐温20、吐温80或泊洛沙姆188等。

在步骤（C）中，多烯紫杉醇与PLGA纳米粒的质量比为1︰4～1︰20，PLGA纳米粒与mPEG-g-CS的质量比为1︰1～1︰20，优选为1︰3～1︰6；PLGA纳米粒溶于有机溶剂浓度为5mg/mL～30mg/mL；mPEG-g-CS溶于酸溶液的浓度为10mg/mL～60mg/mL；所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿或二甲基亚砜等；所述的酸溶液为醋酸溶液、甲酸溶液或稀盐酸溶液等，酸溶液中的氢离子浓度为0.5mol/L～2.0mol/L；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟。

本发明所述的双层缓控释纳米粒以PLGA纳米粒为内核，以mPEG-g-CS聚合物为外壳，形成双层核壳结构，其具有以下优点：

1、mPEG-g-CS聚合物在超声作用后通过透析法能够自聚集成纳米粒，亲水性基团（PEG）向外，亲脂性基团（壳聚糖）向内，这是因为随着透析环境pH值升高，壳聚糖中未被接枝的葡萄糖单元之间的极性基团能够形成氢键，此外，壳聚糖的乙酰基之间存在疏水作用力，因此，壳聚糖未被接枝的葡萄糖单元之间由于极性基团间的氢键和乙酰基之间的疏水作用力而自聚集形成核心，而PEG具有很强的亲水性和柔性，在胶束外层可形成比较疏松的亲水区域；

2、mPEG-g-CS自聚集纳米粒的Zeta电势为正，由于PLGA纳米粒为亲脂性且Zeta电势为负，在静电吸附作用以及亲脂性基团吸附作用下，mPEG-g-CS聚合物能够包覆在PLGA纳米粒的外层，形成稳定的双层纳米粒结构；

3、mPEG-g-CS聚合物为两亲性聚合物，能够提高纳米粒载体对亲水性药物的包封率，此外，通过PEG修饰后，一方面增加了药物的分子量，可降低肾脏的排泄速率，另一方面，聚乙二醇在分子表面产生空间位阻效应，可减弱血液中各种水解酶对药物或者载体材料的水解，有效地延长了药物或者载体在循环系统中的时间，从而实现药物长循环以及提高药物靶向作用；

4、所述的双层缓控释纳米粒可以同时负载两种或以上不同的药物，并且能够同时负载亲水性和亲脂性药物，且药物包封率高，此外，由于mPEG-g-CS聚合物与PLGA纳米粒具有不同的降解特性，一方面能够克服PLGA纳米粒的突释效应，另一方面还能够实现内外层药物的时序性释放，从而实现缓释、控释的效果；

5、所述的双层缓控释纳米粒还具有粒径可控、粒径分布均匀、形态光滑圆整、稳定性和分散性好等优点。

通过控制mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率以及mPEG-g-CS与PLGA纳米粒的质量比，可控制所述双层缓控释纳米粒的粒径和Zeta电势，以得到粒径适中、分布均匀的双层缓控释纳米粒。其中，PLGA纳米粒与mPEG-g-CS的质量比优选为1︰1～1︰20，若mPEG-g-CS的比例过大，将导致多余的mPEG-g-CS自聚集成纳米粒；若mPEG-g-CS的比例过少，则不能包裹PLGA而形成双层纳米粒。mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率优选为1%～15%，若聚乙二醇接枝率过低，所形成的双层纳米粒的外层聚乙二醇含量过少，其临界胶束浓度小，一方面容易自聚集形成纳米粒而不包裹在PLGA纳米粒表面，另一方面达不到体内长循环的目的；若聚乙二醇接枝率过高，所形成的双层纳米粒的粒径过大，不适用于静脉给药体系，并且会导致双层纳米粒的Zeta电势绝对值降低，影响纳米粒悬浮液的稳定性和分散性。

PLGA纳米粒内核的粒径优选为80nm～150nm，双层缓控释纳米粒的粒径优选为220nm～350nm，若PLGA纳米粒及双层缓控释纳米粒的粒径过小，难以形成有效的空间包裹药物；若PLGA纳米粒内核的粒径过大，mPEG-g-CS聚合物难以包裹在PLGA纳米粒的外层；若双层缓控释纳米粒的粒径过大，则不适用于静脉给药体系。PLGA纳米粒内核的Zeta电势优选为-24mV～-42mV，在该Zeta电势范围内，PLGA纳米粒在溶液中稳定性及分散性佳，且易被Zeta电势为正的mPEG-g-CS吸附包裹在其外层。双层缓控释纳米粒的Zeta电势优选为20mV～46mV，在该Zeta电势范围内，双层缓控释纳米粒在溶液中稳定性及分散性佳，并且对于相应负电荷的肿瘤微环境具有较大亲和性，适用于制备抗肿瘤药物；若Zeta电势低于20mV，双层缓控释纳米粒在溶液中容易聚集而影响其分散性；若制备Zeta电势高于46mV的双层缓控释纳米粒，则需要使用较低接枝率的mPEG-g-CS，而导致双层缓控释纳米粒的粒径过大（大于400nm）。

本发明所述的双层缓控释载药纳米粒，以所述的双层缓控释纳米粒为载体，mPEG-g-CS外壳负载有抗肿瘤血管生成药物--多烯紫杉醇，PLGA纳米粒内核负载有化疗药物--硫酸长春新碱，具有以下优点：位于外层的多烯紫杉醇先释放，一方面通过对抗肿瘤血管生成来阻断肿瘤营养来源和转移通路，另一方面还能使残存的肿瘤血管结构和渗透性正常化，缓解由于肿瘤血管通透性强而导致化疗药物外渗而难以达到有效治疗剂量的缺点，提高化疗药物的有效浓度；位于纳米粒内核的硫酸长春新碱随后释放，发挥抑制肿瘤细胞的作用。多烯紫杉醇与硫酸长春新碱顺序释放，能够多方位控制和抑制肿瘤。

本发明所述的双层缓控释纳米粒的制备方法，具有反应条件温和，有机溶剂用量少，过程简单可控等优点。通过控制超声乳化的功率、时间以及PLGA溶液浓度，可以控制PLGA纳米粒的粒径：随着超声功率增加，所制得的PLGA纳米粒的粒径减小，当超声功率小于20W时，PLGA纳米粒的平均粒径大于400nm，但当超声功率大于100W时，粒径不再显著减小；当PLGA溶液的浓度小于10mg/mL时，所制得的PLGA纳米粒呈现多孔的囊壁，而当PLGA溶液的浓度大于100mg/mL时，所制得的PLGA纳米粒囊壁皱缩不光滑。在PLGA初乳中加入乳化剂水溶液制备复乳时，通过在乳化剂中加入表面活性剂，可以改善纳米粒的球形，并且使粒径分布均匀。此外，制备mPEG-g-CS时，采用甲酸溶液溶解壳聚糖，并采用甲醛溶液溶解聚乙二醇单甲醚，是利用甲醛和壳聚糖的氨基之间形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚的羟基与希弗氏碱进行加成反应，避免了其他副产物的产生；通过将反应体系中的聚乙二醇单甲醚与壳聚糖的质量比控制在1︰1～1︰12的范围内，从而将mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率控制在1%～15%的范围内。

附图说明

图1为本发明所述的PLGA纳米粒的透射电镜图；

图2为本发明所述的双层缓控释纳米粒的透射电镜图；

图3为本发明所述的PLGA纳米粒的粒径分布图；

图4为本发明所述的双层缓控释纳米粒的粒径分布图；

图5为本发明所述的双层缓控释纳米粒的模式图；

图6为本发明所述的双层缓控释载药纳米粒的模式图；

图7为本发明所述的双层缓控释载药纳米粒的药物释放图。

具体实施方式

实施例一：本发明所述双层缓控释纳米粒的制备

1、聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖（mPEG-g-CS）的制备

（1）称取1g壳聚糖，加至10mL质量浓度为1.0%的甲酸溶液中，搅拌使之溶解；

（2）加入3g聚乙二醇单甲醚，搅拌15分钟，然后加入10mL质量浓度为6.0%的甲醛溶液，磁力搅拌12小时；

（3）移入透析袋中，用去离子水透析处理3天，冷冻干燥12小时；

（4）取冻干样品用氯仿洗涤，抽干，然后用0.1mol/L盐酸溶解，再次移入透析袋中，用去离子水透析处理3天，冷冻干燥24小时，得到白色棉絮状的mPEG-g-CS样品。

2、mPEG-g-CS--PLGA双层控缓释纳米粒的制备

（1）取200mg PLGA，溶于4mL二氯甲烷中，加入0.5mL去离子水，于60W功率下超声乳化2分钟，形成W1/O型初乳；

（2）将步骤（1）制得的W1/O型初乳搅拌加入质量浓度为1.5%的聚乙烯醇水溶液（含有质量浓度为1%的吐温20）中，在200rpm转速下持续搅拌4小时，形成W1/O/W2型复乳，挥发有机溶剂进行固化，得PLGA纳米粒溶液；

（3）取将步骤（2）制得的PLGA纳米粒溶液，用0.8μm的滤膜过滤，收集滤液，在18000rpm转速下离心，收集纳米粒，冷冻干燥12小时，得到固态粉末状的PLGA纳米粒；

（4）精密称取PLGA纳米粒固体粉末10mg，加入0.5mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，振荡分散均匀；精密称取mPEG-g-CS样品30mg，加入3mL浓度为1.0mol/L的醋酸溶液中，振荡分散均匀；将两溶液混合，于20W功率下超声处理2分钟，然后移入透析袋中用蒸馏水透析处理12小时，制得所述的双层缓控释纳米粒溶液。

实施例二：本发明所述双层缓控释纳米粒的性能测定

1、mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率的测定

将干燥恒重的壳聚糖50mg、mPEG-g-CS50mg，分别溶解于25mL蒸馏水中，分别配制成质量浓度0.02%的样品溶液；准确移取5mL上述溶液置于锥形瓶中，加入0.2M的盐酸溶液2mL和甲苯胺蓝指示剂一滴，摇匀。利用聚乙烯醇硫酸钾标准溶液进行滴定，直至样品溶液由蓝色变为亮紫色，同时取5mL蒸馏水做空白对照试验。通过以下公式计算氨基含量（NH₂%），由此推出聚乙二醇接枝率。

${\mathrm{NH}}_2\%=\frac{c_N\×(v-v_0)\×M}{5\×c}$

公式中：C_N为标定的聚乙烯醇硫酸钾的浓度（mmol/L），M为壳聚糖链节的相对分子质量；C为样品溶液的浓度（g/mL）；V为滴定体积（mL）；V₀为空白滴定体积（mL）。

测定结果表明，制备mPEG-g-CS时，随着聚乙二醇单甲醚与壳聚糖的质量比增加，mPEG-g-CS中的聚乙二醇接枝率逐渐增加，在质量比为1︰1～1︰12范围内，测得聚乙二醇接枝率为1.56～12.78%。

2、mPEG-g-CS临界聚集浓度的测定

采用稳态荧光探针法考察mPEG-g-CS的两亲性，并检测其在水溶液中的临界聚集浓度，具体测定方法如下：

取10mL塑料离心管，加入50μL浓度为1.0×10^-4mol/L的芘的甲醇溶液，氮气吹干；分别加入一定浓度梯度的mPEG-g-CS溶液样品，使芘的最终浓度维持在6～10mol/L；涡旋振荡2次，于60W功率下超声处理2分钟，然后分别检测各个浓度的样品溶液的荧光发射光谱（激发波长为336nm，扫描范围为350～500nm）；记录372nm和383nm处的荧光吸收强度I₃₇₂和I₃₈₃，以I₃₇₂/I₃₈₃对mPEG-g-CS溶液的浓度C（mg/mL）的对数值lgC作图，求出临界聚集浓度。

测定结果表明，随着mPEG-g-CS中聚乙二醇接枝率的提高，mPEG-g-CS的临界聚集浓度逐渐增大。聚乙二醇接枝率分别为1.56%、6.12%、10.23%、12.54%和12.78%的mPEG-g-CS，其对应的临界聚集浓度分别为21μg/mL、55μg/mL、62μg/mL、79μg/mL和86μg/mL。

3、mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒的形态观察

分别取实施例一制得的PLGA纳米粒、双层缓控释纳米粒，分别用铜网打捞纳米粒，多余的液体用滤纸迅速吸去，置空气中自然干燥，然后分别置于透射电镜下观察其形态。结果如图1和图2所示，内层PLGA纳米粒分散均匀，无粘连，表面光滑圆整；双层缓控释纳米粒呈现内外明暗的两层。

4、mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒的粒径测定

采用动态光散射法（氩离子激光器，波长为670nm，动态光散射角为90°，温度为25±0.1℃），分别对实施例一制得的PLGA纳米粒和双层缓控释纳米粒的粒径、粒径分布进行测定。结果如图3和图4所示，内层PLGA纳米粒的平均粒径为87±24nm，双层缓控释纳米粒的平均粒径为275±43nm。

5、mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒的稳定性测试

将mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒溶液于4℃下避光保存，采用激光粒度分析仪测定纳米粒子的粒径分布及Zeta电势，每个样品每天测定3次。结果如表1所示，在4℃条件下，mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒的粒径以及Zeta电势在98天内未见明显改变（P<0.05），说明纳米粒子在水溶液中稳定性好，未出现聚集等现象，表明其在溶液中分散均匀，分散性好。

表1 mPEG-g-CS--PLGA双层缓控释纳米粒的稳定性测试结果

实施例三：本发明所述双层缓控释载药纳米粒的制备

（1）取100mg PLGA，溶于4mL二氯甲烷中，加入0.5mL浓度为20mg/mL的硫酸长春新碱水溶液，于60W功率下超声乳化2分钟，形成W1/O型初乳；

（2）将步骤（1）制得的W1/O型初乳搅拌加入质量浓度为1.5%的聚乙烯醇水溶液（含有质量浓度为1%的吐温20）中，在200rpm转速下持续搅拌4小时，形成W1/O/W2型复乳，挥发有机溶剂进行固化，到PLGA纳米粒溶液；

（3）取将步骤（2）制得的PLGA纳米粒溶液，用0.8μm的滤膜过滤，收集滤液，在18000rpm转速下离心，收集纳米粒，冷冻干燥12小时，得到固态粉末状的PLGA纳米粒；

（4）精密称取10mg PLGA纳米粒固体粉末和2mg多烯紫杉醇，加入0.5mLDMF中，振荡分散均匀；精密称取30mg mPEG-g-CS样品，加入3mL浓度为1.0mol/L的醋酸溶液中，振荡分散均匀；将两溶液混合，于20W功率下超声处理2分钟，然后移入透析袋中用蒸馏水透析处理12小时，制得双层缓控释载药纳米粒溶液。

实施例四：本发明所述双层缓控释载药纳米粒的性能测定

1、双层缓控释载药纳米粒的粒径测定

采用动态光散射法（氩离子激光器，波长为670nm，动态光散射角为90°，温度为25±0.1℃），对实施例三制得的双层缓控释载药纳米粒的粒径、粒径分布进行测定。测定结果表明，该双层缓控释载药纳米粒的平均粒径为277±50nm，与实施例一制得的双层缓控释纳米粒的粒径无显著性差异，这是由于所包载的两种药物均为小分子化合物，对内层PLGA纳米粒及双层缓控释纳米粒的形成影响较小。

2、双层缓控释载药纳米粒的药物包封率及载药量测定

精密吸取双层缓控释载药纳米粒溶液2mL，加入0.5ml二甲基亚砜，于100W功率下超声20分钟（超声5秒，间歇5秒），用0.22μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱分析法测定药物浓度，并根据以下公式计算药物包封率和载药量：

包封率=（双层缓控释载药纳米粒中的药物含量/投药量）×100%；

载药量=（双层缓控释载药纳米粒中的药物含量/双层缓控释载药纳米粒质量）×100%。

测定结果表明，在所述的双层缓控释载药纳米粒中，硫酸长春新碱的包封率为85%～90%，载药量为4.0%～4.5%；多烯紫杉醇的包封率为82%～92%，载药量为3.8%～4.1%。

高效液相色谱法测定硫酸长春新碱含量，其具体条件如下：

C18反相色谱柱：C184.6×150mm，0.5μm；

流动相：甲醇︰磷酸盐溶液的体积比65︰35，pH=7.0；

流速：1mL/min；

柱温：50℃；

紫外检测波长：296nm；

进样量：20μL；

药物保留时间：11.10±0.13min；

流动相经过滤及超声脱气处理，样品均经0.22μm滤膜过滤。

采用高效液相色谱法测定多烯紫杉醇含量，具体条件如下：

C18反相色谱柱：C184.6×150mm，0.5μm；

流动相：去离子水︰甲醇︰乙腈的体积比50︰45︰5，pH=7.0；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

紫外检测波长：230nm；

进样量：20μL；

药物保留时间：7.34±0.14min；

流动相经过滤及超声脱气处理，样品均经0.22μm滤膜过滤。

3、双层缓控释载药纳米粒的体外释药行为检测

精密称取20mg双层缓控释载药纳米粒，投入10mL离心管中，加入pH7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）作为释放介质，置于空气浴振荡器中，在温度为37±1℃、转速为75±1rpm的条件下振荡，每隔12小时离心取样，并补加等量PBS。上清液中的药物浓度用高效液相色谱分析法测定（硫酸长春新碱和多烯紫杉醇的含量测定方法与上述药物包封率、载药量的测定方法相同），通过以下公式计算双层缓控释载药纳米粒的释放量以及累计释放量，并以释放时间为横坐标、累计释放百分比为纵坐标绘制累计释放曲线。

$Q\%=\frac{C_n\&CenterDot;V+V_i\underset{i=0}{\overset{i=n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{C}_i}{W\&times;\mathrm{DL}\%}\&times;100\%$

其中，Q为释放量，C_n为第n个时间点所取样品的浓度，V为释放介质总体积，V_i为第i个时间点的取样体积，C_i为第i个时间点所取样品的浓度（V₀及C₀均为零），W为载药纳米粒的重量，DL%为纳米粒的载药量。

体外释放结果如图7所示，包载于外层的多烯紫杉醇释放较快，24小时累计释放率为64.6±2.4%（与肿瘤临床治疗提前一天给予抗血管新生药物的给药方式一致），48小时达到87.1±3.0%，随后多烯紫杉醇的释放量增加不显著；包载于内层的硫酸长春新碱24小时累积释放率为36.8±2.6%，240小时累计释放为74.1±2.9%。两种药物的释放速率有显著性差异（P<0.01）。本发明的双层缓控释载药纳米粒分阶段释放出两种药物，发挥不同的抗肿瘤作用。

对照例：胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒的制备

1、胆甾醇琥珀酰基壳聚糖的制备

（1）合成胆甾醇琥珀酸酯：取2.0g胆甾醇与1.5g琥珀酸酐加入200mL吡啶中，在室温下反应24小时，然后置于102mL冰盐酸溶液（盐酸︰冰︰水的体积比为12︰50︰40）中析出，过滤收集不溶物，并用蒸馏水洗涤，然后于40mL乙酸乙酯/乙醇/水体系（乙酸乙酯︰乙醇︰水的体积比为40︰40︰20）中，于60℃下进行重结晶，然后在80℃下干燥，制得胆甾醇琥珀酸酯。

（2）取500mg壳聚糖溶解于500mL质量浓度为1%的醋酸溶液中，然后加入250mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；取500mg胆甾醇琥珀酸酯和150mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS），溶解于200mL四氢呋喃中，然后滴加至壳聚糖的醋酸溶液中，于室温下避光反应72小时；过滤收集不溶物，减压蒸馏除去四氢呋喃，并用乙醚萃取两次（100mL/次），然后透析处理48小时，冷冻干燥，制得胆甾醇琥珀酰基壳聚糖。

2、胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒的制备

（1）取100mg PLGA，溶于4mL二氯甲烷中，加入0.5mL浓度为10mg/mL的硫酸长春新碱水溶液，于60W功率下超声乳化2分钟，形成W1/O型初乳；

（2）将步骤（1）制得的W1/O型初乳搅拌加入质量浓度为1.5%的聚乙烯醇水溶液（含有质量浓度为1%的吐温20）中，在200rpm转速下持续搅拌4小时，形成W1/O/W2型复乳，挥发有机溶剂进行固化，得PLGA纳米粒溶液；

（3）取将步骤（2）制得的PLGA纳米粒溶液，用0.8μm的滤膜过滤，收集滤液，在18000rpm转速下离心，收集纳米粒，冷冻干燥12小时，得到固态粉末状的PLGA纳米粒；

（4）精密称取10mg PLGA纳米粒固体粉末与2mg多烯紫杉醇，加入0.5mLDMF中，振荡分散均匀；精密称取30mg胆甾醇琥珀酰基壳聚糖，加入3mL浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，振荡分散均匀；将两溶液混合，于20W功率下超声处理2分钟，然后移入透析袋中用蒸馏水透析处理12小时，制得所述的双层载药纳米粒溶液。

3、胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒的性能测定

按照实施例二、实施例四所述的性能测定方法，对本实施例制得的胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒的性能进行测定。

所述的胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒中，双层纳米粒的平均粒径为472±85nm，粒径分布较宽，Zeta电势为31±17mV，硫酸长春新碱的包封率为85%～90%，多烯紫杉醇的包封率为34%～56%。

本实施例制得的胆甾醇琥珀酰基壳聚糖，在水溶液中经超声处理，可以自聚集形成亲脂性基团向内、亲水性基团向外的纳米粒。然而，经胆甾醇改性后的壳聚糖，其疏水性增加，其自聚集形成的纳米粒中，壳聚糖基团向外，胆甾醇琥珀酰基团向内。由于胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒表面Zeta电势为正值，说明壳聚糖分子中的氨基主要分布于自聚集凝胶纳米粒的表面，由于壳聚糖分子结构骨架的刚性，加之改性基团—脱氧胆酰基间较强的疏水作用力，使得合成两亲性聚合物胆甾醇琥珀酰基壳聚糖的多糖链柔性差，较难发生卷曲形成结构规则的球状，因此形成的胆甾醇琥珀酰基壳聚糖--PLGA双层载药纳米粒粒径分布宽，平均粒径较大，且球形不规则，外层包载的紫杉醇包封率较低。。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种双层缓控释纳米粒，由乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内核与包覆在其外层的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖外壳构成；乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒与聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的质量比为1︰1～1︰20；聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖中的聚乙二醇接枝率为1％～15％；

所述乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内核的粒径为80nm～150nm，Zeta电势为-24mV～-42mV；所述双层缓控释纳米粒的粒径为220nm～350nm，Zeta电势为20mV～46mV。

2.权利要求1所述的双层缓控释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，加入去离子水，超声乳化，形成水包油型初乳；

(2)将步骤(1)制得的水包油型初乳搅拌加入乳化剂水溶液中，持续搅拌至形成水包油包水型复乳，挥发有机溶剂进行固化，经过滤、干燥，得到乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒；

(3)取乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒，加入有机溶剂中分散均匀，另取聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖，加入酸溶液中分散均匀，然后将两者混合，超声处理，透析，得到所述的双层缓控释纳米粒；

所述聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的制备方法包括以下步骤：(a)取壳聚糖，加入甲酸溶液中，搅拌使之溶解；(b)搅拌加入聚乙二醇单甲醚，然后搅拌加入甲醛溶液；(c)用去离子水透析处理，然后冷冻干燥，制得所述的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；其中，聚乙二醇单甲醚与壳聚糖的质量比为1︰1～1︰12。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

在步骤(1)中，乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中的浓度为10mg/mL～100mg/mL；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟；所述的有机溶剂为二氯甲烷或氯仿；

在步骤(2)中，所述的乳化剂水溶液中还添加有表面活性剂；

在步骤(3)中，乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒与聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的质量比为1︰1～1︰20；所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿或二甲基亚砜；所述的酸溶液为醋酸溶液、甲酸溶液或稀盐酸溶液；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟。

4.一种双层缓控释载药纳米粒，由权利要求1所述的双层缓控释纳米粒与硫酸长春新碱和多烯紫杉醇组成，其中，硫酸长春新碱包裹在所述的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内核中，多烯紫杉醇包裹在所述的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内核与所述的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖外壳之间。

5.根据权利要求4所述的双层缓控释载药纳米粒，其特征在于：硫酸长春新碱与乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的质量比为1︰5～1︰20；多烯紫杉醇与乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的质量比为1︰4～1︰20。

6.权利要求4所述的双层缓控释载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(A)将乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，加入硫酸长春新碱水溶液，超声乳化，形成水包油型初乳；

(B)将步骤(A)制得的水包油型初乳搅拌加入乳化剂水溶液中，持续搅拌至形成水包油包水型复乳，挥发有机溶剂进行固化，经过滤、干燥，得到含硫酸长春新碱的载药乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒；

(C)取载药乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒与多烯紫杉醇，加入有机溶剂中分散均匀，另取聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖，加入酸溶液中分散均匀，然后将两者混合，超声处理，透析，得到所述的双层缓控释载药纳米粒。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

在步骤(A)中，乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中的浓度为10mg/mL～100mg/mL；硫酸长春新碱与乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1︰5～1︰20；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟；所述的有机溶剂为二氯甲烷或氯仿；

在步骤(B)中，所述的乳化剂水溶液中还添加有表面活性剂；

在步骤(C)中，乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒与聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的质量比为1︰1～1︰20；多烯紫杉醇与乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的质量比为1︰4～1︰20；所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿或二甲基亚砜；所述的酸溶液为醋酸溶液、甲酸溶液或稀盐酸溶液；超声乳化的功率为20W～100W，时间为20秒～2分钟。