CN103194519A

CN103194519A - 一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用

Info

Publication number: CN103194519A
Application number: CN2013101525905A
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 张秋萍; 周锋; 周楠迪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2013-07-10

Abstract

一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于食品添加剂技术领域。本发明涉及以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化多肽粗品。该粗品PPH经SephadexG-25凝胶层析和两次RESOURCE^TM3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，浓度在0.2mg/mL时对DPPH自由基清除率达62.03%，与同浓度下谷胱甘肽对DPPH的清除率相近。反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定其纯度，超高效液相色谱-质谱法(Q-TOF-MS)分析鉴定其氨基酸序列。经脱盐后的PPH以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力。

Description

一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用

技术领域

一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于生物制品分离纯化、食品添加剂技术领域。

背景技术

对植物蛋白的开发利用，可从营养和功能特性两方面综合考虑，营养特性是基础，功能特性决定着蛋白质资源的真正利用价值。通过对植物蛋白进行加工开发其功能特性，是提高蛋白质价值的一种有效手段。利用酶解技术加工植物蛋白生产生物活性肽，可应用于食品、医药、保健品及化妆品等领域中。

豌豆作为一种传统的豆类作物，在我国拥有相当丰富的资源，存在着极大的开发潜能。国内目前对于豌豆的综合利用和深加工仍处于起步阶段，豌豆主要被许多厂家作为制作粉丝的原料，其主要是利用豌豆中的富淀粉含量来加工成粉丝，而剩下的膳食纤维和蛋白质等常用作饲料，这降低了豌豆的利用价值，因此需要提高豌豆功能特性方面的开发。豌豆蛋白的酶解产物中存在的生物活性肽，因其对人体具有多方面有益的生理功能，具有在食品加工、保健食品、医药等领域的开发潜力，可提高豌豆的利用率与使用价值，扩大豌豆的应用前景。

抗氧化剂是维持食品原有质量和人体抗氧化防御系统动态平衡的物质基础，因此获取抗氧化剂显得非常重要。化学合成和自然存在的物质都具有抗氧化能力，化学抗氧化剂一般具有较高的有效性和很好的经济效益，然而安全性得不到保证，具有一定的毒性，只能在一定范围内使用。来自食物中的天然抗氧化剂虽然一般不及人工合成的高效，可是天然抗氧化剂没有剂量的限制，当达到一定浓度时可与化学抗氧剂等效，天然抗氧化剂安全无毒，对人体不存在副作用，现在已成为研究开发的热点，越来越多的人们倾向于选择天然抗氧化剂。

存在于蛋白质中的一些多肽具有抗氧化能力，自从第一次报告提出以来，越来越多的国内外学者对其进行广泛的研究。抗氧化肽安全高效，容易被人体吸收、分子量小、结构简单，在不同环境下保持稳定，不存在免疫排斥反应，除抗氧化性外还可作为机体的营养物质。因此，可以确信在食品、医药、人类健康等领域，采用酶法制备抗氧化肽是开发天然、安全、营养的抗氧化剂的一个重要方向。

发明内容

本发明目的是一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到抗氧化多肽粗品即豌豆蛋白水解产物PPH。PPH经凝胶层析和反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，液质联用分析推测其氨基酸序列。对PPH进行放大制备工艺与应用探究，选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜进行脱盐浓缩处理，以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力，初步探明该豌豆抗氧化肽在功能型化妆品中的应用潜力。

本发明的技术方案：一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化肽粗品。该粗品PPH经Sephadex G-25凝胶层析和两次RESOURCE^TM 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：

A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽

（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15 min 进行预处理，冷却备用；

（2）胰蛋白酶酶解：随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40℃、pH 10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4×10⁴ U/g，开始水解反应，随时滴加2 M NaOH溶液保持酶解液pH 10不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶；

（3）中性蛋白酶酶解：步骤（2）产物冷却后按50℃、pH 7.5，E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为1×10⁵ U/g，水解4 h，煮沸灭酶，冷却后用2 M HCl溶液调pH 7；

（4）离心：步骤（3）产物按照8000 r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；

B 酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法

（5）对PPH冻干样选用Sephadex G-25进行分离，规格为1.6 cm×60 cm，配置浓度50 mg/mL，加样量为2 mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min，在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥；

（6）选出抗氧化性高的一组分在AKTA蛋白质分析纯化仪上进行反相色谱纯化，样品溶解于含有0.05% (v/v) 三氟乙酸TFA的水溶液中，选用RESOURCE^TM 3RPC色谱柱，进样量为1 mL，以2 mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A进行洗脱，检测波长为215 nm，使用自动收集器收集洗脱峰；5 min后，以流速为3 mL/min进行梯度洗脱，20 min时达到100%溶液B，溶液B 为含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5 mL进行收集；富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力；

（7）选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性。

（8）利用RP-HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436 min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12%；经液质联用分析推测出相对分子量为956.5 Da，氨基酸序列为Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。结果如图2。

用所述方法制备的抗氧化肽的应用，对所得PPH选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜对PPH粗品进行脱盐浓缩处理，脱盐率达到79.87%，PPH浓缩2.86倍，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；随后以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力。

（1）纳滤脱盐：豌豆蛋白双酶酶解生成豌豆蛋白水解产物PPH选用PES 10000超滤膜，在操作压力为0.2 MPa下进行除沉淀和大分子物质，分子量＜10 KDa透过液进行PES 500纳滤脱盐，测定Cl^-离子浓度和根据双缩脲法测定多肽浓度，在室温，操作压力为0.5 MPa条件下，进行预浓缩，期间测定Cl^-离子浓度，计算脱盐率；随后加入纯水，继续进行除盐，如此反复操作三次。最终脱盐率可达到79.87%，PPH浓缩了2.86倍；测定抗氧化肽浓度，由纳滤前的8.57 mg/mL变为浓缩后的21.51 mg/mL，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；对纳滤前后的样品在不同浓度下进行DPPH清除能力的测定并计算IC₅₀值，纳滤后的样品IC₅₀值为2.53 mg/mL，而纳滤前为2.89 mg/mL，PPH经过纳滤脱盐处理对DPPH清除能力没有下降；

（2）用于制作润肤霜：将纳滤脱盐后的样品进行冷冻干燥用于润肤霜的制作，按0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量分别加入到水相中，再与油相混合，即得抗氧化肽润肤霜；观察到分别在-18℃和48℃下放置24 h后恢复至室温无分层情况；在3000 r/min条件下离心30 min无分层情况；感官观察显示不同浓度的润肤霜结构细腻，无气味；除当添加量达到0.7%时润肤霜显浅黄色外，其余色泽白皙；表明在润肤霜制作过程中加入不同浓度的豌豆抗氧化肽状态仍保持稳定，不改变润肤霜的性质；

（3）进行DPPH清除率测定：将不同浓度的润肤霜放置一周后用C₂H₅OH︰CHCl₃体积比1︰1的混合溶剂溶解，进行DPPH清除率测定，将溶解样于太阳光下照射2小时后再进行抗氧化能力测定，反应完成后在5000 r/min下离心5 min后测定吸光度，与PPH原液进行比较发现，制备的豌豆抗氧化润肤霜放置一周后依然能检测出具有抗氧化能力，与豌豆抗氧化肽原样相比，对DPPH自由基清除能力基本保持不变，DPPH清除率随着抗氧化肽添加量的增大而增加，光照处理后的样品对DPPH清除率有所降低，但仍能保持原有的80%，豌豆抗氧化肽的抗氧化性在润肤霜中以及对光照具有很好的稳定性。结果如图3。

DPPH自由基清除能力测定

取处于中性条件下一定浓度的样品2 mL加入到2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，振荡均匀。置于黑暗环境下反应20 min，于517 nm处测定上清液的吸光值(As)。以水代替样品溶液做对照(Ac)。以2 mL乙醇加入2 mL水做空白调零。酶解液样品的DPPH清除能力用清除率(%)表示，

清除率(%)＝ [(Ac-As)/Ac]×100%。

IC₅₀值定义为对DPPH自由基清除率达到50%时所需要的样品浓度。

Cl^-离子浓度和脱盐率测定

采用硝酸银滴定法。吸取酶解液1 mL于10 mL量筒中用超纯水稀释至 10 mL后倒入小烧杯中，加入10滴5%的铬酸钾溶液做指示剂，用0.05 mol/L的硝酸银滴定至桔红色为止，以超纯水做空白。

样品中Cl^-离子浓度(mg/mL)=(V-V₀)×C×35.5。

其中V------滴定样品时硝酸银消耗的体积，mL；V_0------滴定超纯水时硝酸银消耗的体积，mL；C------硝酸银溶液浓度，mol/L；35.5------1 mL浓度为1 mol/L的硝酸银滴定溶液相当的氯质量数值，单位为mg。

脱盐率%＝(c₀v₀-c₁v₁)/c₀v₀×100%。其中v₀、v₁------表示样品起始和终止的体积；c₀、c₁------样品起始和终止的Cl^-离子浓度。

润肤霜的配制

水相A：甘油 4 g，卡波940 0.2 g，EDTA^.2Na 0.1 g，超纯水 100 g。

油相B：十六十八醇 5 g，聚氧乙烯(2)硬脂醇醚（Brj72） 1.5 g，聚氧乙烯(21)硬脂醇醚（Brj721） 1.5 g，棕榈油 2 g，肉豆蔻酸异丙酯 2 g，对羟基苯甲基甲酯 0.1 g，对羟基苯甲基乙酯 0.5 g，液体石蜡 2 g。

将水相A和油相B加热溶解，加热至80~90℃时，将B相加入到A相中，用玻棒按同一方向搅拌冷却至室温，用匀质搅拌器均质2 min，最后滴加2滴三乙醇胺使霜变为中性，搅拌即为水包油型润肤霜。

本发明的有益效果：以豌豆分离蛋白为原料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶组合分步酶解方案，得到一种豌豆抗氧化多肽粗品PPH；PPH经凝胶层析和反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，利用液质联用鉴定为一种八肽 (Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu)；对PPH进行放大制备工艺与应用探究，选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜进行脱盐浓缩处理，得到脱盐的豌豆抗氧化肽，以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力，初步探明该豌豆抗氧化肽具备在功能型化妆品中的应用潜力。

附图说明

图1一种豌豆分离蛋白酶解产抗氧化肽的制备方法及应用流程示意图

图2豌豆分离蛋白酶解抗氧化肽m/z 957.5的质谱图。

图3添加豌豆抗氧化肽的润肤霜对DPPH自由基的清除能力。

具体实例方式

实施例1豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽

称取豌豆分离蛋白15g于250 mL烧杯中，加入200 mL纯水配置浓度为7.5%的水溶液，90℃水浴15 min进行预处理，冷却后放在恒温磁力搅拌器上溶液边搅拌边调至温度40℃、pH 10，随后按照酶底比6%加入胰蛋白酶0.9 g，开始水解反应，随时滴加2 M NaOH保持酶解液pH不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶。冷却后以相同的方法将溶液调至温度40℃、pH 10，按照酶底比6%加入中性蛋白酶0.9 g，水解4 h。冷却后用2 M HCl调至pH 7.0。8000 r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为抗氧化多肽粗品即豌豆蛋白水解产物PPH，对DPPH自由基的半清除浓度IC₅₀值为3.01 mg/mL。对PPH冻干样选用Sephadex G-25进行分离，配置浓度50 mg/mL，加样量为2 mL，以水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min。在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力。收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥。样品溶解于含有0.05% (v/v) TFA的水溶液中，选用RESOURCE^TM 3RPC色谱柱，进样量为1 mL，以2 mL/min的流速用溶液A(5%乙腈，0.05%TFA)进行洗脱，检测波长为215 nm，使用自动收集器收集洗脱峰。5 min后，以流速为3 mL/min进行梯度洗脱，20 min时达到100%溶液B (60%乙腈，0.05%TFA)，每管5 mL进行收集。富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力。选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：10%乙腈，0.05%TFA；溶液D为：50%乙腈，0.05%TFA，其他条件保持不变。按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥，当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力(66.42%)，有很强的抗氧化性。利用反相高效液相分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧肽样品在9.436 min时，出现一个比较纯的洗脱峰。经液质联用分析推测其相对分子量为956.5 Da，氨基酸序列为Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。

实施例2抗氧化肽的应用

称取豌豆分离蛋白60 g于1000 mL烧杯中，加入纯水600 mL，90℃水浴15 min进行预处理后，与上述相同的方法进行双酶分步酶解，所得上清液即为PPH，选用超滤膜(PES 10000)，在操作压力为0.2 MPa下进行除沉淀和大分子物质，得到分子量＜10 KDa透过液2 L，多肽浓度为8.57 mg/mL，Cl^-浓度为2.17 mg/mL。随后进行纳滤(PES 500)脱盐，起始体积为2 L，在室温，操作压力为0.5 MPa条件下，进行预浓缩至700 mL，测定操作时间为85 min，Cl^-离子浓度为2.45 mg/mL，计算脱盐率为39.53%；随后加入纯水至2 L，进行除盐，至体积为700 mL后停止，如此反复操作三次，最终Cl^-离子浓度达到1.25 mg/mL，脱盐率可达到79.87%，PPH浓缩了2.86倍，测定多肽浓度变为21.51 mg/mL，纳滤过后蛋白损失率为12.15%。整个过程总耗时为5.1 h，对纳滤前后的样品在不同浓度下进行DPPH清除能力的测定并计算IC₅₀值，发现纳滤后的样品对清除一半DPPH所需要的浓度比纳滤前的低，IC₅₀值为2.53 mg/mL，而纳滤前为2.89 mg/mL，PPH经过纳滤脱盐处理对DPPH清除能力没有下降。将纳滤脱盐后的样品进行冷冻干燥用于润肤霜的制作，按0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量以加入到水相中，再与油相混合，即得抗氧化肽润肤霜。将不同浓度的润肤霜放置一周后进行稳定性和抗氧化性试验，发现具有良好的稳定性和抗氧化能力。

Claims

1.一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；该粗品PPH经Sephadex G-25凝胶层析和两次RESOURCE^TM 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：

A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽

（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15 min进行预处理，冷却备用；

B 酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法

（7）选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性；

（8）利用RP-HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436 min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12%；经液质联用分析推测出相对分子量为956.5 Da，氨基酸序列为Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。

2.权利要求1所述方法制备的抗氧化肽的应用，其特征在于对所得PPH选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜对PPH粗品进行脱盐浓缩处理，脱盐率达到79.87%，PPH浓缩2.86倍，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；随后以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力；

（1）纳滤脱盐：豌豆蛋白双酶酶解生成豌豆蛋白水解产物PPH选用PES 10000超滤膜，在操作压力为0.2 MPa下进行除沉淀和大分子物质；分子量＜10 KDa透过液进行PES 500纳滤脱盐，测定Cl^-离子浓度和根据双缩脲法测定多肽浓度，在室温，操作压力为0.5 MPa条件下，进行预浓缩，期间测定Cl^-离子浓度，计算脱盐率；随后加入纯水，继续进行除盐，如此反复操作三次；

最终脱盐率可达到79.87%，PPH浓缩了2.86倍；测定抗氧化肽浓度，由纳滤前的8.57 mg/mL变为浓缩后的21.51 mg/mL，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；对纳滤前后的样品在不同浓度下进行DPPH清除能力的测定并计算IC₅₀值，纳滤后的样品IC₅₀值为2.53 mg/mL，而纳滤前为2.89 mg/mL，PPH经过纳滤脱盐处理对DPPH清除能力没有下降；

（2）用于制作润肤霜：将纳滤脱盐后的样品进行冷冻干燥用于润肤霜的制作，按0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量分别加入到水相中，再与油相混合，即得抗氧化肽润肤霜；观察到分别在-18℃和48℃下放置24 h后恢复至室温无分层情况；在3000 r/min条件下离心30 min无分层情况；感官观察显示不同浓度的润肤霜结构细腻，无气味；除当添加量达到0.7%时润肤霜显浅黄色外，其余色泽白皙；表明在润肤霜制作过程中加入不同浓度的豌豆抗氧化肽状态仍保持稳定，不改变润肤霜的性质；

（3）进行DPPH清除率测定：将不同浓度的润肤霜放置一周后用C₂H₅OH︰CHCl₃体积比1︰1的混合溶剂溶解，进行DPPH清除率测定，将溶解样于太阳光下照射2小时后再进行抗氧化能力测定，反应完成后在5000 r/min下离心5 min后测定吸光度，与PPH原液进行比较发现，制备的豌豆抗氧化润肤霜放置一周后依然能检测出具有抗氧化能力，与豌豆抗氧化肽原样相比，对DPPH自由基清除能力基本保持不变，DPPH清除率随着抗氧化肽添加量的增大而增加，光照处理后的样品对DPPH清除率有所降低，但仍能保持原有的80%，豌豆抗氧化肽的抗氧化性在润肤霜中以及对光照具有很好的稳定性。