CN116240256A - 一种人参糖肽及其制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人参糖肽及其制备工艺，所述制备工艺包括如下步骤：(1)提取人参糖肽，收集提取液，进行醇沉，得到人参糖蛋白；(2)将所述人参糖蛋白进行酶解，收集酶解液；所述酶解采用的酶为α‑胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合；(3)将所述酶解液进行固液分离，得到所述人参糖肽；所述固液分离包括离心、一次超滤、二次超滤。本发明采用提取、醇沉、酶解、超滤技术相结合，大大提升人参糖肽的提取率，其中酶解的三种酶协同作用，将人参糖蛋白进行更充分的水解，有效提高人参糖蛋白转化利用率，人参糖肽的纯度最高可达95％，为其在药品、保健品、化妆品等方面的应用奠定了良好的基础。

Description

一种人参糖肽及其制备工艺
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人参糖肽及其制备工艺。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey)是伞形目五加科多年生草本植物，距今约有6000万年悠久的历史，被誉为“植物活化石”。人参作为我国名贵中药材之一，中医对于人参的利用已经有2000多年的历史。近年来，人参外用制剂越来越多，如复方人参挥发油气雾剂、人参活络贴以及复方人参间苯二酚搽剂等，具有广阔的应用价值。人参中发挥多重药理作用的物质基础主要有人参皂苷、多糖、蛋白质、多肽、糖肽、挥发油等成分；其中人参皂苷、多糖、多肽以及糖肽等被证明具有许多生物活性。肽类成分因其分子量小于蛋白质而具有较高的生物利用度，又因其多具有独特的生物活性备受关注，被广泛应用于药品、食品、保健食品及化妆品等领域。
糖蛋白是由Montreuil于1973年提出，是除核酸外，由蛋白质分子与一种或多种含有碳水化合物基团的物质组成的复合物。糖肽(glycopeptides)是指糖蛋白和蛋白聚糖，糖与氨基酸或多肽链以共价键相连而形成的区域。人参糖肽(ginseng glycopeptides，GGP)相对分子质量为200-50000Da，其糖部分主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰半乳糖胺组成；其肽部分主要由17种氨基酸组成，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等，研究发现人参糖肽具有降血糖、降血脂、降胆固醇、增强学习记忆能力、保护神经细胞、抗炎镇痛等功能活性。
CN113151389A公开了一种人参糖肽及制备方法和医药用途，属于医药领域。以人参为原料，经过煎煮法提取、乙醇沉淀法分离、双酶酶解法水解、透析、冷冻干燥等步骤获得人参糖肽，其产率14％以上，纯度90％以上。该方法进行了动物模型实验，结果表明人参糖肽能够增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性。
CN1931874A公开了一种人参糖肽的制备方法和药物制剂，同时也公开了人参糖肽的医药的新用途。该方法以人参为原料，利用不同分子量的物质在不同浓度的乙醇中溶解度不同的原理，采用50％乙醇回流提取，80％乙醇沉淀的方法，得到人参糖肽粗品，同时控制其分子量的大致范围，再通过冷藏、脱色及超滤技术，除去杂质，得到精制的人参糖肽。该人参糖肽经配液、灌封、灭菌、包装等工序，生产出人参糖肽注射液。其药物制剂可用于预防和治疗糖尿病及其并发症等疾病。
CN114158725A公开了一种含多肽多糖的人参酶解物的制备方法，包括如下步骤：将100重量份的人参干品粉碎，加500-2000重量份的水，在30-65℃温度下，加糖酶1-8重量份，反应0.5-12小时；2)同样温度下，同时加碱性蛋白酶0.1-8重量份、中性蛋白酶0.1-8重量份反应0.5-12小时，或先加碱性蛋白酶0.1-8重量份反应0.5-12小时后，再加中性蛋白酶0.1-8重量份反应0.5-12小时；步骤2)维持pH值6～9；3)终止步骤2)的酶反应。
目前，人参糖肽的提取方法主要有水提法、醇提法、稀盐溶液或缓冲溶液提取法、酸碱溶液提取法、超声波辅助法以及微波辅助法等，以上提取方法各有优劣，单一的方式难以达到人参糖肽高效提取，在工业化生产中人参有效利用率低。
因此，开发一种高效、产率高、纯度高的提取人参糖肽的方法，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人参糖肽及其制备工艺，该工艺高效、产率高，制备得到的人参糖肽的纯度高。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种人参糖肽的制备工艺，所述制备工艺包括如下步骤：
(1)将人参进行提取，收集提取液，将所述提取液进行醇沉，得到人参糖蛋白；
(2)将所述人参糖蛋白进行酶解，收集酶解液；
所述酶解采用的酶为α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合；
(3)将所述酶解液进行固液分离，得到所述人参糖肽；
所述固液分离包括离心、一次超滤、二次超滤。
本发明采用组合方式提取人参糖肽，使用提取、醇沉、酶解技术相结合，在有效控制工业化成本的同时，大大提升人参糖肽的提取率。其中酶解采用α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合，三种酶协同作用，将人参糖蛋白进行更充分的酶解，提高人参糖蛋白转化利用率，所制备得到人参糖肽具备更高的纯度，为在药品、保健品、化妆品等方面的应用奠定了良好的基础。本发明采用二次超滤的工艺可以有效控制人参糖肽的分子量，以获得分子量分布更均匀、更容易被吸收的人参糖肽。
优选地，所述提取的料液比为1:(10-15)，例如可以为1:11、1:12、1:13或1:14等，以人参为1g计，提取剂为10-15mL。
优选地，所述提取采用的提取剂为水。
优选地，所述提取的时间为1.5-2.5h，例如可以为1.7h、2h或2.3h等。
优选地，所述提取重复进行2-3次。
优选地，所述提取之前还包括浸泡的步骤，所述浸泡的料液比为1:(5-15)，例如可以为1:6、1:8、1:10、1:12或1:14等。
优选地，所述提取之后还包括浓缩的步骤。
优选地，所述浓缩得到的提取液相对密度为1.0-1.2g/mL，例如可以为1.05g/mL、1.1g/mL或1.15g/mL等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述醇沉时体系中的含醇量为60-80％，例如可以为62％、65％、70％、75％或78％等。
优选地，所述醇沉采用的试剂为乙醇水溶液。
优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量为80-90％，例如可以为82％、84％、86％或88％等。
优选地，所述醇沉之后还包括减压浓缩、冷冻干燥的步骤。
优选地，所述α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为(3-5):(2-3):1，例如可以为3:2:1、3:3:1、4:2:1、4:3:1、5:2:1或5:3:1等。
优选地，所述酶解时酶总量占人参糖蛋白的质量百分比为4-8％，例如可以为4.5％、5％、5.5％、6％、7％、7.2％、7.4％、7.6％或7.8％等。
优选地，所述酶解时，底物中人参糖蛋白的质量百分含量为5-8％，例如可以为5.5％、6％、6.5％、7％或7.5％等。
优选地，所述酶解的温度为40-50℃，例如可以为42℃、44℃、46℃或48℃等，时间为5-7h，例如可以为5.5h、6h或6.5h等。
优选地，所述酶解之前，调整人参糖蛋白的pH值为8-9，例如可以为8.3、8.5或8.8等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述酶解之后还包括灭活的步骤。
优选地，所述灭活采用加热的方式进行，灭活的温度为95-100℃，例如可以为96℃、97℃、98℃或99℃等，时间为8-12min，例如可以为9min、10min或11min等。
优选地，所述固液分离采用离心的方式进行。
优选地，所述固液分离后还包括冷冻干燥的步骤。
优选地，所述一次超滤的截留分子量为1.5-2.5KDa，例如可以为1.6KDa、1.8KDa、2KDa、2.2KDa、2.4KDa等，收集滤液。
优选地，所述二次超滤的截留分子量为400-600Da，例如可以为450Da、500Da、550Da等，收集截留液。
优选地，所述制备工艺包括如下步骤：
(1)将人参加水进行提取1.5-2.5h，提取的料液比为1:(10-15)，重复进行2-3次，收集提取液，浓缩至相对密度为1.0-1.2g/mL，再采用80-90％乙醇水溶液进行醇沉，醇沉时体系中的含醇量为60-80％，收集固体，减压浓缩、冷冻干燥，得到人参糖蛋白；
(2)将所述人参糖蛋白调节pH值为8-9，之后在40-50℃进行酶解5-7h，调节pH值为8-9，收集酶解液；
所述酶解采用的酶为α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合，质量比为(3-5):(2-3):1；
所述酶解时酶总量占人参糖蛋白的质量百分比为4-8％；
(3)将所述酶解液进行离心后，采用1.5-2.5KDa超滤膜进行一次超滤，收集滤液，采用400-600Da超滤膜进行二次超滤，收集截留液，得到所述人参糖肽。
第二方面，本发明提供一种人参糖肽，所述人参糖肽通过第一方面所述的制备工艺制备得到的。
优选地，所述人参糖肽的重均分子量为700-850Da，例如可以为720Da、740Da、760Da、780Da、800Da、820Da、840Da等。
优选地，所述人参糖肽的纯度≥90％，例如可以为91％、92％、93％、94％或95％等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的人参糖肽在药品、保健品、化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用组合方式提取人参糖肽，使用提取、醇沉、酶解技术相结合，在有效控制工业化成本的同时，大大提升人参糖肽的提取率。其中酶解采用α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合，三种酶协同作用，将人参糖蛋白进行更充分的水解，有效提高人参糖蛋白转化利用率，人参糖肽的产率达到17％以上，所制备得到人参糖肽具备更高的纯度，纯度最高可达95％，为其在药品、保健品、化妆品等方面的应用奠定了良好的基础。本发明采用二次超滤的工艺可以有效控制人参糖肽的分子量，获得分子量较小、分子量分布更均匀、更容易被吸收的人参糖肽。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
以下实施例中试剂或仪器来源如下：
α-胰凝酶：上海源叶生物科技有限公司；
胰蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司；
胃蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司；
乙醇：国药集团化学试剂有限公司；
纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；
氢氧化钠：北京化工公司。
实施例1
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
(1)取人参粉碎成粗颗粒，加10倍水浸泡至无白心，捞出，加12倍量水煎煮两次，每次2小时，提取液滤过，合并滤液，浓缩至药液相对密度为1.10g/mL(50℃)，放冷，加入85％乙醇水溶液，调整至体系中含醇量为70％，静置48h，取沉淀，加水，搅匀，减压回收乙醇，冷冻干燥，得人参糖蛋白；
(2)取人参糖蛋白，加去离子水溶解，加入0.5mol/L NaOH水溶液调节至pH为8.5，此时体系中底物浓度为7％，加入蛋白酶(E/S，蛋白酶与底物的浓度比)6％，其中α-胰凝酶3％、胰蛋白酶2.25％和胃蛋白酶0.75％，45℃、180rpm在摇床中反应6h，反应结束后，在100℃条件下水浴10min进行灭活；
(3)灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液，首先将上清液经过2kDa超滤膜过滤，收集滤液，将滤液经过500Da超滤膜过滤，收集截留液，超滤至10min内无过滤液滴下为终点，冻干，得到人参糖肽。
实施例2
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
(1)取人参粉碎成粗颗粒，加15倍水浸泡至无白心，捞出，加10倍量水煎煮两次，每2.5小时，提取液滤过，合并滤液，浓缩至药液相对密度为1.0g/mL(50℃)，放冷，加入90％乙醇水溶液，调整至体系中含醇量为60％，静置48h，取沉淀，加水，搅匀，减压回收乙醇，冷冻干燥，得人参糖蛋白；
(2)取人参糖蛋白，加去离子水溶解，加入0.5mol/L NaOH水溶液调节至pH为8，此时体系中底物浓度为5％，加入蛋白酶(E/S，蛋白酶与底物的浓度比)8％，其中α-胰凝酶4％、胰蛋白酶3％和胃蛋白酶1％，45℃、180rpm在摇床中反应5h，反应结束后，在100℃条件下水浴10min进行灭活；
(3)灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液，首先将上清液经过1.6kDa超滤膜过滤，收集滤液，将滤液经过600Da超滤膜过滤，收集截留液，超滤至10min内无过滤液滴下为终点，冻干，得到人参糖肽。
实施例3
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
(1)取人参粉碎成粗颗粒，加15倍水浸泡至无白心，捞出，加15倍量水煎煮两次，每1.5小时，提取液滤过，合并滤液，浓缩至药液相对密度为1.2g/mL(50℃)，放冷，加入80％乙醇水溶液，调整至体系中含醇量为80％，静置48h，取沉淀，加水，搅匀，减压回收乙醇，冷冻干燥，得人参糖蛋白；
(2)取人参糖蛋白，加去离子水溶解，加入0.5mol/L NaOH水溶液调节至pH为9，此时体系中底物浓度为8％，加入蛋白酶(E/S，蛋白酶与底物的浓度比)4％，其中α-胰凝酶2％、胰蛋白酶1.5％和胃蛋白酶0.5％，45℃、180rpm在摇床中反应7h，反应结束后，在100℃条件下水浴10min进行灭活；
(3)灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液，首先将上清液经过2.5kDa超滤膜过滤，收集滤液，将滤液经过400Da超滤膜过滤，收集截留液，超滤至10min内无过滤液滴下为终点，冻干，得到人参糖肽。
实施例4
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中α-胰凝酶4.2％、胰蛋白酶1.2％和胃蛋白酶0.6％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中α-胰凝酶2.25％、胰蛋白酶3％和胃蛋白酶0.75％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中α-胰凝酶2.25％、胰蛋白酶1.5％和胃蛋白酶2.25％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)10％，其中α-胰凝酶5％、胰蛋白酶3.75％和胃蛋白酶1.25％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)3％，其中α-胰凝酶1.5％、胰蛋白酶1.125％和胃蛋白酶0.375％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中α-胰凝酶4％、胰蛋白酶2％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中α-胰凝酶4.8％、胃蛋白酶1.2％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入蛋白酶(E/S)6％，其中胰蛋白酶4.5％和胃蛋白酶1.5％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入α-胰凝酶(E/S)6％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例5
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入胰蛋白酶(E/S)6％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例6
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中加入胃蛋白酶(E/S)6％。其他原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例7
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(3)，本对比例的步骤(3)为：
灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液经过2kDa超滤膜过滤，收集滤液，超滤至10min内无过滤液滴下为终点，冻干，得到人参糖肽。
对比例8
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(3)，本对比例的步骤(3)为：
灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液，将上清液经过500Da超滤膜过滤，收集截留液，超滤至10min内无过滤液滴下为终点，冻干，得到人参糖肽。
对比例9
本对比例提供一种人参糖肽，所述人参糖肽的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(3)，本对比例的步骤(3)为：
灭活后的酶解产物，于4800rpm离心10min，取上清液，冻干，得到人参糖肽。
测试例1
采用茚三酮显色法测定人参糖肽水解度，配制浓度为20μg/mL的甘氨酸溶液，分别移取甘氨酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL于试管中，加蒸馏水补至1.0mL，加入1mL茚三酮(茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HPO4·10H2O 10.0g及KH2PO4 6.0g)作为显色剂，混合均匀后放入沸水水浴反应15min，放置冷却后加入5mL体积分数为40％乙醇溶液，混合均匀后室温放置15min，精密吸取200μL置于96孔板中，以超纯水为空白，测570nm处吸光度。以甘氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程：y＝0.0121x+0.0657，R2＝0.999。
采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，按照BCA测定试剂盒说明书检测总蛋白浓度。纯度％(糖蛋白质量分数％)＝多糖质量分数+蛋白质质量分数。
对实施例1-8、对比例1-6制备得到的人参糖肽进行检测，其水解度、产率和纯度如表1所示。
表1
水解度 产率(％) 纯度(％)
实施例1 29.98 22.3 95
实施例2 27.47 21.8 94
实施例3 26.30 20.9 93.5
实施例4 23.5 19.1 90.2
实施例5 22.3 18.3 90.9
实施例6 22.0 19.0 91.0
实施例7 22.1 18.9 86.2
实施例8 18.4 17.2 83.4
对比例1 16.1 14.3 80.1
对比例2 15.3 13.7 79.6
对比例3 15.8 14.1 78.5
对比例4 14.0 12.3 65.2
对比例5 13.5 11.9 64.1
对比例6 13.8 12.1 63.9
根据表格数据可知，制备工艺中，当酶总量不变的情况下，α-胰凝酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶中某一种酶的用量比例过高，都会引起水解度的下降；当酶总量过高时，水解度几乎无影响，但是产率和纯度有所下降，当酶总量过低时，水解度限度降低；在酶总量不变情况下，当使用某两种酶，或者单一使用某种酶时，水解度、产率和纯度均会显著降低，表明三种酶协同作用，提升对于人参的水解，并且保证了人参糖肽的产率和纯度。
测试例2
分子量测试
(1)对照品溶液的配制
采用已知分子量的右旋糖酐分子量标准品，根据样品分子量的大小，选用重均分子量(Mw)为右旋糖酐180、1000、5000、12000、50000Da不同分子量的标准品加流动相配制成10mg/mL的溶液，作为对照品溶液。使用安捷伦GPC软件版本为A.02.01分析数据。
(2)供试品溶液的配制
取实施例1-3、对比例7-9制备的人参糖肽，加流动相配成10mg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。
(3)色谱条件
色谱柱：Sepex SRT SEC-100(7.8mm×300mm，5μm)；流动相：0.7％硫酸钠溶液；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；液相：LC-2030C3D高效液相色谱仪；检测器：示差折光检测器；理论板数按葡萄糖峰计算应不小于5000Da。检测得到的结果如表2所示。
表2
样品 重均分子量(Da)
实施例1 786
实施例2 713
实施例3 842
对比例7 695
对比例8 1365
对比例9 1152
根据表格数据可知，进行二次超滤工艺对于制备本发明所需的人参糖肽有重要意义，当只进行一次超滤时，所得人参糖肽分子量有所降低；当只进行第二次超滤工艺时，所得人参糖肽分子量明显增加；当不采用二次超滤工艺时，得到的人参糖肽分子量也会明显增加。
测试例3
羟自由基清除实验
主要设备：多功能酶标仪(Spectra Max M5 Molecular Device)
实验方法：设有样品组实施例1-8和对比例1-9制备的人参糖肽稀释至1/10，和阴性对照组，分别依次加入0.1份硫酸亚铁、0.1份乙醇、0.1份水杨酸、0.1份样品或阴性对照、1份等离子水、0.1份双氧水到1.5mL离心管中，盖紧管盖上下颠倒摇匀，在37℃水浴锅中保温15min，将溶液移到96孔板中，每组三个复孔。酶标仪测定510nm处吸光度。
羟自由基清除率由如下公式计算得到：
羟自由基清除率％＝{[A0-(AX-AX0)]/A0}×100％，其中，A0为阴性对照组的吸光度，Ax为样品组的吸光度，Axo为样品背景的吸光度。测试结果如表3所示。
表3
样品 羟自由基清除率(％)
实施例1 71.8
实施例2 70.2
实施例3 70.8
实施例4 69.1
实施例5 66.3
实施例6 66.9
实施例7 67.0
实施例8 65.3
对比例1 63.1
对比例2 61.2
对比例3 64.0
对比例4 59.4
对比例5 60.2
对比例6 57.6
对比例7 66.9
对比例8 61.3
对比例9 63.4
根据表格数据可知，制备工艺中，当复合酶总量不变的情况下，α-胰凝酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶中某一种酶的用量比例过高，都会引起羟自由基清除率的下降；当酶总量过高时，清除率略有下降，当酶总量过低时，清除率显著降低；在酶总量不变情况下，当使用其中某两种酶的组合，或者单一使用某种酶时，羟自由基清除率会显著降低，表明三种酶协同作用，增强人参糖肽在清除羟自由基方面产生效果，进一步保证了人参糖肽在护肤方面的效用。当人参糖肽的重均分子量较低时，清除率略有下降，当分子量较大时，清除率存在明显降低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种人参糖肽的制备工艺，其特征在于，所述制备工艺包括如下步骤：
(1)将人参进行提取，收集提取液，将所述提取液进行醇沉，得到人参糖蛋白；
(2)将所述人参糖蛋白进行酶解，收集酶解液；
所述酶解采用的酶为α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合；
(3)将所述酶解液进行固液分离，得到所述人参糖肽；
所述固液分离包括离心、一次超滤、二次超滤。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述提取的料液比为1:(10-15)；
优选地，所述提取采用的提取剂为水；
优选地，所述提取的时间为1.5-2.5h；
优选地，所述提取重复进行2-3次。
3.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述提取之后还包括浓缩的步骤；
优选地，所述浓缩得到的提取液相对密度为1.0-1.2g/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述醇沉时体系中的含醇量为60-80％；
优选地，所述醇沉采用的试剂为乙醇水溶液；
优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量为80-90％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述醇沉之后还包括减压浓缩、冷冻干燥的步骤。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为(3-5):(2-3):1；
优选地，所述酶解时酶总量占人参糖蛋白的质量百分比为4-8％；
优选地，所述酶解的温度为40-50℃，时间为5-7h；
优选地，所述酶解之前，调整人参糖蛋白的pH值为8-9。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述一次超滤的截留分子量为1.5-2.5KDa，收集滤液；
优选地，所述二次超滤的截留分子量为400-600Da，收集截留液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述制备工艺包括如下步骤：
(1)将人参加水进行提取1.5-2.5h，提取的料液比为1:(10-15)，重复进行2-3次，收集提取液，浓缩至相对密度为1.0-1.2g/mL，再采用80-90％乙醇水溶液进行醇沉，醇沉时体系中的含醇量为60-80％，收集固体，减压浓缩、冷冻干燥，得到人参糖蛋白；
(2)将所述人参糖蛋白调节pH值为8-9，之后在40-50℃进行酶解5-7h，收集酶解液；
所述酶解采用的酶为α-胰凝酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的组合，质量比为(3-5):(2-3):1；
所述酶解时酶总量占人参糖蛋白的质量百分比为4-8％；
(3)将所述酶解液进行离心后，采用1.5-2.5KDa超滤膜进行一次超滤，收集滤液，采用400-600Da超滤膜进行二次超滤，收集截留液，得到所述人参糖肽。
9.一种人参糖肽，其特征在于，所述人参糖肽通过权利要求1-8任一项所述的制备工艺制备得到的；
优选地，所述人参糖肽的重均分子量为700-850Da。
10.一种如权利要求9所述的人参糖肽在药品、保健品、化妆品中的应用。
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