CN109771661B - 一种奥西替尼脑靶向递药系统及其抗肺癌脑转移瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奥西替尼脑靶向递药系统及其抗肺癌脑转移瘤应用，该靶向递药系统由骨架材料包载奥西替尼形成的载药纳米粒及插入载药纳米粒表面的靶向配体T7肽构成；其中，以胞内还原响应的阿霉素前药为骨架材料，阿霉素前药主要由二硫代二甘醇酸、阿霉素和十八醇反应得到。将本发明的递药系统用于抗肺癌脑转移瘤中，延长药物在体内的循环时间，增加药物在肺癌脑转移瘤部位的蓄积，提高抗肺癌脑转移瘤疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗增效目的。

Description

一种奥西替尼脑靶向递药系统及其抗肺癌脑转移瘤应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种奥西替尼脑靶向递药系统，具体涉及一种脑靶向多肽修饰的阿霉素前药纳米粒荷载奥西替尼组成的肺癌脑转移瘤靶向纳米递释系统及其制备方法。

背景技术

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85％。多数的NSCLC患者诊断时已错过最佳手术治疗时机，5年的生存率仅为15.6％，约2/3的患者就诊时肿瘤已发生区域或远处转移。尽管对症治疗，如甘露醇等脱水药物的应用、全脑放射治疗(WBRT)等抗肿瘤治疗方案给非小细胞肺癌患者带来了一定程度上的收益，但对于非小细胞肺癌脑部转移瘤的治疗依旧棘手，存在预后不理想、化疗管理临床疗效低的问题。而靶向药物治疗相较全身化疗更显著的延长了这类患者的生存期，提高了这些患者的生存质量。奥希替尼(AZD9291)为第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，是一种突变选择性不可逆EGFR抑制剂，对EGFR-TKI敏感性突变及T790M抗药性突变均有效。有临床实验显示，经一线EGFR-TKI治疗耐药且伴有T790M突变的非小细胞肺癌(NSCLC)，使用AZD9291的治疗组PFS明显长于铂类联合培美曲塞治疗组。所以，AZD9291是目前克服第一代和第二代EGFR-TKI耐药的明星小分子靶向药物，对NSCLC治疗具有巨大的应用潜力。然而，对于NSCLC脑转移的患者，AZD9291的临床治疗获益大打折扣。主要是由于AZD9291分子结构为P-糖蛋白(P-gP)与乳腺癌相关蛋白(BCRP)的底物，所以在向脑转移病灶递送药物时，由于血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的存在，使得AZD9291进入颅内的能力有限，从而使得其抗NSCLC脑转移效果下降。

研究表明，BBB的存在对于维持脑内环境的稳定有着重要的作用。它是由紧密连接的毛细血管内皮细胞、基底膜以及嵌入其中的周细胞、外围的星形胶质细胞共同组成的一种屏障结构，这种屏障结构阻碍了包括98％的小分子药物和100％的大分子药物进入脑组织。尽管在脑部肿瘤的发生发展过程中，对BBB的完整性具有一定的破坏作用，导致BBB渗透性有一定的增加。但是，这种渗透性增加仍不能满足脑部肿瘤治疗药物的脑内递送要求。一些内源性的配体可通过结合特定受体，利用受体介导的转运过程，跨过血脑屏障，到达脑内。所以，通过受体介导转运的药物递送系统为脑部肿瘤治疗提供了一条颇具潜力的途径。例如，转铁蛋白受体(TfR)介导的脑靶向已经成为脑部肿瘤药物递送的重要策略之一。

发明内容

本发明目的是，鉴于上述奥西替尼制剂药物递送存在的缺陷，提供一种转铁蛋白受体介导的具有谷胱甘肽(GSH)胞内微环境响应的靶向纳米递药系统及其制备方法，本发明利用奥希替尼结构中的苯环及杂环与DOX-SS-C18结构中的蒽环形成牢固的π-π作用力，使其牢固包封在DOX-SS-C18形成纳米粒中，大大提高了奥希替尼的载药量，同时奥希替尼也提高DOX-SS-C18自组装纳米粒的稳定性。将本发明的递药系统用于抗肺癌脑转移瘤中，延长药物在体内的循环时间，增加药物在肺癌脑转移瘤部位的蓄积，提高抗肺癌脑转移瘤疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗增效目的。

本发明另一目的在于，通过载体材料的方式，将化疗药物阿霉素(DOX)与奥希替尼同时递送向NSCLC脑转移瘤灶，达到化疗与小分子靶向药物协同治疗NSCLC脑转移治疗的目的。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种奥西替尼脑靶向递药系统，该靶向递药系统由骨架材料包载奥西替尼(AZD9291)形成的载药纳米粒及插入载药纳米粒表面的靶向配体T7肽构成；其中，以胞内还原响应的阿霉素前药(DOX-SS-C18)为骨架材料，阿霉素前药主要由二硫代二甘醇酸、阿霉素和十八醇反应得到。

本发明采用T7肽作为靶向头基，DOX-SS-C18为骨架材料包裹奥希替尼自组装形成前药纳米粒，二者混合，制成肺癌脑转移瘤靶向纳米递释系统。

上述奥西替尼(AZD9291)与阿霉素前药(DOX-SS-C18)骨架材料的质量比为1:2～10。

上述靶向配体T7肽和奥西替尼载药纳米粒的质量比为1:5～10。

上述骨架材料是通过以下方法制备得到的：二硫代二甘醇酸与醋酸酐在氮气保护下反应得到2,2-二硫代二甘醇酸酐，再在催化剂作用下与十八醇反应得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯，再进一步与阿霉素反应得到阿霉素前药。

上述二硫代二甘醇酸与醋酸酐的摩尔比为40～30:1；上述二硫代二甘醇酸与十八醇的质量比为2:3；上述阿霉素与十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯的质量比为5:4。

所述的T7肽的氨基酸序列为CHAIYPRH。

上述奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，制备步骤为：

(1)靶向配体T7肽的制备：将T7肽与马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE)通过共价结合连接，得到T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE)；所述的马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺与T7肽的摩尔比为1:1～10；在合成配体T7肽时，利用活泼的Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE与T7肽片段上半胱氨酸残基上的巯基反应，得到T7-PEG₂₀₀₀-DSPE。

(2)阿霉素前药(DOX-SS-C18)的制备：二硫代二甘醇酸与醋酸酐在氮气保护下反应得到2,2-二硫代二甘醇酸酐，再在催化剂作用下与十八醇反应得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯，再进一步与阿霉素反应得到阿霉素前药；所述的二硫代二甘醇酸与醋酸酐的摩尔比为40～30:1；所述的二硫代二甘醇酸与十八醇的质量比为2:3；所述的阿霉素与十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯的质量比为5:4；

(3)靶向递药系统的制备：用阿霉素前药(DOX-SS-C18)包载奥西替尼(AZD9291)形成载药纳米粒；将T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(T7-PEG-DSPE)与前述载药纳米粒按比例混合，制备成靶向递药系统(T7-DSNPs/9291)；所述的奥西替尼(AZD9291)与阿霉素前药(DOX-SS-C18)的质量比为1:2～10；所述的T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE)与载药纳米粒的质量比为1:5～10。

所述的步骤(1)中T7肽与马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE)通过共价结合连接的方法包括以下步骤：将T7肽溶于磷酸盐缓冲溶液中；取马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中；将上述两种溶液混合后，在氮气保护下磁力搅拌反应，待反应完全后，通过透析法除去多余的T7肽和二甲基甲酰胺(DMF)，冷冻干燥，得到T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE)。

所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.4。

所述的马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺与T7肽的摩尔比为1:1～10。

所述的氮气保护下磁力搅拌反应的反应时间为8～16小时。

所述的步骤(2)中阿霉素前药的制备具体包括以下步骤：在二硫代二甘醇酸中加入醋酸酐，氮气保护反应，35℃油泵减压浓缩除去多余的醋酸酐，再加入甲苯5mL，水泵浓缩至干，得2,2’-二硫代二甘醇酸酐；将其用有机溶剂溶解后加入十八醇和催化剂，室温下电磁搅拌，反应液分别用1％醋酸和纯水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯；称取阿霉素溶于有机溶剂中，冰水浴条件下电磁搅拌，加入十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯，分批加入HBTU、再加入三乙胺，室温反应；反应液用1％醋酸洗涤两遍，再用NaCl溶液、纯水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化,得阿霉素前药。

所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶。所述的有机溶剂为二氯甲烷。

所述的硅胶柱层析纯化步骤中，所用洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯混合物，所述的石油醚：乙酸乙酯为2：1。

所述的柱层析纯化中，所用洗涤剂为二氯甲烷和甲醇，所述的二氯甲烷：甲醇为45：1。

所述的步骤(3)中靶向递药系统的制备具体包括以下步骤：将阿霉素前药(DOX-SS-C18)与奥西替尼(AZD9291)分别溶解于四氢呋喃和甲醇中，混合均匀后室温下滴加到去离子水中，搅拌成型后，旋转蒸发除去有机溶剂，过滤后加入T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE)水溶液，搅拌，即得靶向递药系统。

所述的过滤为微孔滤膜过滤。

所述的奥西替尼脑靶向递药系统在制备抗非小细胞肺癌脑转移的药物中的应用具有显著的效果。

在本发明中，T7肽(氨基酸序列为CHAIYPRH)是由噬菌体展示技术筛选出来的与TfR具有高度亲和力的多肽。研究显示，T7可以识别BBB细胞表面的TfR，通过TfR介导内吞可增加纳米粒的BBB渗透能力。因此，以T7肽作为肺癌脑转移瘤靶向递药系统的靶向功能多肽，具有非常大的应用潜力。

当载体系统携带奥希替尼进入非小细胞肺癌脑转移灶肿瘤细胞内后，需要快速释放药物，保证奥希替尼发挥作用。所以，构建肿瘤细胞内刺激响应的载体系统，是奥希替尼递送载体的必然要求。研究显示，胞内的还原性谷胱甘肽(GSH)是胞外的1000倍，成为一个重要的控制药物胞内智能释放的“开关分子”。二硫键(-S-S-)是最常用于构建胞内GSH响应释药的功能化学键。

因此，本发明采用阿霉素前药分子(DOX-S-S-C18)为载体材料，通过二硫键两侧的分子自由旋转，在溶液中不需要表面活性剂的条件下即可以包载脂奥希替尼药物形成载药纳米粒。该载药纳米粒在低GSH浓度下，保持完整的球形结构，而在高浓度的GSH条件下，二硫键被还原断裂，纳米粒的结构解聚，释放出包裹的奥希替尼药物。

对本发明制备的用于治疗脑部肿瘤的靶向纳米递药系统进行了体内外评价：

对本发明制备的T7修饰的阿霉素DOX-SS-C18奥西替尼靶向递药系统进行了细胞毒性实验、细胞摄取实验、体内靶向性研究，结果表明，经T7修饰后，显著增加了奥西替尼血脑屏障跨膜转运能力，在减小对脑毛细血管内皮细胞(BCEC)细胞毒性的同时保留了奥希替尼对肺癌细胞的毒性，并且体内靶向性研究结果证明提高了纳米递药系统在肺癌脑转移瘤部位的蓄积，达到预期目的。将奥希替尼制备成肿瘤主动靶向递药系统后，不仅能大大提高奥希替尼溶解性，减少毒副作用，还可以增加奥希替尼对肿瘤部位的选择性，明显提高奥希替尼抗肿瘤效果。采用T7肽功能化的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺为靶向配体，以及对谷胱甘肽还原响应敏感的DOX-SS-C18为骨架材料，分子量合适且承载功能强，对肺癌脑转移瘤靶向治疗的效果好，能提高穿透血脑屏障，提高抗肿瘤药物肺癌脑转移瘤部位的摄取与蓄积，实现药物跨过血脑屏障和肿瘤屏障向脑内的递释，提高肺癌脑转移瘤治疗效果。

1)细胞毒性实验

采用MTT法测定奥希替尼和包载奥希替尼的各种递药系统的纳米粒对脑毛细血管内皮细胞(BCEC)和人肺癌细胞(PC-9)细胞的体外抑制情况，T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统显著减小了奥希替尼对普通细胞的毒性同时保留奥希替尼对PC-9的细胞毒作用。

2)细胞摄取

纳米粒通过包载荧光物质香豆素-6考察递药系统的BCEC细胞定量摄取情况，荧光染料香豆素-6浓度为1、2、5和10μg/mL时，T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统的纳米粒组摄取量明显强于普通纳米粒组，说明T7肽修饰增加了BCEC细胞对纳米粒的摄取。

3)体内靶向性评价

肺癌脑转移瘤模型小鼠分别尾静脉注射300μg/mL DOX的普通纳米粒和T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统的纳米粒组，24h后的脑组织切片荧光结果显示，T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统的纳米粒组在脑部肿瘤部位的荧光强度明显强于普通纳米粒组，该结果表明T7修饰后能增加递药系统穿透血脑屏障及在肺癌脑转移瘤部位的蓄积。

4)体内抗瘤评价

肺癌脑转移瘤模型小鼠分别尾静脉注射游离DOX+AZD9291，T7修饰的DOX纳米粒组，载奥希替尼的纳米粒组以及T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统的纳米粒组，观察各组抗肺癌脑转移效果。结果显示，所有组中，T7肽修饰的奥西替尼靶向递药系统的纳米粒组抑瘤效果最好，中位生存时间最长。

本发明的有益效果：

1、本发明通过转铁蛋白受体介导的脑靶向递药系统，可以显著提高奥希替尼药物向脑内的递送，从而提高非小细胞肺癌脑转移瘤治疗的效果。

2、本发明以阿霉素前药(DOX-SS-C18)为载体材料，既实现了化疗药物与小分子靶向药物联合治疗非小细胞肺癌脑转移瘤的方案，又节省了传统药物载体所需的大量辅料。

3、本发明的递药系统利用奥希替尼结构中的苯环及杂环与DOX-SS-C18结构中的蒽环形成牢固的π-π作用力，使其牢固包封在DOX-SS-C18形成递药系统中，与现有聚合物骨架材料(如聚乳酸)构建的纳米载体载药量仅为3-5％左右相比，该递药系统载药量高达30.3％，因此，本发明以DOX-SS-C18结构作为奥希替尼载药的骨架材料，不仅大大提高了奥希替尼的载药量，同时奥希替尼也提高DOX-SS-C18自组装纳米粒的稳定性。

4、本发明主要以二硫代二甘醇酸、阿霉素和十八醇合成的DOX-SS-C18骨架材料，相比于传统的骨架材料制备奥希替尼递药系统需要大量表面活性剂，本发明在不需要任何表面活性剂的条件下，通过二硫键两侧的分子自由旋转即可包载奥希替尼药物形成递药系统，并且本发明的递药系统具有胞内还原响应性，达到肿瘤细胞后，能够快速激发骨架断裂，释放出奥希替尼。相比其他具有双硫结构的材料，本发明中所用的阿霉素不仅作为简单的化疗药物和骨架材料，还利用了其结构中的蒽环与奥希替尼苯环及杂环之间形成牢固分子间作用，来提高奥希替尼的载药量与稳定性。

附图说明

图1本发明所用T7肽功能材料的红外光谱图；

图2为本发明实施例1肺癌脑转移瘤靶向递药系统扫描电镜图；

图3为实施例4奥西替尼脑靶向递药系统体外释放图；

图4为实施例5奥西替尼脑靶向递药系统BCEC细胞毒；

图5为实施例5奥西替尼脑靶向递药系统PC-9细胞毒；

图6为本发明实施例6中纳米粒在脑组织分布的荧光图；

图7为本发明实施例7奥西替尼脑靶向递药系统及其抗肺癌脑转移瘤生存曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1

(1)T7-PEG₂₀₀₀-DSPE的合成

将氨基酸序列为CHAIYPRH的T7肽(4mg)溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中(pH7.0)，取Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE(8mg)溶于DMF，两者混合后氮气保护磁力搅拌反应8小时，待Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE反应完全后停止反应，将过量的T7肽和DMF通过透析法(截留分子量3.5kDa，透析介质为纯水)除去。冷冻干燥，得到直链的T7-PEG₂₀₀₀-DSPE。

(2)阿霉素前药的制备：称取二硫代二甘醇酸(600mg)置于100mL圆底烧瓶中，加入醋酸酐7.9mL，氮气保护，反应3小时，35℃油泵减压浓缩除去多余的醋酸酐，再加入甲苯5mL，水泵浓缩至干，得淡黄色2,2’-二硫代二甘醇酸酐。不经纯化，用60mL二氯甲烷溶解，加入十八醇(900mg)和催化剂4-二甲氨基吡啶，室温，电磁搅拌过夜，反应液用1％醋酸洗涤15mL×2，水洗15mL×2，有机相用无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析纯化，洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯(体积比)＝2：1)，得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯白色固体。称取阿霉素(DOX，400mg)溶于二氯甲烷(240mL)，冰水浴，电磁搅拌，加入十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯(320mg)，分批加入HBTU(523mg可分五批，每五分钟一批)，后加入三乙胺(576μL)，室温反应过夜。反应液用1％醋酸洗涤两遍，NaCl溶液、纯水洗涤，无水硫酸钠干燥，过夜。柱层析纯化(洗涤剂二氯甲烷：甲醇＝45：1),得红色固体DOX-SS-C18。

(3)自组装法制备奥西替尼脑靶向递药系统：

称取5mg DOX-SS-C18溶于0.2mL四氢呋喃，2.5mg奥希替尼溶于1mL甲醇，涡旋溶解得有机相，用微量注射器将有机相逐滴加入到不断搅拌(650rpm，25℃)的水相(纯水,10mL)中，滴加完毕后在相同条件下继续敞口搅拌5min，旋转蒸发(0.1MPa,70℃,5min)除去残余有机溶剂，最后经0.45、0.22μm微孔滤膜过滤，得由DOX-SS-C18包载奥希替尼的载药纳米粒。

将上述方法制得的载药纳米粒(载药纳米粒质量为2mg)加入T7-PEG₂₀₀₀-DSPE水溶液(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE质量为0.2mg)中混合，搅拌，即得靶向递药系统。

其中，通过核磁共振图谱测得DOX的结构式为：

DOX：¹HNMR(400MHz,DMSO)：δ14.01(1H,s,11-OH),δ13.21(1H,s,6-OH),δ7.97--7.63(6H,m,2-H,3-H,4-H,4’-NH₂,OH),δ5.49-5.47(2H,d,2’-H,OH),δ5.28(1H,d,5’-H),δ4.92-4.89(2H,t,14-2H),δ4.61-4.59(2H,d,4’-H,10-H),δ4.21-4.19(1H,d,OH),δ3.98(3H,s,15-3H),δ3.61-3.60(1H,d,6’-H),δ3.00-2.81(2H,dd,7-2H),δ2.15-2.09(2H,m,3’-2H),δ1.89-1.70(2H,m,9-2H),δ1.17-1.15(3H,d,7’-3H)

DOX-SS-C18的结构式为：

DOX-SS-C18:¹HNMR(400MHz,DMSO)：δ13.98(1H,s,11-OH),δ13.21(1H,s,6-OH),δ7.88-7.55(4H,m,2-H,3-H,4-H,4’-NH),δ5.44(1H,1s,2’-H),δ5.23(1H,d,5’-H),δ4.88-4.85(3H,m,14-2H,OH),δ4.60-4.58(2H,d,4’-H,10-H),δ4.18-4.16(1H,m,OH),δ4.02-3.94(6H,m,15-3H,5”-2H,OH),δ3.67(2H,s,2”-2H),δ3.48-3.46(3H,m,3”-2H,6’-H),δ2.93-2.82(2H,dd,7-2H),δ2.19-2.10(2H,m,3’-2H),δ1.86-1.13(37H,m,9-2H,7’-3H,6”～21”-32H),δ0.86-0.82(3H,t,22”-3H)

本发明中，由DOX-SS-C18包载奥希替尼的载药纳米粒溶液外观为澄清红色溶液。激光粒度分析表明，所得载药纳米粒子以96.54nm为有效直径呈正态分布，多分散性为0.117。扫描电镜下观察该纳米粒具有规整的球形外观，如图2；且由DOX-SS-C18包载奥希替尼的载药纳米粒在溶液中分散良好，且在7天后测得纳米粒粒径为97.55nm，说明纳米粒稳定性较好。骨架材料DOX-SS-C18对奥希替尼的包封率为93.2％，载药量为30.3％。

所用的原料：氨基酸序列为CHAIYPRH的T7肽购自于吉尔生化(上海)有限公司，Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE购自于Nanocs Inc公司，二硫代二甘醇酸购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其它原料均为市售所得。

实施例2

(1)T7-PEG₂₀₀₀-DSPE的合成

将氨基酸序列为CHAIYPRH的T7肽(10mg)溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中(pH7.0)，取Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE(2mg)溶于DMF，两者混合后氮气保护磁力搅拌反应16小时，待Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE反应完全后停止反应，将过量的T7肽和DMF通过透析法(截留分子量3.5kDa，透析介质为纯水)除去。冷冻干燥，得到直链的T7-PEG2000-DSPE。

(2)阿霉素前药的制备：称取二硫代二甘醇酸(400mg)置于100mL圆底烧瓶中，加入醋酸酐7mL，氮气保护，反应3小时，35℃油泵减压浓缩除去多余的醋酸酐，再加入甲苯5mL，水泵浓缩至干，得淡黄色2,2’-二硫代二甘醇酸酐。不经纯化，用60mL二氯甲烷溶解，加入十八醇(600mg)和催化剂4-二甲氨基吡啶，室温，电磁搅拌过夜，反应液用1％醋酸洗涤15mL×2，水洗15mL×2，有机相用无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析纯化，洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)，得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯白色固体。称取阿霉素(DOX，500mg)溶于二氯甲烷(240mL)，冰水浴，电磁搅拌，加入十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯(400mg)，分批加入HBTU(523mg可分五批，每五分钟一批)，后加入三乙胺(576μL)，室温反应过夜。反应液用1％醋酸洗涤两遍，NaCl溶液、纯水洗涤，无水硫酸钠干燥，过夜。柱层析纯化(洗涤剂二氯甲烷：甲醇＝45：1),得红色固体DOX-SS-C18。

(3)自组装法制备奥西替尼脑靶向递药系统：

称取30mg DOX-SS-C18溶于0.2mL四氢呋喃，3mg奥希替尼溶于1.5mL甲醇，涡旋溶解得有机相，用微量注射器将有机相逐滴加入到不断搅拌(650rpm，25℃)的水相(纯水,10mL)中，滴加完毕后在相同条件下继续敞口搅拌5min，旋转蒸发(0.1MPa,70℃,5min)除去残余有机溶剂，最后经0.45、0.22μm微孔滤膜过滤，得由DOX-SS-C18包载奥希替尼的载药纳米粒。

将上述方法制得的载药纳米粒(纳米粒质量为2.5mg)加入T7-PEG₂₀₀₀-DSPE水溶液(T7-PEG₂₀₀₀-DSPE质量为0.5mg)中混合，搅拌，即得靶向递药系统。

其中，通过核磁共振图谱测得DOX的结构式为：

DOX：¹HNMR(400MHz,DMSO)：δ14.01(1H,s,11-OH),δ13.21(1H,s,6-OH),δ7.97--7.63(6H,m,2-H,3-H,4-H,4’-NH₂,OH),δ5.49-5.47(2H,d,2’-H,OH),δ5.28(1H,d,5’-H),δ4.92-4.89(2H,t,14-2H),δ4.61-4.59(2H,d,4’-H,10-H),δ4.21-4.19(1H,d,OH),δ3.98(3H,s,15-3H),δ3.61-3.60(1H,d,6’-H),δ3.00-2.81(2H,dd,7-2H),δ2.15-2.09(2H,m,3’-2H),δ1.89-1.70(2H,m,9-2H),δ1.17-1.15(3H,d,7’-3H)

DOX-SS-C18的结构式为：

DOX-SS-C18:¹HNMR(400MHz,DMSO)：δ13.98(1H,s,11-OH),δ13.21(1H,s,6-OH),δ7.88-7.55(4H,m,2-H,3-H,4-H,4’-NH),δ5.44(1H,1s,2’-H),δ5.23(1H,d,5’-H),δ4.88-4.85(3H,m,14-2H,OH),δ4.60-4.58(2H,d,4’-H,10-H),δ4.18-4.16(1H,m,OH),δ4.02-3.94(6H,m,15-3H,5”-2H,OH),δ3.67(2H,s,2”-2H),δ3.48-3.46(3H,m,3”-2H,6’-H),δ2.93-2.82(2H,dd,7-2H),δ2.19-2.10(2H,m,3’-2H),δ1.86-1.13(37H,m,9-2H,7’-3H,6”～21”-32H),δ0.86-0.82(3H,t,22”-3H)

所用的原料：氨基酸序列为CHAIYPRH的T7肽购自于上海吉尔生化公司，Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE购自于Nanocs Inc公司，二硫代二甘醇酸购自于上海阿拉丁生化公司，其它原料均为市售所得。

实施例3：奥西替尼脑靶向递药系统稳定性研究

按照上述奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，考察了加入不同奥希替尼投入量对递药系统稳定性的影响。固定5mg DOX-SS-C18溶于0.2mL四氢呋喃，分别加入0mg,0.2mg，0.5mg，1mg和2.5mg奥希替尼溶于1mL甲醇，涡旋溶解得有机相，后续制备过程同实施例1所述。最后将其用PBS(pH 7.4)重组后，放置4℃，监测递药系统溶液的粒径变化。结果显示：投入0mg和0.2mg奥希替尼的处方，在旋转蒸发阶段大量红色沉淀物产生，表明单纯DOX-SS-C18在自组装时，稳定性不够，分子容易聚结沉降。而在5mg，1mg和2.5mg处方中，没有出现该现象。从粒径监测结果看，0mg和0.2mg奥希替尼的处方溶液，粒径从第0天的约100nm，到第14天增加到430nm，而奥希替尼投入量为0.5mg，1mg和2.5mg的处方，粒径始终维持在105nm左右。按照上述靶向递药系统的制备方法，分别考察了加入香豆素-6、Cy5.5、Dir等物质对递药系统稳定性的影响。结果显示，加入这三种物质的处方在旋转蒸发阶段均产生大量沉淀，表明DOX-SS-C18对这三种物质的载药性能差，并且影响DOX-SS-C18自组装形成纳米粒过程。从这些结果可以看出，奥希替尼投入量对稳定DOX-SS-C18纳米系统具有重要作用。

对比例1：

通过乳化溶剂蒸发法，制备了载奥希替尼的聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)聚合物，并且以在PBS(pH 7.4)环境中奥希替尼的药物泄露率考察了传统的聚合物PEG-PLA以及本发明骨架材料DOX-SS-C18分别对奥希替尼包载的稳定性。

结果显示，14天后，PEG-PLA包裹的奥希替尼载体系统药物泄露达到83％，而DOX-SS-C18包裹的奥希替尼载体系统药物泄露仅8％。结果表明：与传统聚合物相比，DOX-SS-C18载体对奥希替尼的包封作用明显增强，有利于制剂的稳定性提高。

实施例4：奥西替尼脑靶向递药系统的体外释放

采用超滤离心法考察纳米粒中奥希替尼和DOX的体外释放行为，取10μL制备的递药系统的溶液，用释放介质稀释至4mL，置于10ml EP管中，奥希替尼的总量为3.5μg，以保证药物释放是在漏槽条件下进行。释放介质分别为pH为5.5的含10mM GSH 0.5％吐温-80的缓冲液以及pH为7.4的含1μM GSH和0.5％吐温-80的缓冲液。将稀释后的递药系统放入37℃，150rpm恒温摇床中，分别于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、8h取出平行的三组样品，立即转移至截留分子量为30000Da的超滤离心管中，以4000rpm离心10min，取滤液进样，样品浓度HPLC方法测定，计算释放百分率(％)。结果显示，在1μM GSH存在下几乎没有释放奥希替尼，而在10mM GSH存在下，在第一小时观察到奥希替尼的突释，并且在孵育8小时后，奥西替尼脑靶向递药系统中奥希替尼和DOX的累积释放分别达到63.95％和62.64％，表现了良好的释药性，如图3。

实施例5：奥西替尼脑靶向递药系统的体外细胞毒

细胞毒分析采用MTT法，将对数生长期人肺癌细胞(PC-9)或脑毛细血管内皮细胞(BCEC)细胞株以5×10³cells/pore的密度接种到96孔培养板中，培养24h后。分别加入9291浓度为0.01-10μg/mL的游离奥西替尼和阿霉素(奥希替尼+DOX)、T7修饰的空白前药纳米粒(T7-DSNPs)、没有修饰的包载奥希替尼前药纳米粒(PEG-DSNPs/9291)和T7修饰的包载奥希替尼的靶向递药系统的纳米粒(T7-DSNPs/9291)无血清DMEM溶液，平行操作六份，在常规培养条件下培养48h。培养结束后，每孔加5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，小心吸弃上清液，每孔加200μL DMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测490nm处的吸光度值(A)。按以下公式计算：

并计算半数抑制浓度IC₅₀值。结果显示，游离药物对BCEC有很强的毒性，而载药纳米粒在一定浓度范围内对BCEC基本没有毒性，T7-DSNPs/9291对PC-9的细胞毒性(IC₅₀＝2.041±0.31μg/mL)明显高于T7-DSNPs组(IC50＝9.639±0.984μg/mL)，与游离组无显著差异，如图4和图5。这些结果表明奥西替尼脑靶向递药系统在降低游离药物对BCEC细胞毒作用的同时，保证了奥希替尼对PC-9细胞的细胞毒作用。

实施例6：奥西替尼脑靶向递药系统的脑组织分布

建立非小细胞肺癌脑转移BALB/c裸鼠模型，21天后，尾静脉注射200μg/kg PEG-DPSNPs/9291和T7-DSNPs/9291，分别于给药后4、12和24h，将荷瘤裸鼠用异氟烷麻醉后，置于活体成像仪中荧光扫描并拍照，如图6。结果显示，各时间点T7-DSNPs/9291在脑部的荧光强度均明显强于PEG-DPSNPs/9291组，该结果表明T7修饰后能增加递药系统在脑部的主动靶向与蓄积。

实施例7：奥西替尼脑靶向递药系统体内药效学研究

建立非小细胞肺癌脑转移BALB/c裸鼠模型，将荷瘤裸鼠随机分为5组(每组8只)，分别为生理盐水、AZD9291+DOX、T7-DSNPs、PEG-DSNPs/9291和T7-DSNPs/9291。于接种PC-9细胞后2、4、6、8天，除生理盐水组为对照组外，其余四组分别尾静脉注射相应处方，奥希替尼给药剂量为5mg/kg，记录各组荷瘤裸鼠的死亡时间，利用SPSS 22.0软件绘制生存曲线，计算并比较各组的中位生存时间(Median)并进行log-rank统计学分析，如图7。结果显示，与生理盐水组(21天)，AZD9291+DOX(24天)，T7-DSNPs组(26天)和PEG-DSNPs/9291(28天)治疗的组相比，T7-DSNPs/9291组存活时间最长，达到35天，表明该递药系统能有效达到抗非小细胞肺癌脑部转移的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种奥西替尼脑靶向递药系统，其特征在于，该靶向递药系统由骨架材料包载奥西替尼形成的载药纳米粒及插入载药纳米粒表面的靶向配体T7肽构成；其中，以胞内还原响应的阿霉素前药为骨架材料；所述的阿霉素前药的制备步骤为二硫代二甘醇酸与醋酸酐在氮气保护下反应得到2,2-二硫代二甘醇酸酐，再在催化剂作用下与十八醇反应得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯，再进一步与阿霉素反应得到；所述的靶向配体T7肽的制备步骤为将T7肽与马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺通过共价结合连接，得到T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺；所述的T7肽的氨基酸序列为CHAIYPRH。

2.根据权利要求1所述的奥西替尼脑靶向递药系统，其特征在于：所述的奥西替尼与骨架材料的质量比为1:2～10；所述的靶向配体T7肽和载药纳米粒的质量比为1:5～10。

3.根据权利要求1所述的奥西替尼脑靶向递药系统，其特征在于：所述的二硫代二甘醇酸与醋酸酐的摩尔比为40~30:1；所述的二硫代二甘醇酸与十八醇的质量比为2:3；所述的阿霉素与十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯的质量比为5:4。

4.一种权利要求1所述的奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，其特征在于，制备步骤为：

（1）靶向配体T7肽的制备：将T7肽与马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺通过共价结合连接，得到T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺；所述的马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺与T7肽的摩尔比为1:1～10；

（2）阿霉素前药的制备：二硫代二甘醇酸与醋酸酐在氮气保护下反应得到2,2-二硫代二甘醇酸酐，再在催化剂作用下与十八醇反应得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯，再进一步与阿霉素反应得到阿霉素前药；所述的二硫代二甘醇酸与醋酸酐的摩尔比为40~30:1；所述的二硫代二甘醇酸与十八醇的质量比为2:3；所述的阿霉素与十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯的质量比为5:4；

（3）靶向递药系统的制备：用阿霉素前药包载奥西替尼形成载药纳米粒；将T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与载药纳米粒按比例混合，制备成靶向递药系统；所述的奥西替尼与阿霉素前药的质量比为1:2～10；所述的T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与载药纳米粒的质量比为1:5～10。

5.根据权利要求4所述的奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中T7肽与马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺通过共价结合连接的方法包括以下步骤：将T7肽溶于磷酸盐缓冲溶液中；取马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺溶于二甲基甲酰胺中；将上述两种溶液混合后，在氮气保护下磁力搅拌反应8～16小时，待反应完全后，通过透析法除去多余的T7肽和二甲基甲酰胺，冷冻干燥，得到T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。

6.根据权利要求5所述的奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，其特征在于：所述的马来酰亚胺-聚乙二醇₂₀₀₀-磷脂酰乙醇胺与T7肽的摩尔比为1:1~10。

7.根据权利要求4所述的奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中阿霉素前药的制备包括以下步骤：在二硫代二甘醇酸中加入醋酸酐，氮气保护反应，35℃油泵减压浓缩除去多余的醋酸酐，再加入甲苯5 mL，水泵浓缩至干，得2,2’-二硫代二甘醇酸酐；将其用有机溶剂溶解后加入十八醇和催化剂，室温下电磁搅拌，反应液分别用1%醋酸和纯水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得十八醇-2，2’-二硫代二甘醇酸酯；称取阿霉素溶于有机溶剂中，冰水浴条件下电磁搅拌，加入十八醇-2,2’-二硫代二甘醇酸酯，分批加入HBTU、再加入三乙胺，室温反应；反应液用1%醋酸洗涤两遍，再用NaCl溶液、纯水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化,得阿霉素前药；所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶；所述的有机溶剂为二氯甲烷。

8.根据权利要求4所述的奥西替尼脑靶向递药系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中靶向递药系统的制备包括以下步骤：将阿霉素前药与奥西替尼分别溶解于四氢呋喃和甲醇中，混合均匀后室温下滴加到去离子水中，搅拌成型后，旋转蒸发除去有机溶剂，过滤后加入T7肽接枝的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺水溶液，搅拌，即得靶向递药系统；所述的过滤为微孔滤膜过滤。

9.一种权利要求1所述的奥西替尼脑靶向递药系统在制备抗非小细胞肺癌脑转移的药物中的应用。

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