CN114652848A - 一种peg化人血清白蛋白纳米材料及其制备方法和在肿瘤诊疗中的应用 - Google Patents
一种peg化人血清白蛋白纳米材料及其制备方法和在肿瘤诊疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种PEG化人血清白蛋白纳米材料及其制备方法和在肿瘤诊疗中的应用，属于生物医药和医疗技术领域。本发明通过疏水性药物紫杉醇诱导的方法，促使PEG‑cys34HSA自组装成具有生物相容性的纳米载体，改善HSA作为纳米载体不稳定、半衰期短、易被体内的酶降解等缺点。通过包裹PTX和有机近红外荧光染料吲哚箐绿ICG，得到具有荧光成像能力、化疗和光热治疗协同治疗效果的长循环诊疗一体化纳米制剂PEG‑cys34HSA/PTX/ICG，在ICG的荧光成像的指导下，进行PTX和ICG协同的化学和光热治疗，实现肿瘤治疗的诊疗一体化，为肿瘤的综合治疗提供一种长效稳定、简单经济、绿色安全的诊疗制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和医疗技术领域，具体涉及一种PEG化人血清白蛋白纳米材料及其制备方法和在 肿瘤诊疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何 形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
20世纪以来，人类的生活环境不断恶化，污染日益加重，致癌因素越来越普遍地出现在日常生活中， 由此导致罹患癌症的人数不断上升，恶性肿瘤已经超过心脑血管成为人类健康的最大敌人。目前临床上肿 瘤治疗的常规方法为：手术切除、化学治疗和放射治疗。手术切除即为切除肿瘤组织，对肿瘤的大小数目、 生长情况等有较高的要求。化学治疗即为利用化疗药物对肿瘤进行治疗，最常见的化疗药物为紫杉醇、阿 霉素、卡铂等，这些药物的细胞毒性大、选择性低，给人体产生巨大的毒副作用，同时易产生多药耐药性。 放射治疗即为利用一种或多种电离辐射对恶性肿瘤进行的治疗。单一的手术切除难以根除病灶，单一的化 学疗法易产生耐药，单一的放射疗法疗效有限，因此临床上常采用联合疗法以提高治疗效果，降低毒副作 用。
近年来，纳米材料作为药物传递系统得到了广泛的研究。通过精心的设计和组装，许多纳米药物递送 系统可以成为结合多种不同的诊断和治疗功能于一体的纳米诊疗制剂，实现对肿瘤的协同诊疗，逆转抗肿 瘤药物的耐药性，或者在较低剂量下获得较高的疗效，减轻治疗的毒副作用，成为纳米医学领域一个颇具 吸引力的研究方向。但是，目前开发具有高度集成功能的纳米诊疗制剂往往需要应用复杂的材料工程和繁 琐的化学合成过程，特别是一些无机纳米载体并不具有生物相容性。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种PEG化人血清白蛋白纳米材料及其制备方法和在肿瘤诊疗中 的应用。本发明通过疏水性药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)诱导的方法，促使PEG-cys34HSA自组装成具有 生物相容性的纳米载体，改善HSA作为纳米载体不稳定、半衰期短、易被体内的酶降解等缺点。通过包裹 PTX和有机近红外荧光(near-infraredfluorescence,NIRF)染料——吲哚箐绿ICG，得到同时具有荧光成像 能力、化疗和光热治疗协同治疗效果的长循环诊疗一体化纳米制剂PEG-cys34HSA/PTX/ICG，具有良好的 实际应用之价值。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种PEG化人血清白蛋白纳米材料，所述纳米材料包括由PEG-cys34HSA自 组装形成的纳米粒，以及负载在纳米粒上的疏水性药物和有机近红外荧光染料；
其中，所述PEG-cys34HSA为单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)对HSA的游离的半胱氨 酸残基Cys34进行定点PEG修饰后获得。
PEG的相对分子量Mr为1k～20kDa，进一步优选为5k～20kDa；所述单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺 与HSA的摩尔比为1:1～5，如1:2。
所述疏水性药物可以为紫杉醇PTX，其作为目前发现的抗肿瘤效果最好的抗癌药之一，在临床上广泛 应用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种瘤种。
所述有机近红外荧光染料可以为吲哚箐绿ICG，其作为一种已被FDA批准使用的体内造影剂，生物安 全性高，具有较高的光热转换效率，并且可以荧光成像。
更具体的，所述PEG-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1:10:1～10，优选为1:10:1～5，更优选为1:10:1～3， 如1:10:2、1:10:2.5。
所述纳米粒粒径为150-250nm，Zeta电位为-10～-1mV。
本发明的第二个方面，提供上述PEG化人血清白蛋白纳米材料的制备方法，所述制备方法包括：
S1、HSA的Cys34定点PEG修饰得PEG-cys34HSA；
S2、将疏水性药物溶液和有机近红外荧光染料溶液加入PEG-cys34HSA水溶液中，搅拌后加入缓冲液， 离心透析后即得。
其中，所述步骤S1具体方法包括：
将HSA与mPEG-MAL加入缓冲液(如磷酸盐缓冲液，含10mmol/LEDTA)，在30～40℃(如37℃) 振荡10-30h(如20h)后分离纯化后即得。
其中，PEG的相对分子量Mr为1k～20kDa，进一步优选为5k～20kDa；所述mPEG-MAL与HSA的 摩尔比为1:1～5，如1:2。
所述分离纯化包括将反应液经滤膜(0.45μm)过滤以及进行离子交换层析(如可采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱)的步骤。
所述步骤S2中，所述疏水性药物可以为紫杉醇PTX；所述疏水性药物溶液可以为PTX的无水甲醇溶 液；
所述有机近红外荧光染料可以为吲哚箐绿ICG；所述有机近红外荧光染料溶液可以为ICG的DMSO溶 液。
所述PEG-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1:10:1～10，优选为1:10:1～5，更优选为1:10:1～3，如1:10:2、 1:10:2.5；研究发现PEG修饰后可以显著增强HSA载PTX和ICG形成纳米粒的能力，同时通过合理优化各 原料投料摩尔比，从而能够有效提高纳米材料的载药量和包封率，从而更加有利于其实际临床应用。
进一步的，所述搅拌反应具体条件包括：在10～25℃条件下反应10～30h，如在10℃条件下反应12h， 搅拌速度控制为500～1000r/min，优选为1000r/min。通过对搅拌反应条件进行优化，从而更易获得形状规 则、粒径均匀的紧实纳米粒，从而进一步提高其诊疗效果。
所述缓冲液可以为PBS缓冲液，离心可采用高速离心(如12000r/min离心5min)方式去除游离的ICG 和未结合的PTX；
透析次数可控制为4～5次，每次2～3h，透析分子量为可以为12～14kDa。
本发明的第三个方面，提供上述PEG化人血清白蛋白纳米材料在制备肿瘤诊疗产品中的应用。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿 瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能 够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的诊疗产品可用于监控肿瘤发生及进展并用于治疗恶性瘤。恶性瘤包括在所述器官中的原发性 肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。可用本发明的纳米材料治疗的恶性瘤的实例包括实体 瘤和血液瘤。优选为实体瘤，从而更有利实现药物的瘤内注射和/或瘤旁注射。实体瘤可以是乳腺、膀胱、 骨、脑、中枢和外周神经系统、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、 肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、结肠、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、 皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤等。
本发明的第四个方面，提供一种肿瘤诊疗产品，所述肿瘤诊疗产品其包含上述PEG化人血清白蛋白纳 米材料。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可 以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无 菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能 够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山 梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤 维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬 脂酸镁和矿物油等。
本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织 中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂 量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而 变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、 兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的第五个方面，提供一种肿瘤诊疗系统，所述肿瘤诊疗系统包括上述PEG化人血清白蛋白纳米 材料或上述肿瘤诊疗产品，以及如下任意一种或两种装置：
a)活体荧光成像装置；
b)光照装置。
其中，所述光照装置发射光源为近红外光源，具体的，所述光源波长可为808nm。
上述技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过对HSA进行PEG修饰，发现PEG的修饰分子量应该适当，mPEG-MAL(5kDa) 修饰对HSA的结构影响大，虽然修饰后的PEG5kD-cys34HSA形成的纳米粒结构更加均匀，但载药量明显降 低，而mPEG-MAL(20kDa)修饰对HSA的结构影响小，由于PEG链的亲水性，PEG20kD-cys34HSA的载 药量显著提高。对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的靶向性和抗肿瘤活性也表明mPEG-MAL(20kDa) 修饰显著提高了纳米粒的肿瘤聚集性和体内抗肿瘤活性。
综上，上述技术方案制备得到的同时具有荧光成像能力、化疗和光热治疗协同治疗效果的长循环诊疗 一体化纳米制剂PEG-cys34HSA/PTX/ICG。在ICG的荧光成像的指导下，进行PTX和ICG协同的化学和光 热治疗，实现肿瘤治疗的诊疗一体化，在较低的药物剂量下获得较高的疗效，从而为肿瘤的综合治疗提供 一种长效稳定、简单经济、绿色安全的诊疗制剂。因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用 于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中不同Mr PEG对HSA的Cys34定点修饰反应产物的离子交换分离纯化谱图；其 中，A.PEG5kD-cys34HSA；B.PEG20kD-cys34HSA；
图2为本发明实施例1中HSA的Cys34定点PEG(5kDa)修饰反应产物的SDS-PAGE图；A.mPEG-MAL (5kDa)与HSA的反应液；B.PEG5kD-cys34HSA；
图3为本发明实施例1中HSA的Cys34定点PEG(20kDa)修饰反应产物的SDS-PAGE图；
图4为本发明实施例2中HSA、PTX不同投料比所制的纳米粒的粒径分布图；A.1:10；B.1:20。
图5为本发明实施例2中反应温度对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.25℃；B.10℃；
图6为本发明实施例2中反应时间对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.12h；B.24h；
图7为本发明实施例2中搅拌转速对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.500r/min；B.700r/min；C. 1000r/min；
图8为本发明实施例2中PEG5kD-cys34HSA与PTX不同投料比所制的纳米粒的粒径分布图；A.1:5；B. 1:10；C.1:20；
图9为本发明实施例2中反应温度对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.25℃；B. 10℃；
图10为本发明实施例2中反应时间对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.12h；B.24 h；
图11为本发明实施例2中搅拌速度对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.500r/min； B.700r/min；C.1000r/min；
图12为本发明实施例2中不同PEG20kD-cys34HSA、PTX投料比所制的纳米粒的粒径分布图；A.1:5；B. 1:10；C.1:20；
图13为本发明实施例2中反应温度对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.25℃；B. 10℃；
图14为本发明实施例2中反应时间对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.12h；B.24 h；
图15为本发明实施例2中搅拌转速对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响TEM图；A.500r/min； B.700r/min；C.1000r/min；
图16为本发明实施例2中16搅拌过夜并离心后的纳米粒反应液；A.HSA/PTX/ICG；B. PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG；C.PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图17为本发明实施例2中纳米粒的粒径分布图；A.HSA/PTX/ICG；B.PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG；C. PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图18为本发明实施例2中纳米粒的Zeta电位分布图；A.HSA/PTX/ICG；B.PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG； C.PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图19为本发明实施例2中纳米粒的TEM图；A.HSA/PTX/ICG；B.PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG；C. PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图20为本发明实施例3中游离ICG和纳米粒在荷瘤小鼠体内的荧光示踪，虚线圈出区为肿瘤部位。A. 注射游离ICG；B.注射HSA/PTX/ICG纳米粒；C.注射PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒。20K-HSA/PTX/ICG代 指PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图21为本发明实施例3中尾静脉注射游离ICG和纳米粒24h后小鼠主要脏器和及实体瘤的荧光成像
A.游离ICG；B.HSA/PTX/ICG；C.PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；D.小鼠脏器及实体瘤的相对荧光强度。 20K-HSA/PTX/ICG代指PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图22为本发明实施例3中纳米粒对荷瘤小鼠给药后肿瘤体积随时间变化的影响
L+代指808nm激光以1W的功率照射肿瘤5min，20K-HSA/PTX/ICG代指 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG，***p<0.001；
图23为本发明实施例3中给药16天后不同治疗组小鼠的肿瘤重量；L+代指808nm激光以1W的功率 照射肿瘤5min，20K-HSA/PTX/ICG代指PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG，**p<0.01，***p<0.001；
图24为本发明实施例3中PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG对荷瘤小鼠给药后小鼠体重随时间变化的影响；L+代指 808nm激光以1W的功率照射肿瘤5min，20K-HSA/PTX/ICG代指PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG；
图25为本发明实施例3中给药16天后不同治疗组小鼠的肿瘤照片；L+代指808nm激光以1W的功率 照射肿瘤5min。
具体实施方式
需要指出的是，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文 使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 HSA的Cys34定点PEG修饰及修饰产物的分离纯化
人血清白蛋白(HSA)分子中只存在一个34位游离半胱氨酸残基(Cys34)。本研究对HSA的修饰即 是利用Mr为5kDa和20kDa的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)对Cys34进行定点修饰。修 饰后的产物用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱进行分离，收集洗脱峰，透析脱盐，冻干，SDS-PAGE 检测样品纯度。
1、试剂与材料
HSA，批号：401L056，购自北京索莱宝科技有限公司；mPEG-MAL(20kDa)，批号：ZZ359P098、 mPEG-MAL(5kDa)，批号：ZZ363P191，购自北京键凯生物科技有限公司；透析袋(1kDa)，购自生工生 物工程(上海)股份有限公司；0.45μm滤膜，购自天津市津腾实验设备有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow 填料，购自美国GE公司；十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、氯化钠， 购自国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×) 购自碧云天生物技术研究所；PAGE凝胶快速制备试剂盒(10％)，购自上海雅酶生物医药科技有限公司； 蛋白质常规分子量标记(10kDa-180kDa)，购自Proteintech公司。所有化学试剂均是分析纯。
2、实验方法
2.1不同MrPEG对HSACys34位点的定点修饰
配制50mmol/L磷酸盐缓冲液(含10mmol/LEDTA)100mL，加入HSA500mg，并按照HSA:mPEG-MAL (摩尔比)为1:2加入mPEG-MAL(20kDa)300.75mg或mPEG-MAL(5kDa)75mg。将反应液置于37℃ 水浴摇床震摇20h。
2.2不同Mr PEG修饰的HSA产物的分离纯化
反应液经0.45μm滤膜过滤后上DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱进行分离纯化。
离子交换层析的条件为：
(1)10mmol/L磷酸盐缓冲液以5mL/min的流速平衡冲洗离子交换柱3-4个柱体积；
(2)用平衡缓冲液稀释反应液至5倍体积，0.45μm微孔滤膜过滤后，以5ml/min的流速上样；
(3)10mmol/L磷酸盐缓冲液以1.5mL/min的流速冲洗柱子；
(4)用0.1-0.5mol/L氯化钠溶液梯度洗脱20个柱体积，流速设置为5mL/min，检测波长设置为280nm；
(5)收集洗脱峰，28℃旋蒸浓缩，1kDa透析袋透析除盐，冻干备用。
2.3不同Mr PEG修饰的HSA产物的鉴定
按照PAGE凝胶快速制备试剂盒制备凝胶。冻干的样品蛋白粉末用双蒸水溶解，BCA蛋白浓度测定试 剂盒(增强型)测试蛋白浓度，加入1/4体积SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，使SDS-PAGE蛋白上样缓冲 液的终浓度为1×，煮沸5min。以蛋白质含量为10、15、20和30μg上样。
3、结果与分析
3.1不同Mr PEG对HSA的Cys34定点修饰产物的分离
如图1所示，PEG5kD-cys34HSA反应液和PEG20kD-cys34HSA反应液经过DEAESepharose Fast Flow分 离洗脱时，都出现了两个完全分离的峰，收集两个峰，旋蒸浓缩，SDS-PAGE检测样品纯度。
3.2不同MrPEG对HSACys34定点修饰产物的鉴定
HSA经mPEG-MAL(5kDa)修饰后，分子量增加5kDa，PEG5kD-cys34HSA的分子量约为71.5kDa； 经mPEG-MAL(20kDa)修饰后，分子量增加20kDa，PEG20kD-cys34HSA的分子量约为86.5kDa。如图2 所示，PEG5kD-cys34HSA条带位于70kDa左右，明显比HSA条带高。图3所示，PEG20kD-cys34HSA条带 位于75-100kDa之间，明显比HSA条带高。
HSA含有一个游离的半胱氨酸残基(Cys34)，位于蛋白质表面，半胱氨酸残基的末端巯基具有亲核性。 利用可与巯基特异性反应的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)能够对Cys34进行定点PEG修 饰。经过PEG修饰后，HSA表面携带的电荷发生了改变，与离子交换柱层析填料的结合力发生了变化，因 此可以利用离子交换层析分离HSA和PEG-HSA。未反应的PEG不与离子交换柱层析填料结合，PEG-HSA 与填料的结合力弱于HSA，先行被洗脱出来。收集不同保留时间下流出的样品，旋蒸浓缩后进行SDS验证。 HSA的蛋白分子量为66.5kDa，对其进行PEG修饰后，蛋白分子量增大，PEG5kD-cys34HSA分子量为71.5 kDa，PEG20kD-cys34HSA分子量为86.5kDa，在SDS-PAGE电泳中能明显显示出差别。由图1和图2可知， 在HSA和mPEG-MAL(5kDa)的反应液的分离纯化中，PEG5kD-cys34HSA和HSA完全分离。同样，在 HSA和mPEG-MAL(20kDa)的反应液的分离纯化中，PEG20kD-cys34HSA和HSA完全分离。PEG5kD-cys34HSA和PEG20kD-cys34HSA均达到了电泳纯。
实施例2PEG-HSA纳米诊疗制剂的制备及其表征
1、试剂与材料
紫杉醇，批号：20191002，购自江苏红豆杉药业有限公司；ICG，批号：RS0202104，购自西安瑞禧生 物科技有限公司；透析袋(14kDa)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、甲醇，均购自国药集团化学试剂有限公司。所有化学试剂均是分析纯。
2、实验方法
首先通过单因素实验优化自组装纳米粒的制备方法得到纳米诊疗制剂制备的最佳处方，然后按照最佳 处方，制备共载药纳米粒，并利用紫外分光光度计测试纳米粒中PTX和ICG的载药量和包封率。
2.1 HSA/PTX/ICG的制备及单因素考察实验
HSA/PTX/ICG将HSA溶于去离子水中，PTX溶于无水甲醇，ICG溶于DMSO。在搅拌条件下，以缓 慢滴加的方法将PTX的甲醇溶液和ICG的DMSO溶液逐滴滴加于HSA的水溶液中，避光过夜搅拌后反应 液加入2倍体积PBS溶液，12000r/min离心5min以去除游离ICG和未结合的PTX后，透析4～5次，每次 3h，透析分子量为14kDa，透析后得纳米粒。
2.1.1 HSA与PTX的投料比考察
将HSA与PTX分别以摩尔比1：10、1：20投料，HSA溶于去离子水，PTX溶于无水甲醇，将PTX 的甲醇溶液逐滴滴加于人血清白蛋白的水溶液中，过夜搅拌12h。将上述反应液以12000r/min离心10min 以去除未结合的PTX，取上清转移至14kDa的透析袋中，用去离子水透析4～5次，每次3h，透析后得纳 米粒。采用马尔文粒径仪对纳米粒的粒径进行考察，以筛选出最适投料比。
2.1.2 HSA/PTX/ICG的反应温度考察
确定HSA、PTX和ICG的投料比为1：10：2。称取HSA8mg溶于双蒸水2mL，在HSA溶液搅拌的 条件下，转速设置为1000r/min，取PTX的甲醇溶液55.23μL和ICG的DMSO溶液20.05μL依次逐滴滴 加于HSA的水溶液当中，搅拌时间设置为12h。分别在10℃和25℃情况下按照上述方法制备纳米粒，通 过纳米粒的形态筛选出适宜的反应温度。
2.1.3 HSA/PTX/ICG的反应时间考察
称取HSA8mg溶于双蒸水2mL，在HSA溶液搅拌的条件下，转速设置为1000r/min，反应温度设置为 10℃，按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，将反应时间设置为12h和24h，通过比较不同反应 时间下制备的纳米粒形态筛选出适宜的反应时间。
2.1.4 HSA/PTX/ICG的搅拌速度考察
称取HSA8 mg溶于双蒸水2mL，在HSA溶液搅拌的条件下，反应时间设置为1000r/min，反应温度 设置为10℃，按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，将反应时间设置为500、700和1000r/min， 通过比较不同搅拌速度下制备的纳米粒形态筛选出最佳搅拌速度。
2.2PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG的制备及单因素考察实验
PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法和HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法相同，均是通过纳米 沉淀法制备。为了得到纳米粒制备的最佳处方，以投料比、反应温度、反应时间和搅拌速度为维度，分别 通过单因素实验优化PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法。
2.2.1 PEG5kD-cys34HSA与PTX的投料比考察
将PEG5kD-cys34HSA与PTX分别以摩尔比1：5、1：10、1：20投料，PEG5kD-cys34HSA溶于去离子 水，PTX溶于无水甲醇。在搅拌条件下，将PTX的甲醇溶液逐滴滴加于PEG-HSA的水溶液中，过夜搅拌 12h。将上述反应液以12000r/min离心10min以去除未结合的PTX，取上清转移至14kDa的透析袋中， 用去离子水透析4-5次，每次3h，透析后得纳米粒。采用马尔文粒径仪对纳米粒的粒径进行考察，以筛选 出最适投料比。
2.2.2 PEG5kD-cys34HSA与ICG的投料比考察
固定PEG5kD-cys34HSA与PTX的摩尔比，改变ICG的投料使PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX 和ICG的含量比与HSA/PTX/ICG纳米粒相等，便于比较HSA/PTX/ICG纳米粒和PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG 纳米粒的抗肿瘤效果差异。PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比分别设置为1：10：1、1：10：1.5、1： 10：2、1：10：2.5、1：10：3，按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，反应时间设置为12h，反 应温度设置为12℃，搅拌速度设置为1000r/min。过夜反应后，反应液以12000r/min离心10min以去除未 结合的PTX和游离的ICG，取上清转移至14kDa的透析袋中，用去离子水透析4-5次，每次3h，透析后 得纳米粒。采用马尔文粒径仪对纳米粒的粒径进行考察，以筛选出最适投料比。
2.2.3 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG的反应温度考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1：10： 2，将反应时间设置为12h，搅拌速度设置为1000r/min，通过比较10℃和25℃下制备的纳米粒形态筛选出 制备PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的适宜反应温度。
2.2.4 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG的反应时间考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1：10： 2，将反应温度设置为10℃，搅拌速度设置为1000r/min，通过比较12h和24h下制备的纳米粒形态筛选 出制备PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的适宜反应时间。
2.2.5 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG的搅拌速度考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1：10： 2，将反应温度设置为25℃，反应时间设置为12h，通过比较500、700和1000r/min下制备的纳米粒形态 筛选出制备PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的最佳搅拌速度。
2.3 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG的制备及单因素考察实验
PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法和HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法相同，均是通过纳 米沉淀法制备。为了得到纳米粒制备的最佳处方，同样以投料比、反应温度、反应时间和搅拌速度为维度， 分别通过单因素实验优化PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的制备方法。
2.3.1 PEG20kD-cys34HSA与PTX的投料比考察
将PEG20kD-cys34HSA与PTX分别以摩尔比1：5、1：10、1：20投料，PEG20kD-cys34HSA溶于去离子 水，PTX溶于无水甲醇。在搅拌条件下，将PTX的甲醇溶液逐滴滴加于人血清白蛋白的水溶液中，过夜搅 拌12h。将上述反应液以12000r/min离心10min以去除未结合的PTX，取上清转移至14kDa的透析袋中， 用去离子水透析4-5次，每次3h，透析后得纳米粒。采用马尔文粒径仪对纳米粒的粒径进行考察，以筛选 出最适投料比。
2.3.2 PEG20kD-cys34HSA与ICG的投料比考察
固定PEG20kD-cys34HSA与PTX的摩尔比，改变ICG的投料使PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒中 PTX和ICG的含量比相等，便于比较HSA/PTX/ICG纳米粒和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的抗肿瘤 效果差异。PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比分别设置为1：10：1、1：10：1.5、1：10：2、1：10： 2.5，按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，反应时间设置为12h，反应温度设置为12℃，搅拌速 度设置为1000r/min。过夜反应后，反应液以12000r/min离心10min以去除未结合的PTX和游离的ICG， 取上清转移至14kDa的透析袋中，用去离子水透析4-5次，每次3h，透析后得纳米粒。采用马尔文粒径仪 对纳米粒的粒径进行考察，以筛选出最适投料比。
2.3.3 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG的反应温度考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1： 10：2，将反应时间设置为12h，搅拌速度设置为1000r/min，通过比较10℃和25℃下制备的纳米粒形态筛 选出制备PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的适宜反应温度。
2.3.4 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG的反应时间考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1： 10：2，将反应温度设置为25℃，搅拌速度设置为1000r/min，通过比较12h和24h下制备的纳米粒形态 筛选出制备PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的适宜反应时间。
2.3.5 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG的搅拌速度考察
按照实施例2中的2.1项下的方法制备纳米粒，固定PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1： 10：2，将反应温度设置为10℃，反应时间设置为12h，通过比较500、700和1000r/min下制备的纳米粒 形态筛选出制备PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的最佳搅拌速度。
2.4纳米粒的理化性质比较
2.4.1纳米粒表面形态的考察
采用透射电子显微镜对所制备的各种纳米颗粒的形态和结构进行表征，比较不同纳米粒的表面形态是 否均匀。采用200目TEM透射电镜铜网蘸取相同摩尔浓度的HSA、PEG5kD-cys34HSA和PEG20kD-cys34HSA 纳米粒反应液后，在滤纸上晾干，置于电子显微镜下观察并拍摄电镜照片。
2.4.2纳米粒的粒径分布及Zeta电位
采用马尔文粒径仪对HSA/PTX/ICG、PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米 粒的粒径分布及Zeta电位进行测定。
3、实验结果与分析
3.1 HSA/PTX/ICG纳米粒的单因素考察实验结果
3.1.1 HSA与PTX投料比对纳米粒粒径的影响
由图4可见，HSA、PTX的摩尔比1：10和摩尔比1：20的粒径几乎完全相同，表明当摩尔比为1：10 时，HSA上的疏水性结合位点与PTX的结合达到饱和。
3.1.2反应温度对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应温度下制备的HSA纳米粒TEM图见图5。由图5可以看出，在25℃条件下反应时，HSA、 PTX和ICG几乎没有形成纳米粒，这可能是因为HSA在高温搅拌的条件下易被磁子打碎。而在10℃条件 下，HSA、PTX、ICG明显形成了球状纳米粒，粒径大约在150nm左右，因此HSA、PTX和ICG形成纳 米粒的适宜反应温度为10℃。
3.1.3反应时间对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应时间下制备的HSA纳米粒TEM图见图6。由图6可见，反应时间为12h时，HSA、PTX和 ICG能够形成明显的球状纳米粒，粒径大约在150nm左右，而当反应时间为24h时，HSA、PTX、ICG形 成的几乎都是蛋白碎片，这可能是因为搅拌时间过长会打碎已经形成好的纳米粒，因此HSA、PTX和ICG 形成纳米粒的适宜反应时间为12h。
3.1.4搅拌速度对HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同搅拌速度下制备的HSA纳米粒TEM图见图7。由图7可见，当搅拌速度为500r/min时，HSA、 PTX和ICG几乎无法形成纳米粒，TEM透射电镜图显示几乎全为蛋白碎片；当搅拌速度为700r/min的时 候，可以明显看出纳米粒形成趋势，但形状不规则，甚至内部出现空心的状态；当搅拌速度为1000r/min 的时候，HSA、PTX和ICG能够形成明显的紧实的纳米粒，形状规则。这可能是由于低搅拌转速下，HSA、 PTX和ICG不能充分混合，因此难以形成形状规则的紧实纳米粒。因此HSA、PTX和ICG形成纳米粒的 最佳搅拌速度为1000r/min。
3.2 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的单因素考察实验结果
3.2.1 PEG5kD-cys34HSA与PTX的投料比对纳米粒粒径的影响
PEG5kD-cys34HSA与PTX的不同投料比下制备的纳米粒粒径图见图8和表1。
表1 PEG5kD-cys34HSA和PTX的不同投料比制成的纳米粒的粒径
由图8和表1可见，当PEG5kD-cys34HSA和PTX为1：10和1：20时，制备的纳米粒粒径几乎没有改 变，且都显著大于1：5投料制备的纳米粒。因此，制备PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒时， PEG5kD-cys34HSA和PTX的摩尔比定为1:10。
3.2.2 PEG5kD-cys34HSA与ICG的投料比对纳米粒的影响
经重复实验，测得HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX和ICG的含量比为2.82，因此 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX和ICG的含量应等于或者接近于2.82，方能后续比较两种纳米粒 的体内活性。由表2可知，当PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的投料比为1：10：2.5时，PTX和ICG的 含量比为2.76，最接近于HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX和ICG的含量比，因此PEG5kD-cys34HSA、PTX和 ICG的投料比应选择为1：10：2.5。
表2不同投料比制成的纳米粒中PTX和ICG含量比
3.2.3反应温度对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应温度下制备的PEG5kD-cys34HSA纳米粒TEM图见图9。由图9可见，但反应温度为25℃时， PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成的纳米粒呈现规则的球状，粒径大约在150nm左右，而在10℃下形成 的纳米粒粒径只有50nm左右，大小形状相对不规则，个体单薄，但对比HSA在不同温度下与PTX、ICG 形成的纳米粒情况(图3-4)，发现PEG5kD-cys34HSA与PTX、ICG的成纳米粒情况显著优于HSA。PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成纳米粒的适宜反应温度为25℃。
3.2.4反应时间对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应时间下制备的PEG5kD-cys34HSA纳米粒TEM图见图10。由图10可见，当反应时间为12h 时，相比于24h反应形成的纳米粒，PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成纳米粒形状更加均匀规则，因此 PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成纳米粒的适宜反应时间为12h。
3.2.5搅拌速度对PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同搅拌速度下制备的PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒TEM图见图11。由图11可见，当搅拌速 度设置为500r/min时，TEM电镜图呈现的几乎全是蛋白碎片；当搅拌速度设置为700r/min时，TEM电镜 图可发现一些不规则的纳米粒，而当搅拌速度设置为1000r/min时，PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成 的纳米粒呈规则的球状，粒径均匀，大约在150nm左右。这可能是由于当反应液中PEG5kD-cys34HSA的浓 度达到4.30mg/mL时，加大搅拌速度有利于PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG的充分混合，从而形成形状规 则、粒径均匀的紧实纳米粒。因此PEG5kD-cys34HSA、PTX和ICG形成纳米粒的最佳搅拌速度为1000r/min。
3.3 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的单因素考察实验结果
3.3.1 PEG20kD-cys34HSA与PTX投料比对纳米粒粒径的影响
PEG20kD-cys34HSA与PTX的不同投料比下制备的纳米粒粒径图见图12、表3。
表3不同PEG20kD-cys34HSA、PTX投料比制成的纳米粒的粒径
由图12和表3可见，当投料比为1：10和1：20时，PEG20kD-cys34HSA和PTX制备的纳米粒粒径几 乎没有改变，并且都显著大于1：5投料制备的纳米粒。因此，制备PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒时， PEG20kD-cys34HSA和PTX的摩尔比同样定为1:10。
3.3.2 PEG20kD-cys34HSA与ICG投料比对纳米粒的影响
见表4。
表4不同投料比制成的纳米粒中PTX和ICG的含量比
HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX和ICG的含量比为2.82，由表4可知，当PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG 的投料比为1：10：2时，PTX和ICG的含量比为2.85，最接近于HSA/PTX/ICG纳米粒中PTX和ICG的 含量比，因此PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG的投料比应选择为1：10：2。
3.3.3反应温度对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应温度下制备的PEG20kD-cys34HSA纳米粒TEM图见图13。由图13可见，虽然在25℃和10℃ 条件下PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG均能形成粒径均匀的紧实纳米粒，但在10℃条件下 PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG形成的纳米粒数量多、蛋白碎片少，因此PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG 形成纳米粒的适宜反应温度为10℃。
3.3.4反应时间对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同反应时间下制备的PEG20kD-cys34HSA纳米粒TEM图见图14。由图14可见，反应时间设置为24 h时，PEG20kD-cys34HSA集结成不规则块状，直径逼近300nm，而反应时间设置为12h时，PEG20kD-cys34HSA、 PTX和ICG形成形状规则的球状纳米粒，粒径大约在150nm左右，因此PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG 形成纳米粒的适宜反应时间为12h。
3.3.5搅拌速度对PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的影响
不同搅拌速度下制备的PEG20kD-cys34HSA纳米粒TEM图见图15。由图15可见，搅拌速度设置为1000 r/min时，PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG形成的球状纳米粒数量最多，蛋白碎片最少，因此 PEG20kD-cys34HSA、PTX和ICG形成纳米粒的最佳搅拌速度为1000r/min。
3.4不同纳米粒的理化性质比较
搅拌过夜并离心后的纳米粒反应液见图16，HSA/PTX/ICG、PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG、 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的粒径和Zeta比较见图17、图18、表5。Zeta电位比较见图18，TEM透射 电镜图比较见图19。不同纳米粒的载药量见表6。由图16可知，HSA/PTX/ICG、PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG 和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG以相同摩尔浓度的反应经过搅拌和离心后，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒 反应液所显示出的ICG颜色最深，HSA/PTX/ICG纳米粒反应液次之，PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒反应 液的颜色最浅，表明PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒中结合的ICG最多，HSA/PTX/ICG纳米粒次之， PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒结合ICG最少。
表5纳米粒的粒径及Zeta电位结果
表6不同纳米粒的载药量
由图17、图18和表5可知，对HSA进行修饰后，纳米粒粒径显著增大，Zeta电位也逐渐增大。由图 19可以看出，PEG修饰可以显著增强HSA载PTX和ICG形成纳米粒的能力，HSA不经纳米粒修饰时，形 成的纳米粒数量少并且形状不规则。当用mPEG-MAL(5kDa)对HSA进行修饰再与PTX、ICG形成纳米 粒时，可以明显发现形成纳米粒数量增多，且形状较为规则。当用mPEG-MAL(20kDa)对HSA进行修饰 再与PTX、ICG形成纳米粒时，纳米粒数量最多，形状最为均匀规则。由表6可知，与HSA/PTX/ICG纳米 粒相比，PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒对PTX和ICG的载药量均出现了一定程度的降低， PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG对PTX和ICG的载药量出现了显著的升高。
对HSA进行PEG修饰后，由于PEG的亲水性，大大提高蛋白在与水混溶的有机溶剂(四氢呋喃、乙 腈、乙醇、甲醇)中的溶解性，从而更有利于PTX诱导HSA自组装，得到形状更为均匀规则的纳米粒。 PEG修饰引入的大量的氢键，也有助于自组装纳米结构的稳定性。mPEG-MAL(5kDa)与HSA共价连接 后，PEG(5kDa)利用自身大量的氢原子，与大量水分子以氢键相连，形成一个无规则的线团，覆盖在HSA 表明，阻止PTX和ICG与HSA在疏水性结合位点的结合，因此PEG5kD-cys34HSA对PTX和ICG的载药 量均出现了一定程度的降低。而PEG(20kDa)虽然对HSA的疏水性结合位点有一定的覆盖作用，但较长 的亲水性PEG链既有利于疏水性药物PTX和ICG的结合，同时也可以包裹一部分的PTX和ICG，两种因 素博弈导致PEG20kD-cys34HSA对PTX和ICG的载药出现了显著的升高。
实施例3纳米诊疗制剂PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG的靶向性和体内抗肿瘤活性研究
本实施例以4T1细胞的荷瘤小鼠为模型，采用活体光学成像系统对给药后的小鼠在指定的时间点进行 监测，观察药物随着时间的变化在小鼠体内各器官的分布变化情况和在肿瘤组织中的聚集情况，并评价制 备的不同纳米药物在化疗/光热联合疗法下对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用。因为 PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的PTX和ICG载药量均低于HSA/PTX/ICG，因此本实施例只讨论 HSA/PTX/ICG纳米粒和PEG20kD-cys34HSA/PTX/CG纳米粒的靶向性和体内抗肿瘤效果。
1、试剂与材料
PTX，购自江苏红豆杉药业有限公司；ICG，购自西安瑞禧生物科技有限公司；聚氧乙烯蓖麻油，购自 上海阿拉丁试剂有限公司；二甲苯、无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；H&E染色套装，购自武 汉谷歌生物科技有限公司；PBS，购自中科迈晨(北京)科技有限公司；胰酶、青霉素-链霉素-庆大霉素混 合溶液，购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基，购自以色列Biological Industries 公司；生理盐水，购自辰欣药业；多聚甲醛，购自广州赛国生物科技有限公司；异氟烷，购自北京友诚嘉 业生物科技有限公司。所有化学试剂均是分析纯。
鼠源乳腺癌细胞(4T1细胞)，山东大学药学院生化与生物技术药物研究所保存；BALB/c雌性小鼠， 18-20g，北京维通利华实验动物技术有限公司。动物实验获得山东大学齐鲁医学院实验动物伦理审查委员 会的审查批准，并遵循中国国家实验室动物护理和使用指南。
2、实验方法
通过小动物活体成像，观察HSA/PTX/ICG纳米粒和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒经过尾静脉注 射入荷瘤小鼠体内后，随时间变化的分布情况，记录在肿瘤组织蓄积最多的时间点。在体内抗肿瘤活性评 价实验中，纳米粒在肿瘤部位蓄积最多的时候，给与肿瘤部位808nm激光照射，实现PTX和ICG协同的 化学和光热治疗。
2.1体内活体成像和生物分布研究
将ICG通过尾静脉注射入小鼠体内后，可以通过小动物活体成像观察游离ICG和HSA/PTX/ICG、 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒随时间变化的分布情况。
2.1.1建立荷瘤小鼠模型
9只18-20g BALB/c雌性小鼠养于实验室适应环境约1周后，建立荷瘤小鼠模型。将处于对数生长期 的4T1细胞经胰酶消化至细胞刚好脱落，加入9倍体积完全培养基终止消化。含有4T1细胞的消化液转移 至离心管内，1000r/min离心10min，弃去上清液，以PBS重旋为1×10 7个细胞/mL的细胞悬液，立即取 细胞悬液100μL接种于BALB/c雌性小鼠腋下。用游标卡尺对肿瘤的长度和宽度进行测量
肿瘤体积的计算公式为V＝L×W2/2(L代表肿瘤的最长直径，W代表肿瘤的最短直径)。
2.1.2体内活体成像和生物分布研究
荷瘤第8天后，荷瘤小鼠的肿瘤体积长到200-300mm3，将9只小鼠随机分成3组，每组3只。各组小 鼠按ICG剂量为0.75mg/kg分别通过尾静脉注射游离ICG、HSA/PTX/ICG和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG。 HSA/PTX/ICG纳米粒和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒以生理盐水溶解。在注射后1、2、4、6、8、24 h的时候，利用异氟烷麻醉小鼠，并置于小动物活体成像仪器内对给药后的小鼠进行活体荧光成像监测，观 察药物随着时间的变化在小鼠体内的分布变化情况和在肿瘤组织中的聚集情况。24h后，处死小鼠，将其 解剖，剥离出肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，观察24h后ICG在小鼠主要脏器内的分布情况。
2.2纳米粒的体内抗肿瘤活性评价
2.2.1建立荷瘤小鼠模型
30只18-20g BALB/c雌性小鼠养于实验室适应环境约一周后，按照2.1.1项下的方法建立荷瘤小鼠模 型，并利用游标卡尺测量瘤块体积。
2.2.2体内抗肿瘤活性评价
荷瘤第6天后肿瘤长到80mm3。将荷瘤小鼠按照每组5只的数量分成6组，各组小数按PTX剂量为13mg/kg、 ICG的剂量为4.6mg/kg分别尾静脉注射PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG、HSA/PTX/ICG、游离PTX、游离ICG、游 离PTX+游离ICG、PBS，每4天给药一次，共给药4次。每次给完药4h后，用808nm激光以1W的功率照射肿 瘤5min。每2天测量一次瘤块的长径(L)与短径(W)，称量一次小鼠体重。16天后处死小鼠，取出肿瘤并称量， 剥离出小鼠的心、肝、脾、肺、肾。
2.2.3肿瘤组织和主要脏器的组织病理学切片实验
实验结束后，将小鼠脱臼处死，将各组小鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾浸泡于4％多聚甲醛中进行固 定。固定后石蜡切片，用二甲苯和无水乙醇对切片进行脱蜡处理。脱蜡处理后，利用苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin staining,H&E)染色，置于显微镜下观察，进行组织病理分析。
3、实验结果与分析
3.1纳米粒体内活体成像和生物分布
游离ICG和纳米粒在荷瘤小鼠体内的荧光示踪见图20。从图20可以看出，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳 米粒组在肿瘤部位的蓄积明显多于游离ICG组和HSA/PTX/ICG纳米粒组。尾静脉注射4h后， PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒蓄积在肿瘤部位的量达到了峰值，而游离ICG和HSA/PTX/ICG更多地蓄积 在肝脏组织。
尾静脉注射游离ICG和纳米粒24h后小鼠主要脏器和及实体瘤的荧光成像见图21。由图21可知，尾静脉注 射24h后，游离ICG组的肿瘤部位无ICG滞留，HSA/PTX/ICG制剂组存在少量纳米粒滞留， PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组中制剂滞留明显多于HSA/PTX/ICG制剂组。
由图20和图21可知HSA经过mPEG-MAL(20kDa)后，靶向性和滞留性得到了明显的增强。这可能是由以 下原因导致：一方面，经过PEG修饰后，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的粒径增大，增强了EPR效应的被动 靶向作用；另一方面，PEG修饰大大促进了PEG20kD-cys34HSA和PTX、ICG形成形状均匀规则的纳米粒，而形状 规则的纳米粒更有利于发挥纳米粒的EPR效应，同时，HSA经过mPEG(20kDa)修饰后，PEG20kD-cys34HSA与 体内血红素的亲和力降低，更多有效的PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒能够靶向至肿瘤部位。PEG20kD-cys34HSA 的分子半径增大，半衰期延长，由此导致24h后PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组的肿瘤组织中还存在较高浓度 的PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG分布。
3.2纳米粒的抗肿瘤活性评价
纳米粒的抗肿瘤实验结果见图22至图25。由图22和图23可以看出，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG(L+) 治疗组显著抑制肿瘤生长，直到实验结束，肿瘤体积维持在180mm3。而HSA/PTX/ICG(L+)治疗组实验 前期抑瘤效果显著，但从第8天开始，肿瘤体积急剧增大，第14天时肿瘤体积长至450mm3。可能是因为 HSA/PTX/ICG不稳定，易降解，当肿瘤体积尚小时HSA/PTX/ICG(L+)还能起到较好的治疗效果，但随 着肿瘤的增大，加上HSA/PTX/ICG纳米粒靶向性不好，治疗效果明显低于PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳 米粒。
从图24可以看出，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组的小鼠体重在正常范围内波动，提示 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的毒性并不突出，在可接受的范围之内。
由表7可知，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组的抑瘤效果十分突出，抑瘤率为94.55％，相比之下 HSA/PTX/ICG制剂组的抑瘤率为63.15％，两种制剂的抗肿瘤活性存在明显区别。一方面是因为 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的靶向性显著强于HSA/PTX/ICG纳米粒；另一方面， PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒在肿瘤部位的停留时间也长于HSA/PTX/ICG纳米粒。双重因素导致 PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的抗肿瘤效果显著强于HSA/PTX/ICG纳米粒。
表7不同药物的抑瘤率
3.3组织病理学切片实验实验结果
所有组别的心脏组织心内膜、心肌膜及心外膜结构清晰，心壁及心腔未见明显异常；心肌 纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常； 均未见明显的炎性变化。而在肝脏组织中，所有组别均存在肝细胞颗粒变形、胞质疏松淡染的 情况，PTX组、ICG组、PTX+ICG组、HSA/PTX/ICG制剂组的小叶内均可见大量髓外造血灶， 而PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组虽然广泛可见肝细胞颗粒变性，胞质疏松或呈空泡状， 但不存在髓外造血灶，提示肿瘤的存在会影响正常骨髓的造血功能，致使肝脏恢复胚胎时期的 造血功能，但PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组因为可以将肿瘤的体积抑制在180mm3左右， 肿瘤对小鼠的影响有限，因此造血功能不受影响。
在肺脏组织中，所有组别均存在肺泡壁轻度至中度增厚、肺泡狭窄、粒细胞浸润的情况，不同的是PBS 组还存在局部轻度出血的的状况，这一现象提示所有组别均出现了炎症反应，治疗组的肺脏情况均好于PBS 组。在肾脏组织中，所有组别均存在皮髓质交界处较多肾小管上皮细胞水肿、周围肾小管间质可见少量粒 细胞浸润的情况，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组的炎症反应略轻于其他组别。在肿瘤组织中，ICG组、 PTX+ICG组、HSA/PTX/ICG制剂组和PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组因为808nm近红外对光热物质 ICG的激发引起光热效应，导致肿瘤细胞出现大面积坏死，其中又以PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG制剂组的坏死面积面积占比最为显著，HSA/PTX/ICG制剂组次之，这主要是因为PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米 粒的强靶向性导致肿瘤部位的ICG聚集多，光热转换效率因此也最高，同时HSA经mPEG(20kDa)修饰 后，半衰期延长。因此PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒在体内抗肿瘤活性强于HSA/PTX/ICG纳米粒的 同时，对肝脏等器官的毒性也小于HSA/PTX/ICG纳米粒。
综上，
(1)对HSA进行PEG修饰后，HSA包载PTX和ICG形成的纳米粒粒径和Zeta电位均显著增大，并 且PEG分子量越大，HSA修饰后形成的纳米粒粒径和Zeta电位也越大。
(2)相比于HSA/PTX/ICG纳米粒，PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的PTX和ICG载药量均有一 定程度的下降，因为mPEG-MAL(5kDa)修饰，遮蔽了HSA的部分疏水性结合位点；PEG5kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的PTX和ICG载药量和包封率却出现了明显的增高，因为mPEG-MAL (20kDa)修饰对HSA的结构影响小，对HSA的疏水性位点的遮蔽效应小，同时亲水性的PEG长链更有 利于PTX和ICG的结合。
(3)相比于HSA/PTX/ICG纳米粒纳米粒，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的肿瘤靶向性更强，一 方面是因为PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的粒径更大，更容易通过EPR效应穿透肿瘤血管，靶向至 肿瘤部位；另一方面，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的形状更为均匀规则，数量也更多。
(4)相比于HSA/PTX/ICG纳米粒纳米粒，PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的体内抗肿瘤活性更强。 一方面是因为PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的靶向性更强，另一方面是PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG 纳米粒在肿瘤部位的滞留时间更长。强靶向性和长滞留性造就了PEG20kD-cys34HSA/PTX/ICG纳米粒的强抗 肿瘤活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以 有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种PEG化人血清白蛋白纳米材料，其特征在于，所述纳米材料包括由PEG-cys34HSA自组装形成的纳米粒，以及负载在纳米粒上的疏水性药物和有机近红外荧光染料；
其中，所述PEG-cys34HSA为单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL对HSA的游离的半胱氨酸残基Cys34进行定点PEG修饰后获得。
2.如权利要求1所述的PEG化人血清白蛋白纳米材料，其特征在于，PEG的相对分子量Mr为1k～20kDa，优选为5k～20kDa；所述单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺与HSA的摩尔比为1:1～5。
3.如权利要求1所述的PEG化人血清白蛋白纳米材料，其特征在于，所述疏水性药物为紫杉醇PTX；
所述有机近红外荧光染料为吲哚箐绿ICG。
4.如权利要求3所述的PEG化人血清白蛋白纳米材料，其特征在于，所述PEG-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1:10:1～10，优选为1:10:1～5，更优选为1:10:1～3，包括1:10:2、1:10:2.5；
所述纳米粒粒径为150-250nm，Zeta电位为-10～-1mV。
5.权利要求1-4任一项所述PEG化人血清白蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、HSA的Cys34定点PEG修饰得PEG-cys34HSA；
S2、将疏水性药物溶液和有机近红外荧光染料溶液加入PEG-cys34HSA水溶液中，搅拌后加入缓冲液，离心透析后即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体方法包括：
将HSA与mPEG-MAL加入缓冲液，在30～40℃(优选37℃)振荡10-30h后分离纯化后即得；
优选的，PEG的相对分子量Mr为1k～20kDa，进一步优选为5k～20kDa；所述mPEG-MAL与HSA的摩尔比为1:1～5，如1:2；
所述分离纯化包括将反应液经滤膜过滤以及进行离子交换层析的步骤。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述疏水性药物为紫杉醇PTX；所述疏水性药物溶液为PTX的无水甲醇溶液；
所述有机近红外荧光染料为吲哚箐绿ICG；所述有机近红外荧光染料溶液为ICG的DMSO溶液；
优选的，所述PEG-cys34HSA、PTX和ICG的摩尔比为1:10:1～10，进一步优选为1:10:1～5，更优选为1:10:1～3，包括1:10:2、1:10:2.5；
优选的，所述搅拌反应具体条件包括：在10～25℃条件下反应10～30h，优选为在10℃条件下反应12h，搅拌速度控制为500～1000r/min，优选为1000r/min；
所述缓冲液为PBS缓冲液；
透析次数控制为4～5次，每次2～3h，透析分子量为12～14kDa。
8.权利要求1-4任一项所述PEG化人血清白蛋白纳米材料在制备肿瘤诊疗产品中的应用。
9.一种肿瘤诊疗产品，其特征在于，所述肿瘤诊疗产品其包含权利要求1-4任一项所述PEG化人血清白蛋白纳米材料；
优选的，所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
10.一种肿瘤诊疗系统，其特征在于，所述肿瘤诊疗系统包括权利要求1-4任一项所述PEG化人血清白蛋白纳米材料或上述肿瘤诊疗产品，以及如下任意一种或两种装置：
a)活体荧光成像装置；
b)光照装置；
优选的，所述光照装置发射光源为近红外光源，更优选的，所述光源波长为808nm。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012166622A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Baxter International Inc. | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| CN104043135A (zh) * | 2014-06-13 | 2014-09-17 | 苏州大学 | 一种白蛋白吲哚菁绿紫杉醇复合物及其制备方法与应用 |
| US20170119914A1 (en) * | 2015-10-29 | 2017-05-04 | Institute of Nuclear Energy Research, Atomic Energy Council, Executive Yuan, R.O.C. | Nanoparticles and method for manufacturing the same |
-
2022
- 2022-03-18 CN CN202210269130.XA patent/CN114652848A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012166622A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Baxter International Inc. | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| JP2017206513A (ja) * | 2011-05-27 | 2017-11-24 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 増加した半減期を有する治療用タンパク質およびそれを調製する方法 |
| CN104043135A (zh) * | 2014-06-13 | 2014-09-17 | 苏州大学 | 一种白蛋白吲哚菁绿紫杉醇复合物及其制备方法与应用 |
| US20170119914A1 (en) * | 2015-10-29 | 2017-05-04 | Institute of Nuclear Energy Research, Atomic Energy Council, Executive Yuan, R.O.C. | Nanoparticles and method for manufacturing the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JONATHAN G. MEHTALA等: "Cys34-PEGylated Human Serum Albumin for Drug Binding and Delivery", 《BIOCONJUG CHEM》 * |
| 周琴琴等: "清蛋白作为药物载体的PEG化修饰研究进展", 《药学实践杂志》 * |
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