CN116804048A - 豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途 - Google Patents

豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途，所述豌豆白蛋白分离肽的分离纯化方法如下：豌豆白蛋白的制备；混合肽溶液制备；初步分离纯化及主要肽组分确定；分离肽序列及分子量的测定。本发明提供的豌豆白蛋白分离肽及其组合物具有高疏水性，可用于疏水性药物的包封，还具有良好的生物相容性、生物可降解性以及较好的跨小肠上皮细胞膜转运效果和细胞吸收，可应用于生物医药以及功能性食品等领域，具有良好的发展潜力。

Description

豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及豌豆白蛋白分离肽及其组合物。
背景技术
疏水性药物水溶性差，易受外界环境影响而发生降解，极大地限制了其在食品、药品中的应用；同时其胃肠道稳定性差、跨小肠上皮转运主要通过被动扩散这种低效方式进行，且大部分进入细胞后还会被特定转运蛋白识别并外排，这些原因都导致了它在人体中的吸收率低、生物利用度差。
近年来，食品中的蛋白质和多肽被广泛应用于疏水性药物的包封和递送。蛋白质、多肽通过肽键间的氢键作用及氨基酸残基之间的静电作用和疏水性作用等可自组装成纳米体系，然后通过氢键和疏水相互作用与疏水性药物结合，使药物被稳定的包封在纳米颗粒的核心区域，从而增强其水溶性。除此之外，多肽还可以通过增加药物跨小肠上皮细胞膜的转运方式，从而提高药物的细胞吸收，极大的增强其生物利用度。
豌豆蛋白是一种营养价值丰富的植物蛋白资源，相比于球蛋白，豌豆白蛋白的直链含量更多，在酶解时，其内外酶解程度会更均匀，更容易诱导进行自组装，从而成为疏水性药物的良好载体。因此，本发明旨在制备筛选出多种来源于豌豆白蛋白酶解液中的分离肽，该分离肽及其组合物可促进疏水性药物跨小肠上皮细胞膜转运和细胞吸收。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供豌豆白蛋白分离肽及其组合物，该分离肽及其组合物具有高疏水性和细胞吸收性，可促进疏水性药物的跨小肠上皮细胞膜转运和吸收。
技术方案：豌豆白蛋白分离肽，其氨基酸序列为如下任意一种或多种：
（1）APGTSNDKVLYGPTPV；
（2）ARVTVTPGATDDQIMDGV；
（3）LLDYAPGTSNDKVLYGPTPV；
（4）FRNTIFESGTDAA；
（5）LFINDKYV；
（6）APEPVLDVSGKKLLTGV；
（7）APELLSGKKLLTGVEAP；
（8）VTMVKQQATGKEVTDVV；
（9）LSEKGTAKAMGNLTVDVV；
（10）PTTGVPRVLVTGAAGOLG。
进一步的，所述豌豆白蛋白分离肽的制备方法如下：
（1）豌豆白蛋白的制备：将脱脂生豌豆粉和50mM醋酸盐缓冲液混合，在4℃中连续搅拌1~1.5h后，离心取上清并用水透析，再次离心取上清液，加入硫酸铵溶液（60.8%，w/v）并搅拌2~2.5h后收集沉淀，继续透析，最后冷冻干燥24~48h；
（2）混合肽溶液制备：将豌豆白蛋白和水混合，4℃静置过夜，得到浓度为4.5g/L~5.5g/L的豌豆白蛋白溶液；将豌豆白蛋白溶液离心，离心条件为：离心力为4500×g，时间为10min，温度为4℃，弃去沉淀，保留上清液；将上清液调节至最适酶解条件后，加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解液中加入胰蛋白酶抑制剂进行灭酶处理，胰蛋白酶抑制剂与上述胰蛋白酶的质量比为1:4；调节灭酶之后溶液的pH为11.9~12.1，搅拌3~5min后再调节pH为7.9~8.1，最后将所得溶液通过0.22µm的聚醚砜过滤器；
（3）初步分离纯化及主要肽组分确定：使用尺寸排阻色谱法对通过过滤器的溶液进行初步分离，收集不同峰值的峰溶液，然后用SDS-PAGE确定豌豆白蛋白混合肽溶液中的主要肽组分；
（4）分离肽序列及分子量的测定：使用液相色谱-质谱联用对主要肽组分进行鉴定，得到豌豆白蛋白分离肽分子量和氨基酸序列。
进一步的，步骤（1）中，所述醋酸盐缓冲液的pH为4.9，所述脱脂生豌豆粉和醋酸盐缓冲液的质量体积比为1:10；两次所述离心的条件均为：离心力为10000×g、温度为4℃、时间为30min；所述透析条件为：透析袋的截留分子量为10kDa，透析时间为72h。
进一步的，步骤（2）中，所述最适酶解条件为：温度为35~37℃，pH值为7.8~8.0，时间为1~1.5h；所述胰蛋白酶的酶活为250U/mg，胰蛋白酶与豌豆白蛋白的质量比为1:90~1:100。
进一步的，步骤（3）中，所述尺寸排阻色谱法包括：柱平衡：采用3倍柱体积的超纯水（20mL）润洗凝胶色谱柱；润洗完成，待底盖出口无液体流出后，加入混合肽溶液进行洗脱，流动相为超纯水，流速为3mL/min。
进一步的，步骤（3）中，SDS-PAGE中蛋白质分子量标准为10~180 kDa。
进一步的，步骤（4）中，所述液相色谱-质谱联用配备在线纳喷离子源，以乙腈（B相）和水（A相），为流动相进行梯度洗脱，柱流量控制在400nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从5%的B相起始，在55min以非线性梯度升高到80%，1min内升高到100%，维持4min。
进一步的，所述液相色谱-质谱中质谱仪在数据依赖采集模式下运行，扫描范围为200~1600m/z、分辨率为120000、最大注入时间为50ms。
一种组合物，所述组合物包含上述的豌豆白蛋白分离肽以及药学、食品或保健品上可接受的辅料。
上述豌豆白蛋白分离肽和/或组合物在制备促进疏水性药物跨膜转运和细胞吸收药品、食品或保健品中的用途。
进一步的，所述疏水性药物包括姜黄素、辣椒素、槲皮素、白藜芦醇、番茄红素、香豆素等。
有益效果：
1、本发明从豌豆中制备并筛选得到十种功能性豌豆白蛋白分离肽（APGTSNDKVLYGPTPV、ARVTVTPGATDDQIMDGV、LLDYAPGTSNDKVLYGPTPV、FRNTIFESGTDAA、LFINDKYV、APEPVLDVSGKKLLTGV、APELLSGKKLLTGVEAP、VTMVKQQATGKEVTDVV、LSEKGTAKAMGNLTVDVV、PTTGVPRVLVTGAAGOLG）是纯天然的、无毒无害的植物源物质，该分离肽及其组合物具有促进疏水性药物跨小肠上皮细胞膜转运和细胞吸收的功效。
2、本发明通过Caco-2细胞模型对这十种豌豆白蛋白分离肽组合物跨膜转运机制、促进疏水性药物细胞吸收的功能进行了探索与验证，发现该分离肽组合物不仅可以增加疏水性药物的内吞途径，如小窝蛋白介导的内吞途径、巨胞饮途径，还可以有效抑制多药耐药性蛋白转运体介导的药物外排过程，极大的促进了疏水性药物的细胞吸收。
3、本发明的十种功能性豌豆白蛋白分离肽还具有安全无毒、生物相容性好等优点，可应用于生物医药以及功能性食品等领域，具有良好的发展潜力。
附图说明
图1为本发明实施例1、实施例2及从凝胶色谱柱中采集到的不同峰溶液SDS-PAGE图；图中，标准蛋白质分子为Marker，实施例1为未酶解豌豆蛋白，实施例2为混合肽溶液，峰-1、峰-2、峰-3、峰-4分别为从凝胶色谱柱中采集到的不同峰溶液。
图2为本发明实施例7功能评价1中结果图；其中图2（A）为实施例1和实施例5两种溶液的尼罗红发射光谱最大荧光强度与蛋白质浓度的关系图，图2（B）为不同浓度下实施例1和实施例5在空气-水界面的表面张力变化图，图2（C）为不同浓度实施例1和实施例5在大豆油中的动态界面张力变化图。
图3为本发明实施例7功能评价2中结果图；其中图3（A）为对比例1和实施例6中获得的两种颗粒粒径图，图3（B）为对比例1、实施例6以及游离辣椒素的保留率随时间变化图。
图4为本发明实施例7功能评价3中豌豆白蛋白和豌豆白蛋白分离肽SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10的疏水性评分示意图。
图5为本发明实施例7中功能评价4（2）（5）（6）（7）的结果图；其中图5（A）为Caco-2细胞对游离辣椒素、负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物的摄取量随时间变化图，图5（B）为本发明实施例7功能评价4（5）中Caco-2细胞转运游离辣椒素、负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物过程中单层细胞跨膜电阻值保留比例随时间变化图，图5（C）为本发明实施例7功能评价4（6）中透过Caco-2细胞单层的游离辣椒素、负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物比例随时间变化图，图5（D）为本发明实施例7功能评价4（7）中游离辣椒素、负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物表观渗透系数。
图6为本发明实施例7功能评价4（3）中结果图；其中图6（A）为使用不同内吞途径抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对游离辣椒素内吞率的变化图，图6（B）为使用不同内吞途径抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白内吞率的变化图，图6（C）为使用不同内吞途径抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物内吞率的变化图。
图7为本发明实施例7功能评价4（8）中结果图；其中图7（A）为使用不同抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对游离辣椒素转运比例的变化图，图7（B）为使用不同抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白转运比例的变化图，图7（C）为使用不同抑制剂处理Caco-2细胞后，Caco-2细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物转运比例的变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别说明，说明书中采用的技术手段均为本领域已知的技术手段，所用原料均可市购。
实施例1制备豌豆白蛋白
脱脂生豌豆粉和醋酸盐缓冲液（50mM，pH4.9）以1:10（w/v）的比例混合，在4℃中连续搅拌1h后，在离心力为10000×g、离心温度为4℃的条件下离心30min并收集上清液，将上清液用水透析（10kDa）72h；透析完成后按照第一次离心的条件再次离心30min并去除沉淀。将硫酸铵以0.608:1（w/v）的比例加入上清液中，4℃下搅拌2h后收集沉淀，将沉淀溶于水中并透析（10kDa）72h，将透析后的溶液冷冻干燥，得到豌豆白蛋白。
实施例2制备混合肽溶液
配制5 g/L的豌豆白蛋白溶液；在离心力为4500×g、离心温度为4℃的条件下，离心20 min；取上清液调节温度为37℃、pH为7.8后，加入胰蛋白酶（酶与蛋白的质量比为1:100）酶解1.5 h；酶解结束后，加入胰蛋白酶抑制剂（抑制剂与胰蛋白酶的质量比为1:4）进行灭酶处理；将溶液的pH调为12，搅拌4 min后将pH调回8；用0.22 µm的聚醚砜过滤器过滤，即可得到混合肽溶液。
实施例3初步分离纯化及主要肽组分确定
首先使用尺寸排阻色谱法对实施例2进行初步分离纯化，收集不同峰值的峰溶液，具体步骤如下：
预处理：柱平衡：3倍柱体积的超纯水（20 mL）润洗凝胶色谱柱；润洗完成，待底盖出口无液体流出后，加入溶液进行洗脱，流动相为超纯水，流速为3 mL/min，最后收集到4组不同峰值的峰溶液，分别命名为峰-1、峰-2、峰-3、峰-4（表1）。
表1 4组不同峰值的峰溶液出峰信息表
峰编号 保留时间/min 出峰面积 面积百分比%
峰-1 15.8 13.665 0.68
峰-2 27.863 1820.353 91.033
峰-3 28.980 162.815 8.142
峰-4 34.013 2.847 0.142
然后用SDS-PAGE确定混合肽溶液中的主要肽组分。将10~180 kDa标准蛋白质、实施例1（未酶解的豌豆白蛋白）、实施例2（混合肽溶液）、4组不同峰值的峰溶液分别进行电泳；由标准蛋白质的相对移动度测定分子质量，由条带情况确定纳米胶束的主要成分。
SDS-PAGE结果见图1。与未酶解的白蛋白相比，混合肽溶液100 kDa和70 kDa处的条带消失，主要条带位于25 kDa和15 kDa-10kDa。峰-1存在100 kDa和70 kDa条带，但相较于未酶解白蛋白条带变浅，15 kDa-10 kDa处条带明显加深，说明大分子白蛋白被部分酶解为小分子肽。峰-2中100 kDa和70 kDa条带消失，25 kDa处和15 kDa-10 kDa处条带加深，与胶束条带分布相似。峰-3、峰-4出峰时间较晚，没有明显条带分布。综上可判断峰-2是混合肽的主要肽组分。
实施例4分离肽序列及分子量的测定
使用液相色谱-质谱联用再次从峰-2中分离纯化得到分离肽，并测定分离肽的分子量和氨基酸序列。进样量为3 µL，以乙腈（B相）和水（A相）为流动相进行梯度洗脱，共计60min。柱流量控制在400nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2 kV，梯度从5%的B相起始，在55min内以非线性梯度升高到80%，1 min内升高到100%，维持4 min。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，扫描范围为200~1600 m/z、分辨率为120000、最大注入时间为50 ms。
综合考虑数据结果、已知豌豆白蛋白序列、分离肽的含量和疏水性，在氨基酸库中进行筛选，最终得到10种豌豆白蛋白分离肽（表2）。
表2 10种豌豆白蛋白分离肽序列和分子量表
序列号 氨基酸序列 氨基酸数量 ppm m/z 分子量 (D)
SEQ ID NO.1 APGTSNDKVLYGPTPV 16 1.8 808.4214 1614.825
SEQ ID NO.2 ARVTVTPGATDDQIMDGV 18 2 923.4560 1844.894
SEQ ID NO.3 LLDYAPGTSNDKVLYGPTPV 20 1.3 1060.5505 2119.084
SEQ ID NO.4 FRNTIFESGTDAA 13 1.5 714.8424 1427.668
SEQ ID NO.5 LFINDKYV 8 2 506.2801 1010.544
SEQ ID NO.6 APEPVLDVSGKKLLTGV 17 2.6 575.0063 1721.993
SEQ ID NO.7 APELLSGKKLLTGVEAP 17 2.6 575.0063 1721.993
SEQ ID NO.8 VTMVKQQATGKEVTDVV 17 1.6 611.6654 1831.971
SEQ ID NO.9 LSEKGTAKAMGNLTVDVV 18 1.6 611.6654 1831.971
SEQ ID NO.10 PTTGVPRVLVTGAAGQLG 18 1.6 847.4847 1692.952
实施例5豌豆白蛋白分离肽组合物溶液
根据实施例4质谱鉴定分析获得的豌豆白蛋白分离肽序列进行化学合成，然后协同自组装得到豌豆白蛋白分离肽组合物溶液。
实施例6负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物
取10 mg辣椒素，加入0.334 mL无水乙醇和0.334 mL pH为12的氢氧化钠溶液，混合均匀后进行氮吹，直到最终溶液的体积为0.334mL后停止氮吹；将氮吹后的溶液缓慢加入20 mL、pH为12的豌豆白蛋白分离肽组合物溶液中，搅拌4 min后将溶液的pH调回8.0；最后用0.22 µm的聚醚砜过滤器过滤，即可得到负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物；组合物对辣椒素的包埋率为84.07％，载药量为20.43 µg/mg。
对比例1制备负载辣椒素的豌豆白蛋白
首先配制5 g/L的豌豆白蛋白溶液；然后取10 mg辣椒素，加入0.334 mL无水乙醇和0.334 mL pH为12的氢氧化钠溶液，混合均匀后进行氮吹，直到最终溶液的体积为0.334mL后停止氮吹；将氮吹后的溶液缓慢加入pH为12的豌豆白蛋白溶液（0.5% w/v），搅拌4 min后将溶液的pH调回8.0；最后用0.22 µm的聚醚砜过滤器过滤，即可得到负载辣椒素的豌豆白蛋白溶液。
实施例7功能评价
功能评价1：
根据实施例1获得的豌豆白蛋白、实施例5获得的豌豆白蛋白分离肽组合物溶液，使用临界胶束浓度、表面张力、动态界面张力对其进行表征（如图2所示）。临界胶束浓度是使用尼罗红作为荧光探针，测定荧光强度；表面张力用悬滴法测定，使用接触角测量仪测量；动态界面张力是在1800 s内实时记录油-水界面张力的变化情况。
由图2（A）可知，未酶解的豌豆白蛋白的临界胶束浓度为0.13 mg/mL，豌豆白蛋白分离肽组合物溶液的临界胶束浓度为0.062 mg/mL，比未酶解的豌豆白蛋白低，说明分离肽组合物溶液自组装形成聚集体的潜力更大。由图2（B）可知，与未酶解的豌豆白蛋白相比，在相同浓度下，分离肽组合物溶液具有更好地降低表面张力的能力。由图2（C）可知，随着分离肽组合物溶液的增加，水-油界面张力会迅速降低，与相同浓度的豌豆白蛋白相比，分离肽组合物溶液降低界面张力的能力显著增强。
功能评价2：
根据对比例1获得的负载辣椒素的豌豆白蛋白、实施例6获得的负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物，进行粒径和肠道稳定性评价（如图3所示）。粒径使用马尔文激光粒度仪进行测定，肠道稳定性评价采用模拟体外消化的方法进行测定。
由图3（A）可知，辣椒素包封后的水溶性均有所提高，负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物粒径、PDI值更小，分布更均匀。由图3（B）可知，消化120 min之内，负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物中辣椒素的保留率均远远高于负载辣椒素的豌豆白蛋白中辣椒素的保留率；说明负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物肠道消化稳定性更高。
功能评价3：
根据实施例4质谱鉴定分析获得的肽序列进行化学合成，对10种豌豆白蛋白分离肽的疏水性进行评价。依据Kyte&Doolittle算法构建豌豆白蛋白和10种分离肽的疏水性评分示意图（如图4所示），可通过亲水性评分（GRAVY）对肽亲疏水性预测，亲水性评分值越高表明肽疏水性越强。
由图4可知，天然豌豆白蛋白的亲水性评分值为-0.423；能在数据库中检测到的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的亲水性评分值分别为-0.375、-0.022、-0.300、-0.160、0.387，未在数据库中检索到但具有较高可信度的从头测序结果（可信度 (%)＞50）的SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10的亲水性评分均为正值。与豌豆白蛋白相比，十种分离肽的亲水性评分均有所增大，疏水性总体上有所增强，因此更利于疏水性药物的包封。
功能评价4：
研究实施例6负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物对Caco-2细胞摄取的影响，具体步骤与分析如下：
（1）Caco-2细胞培养：Caco-2细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，Caco-2细胞培养于含20% 胎牛血清的培养基中，生长环境为37℃、5%二氧化碳细胞培养箱。在25 cm2培养瓶中培养细胞，细胞生长到密度为80%-90%时传代。
（2）细胞摄取：首先将Caco-2细胞以1×105/mL的浓度培养于12孔板中，按照Caco-2细胞的培养方法培养至细胞汇合度80%以上后进行实验。首先，弃去孔内的培养基，并用磷酸缓冲盐溶液清洗三次除去残留的培养基和细胞表面的胎牛血清。向孔内加入1 mL的纯培养基（不含胎牛血清和其它营养成分），并放入培养箱继续平衡30 min，弃去孔内培养基并加入预热到37℃含有负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物或游离辣椒素（辣椒素浓度为200 μg/mL）。加药完毕后，放入培养箱中继续培养，继续培养5、30、60、120、240和480 min后，终止摄取。弃去含药培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次。每孔加入200 μL的细胞裂解液。用枪吹打数下，充分裂解后，将孔内液体全部取出，离心取上清。测定每组细胞裂解液中辣椒素的含量和蛋白含量，对比各组制剂在不同时间、单位蛋白含量下细胞对药物的摄取量（如图5（A）所示）。
由图5（A）可知，细胞对游离辣椒素的摄取量较低，呈现出平衡趋势；细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物摄取量均随着时间的增加而增加，且细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物继续摄取趋势更明显。给药480 min后，细胞对负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物的摄取量是负载辣椒素的豌豆白蛋白的2.18倍，是游离辣椒素的8.04倍。说明协同自组装得到的分离肽组合物能够更好地提高细胞对辣椒素的摄取量。
（3）内吞机制：将Caco-2细胞培养至细胞汇合度90%后进行实验。首先，将细胞分别在氯丙嗪（10 μg/mL）、吲哚美辛（50 μM）、秋水仙碱（10μg/mL）、叠氮化钠（10 mM）、4℃的条件下共孵育0.5 h 对细胞进行预处理。随后弃去孔内液体，加入含有上述浓度的抑制剂和制剂（辣椒素浓度为200μg/mL）的培养基（不含胎牛血清）。加药完毕后，将12孔板放回培养箱，培养1 h后，弃去含药培养基，磷酸缓冲盐溶液清洗3次。每孔加入200 μL细胞裂解液。用枪吹打数下，充分裂解后，将孔内液体全部取出，离心取上清。测定每组细胞裂解液中辣椒素的含量和蛋白含量，对比各组在相同时间、单位蛋白含量下细胞对药物的摄取量（如图 6所示）。
由图 6可知，4℃的实验条件和叠氮化钠均对负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物的细胞摄取产生了抑制作用，说明这两种制剂被细胞内化的过程均需要能量的参与。吲哚美辛和秋水仙碱对三组细胞内吞均有明显的抑制作用，说明辣椒素的内吞主要是通过小窝蛋白介导，巨胞饮也可能参与其中。
（4）Caco-2细胞单层模型的构建：向Transwell板的上、下层小室内分别加入0.5mL和1.5 mL培养液，在培养箱内进行过夜预处理。弃去培养液，将Caco-2细胞以1×105/mL的浓度培养于上层小室内，每小室0.5 mL。下层小室加入1.5 mL培养液。将Transwell板放回培养箱培养21天。第一周隔天换液，之后每天换液。培养至15天时，每天测定Transwell膜两侧的单层细胞跨膜电阻值（TEER）来判断Caco-2单层细胞的生长状况及完整性。培养至约21天时，当细胞两侧电阻值超过700 Ω后即可用于后续的研究。
（5）细胞旁路转运途径：实验开始前，待跨膜电阻值稳定后，弃去Transwell板的上、下层小室的培养液，分别用预热的平衡盐溶液清洗2次。上室加入0.5 mL的平衡盐溶液，下室加入1.5 mL的平衡盐溶液，在37℃下预热30min。弃去上层小室内的平衡盐溶液后，加入0.5 mL预热37℃的含有负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物、游离辣椒素（辣椒素浓度为200 μg/mL）的平衡盐溶液。设置空白组，加入等量的平衡盐溶液。实验开始后分别于2 h、4 h、6 h、8 h测定细胞跨膜电阻值（如图5（B）所示）。
由图5（B）可知，实验开始前，细胞跨膜电阻值已经达到稳定，当向其中加负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物、游离辣椒素后，其细胞跨膜电阻值均在90%以上，无显著性改变，说明这些颗粒均不能通过打开细胞间的紧密连接进行细胞旁路的转运。
（6）细胞层渗透性：弃去Transwell板中培养基，用预热至37℃的平衡盐溶液清洗2次后，上、下小室分别再加入0.5 mL和1.5 mL的平衡盐溶液孵育30min。倒出上室平衡盐溶液，分别加入0.5 mL含辣椒素0.2 mg/mL的负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物、游离辣椒素溶液。在培养箱孵育2 h、4 h、6 h、8 h后，分别从下室取样100µL，再补充100 µL的 平衡盐溶液。取出的样品加入300 µL乙腈，混匀后离心处理（8000×g，5 min），最后使用HPLC检测透过细胞层的辣椒素浓度（如图5（C））。
由图5（C）可知，在2-8 h中，负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物中辣椒素的透过量差异逐渐增大，8 h后负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物中辣椒素的透过量是负载辣椒素的豌豆白蛋白中辣椒素透过量的1.57倍，是游离辣椒素透过量的3.14倍。表明分离肽组合物可显著增强辣椒素在Caco-2细胞单层中的渗透性。
（7）多药耐药性蛋白转运体介导的药物外排情况：弃去Transwell板的上、下层小室的培养液，分别用预热的平衡盐溶液清洗2次。上室加入0.5 mL含有维拉帕米（100 µM）的平衡盐溶液，下室加入1.5 mL的平衡盐溶液，在37℃预热30min。弃去上层小室内的平衡盐溶液后，分别加入0.5 mL含有维拉帕米（100 µM）的负载辣椒素的分离肽组合物和游离辣椒素（辣椒素浓度为200 μg/mL）溶液；设置空白组，加入等量的平衡盐溶液。实验开始后分别于2 h、4 h、6 h、8 h从下层取样100 µL，并补加100 µL预热的平衡盐溶液。将收集到的样品加3倍乙腈，离心处理后（8000×g，5 min）用HPLC测定上清液中辣椒素的含量（如图5（D）所示）。表观渗透系数（）按以下公式计算：
其中为单位时间辣椒素的透过量（ng/s），/>为细胞单的扩散面积（cm2），/>为上室中辣椒素的初始浓度（ng/cm3）。
由图5（D）可知，当抑制了多药耐药性蛋白转运体介导的药物外排后，与没加入抑制剂相比，游离辣椒素组跨膜转运量被显著提高，但负载辣椒素的豌豆白蛋白和负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物组的表观渗透系数变化不大。这说明辣椒素被包埋后可以有效抑制多药耐药性蛋白转运体外排，提高辣椒素的肠细胞渗透性。
（8）转胞吞途径探究：首先将细胞与布雷非德菌素A（25 μg/mL)、巴佛洛霉素A1（0.5 μM）和莫能霉素（32.5 μg/mL）在37℃下孵育1 h。随后去除抑制剂，用磷酸缓冲盐溶液清洗两次，并加入含有200 µg/mL辣椒素的负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物、游离辣椒素溶液继续孵育2 h。然后从下层取样200 μL，并补加200 μL预热的平衡盐溶液。将收集到的样品加入3倍体积的乙腈，离心处理后（8000×g，5 min）用HPLC 测定上清液中辣椒素的含量（如图 7所示）。
布雷非德菌素A是一种真菌代谢产物，可阻止内质网向高尔基复合体之间的正向运输；莫能霉素可有效阻止大分子从高尔基体向质膜的运输；巴佛洛霉素A1可抑制内质体酸化途径。由图 7结果表明，添加巴佛洛霉素A1、布雷非德菌素A和莫能霉素后，负载辣椒素的豌豆白蛋白、负载辣椒素的豌豆白蛋白分离肽组合物、游离辣椒素跨Caco-2单层的转运百分比均显著降低，表明内质体酸化、内质网向高尔基途径和高尔基体向质膜途径参与了整个转运过程。
虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，其氨基酸序列为如下任意一种或多种：
APGTSNDKVLYGPTPV；
ARVTVTPGATDDQIMDGV；
LLDYAPGTSNDKVLYGPTPV；
FRNTIFESGTDAA；
LFINDKYV；
APEPVLDVSGKKLLTGV；
APELLSGKKLLTGVEAP；
VTMVKQQATGKEVTDVV；
LSEKGTAKAMGNLTVDVV；
PTTGVPRVLVTGAAGOLG。
2.根据权利要求1所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，所述豌豆白蛋白分离肽的制备方法如下：
（1）豌豆白蛋白的制备：将脱脂生豌豆粉和50 mM醋酸盐缓冲液混合，在4℃中连续搅拌1~1.5h后，离心取上清并用水透析，再次离心取上清液，加入硫酸铵溶液并搅拌2~2.5h后收集沉淀，继续透析，最后冷冻干燥24~48h；
（2）混合肽溶液制备：将豌豆白蛋白和水混合，4℃静置过夜，得到浓度为4.5g/L~5.5g/L的豌豆白蛋白溶液；将豌豆白蛋白溶液离心，离心条件为：离心力为4500×g，时间为10min，温度为4℃，弃去沉淀，保留上清液；将上清液调节至最适酶解条件后，加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解液中加入胰蛋白酶抑制剂进行灭酶处理，胰蛋白酶抑制剂与上述胰蛋白酶的质量比为1:4；调节灭酶之后溶液的pH为11.9~12.1，搅拌3~5min后再调节pH为7.9~8.1，最后将所得溶液通过0.22µm的聚醚砜过滤器；
（3）初步分离纯化及主要肽组分确定：使用尺寸排阻色谱法对混合肽溶液进行初步分离，收集不同峰值的峰溶液，然后用SDS-PAGE确定豌豆白蛋白混合肽溶液中的主要肽组分；
（4）分离肽序列及分子量的测定：使用液相色谱-质谱联用对主要肽组分进行鉴定，得到豌豆白蛋白分离肽分子量和氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（1）中，所述醋酸盐缓冲液的pH为4.9，所述脱脂生豌豆粉和醋酸盐缓冲液的质量体积比为1:10；两次所述离心的条件均为：离心力为10000×g、温度为4℃、时间为30min；所述透析条件为：透析袋的截留分子量为10kDa，透析时间为72h。
4.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（2）中，所述最适酶解条件为：温度为35~37℃，pH值为7.8~8.0，时间为1~1.5h；所述胰蛋白酶的酶活为250U/mg，胰蛋白酶与豌豆白蛋白的质量比为1:90~1:100。
5.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（3）中，所述尺寸排阻色谱法包括：柱平衡：采用3倍柱体积的超纯水20mL润洗凝胶色谱柱；润洗完成，待底盖出口无液体流出后，加入混合肽溶液进行洗脱，流动相为超纯水，流速为3mL/min。
6.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（3）中，所述SDS-PAGE中蛋白质分子量标准为10~180 kDa。
7.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（4）中，所述液相色谱-质谱联用配备在线纳喷离子源，以乙腈：B相，和水：A相，为流动相进行梯度洗脱，柱流量控制在400nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从5%的B相起始，在55min以非线性梯度升高到80%，1min内升高到100%，维持4min。
8.根据权利要求7所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，所述液相色谱-质谱中质谱仪在数据依赖采集模式下运行，扫描范围为200~1600m/z、分辨率为120000、最大注入时间为50ms。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1~8任意一项所述的豌豆白蛋白分离肽以及药学、食品或保健品上可接受的辅料。
10.根据权利要求1~8任意一项所述的豌豆白蛋白分离肽和/或权利要求9所述的组合物在制备促进疏水性药物跨膜转运和细胞吸收药品、食品或保健品中的用途。
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