CN115025054B - 一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法，包括如下内容：(1)将疏水活性成分用有机溶剂溶解，得到溶剂相；(2)将含乳铁蛋白的溶液作为反溶剂相，与溶剂相混合制备纳米粒，溶剂相：反溶剂相的体积比为1:8～16，制备过程中混合溶液pH值为5～7，分离出游离的疏水活性成分后过滤、冻干，即得纳米组合物；其中，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8～12。本发明组合物LF‑NP粒径均一、载药能力强、稳定性好，解决了乳铁蛋白现阶段制备过程中，使用具有较大毒性的交联剂而导致的安全性低，无法临床运用的瓶颈问题，且经过系列筛选，获得了可规模化稳定制备LF的工艺处方。

Description

一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用药物载体技术领域，具体涉及一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法。
背景技术
阿尔茨海默症、帕金森病及脑部肿瘤等脑部疾病已成为危害人类生命、健康的一类难治的病症。目前临床上治疗脑部疾病使用的小分子细胞药物存在靶向性差、时间短和易产生耐药性等问题。纳米药物载体是指粒径在10～1000nm的一类新型载体，由于其粒径比毛细血管通路小，且具有降低药物毒副作用、提高药物稳定性、缓释控释药物和药物靶向释放等优点，逐渐引起了人们的高度重视。
近年来，纳米载药技术的发展为药物的脑靶向递送提供了一系列的研发策略，如基于纳米尺寸效应以提高疏水性药物分散性及渗透性的脂质体、微乳液、胶束等纳米制剂和能够提高血脑屏障(BBB)透过效率的细胞穿膜肽(CPPs)、基于受体介导的膜转运蛋白(如转铁蛋白和乳铁蛋白)等修饰技术均有效提高了药物在脑组织的富集。其中，作为人体内源性物质的乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)，不仅可实现对于血脑屏障的高效透过及神经损伤部位的主动靶向，还因其来源广泛、可结合基团多、生物相容性高等优点，具有成为药物脑部递送候选载体的潜力。
LF是分子量约为80kDa的单体糖蛋白，其等电点(Pl)约为8.0-8.5。LF作为纳米药物载体治疗神经退行性疾病有多方面优势，包括：1)LF是生物相容性高且具有营养价值的GRAS(普遍认为是安全的)原料；2)乳铁蛋白受体(LfR)在脑内皮细胞中高度表达，有助于药物分子跨过BBB，且LfR在与神经退行性疾病相关的毛细血管和神经元中高度表达，故LF可以发挥脑靶向作用；3)LF本身具有改善神经系统的功能，大量学者在衰老和神经退化的大脑中检测到较高水平的铁，LF作为铁转运蛋白，能够通过与铁的螯合作用来减轻氧化应激反应和改善铁代谢来保护神经系统。
贾前生等公开了乳铁蛋白基姜黄素(Cur)纳米载体颗粒的制备方法：采用超声浴使姜黄素溶解在无水乙醇溶液中；将一定体积的姜黄素溶液与5倍体积的乳铁蛋白-Tris-HCl溶液混合，静置12h后过滤，冻干后得到姜黄素纳米载体颗粒(乳铁蛋白基姜黄素纳米载体颗粒的制备及其对大鼠抗疲劳能力的影响[J].食品工业科技,2021,42(13):7.)。该文献中的pH调节剂是使用Tris-HCl进行调节，Tris(三羟甲基氨基甲烷)是一种有毒、有刺激性的化学物质，对人体伤害较大；该文献方法得到的粒径太大，粒径为593.8nm，不利于利于穿过紧密的脑组织间隙到达作用部位，且包封率不理想，仅为(63.57±2.43)％。
尽管目前关于乳铁蛋白纳米粒的制备方法已有报道，但在制备工艺中存在大量使用非药用交联剂(如戊二醛)、有毒有机试剂的问题，不适合直接作用于人体。不仅如此，制备得到的纳米载药颗粒性状会受到反应原料、反应条件等因素影响，过于复杂的制备工艺会常导致纳米粒制备结果重现性差，使制剂后期的有效性评价产生差异，这也是多数纳米制剂无法规模化生产应用的瓶颈问题。
基于此，开发一种具有安全性、稳定性、载药能力等各方面均较好的纳米制剂，具有重要的现实和经济意义。
发明内容
基于上述存在的问题，本发明提供了一种简单、无交联剂、无有毒有机试剂的安全的以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法，制备出粒径均一、载药能力强、稳定性好的纳米药物。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
提供一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法，包括如下内容：
(1)将疏水活性成分用有机溶剂溶解，得到溶剂相；
(2)将含乳铁蛋白的溶液作为反溶剂相，与溶剂相混合制备纳米粒，溶剂相：反溶剂相的体积比为1:8～16，制备过程中混合溶液pH值为5～7，分离出游离的疏水活性成分后过滤、冻干，即得纳米组合物；
其中，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8～12。
载药纳米微粒一般是指粒径在10nm-1000nm之间的固态或胶态粒子。活性成分(药物，生物活性物质等)通过溶解、包裹作用分布于粒子内部或通过吸附作用位于粒子的表面。由于纳米微粒的尺寸效应，纳米微粒在生物体内的分布具有特异性，控制纳米微粒的大小，可以使纳米微粒到达特定的组织，起到靶向的作用。比如粒径在100nm-1000nm的微球很快被网状内皮系统(RES)的吞噬细胞从血液中清除，到达网状内皮组织丰富的肝、脾组织中，而粒径小于100nm的纳米微粒可到达骨髓等组织中。本发明得到的纳米制剂的粒径低至70纳米，分布均匀，粒径分散指数PDI在0.2以下，呈现单分布，有利于提高组织间的渗透作用，且粒度越小，越容易进入组织深部，更益于肿瘤、脑部疾病的治疗。
所述疏水活性成分包括但不限于木犀草素、姜黄素、依达拉奉、喹硫平、丁苯酞、奥氮平、乙酰唑胺、槲皮素，厚朴酚，这类活性成分水溶性较差。例如，姜黄素极难溶于水，经实验测得其在25℃条件下于水中的饱和溶解度仅为(11.33±0.73)ng/ml。
改善疏水活性成分在水中的分散性是促进其临床发展应用的前提。乳铁蛋白作为多功能糖蛋白，既可作为配体修饰于载体上发挥靶向作用，也可充当载体递送活性药物、其本身也是活性分子具有抗微生物、抗癌和神经保护等药理作用。本发明通过筛选乳铁蛋白包载姜黄素纳米粒的制备工艺，以期获得充分发挥乳铁蛋白的脑靶向、运载和治疗活性作用的姜黄素纳米制剂，并用于后期脑部神经退行性疾病的治疗。
所述有机溶剂包括但不限于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、石油醚，选用的有机溶剂可在制备后期完全除去。
在制备过程中，发明人发现，溶剂、反溶剂混合后的混合溶液中的酸碱性会影响纳米粒径，pH值在4～6时，包封率会逐渐增大，pH值逐渐增加包封率出现下降，因此，在本发明的一种优选的实施方式中，所述混合溶液pH值为5～7。
当溶剂相：反溶剂相的体积比为1:12～1:16，所述混合溶液pH值为5～6，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8～10时，得到的产品包封率都在91％以上，粒径低于100nm；
基于投料比更低，pH更接近于生理环境的考虑，在本发明中，最佳工艺为：溶剂相：反溶剂相的体积比设定为1:16，混合溶液pH值为6，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8；
进一步地，综合考虑包封率、粒径，本发明中，当溶剂相：反溶剂相的体积比为1:16，混合溶液pH值为5，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:10时，得到的综合评分指标最高。
进一步地，所述(2)中，采用探针超声仪将反溶剂相与溶剂相混合制备纳米粒，所述探针超声仪的超声功率为45～180w，振幅为2％～15％，超声时间为0～5min。
适当的超声条件有助于提高纳米体系的稳定性，超声功率过小、超声时间过短会引起包封率下降，超声功率过大、超声时间过长会导致破坏了纳米体系的稳定性使药物泄漏，最终也会导致包封率下降、粒径增大，因此，在本发明的一种优选的实施方式中，所述探针超声仪的超声功率为90w，振幅为10％，超声时间为2min，能够保证纳米体系更稳定，提高包封率。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述(2)中，采用均质机将反溶剂相与溶剂相混合制备纳米粒，均质机搅拌速率为：500～1500rpm。
进一步地，所述冻干使用的冻干保护剂包括但不限于乳糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、木糖醇、甘氨酸、肌醇。
稳定性考察中，观察到纳米组合物在水溶液中的稳定性受时间、温度等因素的影响较大，且在4℃条件下的稳定性也仅为1个月左右，这不利于其长期储存备用。因此本发明通过将纳米组合物制备成冻干粉以延长其稳定时间。冷冻干燥技术是储存和稳定纳米粒的常用方法，但蛋白质的高级结构可能会在长时间的低温冷冻和干燥失水的情况下受到破坏。糖类作为常见的冻干保护剂，可提供羟基与蛋白质结合，从而稳定蛋白质原有的氢键结构，称为“水替代假说”。但并非所有糖类都能对本发明纳米组合物的冻干起到很好的保护效果，本发明经过大量实验筛选，最终找到了乳糖、甘露醇、海藻糖这几种糖对纳米组合物的冻干能有较好的保护效果。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述冻干保护剂为海藻糖，用量为0.5％～5％。
2％的海藻糖作为冻干保护剂能较好的稳定纳米组合物的物理化学性质，冻干复溶前后未见明显的粒径、PDI和电位值的变化。
在某些实施方式中，通过将本发明的纳米组合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合，制备用于储存和使用的制剂。
本发明还提供了一种前述制备方法所制备得到的纳米组合物，或前述药物组合物在制备治疗和/或预防脑部疾病中的用途；所述脑部疾病包括但不限于脑部神经损伤性疾病、精神类疾病、癌症、肿瘤。
有益效果：
(1)与现有技术相比，本发明以乳铁蛋白为载体，通过特定的制备条件提高了疏水活性药物成分在水溶液中的分散性，制备工艺中避免使用如戊二醛等有毒的交联剂、有机试剂，有效的提高了纳米颗粒的安全性，解决了无法临床运用的瓶颈问题，经过系列筛选，获得了可规模化稳定制备LF的工艺处方。
(2)本发明以乳铁蛋白为载体的纳米组合物粒径约为70纳米，粒径分布均匀，PDI在0.2以下，呈现单分布，有利于穿过紧密的脑组织间隙到达作用部位，从而提高组织间的渗透作用，益于肿瘤、脑部疾病的治疗。
(3)本发明纳米组合物具有理想的包封率(94.8±1.6)％和载药量(10.2±0.5)％，其体外释放24h后累积释放量为65.8％，相较于游离姜黄素展现出较好的缓释效果。
(4)相对于负电位，正电位更益于细胞摄取，有利于药物进入细胞，递送效率更高，当Zeta电位高于30mV时，细胞毒性增大，因此低于30mV的制剂具有更好的安全性，本发明以乳铁蛋白为载体的纳米组合物表面电位约为20mV，安全性更好。
(5)本发明制备方法简便、有效，具有良好的包封率、载药能力和稳定性，包封率在90～95％，而现有技术包封率仅在60～70％左右。
附图说明
图1为LF载体的色谱图，(A)空白LF纳米粒溶液；(B)LF-Cur NPs供试品溶液；(C)Cur标准品溶液；
图2为溶剂/反溶剂比对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图3为Cur/LF质量比对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图4为pH值对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图5为磁力搅拌速度对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图6为超声时间对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图7为超声功率对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响(n＝3)；
图8为Cur-LF NPs的粒子形态，左图(A)为Cur-LF NPs水溶液状态外观，右图(B)为Cur-LF NPs透射电镜(×100,000)图；
图9为Cur-LF NPs粒度图和电位图，A.Cur-LF NPs粒度图，B.Cur-LF NPs的电位图；
图10为Cur-LFNPs在室温(A)和4℃(B)条件下的储存稳定性；
图11为Cur-LFNPs冻干品外观；
图12为姜黄素原料药溶液和Cur-LF NPs的体外释放曲线(n＝3)；
图13为Lu-LF NPs粒度分散图和Zeta电位图，A.Lu-LF NPs粒度分散图，B.Lu-LFNPs的Zeta电位图；
图14为奥氮平-LF粒径表征图；
图15为依达拉奉-LF粒径表征图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
实施例1
1.试剂
乳铁蛋白(批号A16GS145363，含量95％)，上海源叶生物科技有限公司；姜黄素(批号C12811019，AR级)，成都麦克林生物科技有限公司；姜黄素对照品(批号PS012299，含量98.5％)，成都普思生物科技股份有限公司；CE型透析袋(8000～10000Da)，甘露醇(批号M24GS149532，AR级)，海藻糖(批号S28J12H138585，BR级)，上海源叶生物科技有限公司；冰乙酸、乙腈和甲醇为HPLC级，无水乙醇和十二烷基硫酸钠为AR级，成都科隆化学品有限公司。
2.方法
2.1去溶剂化法制备Cur-LF NPs
采用去溶剂化法制备Cur-LF NPs：称取一定量的LF超声溶于12ml超纯水中，将pH调至6后于冰箱放置过夜至充分溶解，为反溶剂相，若溶解不完全，后期会影响载药量和包封率。
将适量姜黄素(Cur)超声溶于无水乙醇中，为溶剂相。使用注射器将Cur-乙醇溶液以1mL/min的速率缓慢地滴入正在磁力搅拌中的LF溶液，得到混合溶液，然后在探针超声仪上匀化制得的纳米粒(功率900w，振幅10％，开2s、关3s，循环2min)。最后通过离心(4000r/min，10min)以分离游离姜黄素，上清液过0.22μm微孔滤膜即得黄色澄清的Cur-LF NPs溶液，备用。空白LF NPs的制备除不加Cur外，同法制备。
2.2包封率、载药量的测定方法
2.2.1离心沉淀-滤膜法测定包封率
姜黄素极难溶于水，未包封的游离药物常以微晶的形式存在于溶液中。故通过离心联合滤过的方式除去游离姜黄素，进行Cur-LFNPs包封率的测定。具体操作方法为：取1ml“2.1”项下探针超声前的Cur-LFNPs置于20mL容量瓶中，加入适量甲醇超声破乳，冷却后加甲醇定容，采用HPLC法测得的药物浓度为加入药物总量(Wt)；吸取“2.1”项下离心-过膜后的Cur-LFNPs 1mL同上法处理后测得的浓度为被包封药物的量(We)，包封率(Entrapmentefficiency,EE,％)按下列公式求得。
EE(％)＝(We/Wt)×100
2.2.2载药量
将Cur-LF NPs冷冻干燥48h后储存于棕色干燥器中，备用。精密称取Cur-LF NPs冻干粉(W总)至20mL容量瓶中，加入适量甲醇超声破乳，冷却后加甲醇定容，采用HPLC法测得的浓度为冻干粉中药物的量(W药)，载药量(Drugloadingcontent,DL,％)按下列公式求得。
DL(％)＝(W药/W总)×100
2.3含量测定方法学建立
2.3.1色谱条件
色谱系统：Agilent 1260Infinity II型高效液相色谱仪；色谱柱：AglientZORBAX Eclipse Plus C18(150×4.6mm，3.5μm)；流动相：4％冰醋酸:乙腈＝52:48；检测波长430nm；流速：1mL.min-1；柱温：30℃；进样体积：10μL。
2.3.2专属性考察
供试品溶液的制备：取1mL“2.1”项下的LF-Cur NPs溶液至50mL容量瓶中，用适量甲醇溶解后超声5min以破坏NPs，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度线，精密吸取供试品溶液10μL进样，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定；空白LF NPs供试品溶液同法制备。色谱图见图1，可知空白LF载体在此色谱条件下不出峰，不会对Cur的含量测定产生干扰；含Cur的纳米粒供试品溶液中，Cur的出峰时间与Cur对照品出峰时间一致，证明该色谱方法专属性好。
2.3.3线性关系考察
精密称取Cur对照品(纯度98.5％)24.00mg，置于50mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度线配制成浓度为472.8μg/mL的对照品母液。移取相应体积的对照品母液，用甲醇稀释配制成浓度分别为141.84、94.56、70.92、47.28、18.91、3.78、0.76μg/mL的一系列标准品溶液，精密吸取上述标准溶液10μL进样，平行3次，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以Cur对照品溶液浓度为横坐标(X)，对应的峰面积为纵坐标(Y)，得线性回归方程：Y＝58893X-20895，r＝0.9998，结果表明Cur在浓度范围0.76～141.84μg/mL内线性关系良好。
2.3.3精密度试验
取低、中、高浓度(0.76、47.28、141.84μg/mL)的Cur对照品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件，在一天中早、中、晚3个时间点，将每个浓度连续进样3次，记录平均峰面积，计算不同时间点间峰面积的RSD值，考察不同浓度下的日内精密度；RSD分别为0.72％、0.12％、0.18％，可见日内精密度良好。
取低、中、高浓度(0.76、47.28、141.84μg/mL)的Cur对照品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件，连续3天在固定时间点将每个浓度连续进样3次，记录平均峰面积，计算3天间峰面积的RSD值，考察不同浓度下的日间精密度；RSD分别为0.89％、0.44％、0.46％，可见日间精密度良好。
表1高效液相色谱法测定姜黄素的日内精密度和日间精密度
2.3.4加样回收率试验
按“2.1”方法配制一定浓度的Cur-LFNPs供试品溶液，精密吸取1mL至10mL容量瓶中，用适量甲醇溶解后超声5min以破坏NPs，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度线，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算供试品浓度；然后取9份1mL供试品溶液分别置于10mL容量瓶中，分为3组，每组3份，根据供试品浓度分别加入1mL70.92、94.56、118.2μg/mLCur对照品溶液，同上法破坏NPs后用甲醇稀释至刻度线后进样测定，计算Cur的加样回收率；结果显示，各组样品回收率分别为96.3％、95.1％、96.1％，RSD分别为1.07％、1.03％、0.95％，可见回收率良好。
表2回收率实验结果
2.3.5样品稳定性试验
取“2.3.4”项下处理后的供试品溶液，于0、6、12、24、48h进样测定Cur的含量，计算得到的RSD为1.48％，结果显示样品在48h内稳定性良好。
2.4单因素考察实验
根据“2.1”项下的Cur-LF NPs制剂工艺，对影响NPs形成的因素如溶剂/反溶剂比、Cur/LF质量比、PH值和磁力搅拌速度等6个因素进行单因素考察实验，以包封率和粒径大小作为评价指标，为后续BBD-RSM实验初筛对Cur-LF NPs制备过程中影响较大的实验因素。
2.4.1溶剂/反溶剂体积比
基于前期预实验结果，固定Cur/LF投料比为1:10，PH值为6、磁力搅拌速度为400r/min、磁力搅拌拌时间为10min、探针超声(45w、2min)。考察溶剂/反溶剂比为1:4、1:8、1:12、1:16、1:20时对Cur-LFNPs包封率和粒径的影响，结果见图2。
由图2可知，随着溶剂/反溶剂体积比不断增大，包封率出现先增大后减少的趋势。乳铁蛋白具有亲水区和疏水区，姜黄素主要依靠疏水作用力和氢键作用力与乳铁蛋白结合。当溶剂/反溶剂体积比小于1:4时，溶液体系中存在大量乙醇会与蛋白质之间形成氢键从而破坏其内部原有的氢键结构使蛋白质变性，引起蛋白质沉淀、溶液浑浊。制备过程中，药物分子需要进入靶标蛋白的结合空腔，因此加入适量的乙醇可以与存在于靶标蛋白结合空腔中的水形成氢键结构，以促进空腔中水分子的外排，从而增加姜黄素与靶标蛋白结合空腔的缔合效率，继而提高姜黄素的包封率。当溶剂/反溶剂比逐渐增大时，体系中存在的乙醇不足以提供足够的去溶剂化能，即不能完全排出靶标蛋白结合空腔中的水，无法使更多的姜黄素进入靶标蛋白结合空腔，故姜黄素的包封率出现下降。
本实验结果表明，溶剂/反溶剂体积比为1:12时包封率最高，且1:8～1:16范围内粒径变化趋势不明显，因此选择这一范围进行接下来的后续优化实验。
2.4.2Cur/LF投料比
固定溶剂/反溶剂体积比为1:12，溶剂、反溶剂混合后制备纳米组合物过程中混合溶液pH值为6、磁力搅拌速度为400r/min、磁力搅拌时间为10min、探针超声(45w、2min)。考察Cur/LF投料比1:6、1:8、1:10、1:12、1:14对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响，结果见图3。
由图3可以得出，随着Cur/LF投料比不断增大，纳米粒的包封率呈现增大的趋势，粒径呈现减小的趋势，当Cur/LF投料比为1:10至1:14时，制剂粒径和包封率的变化趋势逐渐平稳。考虑到Cur/LF投料比同时影响着纳米粒的载药量，故在保证较好的包封率和粒径的情况下，选择较大的Cur/LF投料比范围1:8～1:12进行接下来的优化实验。
2.4.3pH值
固定溶剂/反溶剂体积比为1:12，Cur/LF投料比为1:10、磁力搅拌速度为400rpm、磁力搅拌时间为10min，探针超声(45w、2min)。考察溶剂、反溶剂混合后制备纳米组合物过程中混合溶液pH值分别为4、5、6、7时对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响，结果见图4。
由图4可知，当pH从4增加到6时，包封率逐渐增大，从6增加到7时包封率出现下降，原因可能是Cur在靠近中性至碱性条件下不稳定造成的。且pH为6时纳米粒粒径最小，选择pH值范围为5～7进行接下来的优化实验。
2.4.4磁力搅拌速度
固定溶剂/反溶剂体积比为1:12，溶剂、反溶剂混合后制备纳米组合物过程中混合溶液pH值为6、Cur/LF质量比为1:10、探针超声(45w、2min)，磁力搅拌时间为10min。考察磁力搅拌速度200、400、600、800rpm对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响。
由图5可知，磁力搅拌速度对Cur-LF NPs包封率的影响不大，400r/min时包封率最高；磁力搅拌速度从200r/min增加到400r/min时粒径减小的趋势最大，继续增加磁力搅拌速度对粒径的影响不大，故选择磁力搅拌速度为400r/min。
2.4.5超声时间
固定溶剂/反溶剂体积比为1:12，溶剂、反溶剂混合后制备纳米组合物过程中混合溶液pH值为6、Cur/LF质量比为1:10、磁力搅拌速度为400rpm、磁力搅拌时间为10min，探针超声功率为45w。考察探针超声时间分别为0、2、5min对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响。
由图6可知，探针超声2min与不超声相比，包封率略减小，粒径因为超声强烈的剪切作用而变小；但超声5min时，较长的超声时间破坏了纳米体系的稳定性使药物泄漏，导致包封率下降、粒径增大，故选择超声时间优选为2min。
2.4.6超声功率
固定溶剂/反溶剂体积比为1:12，溶剂、反溶剂混合后制备纳米组合物过程中混合溶液pH值为6、Cur/LF质量比为1:10、磁力搅拌速度为400rpm、磁力搅拌时间为10min，探针超声时间为2min。考察探针超声功率45w、90w和180w对Cur-LF NPs包封率和粒径的影响。
由图7可知，超声功率对包封率和粒径的影响同超声时间类似，优选超声功率为90w。
实施例2优化Cur-LF NPs制备工艺
基于实施例1试验考察结果，选择对Cur-LF NPs制备过程中影响较大的3个因素作为考察因素，分别为溶剂/反溶剂体积比、LF/Cur投料比、PH值，以包封率(Y1,EE/％)、粒径(Y2,d/nm)和多分散系数(Y3，PDI)三者经CRITIC权重分析加权后的综合评分(Y)作为评价指标，使用Design Expert10软件对数据进行拟合并验证优化后的工艺。
对于包封率来说取值越大越好，以公式SEE＝(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)进行数据转换；对于粒径、PDI来说取值越小越好，以公式Sd/PDI＝(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)进行数据转换。然后通过网站SPSSAU进行权重分析，结果见表3。包封率、粒径和PDI的权重系数分别为30.82％、26.37％和42.81％，加权后综合得分公式为Y＝(SEE×0.31+Sd×0.26+SPDI×0.43)×100，实验结果见表4。
表3.CRITIC分析结果
表4.优化条件和结果
由表4可以看出，纳米组合物的最佳制备工艺为：溶剂/反溶剂体积比为1:16、LF/Cur投料比为1:8、PH值为6。
实施例3Cur-LF NPs的体外表征评价
1.纳米粒形态观察
由图8可知，优化后的Cur-LF NPs外观呈澄清透亮的黄色，无沉淀和不溶性微粒存在。使用透射电子显微镜(TEM)观察Cur-LF NPs的微观形貌，取0.1mLCur-LF NPs，加入1mL超纯水混匀，用滴管吸取少量溶液并滴加于碳膜网格上，然后使用1.0％的磷钨酸钠负染色，液体于空气中自然挥干后观察。透射电镜图显示纳米粒呈圆球状，粒径约70nm左右。
2.粒径、电位和包封率、载药量的测定
使用NanoBrook 90Plus PLAS粒度仪对优化后的纳米粒进行粒径和电位的测定，结果见图9。平行多组实验后Cur-LF NPs的平均粒径为(72.6±5.2)nm；PDI为(0.084±0.015)；Zeta电位值为(24.5±3.7)mV。优化后的纳米粒粒径小于100nm且分布均一，体系带正电荷，呈现出良好的稳定性。按照前述方法测定优化后的纳米粒包封率与载药量，平行多组实验，测得Cur-LF NPs的包封率为(94.8±1.6)％、载药量为(10.2±0.5)％，具有良好的载药能力。
3.稳定性试验
将同一批次的Cur-LFNPs分别置于室温25℃(7d)和冰箱4℃(30d)条件下，记录粒径和PDI值，考察其在不同储存条件下的稳定性，结果见图10。可知纳米粒在室温2天内粒径、PDI几乎无变化，从第5天开始粒径和PDI的增长速率明显加快但肉眼未见纳米粒团聚现象，到第7天开始出现不溶性微粒。纳米粒在4℃冰箱内放置30天内粒径和PDI较稳定。
4.冻干工艺考察
为了更好的储存和运输Cur-LF NPs，对其进行冷冻干燥工艺考察。选择0.5％、2％、5％的甘露醇、乳糖和海藻糖作为冻干保护剂，以冻干前后粒径、PDI和Zeta电位值的变化情况优选合适的冻干保护剂及用量，结果见表5。最终选择2％的海藻糖作为冻干保护剂，制得的冻干品复溶后的粒径、PDI和Zeta电位值与冻干前的参数基本一致。冻干品外观图见图11，形为饱满圆整的饼状样，色泽均一，复溶时间短。
表5冷冻干燥工艺考察
5.体外释放试验
采用透析袋法考察姜黄素原料药溶液与Cur-LF NPs的体外释放情况。各取1mLCur50％DMSO溶液与Cur-LF NPs分别装入蒸馏水洗涤后的透析袋中，浓度均为300μg/mL，随后浸入预热至37℃的30mL含30％乙醇的PBS缓冲液中。摇床的水浴温度为37±1℃，转速为100r/min，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h完全更换等体积的释放介质，平行3组实验，用HPLC法测定透析液中Cur的浓度，按公式计算累积释放度(Q，％)。
Q为累积释放度；V为释放介质体积；Ci为各个时间点测得的Cur浓度；M为初始透析袋内药物含量
由图12可知，姜黄素原料药溶液和Cur-LF NPs释放24h后的累积释放度分别达到82％和65.8％。相较于姜黄素原料药，Cur-LF NPs具有一定的缓释效果。通过Origin 2018软件，分别应用零级方程、一级方程和Higuchi方程对姜黄素原料药混悬液和Cur-LF NPs的体外释放行为进行拟合，结果见表6。姜黄素原料药溶液和Cur-LF NPs体外释放均符合一级方程，证明了两者通过扩散控制机制主导了姜黄素的释放行为。
表6姜黄素原料药混悬液和Cur-LF纳米粒体外释放的拟合结果
实施例4
使用木犀草素(Lu)替代姜黄素(Cur)，采用实施例2中的最佳制备工艺制备Lu-LFNPs，粒径及电位进行表征。结果如图13所示，Lu-LF NPs粒径约为70nm，分布均匀，表面电位约为20mV。载药量为10％左右，包封率98％。
实施例5
使用奥氮平替代姜黄素(Cur)，采用实施例2中的最佳制备工艺制备奥氮平-LFNPs，对其粒子粒径及载药量包封率进行表征。粒径结果如图14所示，奥氮平-LF NPs粒径约为70nm，分布均匀。载药量为8％左右，包封率为96％，表面电位约为20mV。
实施例6
使用依达拉奉替代姜黄素(Cur)，采用实施例2中的最佳制备工艺制备依达拉奉-LF NPs，对其粒子粒径及载药量包封率进行表征。粒径结果如图15所示，依达拉奉-LF NPs粒径约为70nm，分布均匀。载药量为12.01％左右，表面电位约为20mV，包封率为96.08％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法，其特征在于，包括如下内容：
（1）将疏水活性成分用有机溶剂溶解，得到溶剂相；
（2）将含乳铁蛋白的溶液作为反溶剂相，与溶剂相混合制备纳米粒，溶剂相：反溶剂相的体积比为1:12~1:16，制备过程中混合溶液pH值为5~6，分离出游离的疏水活性成分后过滤、冻干，即得纳米组合物；
其中，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8~10；
所述疏水活性成分选自木犀草素、姜黄素、依达拉奉、喹硫平、丁苯酞、奥氮平、乙酰唑胺、槲皮素，厚朴酚中的一种或几种；
所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、石油醚中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂相：反溶剂相的体积比为1:16，所述混合溶液pH值为6，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:8；
或，所述溶剂相：反溶剂相的体积比为1:16，所述混合溶液pH值为5，疏水活性成分：乳铁蛋白的投料比为1:10。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述（2）中，采用探针超声仪将反溶剂相与溶剂相混合制备纳米粒，所述探针超声仪的超声功率为45~180w，振幅为2%~15%，超声时间为0~5min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述探针超声仪的超声功率为90w，振幅为10%，超声时间为2min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述（2）中，采用均质机将反溶剂相与溶剂相混合制备纳米粒，均质机搅拌速率为：500~1500rpm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干使用的冻干保护剂选自乳糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、木糖醇、甘氨酸、肌醇中的一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为海藻糖，用量为0.5%~5%。
8.一种药物组合物，包括权利要求1~7任一项制备方法所制备得到的纳米组合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
9.权利要求1~7任一项制备方法所制备得到的纳米组合物，或权利要求8所述的药物组合物在制备治疗和/或预防脑部疾病药物中的用途；所述脑部疾病选自脑部神经损伤性疾病、精神类疾病、癌症、肿瘤。
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