CN111281981A - 泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与peg脂质组合的复合物纳米粒 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗领域,具体涉及一种用于核酸递送的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的阳离子复合物纳米粒,以及制备这种阳离子复合物纳米粒的方法,及其用于体内外细胞基因转染的用途,及其在疫苗新药领域的应用。
背景技术
基因治疗是指将外源治疗性基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的。基因递送是通过递送技术将有生物活性的外源治疗性基因递送至病人的受体细胞中,并使外源治疗性基因翻译产生蛋白多肽从而治疗某种疾病。基因转染是一种将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术。近年来,随着基因的体外合成技术、载体技术和编辑技术等生物技术的成熟,基因治疗时代已经正式来临。此前,美国FDA批准了Alnylam Pharmaceuticals公司的两款基于RNA干扰(RNAi)技术的基因治疗药物Onpattro和Gilvaari,它们分别用于治疗遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hereditary transthyretin amyloidosis hATTR)多发神经病变和急性肝卟啉症(AHP),这在基因治疗领域的新药开发史上具有里程碑意义。然而在另一领域,随着如蛋白替代疗法、蛋白补充疗法、癌症和传染病的疫苗接种等更多关于mRNA应用场景的发现,人们开始着手克服mRNA的缺点如体内外稳定性、短半衰期和不利的免疫原性等,以挖掘其更多的功能。与DNA基因疗法相比,IVTmRNA疗法有自己的优势。IVTmRNA不需要进入细胞核就能发挥作用;相比之下,DNA疗法需要进入细胞核转录成RNA。这主要是由于mRNA是在细胞质起作用,不需要穿越难以逾越的细胞核膜,因此mRNA不会整合进入靶细胞的基因组,也就不存在插入诱变的风险。基于mRNA的疗法和药物开发引起了科学家与投资者的广泛兴趣。
2019年底从中国爆发的2019-nCoV新型冠状病毒疫情来势凶猛,全球有69000多人感染,死亡人数超过1700人,但绝大多数发生在中国,其他20多个国家有300多人感染此病,严峻的形势让全球研究人员争相研发疫苗。疫苗一般分为两类:预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要用于疾病的预防,接受者为健康个体或新生儿;治疗性疫苗主要用于患病的个体,接受者为患者,如肿瘤患者。预防性疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物,经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后,免疫系统便会产生一定的保护物质,如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等;当动物再次接触到这种病原菌时,动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆,制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。肿瘤疫苗属于治疗性疫苗,其工作原理是将肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等,导入患者体内,克服肿瘤引起的免疫抑制状态,增强免疫原性,激活患者自身的免疫系统,诱导机体细胞免疫和体液免疫应答,从而达到控制或清除肿瘤的目的。
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗不仅有预防疾病的作用,同时还具有治疗疾病的作用。DNA疫苗是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA和真核启动调控基因等元件构成的,载有外源抗原的质粒DNA在一种真核启动子和加尾信号以及相关增强子等基因单元的控制下,可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白。将重组有外源抗原编码基因的质粒,利用某种基因递送方法导入人或动物的细胞内,通过宿主细胞的转录系统,在被免疫对象机体的活体细胞内合成抗原蛋白,从而诱导机体产生免疫应答。DNA疫苗具有以下优点:DNA接种载体(如质粒)的结构简单,提纯质粒DNA的工艺简便,因而生产成本较低,且适于大批量生产;DNA分子克隆比较容易,使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新;DNA分子很稳定,可制成DNA疫苗冻干苗,使用时在盐溶液中可恢复原有活性,因而便于运输和保存;比传统疫苗安全,虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性,能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫,但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因,基本没有毒性逆转的可能,因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险,而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定,因此DNA疫苗也不像弱毒疫苗或亚单位疫苗那样,会出现表位丢失的现象。质粒本身可作为佐剂,因此使用DNA疫苗不用加佐剂,既降低成本又方便使用;将多种质粒DNA简单混合,就可将生化特性类似的抗原(如来源于相同病原菌的不同菌株)或一种病原体的多种不同抗原结合在一起,组成多价疫苗,从而使一种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用,使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。但DNA疫苗存在以下严重的安全性问题:外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组,导致癌基因激活或抑癌基因失活;疫苗DNA长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受,长远来说,导致机体免疫功能低下;疫苗DNA作为一种外来物质,是否会引起机体产生抗DNA抗体;DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。这些潜在的风险限制了DNA疫苗的广泛应用。
mRNA疫苗是近几年发展起来的新型疫苗,是继减毒疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗之后的第4代新型疫苗,安全性比DNA疫苗更具优势。mRNA疫苗作为一种新的应对方案,是将编码抗原蛋白的mRNA直接导入细胞,通过细胞的表达系统合成蛋白,从而诱导特异免疫应答,与传统的减毒活疫苗、灭活疫苗、抗毒素、亚单位疫苗(含多肽疫苗)、载体疫苗、DNA疫苗相比有明显的优势。
首先,mRNA可被正常的细胞过程降解,降低代谢毒性的风险,体内半衰期可以通过某些修饰和递送方式进行调节,因此mRNA在体内会经历一个自然的降解过程;其次,mRNA易于合成,可编码任何新抗原,mRNA疫苗可以快速制备,通常生产一种传统流感疫苗需要至少6个月时间,而mRNA疫苗由于高产量的体外转录反应,在实现标准化生产的情况下30天内就可以生产出所需疫苗,时效性尤其在应对新型冠状病毒和禽流感病毒疫情尤为重要;另外,mRNA水溶性较好,更易成药,通过搭载各种修饰和递送方式,可有效提高mRNA疫苗稳定性,避免其在进入细胞前被体内RNA酶所降解;mRNA进入胞内后通过蛋白质翻译由机体自体产生足够的新抗原以快速启动局部T细胞,mRNA疫苗能够有效诱导B细胞和T细胞免疫应答,能引起免疫记忆效果,可以传递更多有效抗原。免疫原性方面,mRNA疫苗可以被专门设计为编码多种肽和蛋白质结构,从而表达整个抗原,还可以设计成一次表达多个抗原或在同一个纳米制剂中包含几个甚至几十段IVTmRNA序列用于制备多价mRNA疫苗。此外mRNA疫苗是非感染性的,属于非集成平台,避免了感染和插入突变的风险,还有成本低,便于保存和运输的优点。
IVTmRNA除了应用于mRNA疫苗或其他恶性肿瘤免疫疗法开发外,IVTmRNA还可以应用于罕见遗传疾病的治疗、蛋白替代或蛋白补充疗法、多功能干细胞疗法和核酸酶的基因组工程等。使用IVTmRNA作为药物无非就是将特定的遗传信息转到患者的细胞中以改变某一疾病状态。有两种方法:一种是先将IVTmRNA转移到离体的细胞中,再将这些转染细胞送回患者体内,转染细胞内的IVTmRNA将信息翻译成蛋白质在患者体内发挥作用从而产生治疗效果。这种方法一般用于基因组工程、遗传重编程、基于T细胞和树突细胞(DC)的免疫疗法以治疗癌症和感染性疾病,以及一些蛋白质替代方法。另一种方法是利用各种方式直接将IVTmRNA递送到患者体内的细胞中。这种方法主要应用于肿瘤学和传染病、过敏治疗的耐受方案和其他蛋白质替代方法。IVTmRNA发挥药效学活性的主要位置是细胞质,与在细胞核中产生并通过核输出进入细胞质的天然mRNA相反,IVTmRNA必须从细胞外空间进入细胞质。两个关键因素决定细胞质生物利用度:一种是体内普遍存在的高活性RNase使其快速降解;另一种是细胞膜,其阻碍带负电的大mRNA分子被动扩散到细胞质中。由IVTmRNA翻译得到的蛋白质产物经历翻译后修饰发挥治疗作用,这两个因素的存在可能会大大降低治疗效果,因此高效的基因递送方案尤为重要。IVTmRNA模板和蛋白质产物的半衰期是药代动力学的关键决定因素。而基因的递送一直是使基因,尤其是RNAi、DNA、mRNA等基因产业转化的难点,也是基因治疗领域的痛点。
基因载体是指将外源的治疗性基因导入生物细胞内的一种工具,目前国际上具有产业转化潜力的基因载体主要是病毒载体和非病毒载体。病毒载体是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞,进行感染的一种基因递送工具,可应用于基础研究、基因疗法或疫苗,目前应用前景较好的有慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体和腺联病毒载体等。然而病毒载体由于其固有的理化性质和生物活性,具有较为严重的缺点,比如具有生产成本高、包载量有限、靶向性差、具有插入整合与致畸致癌致突变等,不利于开发普适性和通用性的疗法。而非病毒载体包括:直接注射法(将含有DNA的溶液直接注射到肌肉,以引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达,在肌细胞中,基因表达可持续数月。)、磷酸钙共沉淀法(将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合,形成磷酸钙微沉淀,附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转化效率通常很低。)、受体介导的基因转移(依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽(配体)之间形成复合体,而这种多肽能为细胞表面的受体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内,可以选将DNA和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联,以便通过细胞内吞过程而被摄入,这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短。)、显微注射法(在显微镜下,将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞,该法适合于各种培养生长的细胞,但需要一定的设备和操作技巧。)、电穿孔法(电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。即利用脉冲场将DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。)、微粒子轰击法(也称基因枪,在真空状态下,利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微颗粒进行加速,打入完整的细胞中,从而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定转化并有可能获得表达。实验结果表明,用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。)、DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法(带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。)、精子载体法(用精子和NDA(吡啶核甘酸辅酶)-剂孵育,可捕获得DNA。通过受精过程,将外源性基因导入受精卵,大大简化了转基因动物的制备过程。这项转染方法是近年来才发展出来应用在鱼类转殖的最新技术,它最大有点就是简单方便。)等。然而上述非病毒基因递送方法存在以下方面的问题:转染效率低、毒性大、操作复杂、不利于靶向修饰等。纳米粒法是指通过纳米技术在体内或体外将外源性基因运载进入细胞的一种方法,属于非病毒载体的一种。纳米粒法包括:脂质体纳米粒、胶束纳米粒、纳米微球、纳米乳、树状大分子、共聚物纳米粒、复合物纳米粒等。与其他基因递送方法比较,具有生产成本低、化学结构明确、便于质量控制、可通过靶向性修饰实现局部靶向给药、理论上包载量不受限制、无整合诱导突变的风险、可通过机体生物降解、细胞毒性小、生物相容性好、无免疫原性以及可应用于体内外的基因递送。
在mRNA领域,虽然大多数细胞可以自发地摄取mRNA,但是效率很低并且在低剂量就饱和了。因此需要合适的制剂来保护IVTmRNA免受细胞外RNase介导的降解并促进其进入细胞。在病毒mRNA疫苗与肿瘤mRNA疫苗开发过程中,将特定序列的IVTmRNA递送至树突状细胞使其安全、高效、足量的表达对疫苗产生药效至关重要。目前纳米递送技术已经成为国际上在RNAi、DNA、mRNA等基因领域的主流递送技术,经过肌内、皮内、结内、皮下、静脉、鞘内、呼吸道及消化道等给药途径,使具有生物活性的基因递送至病人的受体细胞中发挥作用。这种纳米载体是未来基因体内外给药不可替代的传递系统,在临床应用上具有无限潜力。目前全球科学家已经开发了多种纳米递送载体,用于保护RNAi、DNA、mRNA等基因免受细胞外DNA酶或RNA酶介导的降解并促进其进入细胞,同时改善RNAi、DNA、mRNA等基因制剂的药代动力学性质,但目前大部分递送系统仍然存在严重的不稳定性、半衰期短、体内毒性大、转染效率低等问题。
发明内容
本发明目的之一是提供一种转染效率高的用于递送核酸的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒;本发明另一目的是提供一种转染效率和稳定性高的用于递送核酸的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒;本发明又一目的是提供一种转染效率和稳定性高的适用于递送mRNA的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒。
一方面,本发明提供泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒,其包含泊洛沙姆和或泊洛沙胺与PEG脂质。
一方面,本发明所述泊洛沙胺(1,2,-乙二胺四乙醇与环氧乙烷和甲基环氧乙烷的聚合物或1,2-乙二胺四异丙醇与甲基环氧乙烷和环氧乙烷的聚合物,购买自BASF公司,商品名为),在一些实施例中,所述泊洛沙胺选自 或 中的一种或几种;本发明所述泊洛沙胺结构式为:
在一些实施例中,所述泊洛沙姆(聚(丙二醇)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)共聚物或聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)共聚物,购买自Sigma Aldrich公司,商品名为),在一些实施例中,所述泊洛沙姆选自 或中的一种或几种,所述泊洛沙姆的结构式如下:
在某些实施方案中,所述PEG脂质为PEG化的两亲性高分子化合物,尤其是指PEG-C-DMG、mPEG-C-CLS、DSPE-PEG-Mal、DSPE-PEG-NH2或mPEG-DSPE,例如PEG2000-C-DMG、mPEG1000-C-CLS、mPEG2000-C-CLS、mPEG5000-C-CLS、mPEG10000-C-CLS及DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG5000-NH2、mPEG2000/5000-DSPE,其结构式如下式所示:
所述PEG化的两亲性高分子化合物利于改善纳米粒体内药动学性质、利于稳定纳米粒及便于靶向修饰的PEG化的两亲性高分子化合物,
在一些实施例中,所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质阳离子复合物纳米粒还可以包括至少一种如下脂质,如PC、DSPC、DOTAP或DOPE,所述脂质其结构式下式所示:
在一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物包括 中的一种或几种;在一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由L64:P10R5:mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:80组成。在一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由PEG2000-C-DMG:PC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:120:80组成;在一个实施方案中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由 DSPE-PEG200-Mal:PC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:160组成;在一个实施方案中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成。在一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由DSPE-PEG2000-Mal:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:2:15:80组成;一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由L31:DSPE-PEG200-NH2:DOPE:mPEG2000-C-CLS摩尔比为40:3:20:80组成;一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:17R4:mPEG2000-DSPE:DOTAP:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:100:1:30:80组成;一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:PEG2000-C-DMG:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成;一些实施例中,所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:PEG2000-C-DMG:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成。
在一些实施方案中,在制备泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物的过程中,复合物自组装成纳米粒,经检测所述阳离子复合物纳米粒平均直径或粒径小于1000nm,优选小于500nm,例如约20~300nm。在一些实施方案中,所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物的多分散系数为0~0.4,在某些实施例中为0.1~0.3。在一些实施方案中,所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物的表面电位是带正电的,例如为5.0mV~35.0mV,优选10.0mV~25.0mV。
另一方面申请人发现本发明所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物可用于体内外细胞的核酸转染,可以将细胞外的核酸递送至特定细胞内,使基因实现表达。因此,本发明还提供包含核酸的阳离子复合物纳米粒;所述阳离子复合物纳米粒对核酸的包载率在70%以上,或在85%以上,或在90%以上,例如为约93.7%、约90.3%、约77.6%、约88.8%、约89.9%、约91.4%、约68.1%、约88.3%。
在一些实施方案中,所述核酸可以是mRNA、RNAi、DNA等等,在一个具体实施方案中,所述核酸为mRNA。
在一些实施方案中,所述核酸为信使核糖核酸mRNA,mRNA是指从脱氧核糖核酸(DNA)转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸(RNA)。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板,决定肽链的氨基酸排列顺序。体外转录信使RNA(IVT mRNA)是指在体外条件下以DNA为模板转录得到的一种mRNA,这种mRNA可以指导特定蛋白质的合成,阻止或改变某种特定的疾病。
再一方面,本发明提供所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物在制备RNA/DNA疫苗药物中的应用。
基因转染是一种将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术。
本发明创造的优点:
本发明通过选取不同长度或不同聚合度的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与特定的PEG脂质以特殊范围的比例进行混合冻干剂复溶之后能很快形成纳米粒,所得纳米粒的电位带正电的,使得阳离子复合物纳米粒在体内外更稳定,其作为核酸载体比病毒载体成本低,便于质量控制,比一般纳米载体(行业金标准ThermoFischer公司的Lipofactamine2000)转染效率高,毒性小,生物相容性好,在体外实验中给药后无需换液,特别适合离体细胞的转染,体内体外转染均有效,且制备简单,创造性地解决了核酸尤其是mRNA安全高效地在体内外递送的难题。
本发明所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒主要用于体内外细胞的基因转染,可以将细胞外的基因递送至特定细胞内,使基因实现表达。本发明所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的阳离子复合物纳米粒既可以用于科研,尤其是指用于制备基因转染试剂盒或细胞标记试剂盒,还可以应用于RNA/DNA疫苗新药领域,尤其是指用于mRNA肿瘤疫苗和mRNA流感病毒疫苗的开发;创造性地解决了核酸安全高效地在体内外递送的难题。
附图说明
图1.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方1复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图2.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方2复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图3.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方3复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图4.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方4复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图5.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方5复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图6.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方6复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图7.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方7复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图8.示本发明实施例FLuc-mRNA与处方8复合物不同质量比混合后在体外细胞细胞中的转染荧光表达强度。
图9.示本发明实施例不同处方按最佳质量比与FLuc-mRNA混合后在DC2.4细胞中的转染荧光表达强度。
图10.示本发明实施例不同处方按最佳质量比与Luc-pDNA混合后在DC2.4细胞中的转染荧光表达强度。
图11.示本发明实施例不同处方按最佳质量比与5ug OVA-mRNA混合后在C57BL/6J小鼠皮下注射疫苗,考察疫苗对黑色素瘤的治疗效果。
具体实施方式
购买自BASF公司,购买自Sigma Aldrich公司;简写为T904、简写为L-64、简写为T304、 简写为T90R4、简写为T704、简写为17R4、 简写为P-85、简写为T701、简写为L-61、 简写为L31。
实施例一:阳离子复合物纳米粒LLLRNA1003各处方的制备
处方1:T304:PEG2000-C-DMG:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80
先将T304从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将PEG2000-C-DMG、DSPC和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:20:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声2秒暂停2秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:3:20:80的比例混合,即得到处方1水溶液。将处方1水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方2:T304:17R4:mPEG2000-DSPE:DOTAP:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:100:1:30:80
先将T304和17R4从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下按摩尔比1:1称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将mPEG2000-DSPE、DOTAP和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比1:30:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声3秒暂停2秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析24小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为200:1:30:80的比例混合,即得到处方2。将制备好的处方2水溶液。将处方2水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方3:L31:DSPE-PEG200-NH2:DOPE:mPEG2000-C-CLS摩尔比为40:3:20:80
先将L31从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将DSPE-PEG200-NH2、DOPE和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:20:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声2秒暂停3秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为40:3:20:80的比例混合,即得到处方3水溶液。将处方3水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方4:L85:DSPE-PEG2000-Mal:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:2:15:80
先将L85从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将DSPE-PEG2000-Mal、DSPC和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比2:15:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声3秒暂停3秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:2:15:80的比例混合,即得到处方4水溶液。将处方4水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方5:T701:PEG2000-C-DMG:PC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:120:80
先将T701从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将PEG2000-C-DMG、PC和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:120:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声2秒暂停2秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:3:120:80的比例混合,即得到处方5水溶液。将处方5水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方6:T904:T90R4:DSPE-PEG200-Mal:PC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:160
先将T904和T90R4从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下按摩尔比1:1称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将DSPE-PEG200-Mal、PC和mPEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:20:160称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声2秒暂停3秒的方式持续超声60分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:3:20:160的比例混合,即得到处方6水溶液。将处方6水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方7:L61:mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80
先将L61从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将mPEG2000-DSPE、DSPC和mPEG5000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:20:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声2秒暂停2秒的方式持续超声30分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:3:20:80的比例混合,即得到处方7水溶液。将处方7水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
处方8:L64:P10R5:mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:80
先将L64和P10R5从4℃冰箱取出平衡至室温,在室温下按摩尔比称取并加去核酸酶的超纯水溶解,用斡旋仪充分振荡5min,静置过夜得到储备液A;将mPEG2000-DSPE、DSPC和mPEG5000-C-CLS从-20℃冰箱取出,平衡至室温开封,在室温下按摩尔比3:20:80称取,在圆底烧瓶中用氯仿溶解。使用旋转蒸发仪蒸发去除氯仿,将储备液A倒入圆底烧瓶中,在40摄氏度下以超声3秒暂停3秒的方式持续超声30分钟,转入MWCO为5000的透析袋中,用去核酸酶的超纯水透析12小时,每4小时更换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤,得到储备液B,将储备液A和储备液B按摩尔比为100:3:20:80的比例混合,即得到处方8水溶液。将处方8水溶液用冻干机制备成冻干剂,并保存于4℃冰箱中待用。
实施例二:泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的阳离子复合物纳米粒处方的表征
本发明涉及纳米粒径与电位是采用Malvern Zetasizer Nano ZSE测试,将处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8不含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒制成1ml待测液,在25℃条件下考察了处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8不含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒的动态光散射纳米粒子的粒径大小(IntensityMean)、表面电位(Zeta Potential)及多分散性(PDI),如表1所示。
按各处方纳米粒与FLuc-mRNA最佳质量比(处方1最佳质量比为5000、处方2最佳质量比为5000、处方3最佳质量比为3500、处方4最佳质量比为100、处方5最佳质量比为1500、处方6最佳质量比为5000、处方7最佳质量比为2000及处方8最佳质量比为500)称取在4℃下已保存6个月的不含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒的处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8的冻干剂,分别加500ul去核酸酶的水复溶10分钟,吹打数次之后分别将500ul含200ng FLuc-mRNA的去核酸酶水溶液加入混合10分钟制备得到含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒。采用MalvernZetasizer Nano ZSE测试含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒的动态光散射纳米粒子的粒径大小(Intensity Mean)、表面电位(Zeta Potential)及多分散性(PDI),如表2所示。
表1:处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8不含mRNA的阳离子复合物纳米粒的粒径大小(Intensity Mean)、表面电位(Zeta Potential)及多分散性(PDI)。
表2:处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8含mRNA的阳离子复合物纳米粒的粒径大小(Intensity Mean)、表面电位(Zeta Potential)及多分散性(PDI)。
实施例三:测试泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的阳离子复合物纳米粒各处方的包载率
使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒(ThermoFischer公司)测定LLLRNA-1003各处方(处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8)对FLuc-mRNA的包封率,具体方法参考试剂盒说明书,本发明的简要处理方法为:
按各处方纳米粒与FLuc-mRNA最佳质量比(处方1最佳质量比为5000、处方2最佳质量比为5000、处方3最佳质量比为3500、处方4最佳质量比为100、处方5最佳质量比为1500、处方6最佳质量比为5000、处方7最佳质量比为2000及处方8最佳质量比为500)称取在4℃下保存6个月的不含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒的处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8的冻干剂,分别加500ul去核酸酶的水复溶10分钟,吹打数次之后分别将500ul含200ng FLuc-mRNA的去核酸酶水溶液加入混合10分钟制备得到含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒。使用低温高速离心机将各处方在4℃,16000rpm条件下离心2.5h,收集上清液并用移液器定量其体积,记为V1;用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒测量上清中的FLuc-mRNA的浓度,记为C1;将离心后的沉淀溶于1ml的DMSO,从中取100ul,加入200ul肝素钠溶液(6.667mg/ml)混匀,室温静置2h后,记录置换的体积V2并用Quant-iTRiboGreen RNA检测试剂盒测定FLuc-mRNA的浓度,记为C2;LLLRNA-1003各处方的包载率计算公式如下:
包载率=100%-(V1C1)/(V1C1+V2C2)×100%
本发明所述处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8的包载率分别为:93.7%、90.3%、77.6%、88.8%、89.9%、91.4%、68.1%、88.3%。
实施例四:不同处方按材料与FLuc-mRNA的最佳质量比混合后在DC2.4细胞中的转染
1)细胞收集
从培养箱中取出细胞,弃去培养液,加入PBS 10ml,轻轻摇动培养瓶,使其流遍细胞表面,弃去PBS,向瓶内加入约2ml消化液(0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA溶液),轻轻摇动后,消化30秒,将培养瓶置于显微镜下观察,发现胞质回缩,细胞间隙增大后,立即加入含血清的培养液终止消化。用吸管吸取瓶内培养液,反复轻轻吹打瓶壁细胞,使之成为单细胞悬液,将细胞悬液加入到15ml离心管中,于1500转/min离心5min,除去上清液,用培养基重悬细胞,在计数板上计数后,用培养基调节细胞悬液的浓度,待用。
2)FLuc-mRNA在体外细胞中的基因转染
将细胞悬液以4×104个每孔的密度分装至96孔板,放入37℃、5%CO2培养箱中静置培养。24h后将浓度为1ug/ul的FLuc-mRNA用去核酸酶的超纯水稀释至0.1ug/ul,按不同质量比以每孔200ng FLuc-mRNA的浓度分别与复溶的不同浓度的处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8冻干剂等体积混合,分别得到88ul含FLuc-mRNA的阳离子复合物纳米粒处方混合液,静置30min后,以每孔20ul的体积分别加至每孔含180ul完全培养基的96孔板中,以Thermofischer公司的Lipofactamine2000包载的FLuc-mRNA和裸FLuc-mRNA作为两个阳性对照组,每个样品重复4个孔。
给药24h后,用DPBS配置浓度为25mg/ml的D-Luciferin储存液,混匀后立即使用或分装后-20℃保存。用预热好的完全培养基以1:100的比例稀释D-Luciferin,使其工作浓度为250ug/ml,吸出96孔板中的培养液。在成像前将100ul D-Luciferin工作溶液加入各96孔板,继续在37℃孵育箱中培养5min,以每孔200ng FLuc-mRNA的浓度分别与处方1-8的质量比为50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000进行混合,对照组为裸mRNA和Lipo 2000,用Omega FLuostar酶标仪成像测试FLuc-mRNA的荧光表达强度。结果如图1-8所示:横坐标代表处方与mRNA的质量比,纵坐标为荧光强度,纵坐标越高,表示转染效率越高,数据表明,FLuc-mRNA与处方1的最佳质量比为5000、与处方2的最佳质量比为5000、与处方3的最佳质量比为3500、与处方4的最佳质量比为100、与处方5的最佳质量比为1500、与处方6的最佳质量比为5000、与处方7的最佳质量比为2000、与处方8的最佳质量比为500。
采用以上方法按各处方最佳质量比重复在DC2.4细胞中的转染实验,实验结果如图9所示。
实施例五:不同处方按材料与Luc-pDNA的最佳质量比混合后在DC2.4细胞中的转染
将细胞悬液以4×104个每孔的密度分装至96孔板,放入37℃、5%CO2培养箱中静置培养。24h后将浓度为1ug/ul的Luc-pDNA用去核酸酶的超纯水稀释至0.1ug/ul,以每孔300ng Luc-pDNA的浓度分别与复溶好的处方1(质量比为5000)、处方2(质量比为5000)、处方3(质量比为3500)、处方4(质量比为100)、处方5(质量比为1500)、处方6(质量比为5000)、处方7(质量比为2000)及处方8(质量比为500)按蛋白表达最高的质量比比例混合分别得到88ul含Luc-pDNA的阳离子复合物纳米粒处方混合液,静置30min后,以每孔20ul的体积分别加至每孔含180ul完全培养基的96孔板中,以Thermofischer公司的Lipofactamine2000及其处方作为阳性对照,以不加处方不加Luc-pDNA的孔做阴性对照,每个样品重复4个孔。
给药24h后,将100ul工作浓度为250ug/ml的D-Luciferin溶液加入各96孔板,继续在37℃孵育箱中培养5min,最后用Omega-FLuostar酶标仪成像,测试Luc-pDNA的荧光表达强度,每24小时重复测试一次,每次测试完后将含D-Luciferin的培养基吸出,加入新鲜完全培养基继续培养24小时后加D-Luciferin测试,重复四天。结果如图10所示。
实施例六本发明阳离子复合物纳米粒LLLRNA1003-OVA-mRNA疫苗对荷瘤小鼠模型的治疗
1)B16-OVA黑色素瘤小鼠模型的建立:将鼠源淋巴瘤细胞B16-OVA在体外扩增培养,得到B16-OVA细胞系,用DPBS稀释备用,每只小鼠打5×105个肿瘤细胞。在第0天将7周龄的雌性C57BL/6J小鼠侧腹部脱毛,收集培养的B16-OVA肿瘤细胞,将B16-OVA肿瘤细胞皮下注射到小鼠的侧腹部,建立皮下B16-OVA肿瘤模型。
2)LLLRNA1003-OVA-mRNA疫苗的制备:将复溶好的将处方1、处方2、处方5、处方6分别与OVA-mRNA(从美国TriLink公司购买获得)简单轻轻混合30分钟后分别得到由处方1、处方2、处方5、处方6制备的四种LLLRNA1003-OVA-mRNA疫苗;
3)对C57BL/6J小鼠用LLLRNA1003-OVA-mRNA疫苗(每次每只注射含有5ug治疗剂mRNA-OVA的纳米粒疫苗,注射前用9%生理盐水缓冲液稀释)分别在第5天、第8天、第11天、第14天、第17天、第20天通过脚掌注射的方式接种疫苗,同时将接种等体积PBS缓冲溶液和稀释后同体积等量的OVA-mRNA溶液的小鼠设定为对照组,平行每组5只小鼠。
4)从接种肿瘤后第10天开始,每天测量肿瘤垂直直径。按下述公式计算C57BL/6J小鼠的肿瘤体积:V(mm3)=x×y2/2,单位为mm,其中V代表肿瘤体积,x表示肿瘤长径,y表示肿瘤短径。同时每天用电子天平记录C57BL/6J小鼠体重的变化,并统计存活率。其考察结果如图11所示:在第0天皮下接种B16-OVA黑色素瘤细胞,分别在接种肿瘤后第5天、第8天、第11天、第14天、第17天和第20天接种疫苗。接种肿瘤后第11天,由处方1、处方2、处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组从第12天开始显示肿瘤生长,而PBS对照组和裸mRNA组从第12天开始可见肉瘤。从第13天起,由处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组开始可见肿瘤。从第14天起,由处方1和处方2制备得到的LLLRNA1003疫苗组开始可见肿瘤。与PBS对照组和裸mRNA组相比,由处方1、处方2、处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组显示出明显的肿瘤生长延迟。在第20天,由处方1、处方2、处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组的肿瘤大小均小于PBS对照组和裸mRNA组。PBS对照组和裸mRNA组分别从接种肿瘤后第21天和第25天开始,所有小鼠分别在第30天和第33天全部牺牲。由处方1、处方2、处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组分别从第39天、第29天、第27天和第35天开始牺牲。处方2、处方5和处方6制备得到的LLLRNA1003疫苗组所有小鼠分别在第38天、第36天和第41天全部牺牲。继续统计处方1制备得到的LLLRNA1003疫苗组的存活率,直到第44天为止。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与PEG脂质组合的阳离子复合物纳米粒,其包含泊洛沙姆和或泊洛沙胺与PEG脂质;所述泊洛沙胺选自304、701、704、707、803、901、904、908、1107、1301、1304、1307或90R4、150R1中的一种或几种;所述泊洛沙姆选自17R4、P10R5、L-121、L-31、L-64、L-85、P-10R5、L-35、L-61、P-123、F108、F127、F68、P105、P104、P-85、P103或L122中的一种或几种;所述PEG脂质为PEG-C-DMG、mPEG-C-CLS、DSPE-PEG-Mal、DSPE-PEG-NH2或mPEG-DSPE,尤其是指PEG2000-C-DMG、mPEG1000-C-CLS、mPEG2000-C-CLS、mPEG5000-C-CLS、mPEG10000-C-CLS、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG5000-NH2或mPEG2000/5000-DSPE。
2.如权利要求1所述阳离子复合物纳米粒,其特征在于包括如下脂质PC、DSPC、DOTAP或DOPE。
4.如权利要求1所述阳离子复合物纳米粒,其特征在于所述阳离子复合物纳米粒组合物由L64:P10R5:mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:80组成。
6.如权利要求1所述阳离子复合物纳米粒,其特征在于所述阳离子复合物纳米粒组合物由904:90R4:DSPE-PEG200-Mal:PC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为50:50:3:20:160组成;或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由L61:mPEG2000-DSPE:DSPC:mPEG5000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由L85:DSPE-PEG2000-Mal:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:2:15:80组成;或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由L31:DSPE-PEG200-NH2:DOPE:mPEG2000-C-CLS摩尔比为40:3:20:80组成;或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:17R4:mPEG2000-DSPE:DOTAP:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:100:1:30:80组成;或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:PEG2000-C-DMG:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成或者所述阳离子复合物纳米粒组合物由T304:PEG2000-C-DMG:DSPC:mPEG2000-C-CLS摩尔比为100:3:20:80组成。
7.权利要求1-6任一所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物用于体内外细胞的核酸转染的用途。
8.一种包含核酸的阳离子复合物纳米粒,其特征在于包含泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物、核酸。
9.如权利要求7所述用途或权利要求8所述包含核酸的阳离子复合物纳米粒,其特征在于所述核酸为mRNA、siRNA、DNA,优选mRNA。
10.权利要求1-6,8,9任一所述泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的复合物在制备RNA/DNA疫苗药物中的应用。
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