CN106749461B - 可自主装形成纳米微粒的维生素b12衍生物及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物及制备方法与应用。该可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物如式I所示。本发明通过磷酸鎓盐类耦合剂或碳二亚胺类耦合剂活化耦合Boc‑苯丙氨酸二肽的羧基，生成活泼的中间产物，然后再加入维生素B₁₂‑羰基‑腐胺，得到可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物。该维生素B₁₂衍生物能与药物自组装成纳米微粒，从而可以携带多个药物分子通过主动运输的方式穿过肠粘膜进入门脉循环，保证给药药剂量达到的治理效果。

Description

可自主装形成纳米微粒的维生素B12衍生物及制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米药物载体领域，特别涉及一种可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物及制备方法与应用。

背景技术

多肽蛋白质类生物药物目前在药物市场所占的份额越来越大，常见的有治疗癌症和自免疫疾病的单克隆抗体，抗甲、乙型肝炎疫苗，糖尿病治疗剂胰岛素和肠促胰岛素，以及治疗激素缺陷的人生长激素等药物等。但是此类药物更广泛的应用受到了其本身性质的限制，例如：稳定性低、高分子量和亲水性导致难以穿过生物膜造成生物利用度低等等。多肽和蛋白质药物目前主要给药方式还是通过药物注射。但是这种给药方式，由于疼痛，患者的依从性低，并且一些药物注射给药与生理利用途径不同也影响药物的疗效。而免针给药途径，包括多种非侵入性给药方式，如口服给药、鼻腔给药、肺部给药等等，受到广泛关注。

在所有的给药方式中，口服给药是患者依从度最高的，也是最方便安全的。口服多肽蛋白类药物主要受两方面的局限：一是肠胃中的蛋白酶和肽酶极易降解药物；二是该类药物一般分子量比较大，并且在小肠上皮细胞上没有特定的吸收途径。针对上述限制，现阶段有处方组成、包囊技术、大分子复合以及化学修饰等方法，用来改善多肽蛋白质类药物口服吸收。这些方法都可以提高口服蛋白药物的生物利用度，但各有不足。处方组成中的脂肪酸微乳会改变肠胃黏膜表面的完整性，包囊技术中的多糖类结构在吸收效率上还有待提高，大分子复合物以及化学修饰会改变多肽蛋白质类药物的分子结构形态。

维生素B₁₂在肠壁内有特定的吸收途径，由于其分子量比较大(1355Da)，不能通过简单的扩散作用被肠胃吸收。食物中的维生素B₁₂通过胃液的消化而释放出来，并与一种被称为内生因子(intrinsic factor，IF)的胃蛋白酶形成复合物，维生素B₁₂-IF复合物在小肠上皮细胞上有特定的受体蛋白，从而通过受体内吞的方式透过肠道。被小肠上皮细胞吸收后，IF会与维生素B₁₂分离，并将维生素 B₁₂释放到门脉循环中。有报道维生素B₁₂可以直接引导蛋白质或多肽穿过肠壁，提高药物的口服吸收率。但是，这种化学修饰多肽蛋白类药物的方式也有不足：一是多肽蛋白类药物经过化学修饰与维生素B₁₂相连，会影响药物活性；二是肠膜上维生素B₁₂-IF复合物的受体有限，同时受体结合维生素B₁₂受血浆中维生素 B₁₂浓度调控，因此，维生素B₁₂携带蛋白或者多肽药物的剂量常达不到治疗要求。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物。

本发明的另一目的在于提供所述可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物，化学结构式如式I所示：

所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)酰胺类中间产物的制备：

①将磷酸鎓盐类耦合剂、DMF(二甲基甲酰胺)、DIEA(二异丙基乙胺) 和Boc-苯丙氨酸二肽混合，超声水浴反应，得到酰胺类中间产物X₁；

②将DMF、碳二亚胺类耦合剂、HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)和Boc- 苯丙氨酸二肽混合，超声水浴反应，得到酰胺类中间产物X₂；

(2)维生素B₁₂-OP的制备：

往步骤(1)①得到的酰胺类中间产物X₁或步骤(1)②得到的酰胺类中间产物X₂中加入维生素B₁₂-羰基-腐胺(维生素B₁₂-OD)，超声水浴反应，再加入乙酸乙酯终止反应，离心、弃上清、取沉淀、干燥，得到维生素B₁₂-OP(维生素B₁₂-羰基-腐氨-苯丙氨酸二肽-Boc)；

其中，DMF为溶剂，参与反应的各原料按如下摩尔比配比：

通过酰胺类中间产物X₁得到维生素B₁₂-羰基-腐胺时，维生素B₁₂‐羰基‐腐胺：磷酸鎓盐类耦合剂：Boc‐苯丙氨酸二肽：DIEA＝1：1～4：0.75～3：0.5～2；

通过酰胺类中间产物X₂得到维生素B₁₂-羰基-腐胺时，碳二亚胺类耦合剂：HOAT：Boc-苯丙氨酸二肽：维生素B₁₂-羰基-腐胺＝0.75～3：0.75～3：0.75～3： 1。

所述的参与反应的各原料更优选为按如下摩尔比配比：

维生素B₁₂‐羰基‐腐胺：磷酸鎓盐类耦合剂：Boc‐苯丙氨酸二肽： DIEA＝17:34:25:34；

碳二亚胺类耦合剂：HOAT：Boc-苯丙氨酸二肽：维生素B₁₂-羰基-腐胺＝25:25:25:17。

步骤(1)①中所述的磷酸鎓盐类耦合剂优选为HATU(2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)或HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)。

步骤(1)②中所述的碳化二亚胺类耦合剂优选为DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)。

步骤(1)①和②中所述的超声水浴反应I的条件优选为：30℃、70w超声反应5min。

步骤(1)中的DMF用于做溶剂(反应介质)，其用量为能将所有反应原料溶解即可。

步骤(2)中所述的超声水浴反应II的条件优选为：30℃、70w超声反应2h。

步骤(2)中所述的乙酸乙酯的用量为按乙酸乙酯与DMF的体积比为2～8： 1配比计算，优选为按乙酸乙酯与DMF的体积比为2.5～4：1配比计算。

步骤(2)中所述的离心的条件优选为：8000r/min离心5min。

步骤(2)中所述的干燥优选为真空干燥或冷冻干燥。

所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，还包括将步骤(2)得到的产物(维生素B₁₂-OP)经C18反相柱脱盐。

所述的C18反相柱脱盐采用乙腈溶液进行洗脱。

所述的脱盐的优选通过如下步骤实现：

(I)将维生素B₁₂-OP溶解在含TFA(三氟乙酸)的乙腈水溶液中，得到维生素B₁₂-OP溶液；

(II)采用C18反相柱进行梯度洗脱：先用含0.1％(v/v)TFA的20％(v/v) 乙腈水溶液平衡反相柱，然后用20％(v/v)的乙腈溶液(未含TFA)脱盐，再用 50％(v/v)的乙腈溶液(未含TFA)洗脱维生素B₁₂-OP，收集在此梯度下的红色洗脱产物；

(III)将步骤(ii)得到的红色洗脱产物浓缩、冷冻、干燥，得到脱盐后的维生素B₁₂-OP。

步骤(I)中所述的维生素B₁₂-OP溶液的浓度优选为2mg/ml。

步骤(II)中所述的平衡的时间优选为12min。

步骤(II)中所述的脱盐的流速优选为10ml/min。

步骤(II)中所述的脱盐的时间优选为12min。

步骤(II)中所述的洗脱维生素B₁₂-OP的程度为洗脱至无红色溶液为止。

步骤(III)中所述的浓缩优选为45℃条件下真空旋转蒸发进行浓缩。

步骤(III)中所述的干燥优选为置于冷冻干燥机中进行干燥。

步骤(III)中所述的干燥的时间优选为48h。

所述的脱盐还包括洗脱结束后，用含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)乙腈溶液再生反相柱。

所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，还包括将脱盐产物(脱盐后的维生素B₁₂-OP)通过半制备高效液相色谱进一步纯化。

所述的纯化优选通过如下步骤实现：

(i)将脱盐后的维生素B₁₂-OP溶解在20％(v/v)的乙腈溶液，得到脱盐后的维生素B₁₂-OP溶液；

(ii)采用C18反相柱的半制备柱进行梯度洗脱，收集洗脱产物、冷冻、干燥，得到纯化后的维生素B₁₂-OP。

步骤(i)中所述的脱盐后的维生素B₁₂-OP溶液的浓度优选为10mg/ml。

步骤(ii)中所述的洗脱的速度优选为3ml/min。

步骤(ii)中所述的干燥的时间优选为48h。

步骤(2)中所述的维生素B₁₂-羰基-腐胺(维生素B₁₂-OD)优选通过如下方法制备得到：

(a)将维生素B₁₂溶解于DMSO(二甲基亚砜)中，加入8倍摩尔量的CDT，超声水浴反应，再加入乙酸乙酯中止反应，离心，弃上清，得到酯基咪唑中间产物；

(b)将步骤(1)得到的酯基咪唑中间产物溶解于DMSO中，加入DIEA(N,N- 二异丙基乙胺)和腐胺，超声水浴反应，加入乙酸乙酯中止反应，离心，弃上清，取沉淀，干燥，得到维生素B₁₂-OD。

步骤(a)中所述的乙酸乙酯的用量优选为相当于该步骤中DMSO的4倍体积量。

步骤(a)中所述的超声水浴反应的条件为：30～33℃、70w超声反应30min。

步骤(a)中和步骤(b)所述的离心的条件为：8000r/min离心5min。

步骤(b)中所述的乙酸乙酯的用量优选为相当于该步骤中DMSO的4倍体积量。

步骤(b)中所述的超声水浴反应的条件为：30～33℃、70w超声反应2h。

步骤(b)中所述的干燥为使用氮吹仪进行干燥。

步骤(b)中所述的维生素B₁₂-OD还可以进一步经硅胶柱层析纯化。

所述的纯化的步骤优选为：将维生素B₁₂-OD溶解在预制洗脱液中，得到维生素B₁₂-OD溶液，上样到硅胶柱，洗脱，得到纯化后的维生素B₁₂-OD。

所述的硅胶的颗粒大小为5μm-10μm。

所述的预制洗脱液为正丁醇、异丙醇和去离子水按体积比45:30:25配比混合得到。

所述的维生素B₁₂-OD溶液的浓度为15mg/ml。

所述的洗脱的洗脱液是氨水与预制洗脱液按体积比2:98配比得到。

所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物在药物载体领域中的应用。

所述的药物优选为多肽类药物和/或蛋白类药物，更优选为胰高血糖素样肽及其衍生物，如6-KTP。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、生物药物不必进行任何修饰，就可利用维生素B₁₂的吸收途径进入门脉循环，保持药物的活力。

2、每分子维生素B₁₂衍生物可以携带多个药物分子通过主动运输的方式穿过肠粘膜进入门脉循环，保证给药药剂量达到的治理效果。

3、维生素B₁₂衍生物结合IF保护纳米微粒不被降解，并与纳米微粒共同抵抗肠胃蛋白酶对生物药物的降解作用。

4、进入门脉循环的苯丙氨酸二肽纳米微粒可缓慢被血液蛋白酶降解，释放药物。

5、维生素B₁₂、苯丙氨酸二肽都是生物分子，药物载体的副作用非常低，是药物的友好载体。

6、通过肠胃吸收活性分子，如治疗糖尿病的肠促胰岛素类药物，以生理方式发挥药效。

附图说明

图1是维生素B₁₂-羰基-腐胺-苯丙氨酸二肽-Boc(VB₁₂-OP)的合成途径流程图。

图2是维生素B₁₂-羰基-腐胺的质谱图。

图3是使用HBTU作为耦合剂合成VB₁₂-OP的HPLC分析图谱图。

图4是使用HATU作为耦合剂合成VB₁₂-OP的HPLC分析图谱图。

图5是使用DIC作为耦合剂合成VB₁₂-OP的HPLC分析图谱图。

图6是维生素B₁₂-OP合成产物脱盐前后在361nm条件下的吸收图谱图，其中：A为脱盐前的吸收图谱图；B为脱盐后的吸收图谱图。

图7是用HPLC纯化制备得到的维生素B₁₂-OP的质谱检测结果图谱图。

图8是纯化制备得到的维生素B₁₂-OP进行HPLC纯度分析的谱图。

图9是维生素B₁₂介导的纳米粒子载药后的粒径分布图。

图10是维生素B₁₂介导的纳米粒子载药后的场发射电子显微镜图。

图11是维生素B₁₂介导的纳米粒子载药后超滤的滤液HPLC分析图谱图。

图12是不同时间点药物在Caco-2细胞单层膜上的表观渗透系数(Papp)结果图。

图13是不同时间点药物在小鼠血液中的浓度曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1维生素B₁₂-OP的合成与纯化制备(流程如图1所示)

(1)维生素B₁₂-羰基-腐胺(维生素B₁₂-OD)的合成

取0.2mg维生素B₁₂溶解于5ml DMSO(二甲基亚砜)中，投入相当于维生素B₁₂ 8倍摩尔量的CDT。CDT与维生素B₁₂在超声水浴中反应，超声功率为70w，水浴温度保持在30℃至33℃之间，反应半小时，得到酯基咪唑中间产物，接着加入4倍体积的乙酸乙酯中止反应。将反应液转至离心管中，8000r/min离心5min，去上清后，再加入5ml DMSO溶解离心沉淀物，迅速加入300μl DIEA(N,N-二异丙基乙胺)及600μl腐胺。超声水浴辅助反应，超声功率为70w，水浴温度保持在30℃至33℃之间，反应2h后加入4倍体积的乙酸乙酯中止反应，8000r/min 离心5min，去上清。使用氮吹仪吹干沉淀物，得到维生素B₁₂-OD的合成样品。

(2)维生素B₁₂-羰基-腐胺合成产物的硅胶柱层析纯化

使用硅胶柱层析(硅胶购自烟台化学工业研究所，硅胶颗粒5μm-10μm，柱径高为1cm×5cm)纯化制备上述反应样品，样品溶解在预制洗脱液中(45％(v/v) 正丁醇、30％(v/v)异丙醇、25％(v/v)去离子水)，浓度为15mg/ml。每次上样1ml，在预制洗脱液中加入2％(v/v)的氨水洗脱反应产物，得到维生素B₁₂- 羰基-腐胺。通过薄层色谱(TLC)检测，维生素B12-羰基-腐胺洗脱产物对应的灰度值比占约为95％。纯化产物质谱图，质荷比为1469.39[H+]，与维生素B12- 羰基-腐胺分子量相对应，如图2所示。

(3)维生素B₁₂-羰基-腐胺-苯丙氨酸二肽-Boc(维生素B₁₂-OP)的合成

实验采用的磷酸鎓盐类耦合剂或碳二亚胺类耦合剂分别活化耦合 Boc-Phe-Phe-OH的羧基，生成活泼的中间产物，然后再加入维生素B₁₂-羰基-腐胺，生成更为稳定维生素B₁₂-羰基-腐胺-苯丙氨酸二肽-Boc：

(I)鎓盐类的缩合剂法：使用HATU(2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)或HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)活化 Boc-Phe-Phe-OH的羧基，生成活泼的酰胺类中间产物，然后再加入维生素B₁₂-OD，生成更为稳定维生素B₁₂-OP。维生素B₁₂-OP的合成包括羧基的活化和酰胺的生成两个步骤，具体如下：用5ml注射器取2.0mlDMF(二甲基甲酰胺)溶液至青霉素瓶内，先加入0.034mol HATU或HBTU、0.034mol DIEA(N,N-二异丙基乙胺)及0.025mol Boc-苯丙氨酸二肽(Boc‐Phe‐Phe‐OH，供货公司是BACHEM)，盖上瓶盖后，30℃、70w超声5min。超声结束后，取0.017mol维生素B₁₂-OD加入青霉素瓶内，混匀后30℃、70w超声震荡反应2h。反应结束后，将反应体系转入10ml离心管中，加入乙酸乙酯5ml，8000r/min，离心5min。去除上清液，沉淀抽真空干燥，得到维生素B₁₂-OP。其中，使用HBTU作为耦合剂合成VB₁₂-OP 的HPLC分析图谱如图3所示；使用HATU作为耦合剂合成VB₁₂-OP的HPLC分析图谱如图4所示，从图中可以看出，使用HATU或HBTU为耦合剂时，VB12-OP 的合成效果较好，且HATU的效果要高于HBTU。

(II)碳化二亚胺类化合物(碳二亚胺类耦合剂)化学合成方法：用5mL注射器取2.0mL DMF溶液至青霉素瓶内，依次加入0.025mol DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、0.025molHOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)和0.025mol Boc-苯丙氨酸二肽，盖上瓶盖后，超声30min(70W，30℃)。超声结束后，取0.017mol维生素B₁₂-羰基-腐胺加入青霉素瓶内，混匀后超声水浴反应2h(70W，30℃)。加入乙酸乙酯8mL终止反应，并将反应体系转入离心管中，在8000r/min的转速下，离心5min。去除上清液，沉淀冷冻干燥，得到目的产物维生素B₁₂-OP。其中，用DIC作为耦合剂合成VB₁₂-OP的HPLC分析图谱如图5所示，使用DIC 为耦合剂时，能达到较好的合成效果。

(4)维生素B₁₂-OP的反向脱盐

使用径高比为2.5cm×15cm的C18反相柱，填料为硅胶基，粒径大小为 30-60μm(

键合相快速分离柱，三泰科技有限公司)。将维生素B₁₂-OP 合成产物溶解在体积百分比20％的乙腈水溶液中，溶液配制时，在水中加0.1％ (v/v)的TFA(三氟乙酸)，使维生素B₁₂-OP样品溶液浓度为2mg/ml。脱盐过程中，流速恒定为10ml/min，使用含0.1％TFA的20％乙腈溶液平衡反相柱，平衡12min后开始上样。上样结束后，换用20％(v/v)的乙腈溶液(未含TFA) 洗脱盐分，洗脱12min后，换用50％(v/v)的乙腈溶液(未含TFA)洗脱维生素B₁₂-OP，收集在此梯度下的红色洗脱产物，洗脱至无红色溶液为止。洗脱结束后，换用含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)乙腈溶液再生反相柱。收集的洗脱产物，在45℃条件下真空旋转蒸发，将浓缩液冷冻后，置于冷冻干燥机中48h，得到脱盐产物。维生素B₁₂-OP合成产物在脱盐前后的HPLC分析图谱如图6所示，A、B分别为产物脱盐前后在361nm对应的吸收图谱。由A、B图可知，脱盐后保留时间为2.20min，10.04min，13.99min的峰明显减小或消失，说明上述脱盐过程较好的去除了过多的HATU及其反应产物。

(5)维生素B₁₂-OP的纯化制备

将上述脱盐样品旋蒸冻干后，重新溶解在20％(v/v)的乙腈溶液，浓度为 10mg/ml，通过半制备高效液相色谱制备高纯的维生素B₁₂-OP。使用C18反相柱的半制备柱，径高比为9.4mm×250mm，粒径5μm，孔径110A(Agilent，ZORBAX Eclipse XDB–C18)，洗脱梯度如表1所示，洗脱速度为3ml/min。样品体积为 300μL，温度为室温，洗脱收集保留时间为25.5min的目的峰，将收集的样品冷冻干燥48h，得到维生素B₁₂-OP冻干粉。经HPLC纯化后的维生素B₁₂-OP的质谱检测结果如图7所示，出现VB₁₂-OP对应的质荷比1885[H+]。收集样品的HPLC纯度分析结果如图8所示，纯化产物含量在99％以上。

表1维生素B₁₂-OP合成产物的HPLC半制备的洗脱梯度

在¹³C检测中，比较了维生素B₁₂修饰部分C原子化学位移的理论计算值和实际计算值，二者基本上可以对应，因此判断合成的维生素B₁₂-OP与预期设计的结构一致，其结构式如式I所示。

实施例2维生素B₁₂-OP的自组装及其多肽药物的包埋

以配制1ml纳米体系包埋胰高血糖素样肽衍生物6-KTP(王从峰，邹信，冉艳红等.基因重组GLP-1衍生物(6KTP)发酵、纯化及鉴定[EB/OL].北京：中国科技论文在线[2012-05-14].)为例：

(1)在EP管中加入200μl体积分数为50％的乙醇和50μl浓度为20mg/ml 的6-KTP/六氟异丙醇溶液，上下轻轻颠倒混匀；

(2)取浓度为100mg/ml的Boc-FF(Boc-Phe-Phe-OH，BACHEM)/六氟异丙醇溶液40μl，浓度为1mg/ml的VB₁₂-OP(实施例1制备得到的VB₁₂-OP) /六氟异丙醇溶液10μl，混匀，加入步骤(1)的EP管中，上下轻轻颠倒混匀；

(3)将EP管中的300μl混合液取出，滴加入装有690μl去离子水的另一 EP管中，上下轻轻颠倒混匀；

(4)此时加入10μl PEG200，上下轻轻颠倒混匀，使纳米体系中PEG200 的终体积分数为1％，乙醇的终体积分数为10％；

(5)将纳米溶液置于冷冻干燥机中干燥24h，除去有机溶剂，加水复溶重悬，得到无有机相的纳米溶液。

采用马尔文激光纳米粒度仪对1ml纳米体系进行扫描，选择分散物为蛋白质，分散介质为水。纳米粒子在激光纳米粒度仪上的扫描结果如图9所示，纳米粒径主要分布在100～400nm之间，平均粒径为200nm。用场发射扫描电子显微镜(FESEM)对纳米粒子结构的形态进行表征如图10所示，纳米粒子呈球状，分布比较均匀，无其它杂质，纳米粒径和激光纳米粒度仪扫描的结果基本相一致。场发射扫描电子显微镜和激光纳米粒度仪扫描证明了所制备纳米粒子自组装成了球状。

实施例3纳米粒子对多肽药物的包封率和载药量

采用30KD滤膜的超滤离心管过滤载药的纳米溶液(实施例2制备得到的纳米溶液)，游离的6-KTP不能被滤膜截留从而从溶液中离心到滤液中，吸附或包埋在纳米载体上的6-KTP则会被滤膜截留。再用高效液相色谱法测定滤液中6-KTP的含量。

纳米粒子的包封率EE％＝[(W1-W2)/W1]*100％；

纳米粒子的载药量DL％＝[(W1-W2)/W]*100％；

其中W1：6-KTP的总量，W2：未包裹在纳米载体内的6-KTP含量，

W：包裹6-KTP的纳米粒重量。

色谱柱：300Extend-C18分析柱(规格：4.6mm×250mm,5μm)

流动相：乙腈和水梯度洗脱，TFA调pH(乙腈和水中添加0.1％(v/v) 的TFA)

检测波长：214nm

流速：1.0ml/min

柱温：室温

进样量：20μl

表2纳米粒子超滤滤液的HPLC分析的洗脱梯度

经液相分析，保留时间在20.7min的峰的物质为6-KTP，25.3min的峰的物质为Boc-FF，从图11可以得知6-KTP的峰面积，代入6-KTP的峰面积对浓度的回归标准曲线方程y＝16114x-35.407(配制浓度为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml， 200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml的6-KTP溶液，用HPLC分析，根据峰面积与浓度的关系建立6-KTP的标准曲线)，可以计算得到本实验制备得到的纳米颗粒的包封率EE％＝96.96±0.42％，载药量DL％＝24.25±0.1％。说明本实验制备得到的纳米颗粒有较高的包封率和较好的载药量，能都达到纳米药物的要求。

实施例4维生素B₁₂介导的纳米微粒的体外实验

本实验采用结肠癌上皮细胞Caco-2(美国ATCC细胞库)作为体外实验模型。Caco-2细胞以1×10⁵个/ml的浓度种植在24孔的Transwell板上，每孔0.4ml，连续培养21天使其形成融合的单层膜。Caco-2培养形成单层膜后，用HBSS 洗膜两次，上层分别加入6-KTP、维生素B₁₂介导的纳米微粒(FOK Nanoparticles、FOK Nano，为实施例2制备得到的粒子)、维生素B₁₂介导的纳米微粒与内因子(FOK Nanoparticles+IF、FOK Nano+IF，内因子IF货号为ab101419购自abcam)三组各400μl，下层加入400μl HBSS液，3个复孔；其中维生素B₁₂介导的纳米微粒与内因子提前室温共孵育0.5h。三组中6-KTP的浓度都为1mg/ml。将Transwell板放置于37℃恒温培养箱上分别于0.5h，1h， 1.5h，2h，3h，4h后取接受池(下层)液体200μl样品置EP管(共54个样) 内待测。每次取样后加回空白200μl HBSS液。

样品中药物的量用高效液相进行分析，分析方法与实例2相同。表观渗透系数(Papp)可以用于评估药物的转运吸收能力。Papp＝(dQ/dt)/(AC0)，其中dQ/dt 为单位时间药物转运量(mg/s)；A为转运膜的面积，此时A为0.3cm²。C0为药物的初始浓度(mg/ml)。Papp>2*10^-6cm/s属于吸收好的药物，而Papp<10^-6cm/s 属于吸收差的药物。其结果如图12所示，从图中可以看出，添加IF的FOK纳米粒子在1.5h后Papp值开始逐渐高于FOK纳米粒子，说明IF和纳米粒子表面的VB₁₂结合后，有助于其在Caco-2细胞单层膜上的吸收和转运。而未经纳米载体包埋的6-KTP基本不能在Caco-2细胞单层膜上吸收和转运。此实施例可以说明经维生素B₁₂介导的纳米粒子可以明显提高其在细胞上的吸收和转运。

实施例5维生素B₁₂介导的纳米微粒的体内实验

本实例中，选用7～8周龄的雄性昆明小鼠为模型小鼠，小鼠购于南方医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2011-0015。实验小鼠分为4组，分别为溶媒PBS组，6-KTP溶液组，未添加维生素B₁₂-OP的纳米粒子(FK Nano) 组(其制备方法同实施例2，区别在于不添加维生素B₁₂-OP)，添加维生素B₁₂-OP 参与组装的纳米粒子(FOK Nano)组(实施例2制备得到的纳米粒子)，采用灌胃的方式给药，按照平均体重0.2ml/10g的标准进行灌胃，其中药物6-KTP的浓度为2mg/ml。于不同时间点摘眼球取血，用EDTA-Na₂抗凝管收集小鼠血液，抗凝管提前加入15μL DPP-IV(二肽基肽酶IV)抑制剂(DPP4-010，Milipore 公司)，防止GLP-1被酶解。所取血样，即时4℃、2000g离心15min，取上清置于1.5mlEP管中，置-80℃冰箱保存，避免反复冻融。采用密理博公司的

GLP-1试剂盒检测小鼠血液，试剂盒货号为Cat.#EGLP-35K。

其结果如图13所示，从图中可以得知，多肽药物6-KTP直接口服不能被有效地吸收，未经维生素B₁₂介导的纳米粒子和经维生素B₁₂介导的纳米粒子在载药后，都在口服4h后达到血药浓度高峰，分别为50pM和180pM。对比未经维生素B₁₂介导的纳米粒子，经维生素B₁₂介导的纳米粒子进入血液释放的药物显著提高，在24h后仍能达到40～50pM的有效血药浓度，说明维生素B₁₂介导的纳米粒子具有一定的缓释作用。

对比例1纳米体系组装前加入PEG

(1)在EP管中加入200μl体积分数为50％的乙醇和50μl浓度为20mg/ml 的6-KTP/六氟异丙醇溶液，上下轻轻颠倒混匀；

(2)取浓度为100mg/ml的Boc-FF(Boc-Phe-Phe-OH，BACHEM)/六氟异丙醇溶液40μl，浓度为1mg/ml的VB12-OP(实施例1制备得到的VB12-OP) /六氟异丙醇溶液10μl，混匀，加入步骤(1)的EP管中，上下轻轻颠倒混匀；

(3)将EP管中的300μl混合液取出，滴加入装有700μl去离子水的另一 EP管中(含有10μlPEG200)，上下轻轻颠倒混匀；

(4)将纳米溶液置于冷冻干燥机中干燥24h，除去有机溶剂，加水复溶重悬，得到无有机相的纳米溶液。

采用马尔文激光纳米粒度仪对1ml纳米体系进行扫描，选择分散物为蛋白质，分散介质为水。纳米粒子在激光纳米粒度仪上的扫描结果显示，纳米粒径主要分布在800～1100nm之间，平均粒径为960nm，此纳米粒子不利于肠道吸收。

对比例2不同乙醇浓度对于纳米球粒径的影响

固定Boc-FF浓度为3mg/mL，VB12-OP浓度为5μg/mL，多肽浓度为1 mg/mL，改变乙醇浓度分别为10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)、40％(v/v)、 50％(v/v)、60％(v/v)，配制纳米溶液后采用激光纳米粒度仪测定Z-Average diameter。乙醇浓度为10％(v/v)时粒径基本集中在100-400nm之间；乙醇浓度为20％(v/v)时，纳米结构主要分布在两个区域，一个在50nm左右，一个在4μm 左右；乙醇浓度为30％(v/v)时，粒径较大，主要分布在2-5μm之间；乙醇浓度为40％(v/v)时粒径在1000nm以下较多，基本集中300-700nm之间；乙醇浓度为50％、60％(v/v)时较为相似，粒径范围集中在300-800nm之间。

在乙醇浓度的单因素试验中，从结果可以看出，乙醇浓度为10％(v/v)时纳米溶液的粒径最合适。

对比例3不同Boc-FF浓度对于纳米球粒径的影响

固定乙醇浓度为10％(v/v)，VB12-OP浓度为5μg/mL，多肽浓度为1mg/mL，改变Boc-FF浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6 mg/mL，配制纳米溶液后采用激光纳米粒度仪测定Z-Average diameter。随着 Boc-FF浓度的增加，纳米结构的Z均粒径先下降再升高。Boc-FF浓度为1mg/mL 时纳米结构平均粒径为4759nm；2mg/mL时纳米结构平均粒径为1334；3mg/mL 时纳米结构平均粒径为611nm；4mg/mL时纳米结构平均粒径为361nm；5mg/mL 时纳米结构平均粒径为1461；6mg/mL时纳米结构平均粒径为2199nm。

从结果中发现，3mg/mL、4mg/mL纳米溶液的粒径较小且分布也比较均匀，但当Boc-FF浓度较低，可能会使得单位体积内形成的纳米结构较少，可吸附或包埋蛋白药物的纳米数量也随之减少，所以选择4mg/mL的Boc-FF浓度作为最适浓度。

对比例4不同VB12-OP浓度对于纳米球粒径的影响

固定乙醇浓度为10％(v/v)，Boc-FF浓度为4mg/mL，多肽浓度为1mg/mL，改变VB12-OP浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、 80μg/mL，配制纳米溶液后采用激光纳米粒度仪测定Z-Average diameter。

不添加VB12-OP时，纳米Z均粒径明显较高，添加VB12-OP后，纳米Z 均粒径显著下降。在5-40μg/mL范围内，随着VB12-OP浓度的升高，纳米粒径增大，其中VB12-OP浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL时，平均粒径较小，均小于1μm。VB12-OP浓度为2.5μg/mL纳米结构粒径主要分布在三个区域，一个在30nm左右，一个在100nm左右，一个在200-800nm之间；5μg/mL时纳米结构粒径主要分布在200-500nm之间；10μg/mL时纳米结构粒径主要集中在200-500nm之间；20μg/mL时纳米结构粒径主要分布在两个区域，一个在 200-600nm之间，一个在2-6μm之间；40μg/mL时纳米结构粒径主要集中在1-4 μm之间；80μg/mL时纳米结构粒径主要分布在两块，一部分在100nm左右，一部分在200nm-1μm之间。当VB12-OP浓度为5μg/mL或10μg/mL时，纳米粒径最合适。

对比例5不同6-KTP浓度对于纳米球粒径的影响

固定乙醇浓度为10％(v/v)，Boc-FF浓度为4mg/mL，VB12-OP浓度为5 μg/mL，改变6-KTP浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、 1.25mg/mL、1.5mg/mL、1.75mg/mL、2mg/mL，配制纳米溶液后采用激光纳米粒度仪测定Z-Average diameter。

结果显示随着6-KTP浓度的增加，Z均粒径下降，当浓度增加到1.5mg/mL 时，Z均粒径又开始上升。6-KTP浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.25mg/mL 时纳米结构的粒径基本分布在1μm左右；6-KTP浓度分别为0.75mg/mL、1 mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL时纳米结构的粒径基本分布在300nm-800nm之间；6-KTP浓度为1.75mg/mL时纳米结构的粒径则集中1μm左右。从结果来看，6-KTP浓度为1mg/mL为最适条件。

实例中使用1，4-丁二胺作为连接子，Boc-苯丙氨酸二肽作为目的连接肽，使用其他直链二胺类化合物，以及苯丙氨酸二肽类化合物，并使用与本发明类似的理念和原理，视为等效置换，都包含在本发明的保护范围之内。使用维生素B₁₂-连接子-肽与其他苯丙氨酸二肽类化合物共同自主装形成纳米微粒，并进行口服载药的研究，未背离本发明的精神实质，也包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物，其特征在于化学结构式如式I所示：

（式I）。

2.权利要求1所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）酰胺类中间产物的制备：

①将磷酸鎓盐类耦合剂、DMF、DIEA和Boc-苯丙氨酸二肽混合，超声水浴反应，得到酰胺类中间产物X₁；

②将DMF、碳二亚胺类耦合剂、HOAT和Boc-苯丙氨酸二肽混合，超声水浴反应，得到酰胺类中间产物X₂；

（2）维生素B₁₂-OP的制备：

往步骤（1）①得到的酰胺类中间产物X₁或步骤（1）②得到的酰胺类中间产物X₂中加入维生素B₁₂-OD，超声水浴反应，再加入乙酸乙酯终止反应，离心、弃上清、取沉淀、干燥，得到维生素B₁₂-OP；接着用C18反相柱脱盐；

其中，参与反应的各原料按如下摩尔比配比：

通过酰胺类中间产物X₁得到维生素B₁₂-羰基-腐胺时，维生素B₁₂-羰基-腐胺：磷酸鎓盐类耦合剂：Boc-苯丙氨酸二肽：DIEA=1：1～4：0.75～3：0.5～2；

通过酰胺类中间产物X₂得到维生素B₁₂-羰基-腐胺时，碳二亚胺类耦合剂：HOAT：Boc-苯丙氨酸二肽：维生素B₁₂-羰基-腐胺=0.75～3：0.75～3：0.75～3：1。

3.根据权利要求2所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于：

所述的参与反应的各原料按如下摩尔比配比：

维生素B₁₂-羰基-腐胺：磷酸鎓盐类耦合剂：Boc-苯丙氨酸二肽： DIEA=17:34:25: 34；

碳二亚胺类耦合剂：HOAT：Boc-苯丙氨酸二肽：维生素B₁₂-羰基-腐胺=25:25:25:17。

4.根据权利要求2所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于：

步骤（1）①中所述的磷酸鎓盐类耦合剂为HATU或HBTU；

步骤（1）②中所述的碳化二亚胺类耦合剂为DIC；

步骤（1）①和②中所述的超声水浴反应I的条件为：30℃、70w超声反应5min；

步骤（2）中所述的超声水浴反应II的条件为：30℃、70w超声反应2h；

步骤（2）中所述的乙酸乙酯的用量为按乙酸乙酯与DMF的体积比为2～8：1配比计算；

步骤（2）中所述的离心的条件为：8000 r/min离心5min。

5.根据权利要求2所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于：所述的脱盐通过如下步骤实现：

(I)将维生素B₁₂-OP溶解在含TFA的乙腈水溶液中，得到维生素B₁₂-OP溶液；

(II)采用C18反相柱进行梯度洗脱：先用含0.1%（v/v）TFA的20%（v/v）乙腈水溶液平衡反相柱，然后用20%（v/v）的乙腈溶液脱盐，再用50%（v/v）的乙腈溶液洗脱维生素B₁₂-OP，收集在此梯度下的红色洗脱产物；

(III)将步骤(ii)得到的红色洗脱产物浓缩、冷冻、干燥，得到脱盐后的维生素B₁₂-OP。

6.根据权利要求2所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于：还包括将脱盐产物通过半制备高效液相色谱进一步纯化的步骤。

7.根据权利要求6所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物的制备方法，其特征在于：所述的纯化通过如下步骤实现：

(i)将脱盐后的维生素B₁₂-OP溶解在20%（v/v）的乙腈溶液，得到脱盐后的维生素B₁₂-OP溶液；

(ii)采用C18反相柱的半制备柱进行梯度洗脱，收集洗脱产物、冷冻、干燥，得到纯化后的维生素B₁₂-OP。

8.权利要求1所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物在药物载体领域中的应用。

9.根据权利要求8所述的可自主装形成纳米微粒的维生素B₁₂衍生物在药物载体领域中的应用，其特征在于：所述的药物为多肽类药物和/或蛋白类药物。

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