CN117924420B - 豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 - Google Patents
豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117924420B CN117924420B CN202410332175.6A CN202410332175A CN117924420B CN 117924420 B CN117924420 B CN 117924420B CN 202410332175 A CN202410332175 A CN 202410332175A CN 117924420 B CN117924420 B CN 117924420B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pea albumin
- transmembrane transport
- polypeptide
- capsaicin
- pea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 40
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 10
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 9
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract 1
- YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N capsaicin Chemical compound COC1=CC(CNC(=O)CCCC\C=C\C(C)C)=CC=C1O YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N 0.000 description 93
- 235000017663 capsaicin Nutrition 0.000 description 45
- 229960002504 capsaicin Drugs 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 26
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 15
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010084695 Pea Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010844 nanoflow liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019702 pea protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽，所述跨膜转运肽的氨基酸序列为第1至9的序列中的任意一种或多种。所述跨膜转运肽是通过酶解豌豆白蛋白而得，或是人工合成得到的。本发明提出的跨膜转运肽，是从豌豆白蛋白中制备并筛选得到的，是纯天然的、无毒无害的植物源物质。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种跨膜转运肽、其制备方法和应用。
背景技术
近年来，一些疏水性生物活性化合物，例如辣椒素、槲皮素、姜黄素等，由于其潜在的健康益处而受到人们的欢迎。然而，这些物质的低水溶性、较差的稳定性以及较低的肠道吸收率等缺陷极大地限制了其在食品、药品中的应用。增加疏水性生物活性化合物的跨膜转运效率，是提高其肠道吸收率的有效途径。
食品中的蛋白质和多肽可以通过氢键、静电相互作用、疏水相互作用等作用力自组装为纳米胶束，再与疏水性生物活性化合物相结合，将其包裹在疏水核心中，从而实现对疏水性生物活性物的包封和递送。由蛋白质或多肽构成的递送体系往往表现出增强的水溶性，还具有增加疏水性生物活性物的细胞摄取、增强其生物利用度的效果。
豌豆（Pisum sativum）是植物中高蛋白含量的作物，蛋白质含量通常为20%左右。豌豆蛋白是一类混合蛋白，含有以下几类蛋白质：球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。其中，豌豆白蛋白主要由PA1，PA2和一些其他蛋白组成。豌豆白蛋白是一种天然高含硫蛋白质，其分子量小，在水中的溶解度较高，蛋白质柔韧性较好。将豌豆白蛋白酶解后得到多种多样的肽段，在肽段中筛选，获得可以自组装为纳米胶束的小分子跨膜转运肽，从而负载疏水性生物活性化合物，提高其跨小肠上皮细胞膜转运能力，并且筛选源自纯植物源，这对于食品、医药行业具有很大研究及应用的价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足之处，本发明的第一个目的是提出一种豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽，用于促进疏水性生物活性物细胞摄取，增加其跨小肠上皮细胞膜转运，提高其体内生物利用度。
本发明的第二个目的是提出所述跨膜转运肽的制备方法。
本发明的第三个目的是提出所述跨膜转运肽的应用。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽， 所述跨膜转运肽的氨基酸序列为如下序列中的任意一种或多种：
VIPAGHPVA
VVSLKDVVPE
VVIIPAGHPVA
HIISPEL
PSTGGIGKVLP
GTNSIIGRA
TVSDIGSSMIKPI
KNIVSA
FSKNIL 。
其中，所述跨膜转运肽是通过酶解豌豆白蛋白而得，或是人工合成得到的。
以下是本发明提出的所述跨膜转运肽的一种制备方法。
一种跨膜转运肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用胃蛋白酶和胰酶对豌豆白蛋白进行酶解处理，得到多肽混合液；
（2）使用尺寸排阻色谱对多肽混合液进行分离纯化，收集主要峰值的峰溶液，得到多肽混合液中的主要肽组分；
（3）使用液相色谱-质谱联用对所得主要肽组分进行鉴定，得到跨膜转运肽的氨基酸序列和分子量。
进一步地，步骤（1）中，所述胃蛋白酶酶解条件为豌豆白蛋白浓度20~60 g/L，温度33~40 ℃，pH值1~3，酶解时间为0.5~2 h。
其中，步骤（1）中，所述胰酶酶解条件为在胃蛋白酶酶解得到的料液的基础上，调整pH值为6~9，加入胰酶，酶解1.5~3 h。
优选地，步骤（1）中，所述胃蛋白酶加入的量为豌豆白蛋白质量的0.1%~0.2%，胰酶加入的量为豌豆白蛋白质量的0.2%~0.3%；将胰酶酶解后的体系灭酶后离心获得上清液，上清液经1000-5000 Da的透析后获得豌豆白蛋白多肽混合液。透析的时间可以为10~20小时，优选10~15小时。
其中，步骤（2）中，将透析后获得的豌豆白蛋白多肽混合液稀释10~20倍，加入到凝胶色谱柱中进行洗脱，流动相为含0.01~0.1%三氟乙酸的超纯水。
进一步优选地，步骤（2）中，所述尺寸排阻色谱的条件为：所述的凝胶色谱柱为TSKgel G2000SW，测定波长为210 nm~280 nm。
本发明的一种优选技术方案为，步骤（3）中，还包括：筛选含量高、置信度大于50、疏水的氨基酸序列，用Caco-2细胞模型验证所得跨膜转运肽的性能。
本发明所述跨膜转运肽在制备促进疏水性生物活性物跨膜转运和细胞吸收的药物中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提出的跨膜转运肽，是从豌豆白蛋白中经胃肠道模拟消化所得，口服后可以抵抗胃肠道中蛋白酶的二次水解，具有稳定、安全、纯天然、无毒无害等特点。
（2）本跨膜转运肽具有促进疏水性生物活性物细胞摄取、增加其跨小肠上皮细胞层转运、提高其体内生物利用度的作用。
（3）本发明提出的肽可用于递送疏水性生物活性物，应用于生物医药以及功能性食品等领域，具有良好的发展潜力。
（4）源于豌豆白蛋白的制备方法，为利用豌豆白蛋白提供了新途径，提高了豌豆白蛋白的经济价值，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1中多肽混合液的凝胶色谱图，包括峰1组分、峰2组分和峰3组分。
图2为实施例2中从凝胶色谱柱中采集到的不同峰溶液SDS-PAGE图，图中，标准蛋白质分子为Marker，实施例1为多肽混合液，峰1、峰2、峰3分别为从凝胶色谱柱中采集到的不同峰溶液。
图3为实施例4中Caco-2细胞对游离辣椒素和被跨膜转运肽递送的辣椒素的摄取随时间变化图。
图4为实施例4中透过Caco-2细胞单层的游离辣椒素和被跨膜转运肽递送的辣椒素的比例随时间变化图。
图5为实施例4中游离辣椒素和被跨膜转运肽递送的辣椒素在小鼠体内的药代动力学，图中游离辣椒素组的辣椒素浓度在6小时后检测不到。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如无特别说明，说明书中采用的技术手段均为本领域已知的技术手段，所用原料均可市购。
需要说明的是，本文中所有氨基酸序列为“保守修饰形式的氨基酸序列”，“保守修饰形式的氨基酸序列”指所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列的多肽的生物特性，该修饰包括氨基酸增加和缺失，保守修饰在数目上不超过1个或2个。
实施例1 多肽混合液制备
配制40 g/L的豌豆白蛋白溶液，在4 ℃下过夜水合。将豌豆白蛋白溶液加热到37℃并保持温度恒定，用6 M HCl调节其pH为2.0，加入胃蛋白酶（酶活≥2500 units/mg蛋白，胃蛋白酶与豌豆白蛋白质量比为1:625）酶解1 h。酶解结束后立即用6 M NaOH调节溶液pH为7.5，加入胰酶（酶活8×USP，胰酶与豌豆白蛋白质量比为1:400）酶解2 h。结束后沸水浴10 min灭酶，在4 ℃下10000 rpm离心30 min后获得上清液，上清液在4 ℃透析（3500 Da）12 h后获得多肽混合液。
实施例2 多肽的分离纯化
使用尺寸排阻色谱法对多肽混合液进行初步分离纯化。将实施例1中的多肽混合液稀释12倍，加入到已经平衡好的凝胶色谱柱中进行洗脱，凝胶色谱柱为TSKgel G2000SW，21.5×30 mm；每次上样2 mL，流动相为含0.01%三氟乙酸的超纯水，设置流速为4 mL/min，测定波长为218 nm，最后收集到3组不同峰值的峰溶液，分别命名为峰1、峰2、峰3（表1）。
表1 3组不同峰值的峰溶液出峰时间表
| 峰编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 |
| 保留时间(min) | 12.928 | 15.378 | 17.928 |
用SDS-PAGE确定多肽混合液中的主要肽组分。将10-180 kDa标准蛋白质、未酶解的豌豆白蛋白、多肽混合液、3组不同峰值的峰溶液分别进行电泳；由标准蛋白质的相对移动度测定分子质量，由条带情况确定纳米胶束的主要成分。
多肽混合液的凝胶色谱图见图1，SDS-PAGE结果见图2。与未酶解的豌豆白蛋白相比，多肽混合液中大于15 kDa的条带消失，主要条带位于10 kDa-15 kDa，说明大分子的白蛋白被部分酶解为小分子肽。峰1处收集的溶液电泳条带与酶解后的纳米胶束的电泳条带几乎一致，而峰2和峰3处收集的溶液没有显示出明显条带，故判断峰1是纳米胶束的主要成分。
实施例3 多肽测序
使用液相色谱-质谱联用从峰1中分离纯化得到主要的跨膜转运肽，测定肽的氨基酸序列和分子量。将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的 Orbitrap Q-Exactive Plus质谱仪（Thermo Fisher Scientific, MA,USA）。共上样 1.5 μL样品（分析柱：Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm），以60 min的梯度分离样品，柱流量控制在300 nL/min，柱温为40 ℃，电喷雾电压2 kV，梯度从2%的B相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35%，1分钟内升高到100%，维持12分钟。
质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1) MS: 扫描范围 (m/z)：200-2000；分辨率：70,000；AGC target：3e6 ; 最大注入时间：50 ms; (2) HCD-MS/MS: 分辨率: 17,500；AGC target：1e5；最大注入时间: 45ms；碰撞能量：28%; 动态排除时间：30s。
串联质谱图经过PEAKS Studio version 10.6 (Bioinformatics SolutionsInc., Waterloo, Canada) 分析。PEAKS DB对uniprot-Pisum sativum(version2022,2528 entries) 数据库搜库，设置none酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02 Da，母离子质量容许误差：10 ppm，可变修饰：Oxidation (M) 15.99, Deamination（NQ）0.98， 蛋白卡值为至少含1 unique peptide；肽段卡值为-10logP≥20。最终筛选出含量最高、置信度大于50的9条肽，并通过ExPasy(https://web.expasy.org/protparam/)评估总平均亲水性（表2）。
表2 9种豌豆白蛋白跨膜转运肽序列和分子量表
| 序列号 | 氨基酸序列 | 亲水性评分 | 分子量（Da） | 氨基酸数量 |
| SEQ ID NO.1 | VVSLKDVVPE | 0.73 | 1083.618 | 10 |
| SEQ ID NO.2 | VIPAGHPVA | 1.078 | 859.4916 | 9 |
| SEQ ID NO.3 | VVIIPAGHPVA | 1.673 | 1071.644 | 11 |
| SEQ ID NO.4 | HIISPEL | 0.529 | 807.449 | 7 |
| SEQ ID NO.5 | PSTGGIGKVLP | 0.245 | 1024.592 | 11 |
| SEQ ID NO.6 | GTNSIIGRA | 0.056 | 887.4825 | 9 |
| SEQ ID NO.7 | TVSDIGSSMIKPI | 0.546 | 1346.712 | 13 |
| SEQ ID NO.8 | KNIVSA | 0.383 | 630.3701 | 6 |
| SEQ ID NO.9 | FSKNIL | 0.483 | 720.417 | 6 |
注：亲水性评分若为正值说明肽段偏疏水性，若为负值说明肽段偏亲水性。
表1中9种多肽的亲水性评分均为正值，说明肽段偏疏水性，有利于与疏水性生物活性物相互作用。
实施例4 跨膜转运肽功能评价
以辣椒素作为疏水性生物活性物模型，使用获得的跨膜转运肽进行包封递送，评价肽的功能性质。
负载辣椒素的多肽纳米颗粒制备：实施例1中的多肽混合液过0.45 μm的PES膜过滤器，将获得的滤液稀释12倍。辣椒素以25 mg/mL的浓度溶解在乙醇中。辣椒素溶液与稀释后的肽溶液以1:200的体积比涡旋混合15 s，离心（10000×g，25 ℃、10 min）取上清液并冻干获得负载辣椒素的多肽纳米颗粒。
Caco-2细胞培养：Caco-2细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。Caco-2细胞培养于含15%胎牛血清的培养基中，生长环境为37 ℃、5%二氧化碳细胞培养箱。在25 cm2培养瓶中培养细胞，细胞生长到密度为80%-90%时传代。
细胞摄取：将Caco-2细胞以1×105/mL的浓度培养于12孔板中，按照Caco-2细胞的培养方法培养至细胞汇合度80%以上后进行实验。首先，弃去孔内的培养基，并用磷酸缓冲盐溶液清洗三次除去残留的培养基。向孔内加入1 mL的纯培养基（不含胎牛血清和其它营养成分），并放入培养箱继续平衡1 h，弃去孔内培养基并加入预热到37℃负载辣椒素的纳米颗粒或游离辣椒素（辣椒素浓度为50 μg/mL）。加药完毕后，放入培养箱中继续培养10、30、60、90、120和180 min后，终止摄取。弃去含药培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次。每孔加入200 μL细胞裂解液。用枪吹打数下，充分裂解后，将孔内液体全部取出，离心取上清。测定每组细胞裂解液中辣椒素的含量和蛋白含量，对比各组制剂在不同时间、单位蛋白含量下细胞对药物的摄取量。
由图3可知，细胞对游离辣椒素和负载辣椒素的多肽纳米颗粒的摄取都很快达到饱和。然而，细胞对多肽纳米颗粒中辣椒素的摄取量显著高于对游离辣椒素的摄取量。给药3 h后，细胞对多肽纳米颗粒中辣椒素的摄取量是游离辣椒素的2.09倍。说明跨膜转运肽促进细胞对辣椒素的摄取。
Caco-2细胞单层模型的构建：向Transwell板的上、下层小室内分别加入0 .5 mL和1.5 mL培养液，在培养箱内孵育1 h。弃去培养液，将Caco-2细胞以6×105/mL的浓度培养于上层小室内，每小室0.5 mL，下层小室加入1.5 mL培养液。将Transwell板放回培养箱培养21天。前两周隔天换液，最后一周每天换液。培养至约21天时，当细胞两侧电阻值超过700Ω后即可用于后续的研究。
细胞层渗透性：弃去Transwell板中培养基，用预热至37 ℃的平衡盐溶液清洗2次后，上、下小室分别再加入0.5 mL和1.5 mL的平衡盐溶液孵育30 min。倒出上室平衡盐溶液，加入0.5 mL预热到37 ℃负载辣椒素的纳米颗粒或游离辣椒素（辣椒素浓度为50 μg/mL）。在培养箱孵育1、1.5、2、3 h后，分别从下室取样100 µL，再补充100 µL的平衡盐溶液。取出的样品加入300 µL乙腈，混匀后离心处理（8000×g，5 min），最后使用HPLC检测透过细胞层的辣椒素浓度。
如图4所示，在3 h中，负载辣椒素的多肽纳米颗粒和游离辣椒素两组的辣椒素透过量差异逐渐增大。给药3 h后，多肽纳米颗粒中辣椒素透过Caco-2细胞层的比例是游离辣椒素的2.50倍。说明跨膜转运肽能够增加辣椒素的跨小肠上皮细胞层转运。
药代动力学：5周龄C57BL/6J雄性小鼠72只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将小鼠分为2组：游离辣椒素组和多肽纳米颗粒组。适应性喂养5天后，禁食12 h，游离辣椒素组灌胃10 mg/kg的辣椒素，多肽纳米颗粒组灌胃等量辣椒素，然后分别在0、15、30、60、120、240、360、480、720min进行眼眶取血，最后将小鼠脱臼处死，使用液相色谱测定血清中辣椒素含量。
如图5所示，统计了游离辣椒素和负载辣椒素的多肽纳米颗粒的最大血药浓度（Cmax）、达到最大血药浓度的时间（Tmax）并使用曲线下的面积（AUC0-t）表示相对生物利用度（表3）。跨膜转运肽显著改善了辣椒素在小鼠体内的口服吸收，将其最大血药浓度提升了1.88倍，达到最大血药浓度的时间延迟了3 h，相对生物利用度提升了3.88倍，表明跨膜转运肽既可以增加辣椒素在小鼠体内的生物利用度，又具有缓释效果。
表3 游离辣椒素和负载辣椒素的多肽纳米颗粒在小鼠体内的药代动力学特征
| 组别 | Cmax(μg/mL) | Tmax(h) | AUC0-t(μg·h/mL) |
| 游离辣椒素 | 0.42±0.07 | 1 | 1.20±0.09 |
| 负载辣椒素的多肽纳米颗粒 | 0.79±0.09 | 4 | 4.65±0.17 |
虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种豌豆白蛋白来源的跨膜转运多肽，其特征在于，所述跨膜转运多肽是通过酶解豌豆白蛋白而得，其制备方法包括以下步骤：
配制40 g/L的豌豆白蛋白溶液，在4 ℃下过夜水合，将豌豆白蛋白溶液加热到37 ℃并保持温度恒定，用6 M HCl调节其pH为2.0，加入胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的酶活≥2500units/mg蛋白，胃蛋白酶与豌豆白蛋白质量比为1:625，酶解1 h；酶解结束后立即用6 MNaOH调节溶液pH为7.5，加入胰酶，所述胰酶的酶活8×USP，胰酶与豌豆白蛋白质量比为1:400，酶解2 h；结束后沸水浴10 min灭酶，在4 ℃下10000 rpm离心30 min后获得上清液，上清液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋在4 ℃透析12 h后获得多肽混合液；
所述多肽的氨基酸序列包括如下所示的序列：
VIPAGHPVA、
VVSLKDVVPE、
VVIIPAGHPVA、
HIISPEL、
PSTGGIGKVLP、
GTNSIIGRA、
TVSDIGSSMIKPI、
KNIVSA和
FSKNIL。
2.权利要求1所述跨膜转运多肽在制备促进疏水性生物活性物跨膜转运和细胞吸收的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410332175.6A CN117924420B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410332175.6A CN117924420B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117924420A CN117924420A (zh) | 2024-04-26 |
| CN117924420B true CN117924420B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=90751150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410332175.6A Active CN117924420B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117924420B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103194519A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-07-10 | 江南大学 | 一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用 |
| CN111019989A (zh) * | 2018-10-09 | 2020-04-17 | 杏辉天力（杭州）药业有限公司 | 一种豌豆低聚肽粉及其制备方法 |
| CN116804048A (zh) * | 2023-02-24 | 2023-09-26 | 中国农业大学 | 豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011122937A1 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | N.V. Nutricia | Pea protein peptides with anti helicobacter pylori activity |
| CN114315970B (zh) * | 2022-03-15 | 2022-07-19 | 中食都庆（山东）生物技术有限公司 | 一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用 |
-
2024
- 2024-03-22 CN CN202410332175.6A patent/CN117924420B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103194519A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-07-10 | 江南大学 | 一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用 |
| CN111019989A (zh) * | 2018-10-09 | 2020-04-17 | 杏辉天力（杭州）药业有限公司 | 一种豌豆低聚肽粉及其制备方法 |
| CN116804048A (zh) * | 2023-02-24 | 2023-09-26 | 中国农业大学 | 豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117924420A (zh) | 2024-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10183984B2 (en) | Method for extracting recombinant human serum albumin from transgenic rice grain | |
| CN117603308B (zh) | 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用 | |
| CN104593319B (zh) | 一种用于细胞培养基的小麦活性肽添加剂 | |
| CN110628859A (zh) | 一种糖基化牡蛎肽及其制备方法 | |
| CN116102640A (zh) | 重组乳铁蛋白衍生肽及其在提高免疫力方面的应用 | |
| CN117924420B (zh) | 豌豆白蛋白来源的跨膜转运肽及其制备方法与应用 | |
| CN104945484A (zh) | 一种抗菌肽及其制备方法与应用 | |
| CN116804048A (zh) | 豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途 | |
| CN116606369A (zh) | 螺旋藻免疫调节肽及其制备方法与应用 | |
| CN105440103A (zh) | 从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途 | |
| CN111004305B (zh) | 姬松茸小肽及其制备方法和应用 | |
| CN115260295A (zh) | 一种具有抗氧化功能的生物活性肽tdefqlhtnvndgtefggsiyqk | |
| WO2020259109A1 (zh) | 植物生产的epo与转铁蛋白的融合蛋白及其应用 | |
| RU2510398C2 (ru) | Способ выделения низкомолекулярных пептидов | |
| CN113005165A (zh) | α-乳白蛋白水解液和降血压肽及其应用 | |
| CN117264018B (zh) | 一种鸽蛋清中功能肽的制备及其应用 | |
| CN115403656A (zh) | 一种肠道可吸收的降胆固醇肽及其固相合成方法与应用 | |
| CN114478699B (zh) | 一种改善认知功能障碍的牡蛎活性肽及其制备方法与应用 | |
| CN115716870B (zh) | 一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其制备方法和应用 | |
| CN114957463B (zh) | 改造的骨髓干细胞及其制备的人工皮肤 | |
| JPS58128322A (ja) | 制癌剤 | |
| CN114957466B (zh) | 一种干细胞在制备人工皮肤中的用途 | |
| CN118226041A (zh) | 一种适用口服小分子肽的筛选方法 | |
| CN116514957A (zh) | 具有免疫调节活性的螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其制备方法与应用 | |
| CN116808172B (zh) | 葵花盘肽、复合脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |