JPS62181221A - 免疫不全症候群治療用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胸腺抽出物画分を含有する医薬組成物に関する
。

従来の技術 身体の免疫器官は胸腺により調節されること、かつこの
ような機能は胸腺の無細胞蛋白質抽出物によっても営な
まれ得ることは知られている。

従って近年、胸腺組織抽出物の製造、用途及び作用様式
の多数の研究がなされて来た（例えばオソバ（Ｂ、Ｄ、
　０ｓｏｂａ　）及びミラー（、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｐ。

Ｍｉｌｌｅｒ　）、泳イチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　１
９９巻（１９６３年）　ｓ　ｉ−ルｙ　スｐ　イン（Ａ
−ＬａＧｏｌｄａｔｅｉｎ　）及びホワイト（Ａ、　Ｗ
ｈｉｔ　）、ＣＯｎｔｅｍｐ、　Ｔｏｐｉａａ　ｉｎ　
ｘｍｍｕｎｏｌｉｏｌｏｇｙ　１９７３３３９；ビル（
Ｃ，Ｂｉｒｒ　）及びストーレンヴエルク（Ｕ、　５ｔ
ｏ１１ａｎｖｅ＝ｋ　）　、アンゲヴアンｙテヒエミイ
（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍｉａ　）　９１巻（１９７９
年）４２２Ｊｊ；アンゲヴアンｒテヒエミイ、インター
ナシ当ナル　エディジョン　イン　イングリフ　シュ（
Ａｎｇｅｗ、　Ｃｂｅｍｉｅ、　Ｉｎｔ、　Ｅ（１゜Ｅ
ｎｇｌｉｓｃｈ　）　１８巻（１９７９年）３９４頁）
参照）。すなわち例えば、子ウシの胸腺の無細胞蛋白質
抽出物、例えばチモシンフラクション／１６５の表示の
標準曹剤は様々の範囲で免疫不全症候群、例えば移植組
織の低減した拒絶、増加した感染感受性、加速された老
化及び高められた腫瘍確率を抑制することが判明した。

最近、白血病又はその仲の囁、患者にチモシンフラクシ
ョン扁５を臨床的に使用し、特に肺癌の場合に（伏すで
に治療効果に結びついたことも報告された（フレチェ７
　（Ｐ、Ｂ、　Ｃｈｒｅｔｉｅｎ　）等著、Ｊ、Ｄ、　
ＣａｎｃｅｒｔｒｅｌｌＬｔ、　Ｒｅｐｏｒｔ　６２　
（１９７８）１７８７〜１７９０）。

１９７７年にｄ−ルＦ　スｐ　４　：／　（Ａ、Ｌ。

ＧＯ１４ｓｔｓｉｎ　）等（Ｊ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
　１．　Ａａａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７４　（１９７７）　７２５　）は、チモシン
ーポリペデチー浴合物から酸性の成分を純粋な形で分離
すみことに成功し、そねをチモシンーα１と表示し、そ
ｔについてのベプチｒ配列も示した。チモシンーα１は
２８個のアミノ醜、分子量３１０７を有する。チモシン
ーα１は胸腺かめ ら極ｊて煩雑に単離さ第１るので、すでにその完全合成
への方法も提案された（ジャーナル　オデ　アメリカン
　ケミカルソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉθｔｙ　）　１
０１．１（１９７９）２５３〜２５４；西ドイツ国特許
公開公報（ＤＥ　−Ｏ８’）第２９１９５９２号明細書
）。

チモシンーα１は分子量３１０７及び２８個のアミノ酸
を有する比較的に大きなポリペブチｒであシ、その合成
の困難さは報告されている；チモシンーα１の代シにチ
モシンーα１−断片を免疫治療に使用するととも公知で
あり、これはその上シ低い分子量に依シより簡単に、よ
〕高い収率で、かつより良好な純度で製造される（西ド
イツ国特許公開公報（ＤＥ　−Ｏ８）第３１００９７４
号明細書＃照）が、免疫調確作用又は免疫刺激切用をよ
り少ない範囲しか示さない。

発明が、解決しようとする問題点 ところで、胸腺組織−抽出物の２．１１’ｉ類の一定の
画分、つまり低分子蛋白質及び／又はオリビペプチドエ
ク成る画分及びＦＪ器器具異性オリがペプチドと結合し
ているり１１υラビンを含有する黄色画分よりなるａ金
物は鏝れた免疫学的特性を有し、この特性はチモゾンフ
ラクション眉５のそｉｔ又はチそシン−α１のそれと比
較可能であり、かつこの特性は作用強度において一部分
はむしろ凌駕することが判明した。従って本発明による
医ｇｍ成物は免疫不全症候群、例えばＴ−細胞不全症状
、加速されｆｃ老化、高められた腫瘍形成確率及び特に
癌の治療に好適である。

問題点を解決するための手段 従って本発明の目的は、胸腺抽出物の分別によって得ら
れる、低分子蛋白質及び／又はオリデ（ブチｒよりなる
画分及び臓器特異性のオリゴペプチｒと会合しているリ
ボフラ♂ンを含有する黄色画分を含有する又はこれらの
画分より成ることを特徴とする医薬組成物である。七の
有利な実施態様は特許請求の範囲２〜５及び実施例から
引用される。

殊に低分子蛋白質及びオリゴペプチ−の分子量は＜２０
００ダルトンである。臓器特異性のオリビペデチドと会
合されたりがフラ♂ンを含有する抽出物画分において、
”会合 （ＡｓｅＯＺｉａｔｉＯｎ　）　”とは、例えば補酵素
／補欠分子族系で存在するような結合と解さねうる。

抽出物を取得するための出発臓器は胸腺であり、この際
臓器供与体としては特に屠殺動物、殊に子ウシがこれに
該当する。

意外にも、２ｔ１類の抽出物画分の各個々、すなわち低
分子蛋白質及び／又はオリゴペプチドよりなる画分又は
臓器特異性のオリゴペプチドと会合しているリボフラビ
ンを含有する黄色画分は、本発明による組成物とは異な
る作用及び／又は実際にそれよりも弱い作用を示すこと
が判明した；２つの成分の相乗的に作用する組合せがは
じめて本発明による効果を示すのである。

本発明による組成物については、公知のチモシンーフラ
クション１６５のそれよりも良好である優れた免疫刺激
作用が判明した。その製剤は免疫刺激作用を有し、かつ
その際、癌細胞に対する有効性を示すばかシでなく、エ
イズ（Ａｌｓ　）及び重症のヘルペスにおいても者しく
有効であると立証された。これは例えばＴ−サかである
。

分別のための出発物質として使用される胸腺抽出物は自
体公知の方法で胸腺の抽出により得ることができる（オ
ソバ（Ｂ、Ｄ、　０ｓｏｂａ　）及びミラー（Ｊ、Ｆ、
Ａ、Ｐ、　Ｍｉ’１ｌｅｒ　）　４、ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ　）　１９９巻（１９６３年）６５３；イエガ
ー（Ｋ、Ｈ，Ｊａｅｇｅｒ　）尋者、Ｐｈａｒｍ、　Ｒ
ｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎｌｃａｔｉｏｎ　ｊ　６巻（１９８４年）
慮６．５５９参照）。

本発明による組成物の製造は、例えば次の方法で行なう
ことができる： 機械的に砕壊した臓器から外来のプロテアーゼ（蛋白質
分解酵素）、例えばパンクレアチン製剤又は同様にパパ
インの存在で水での抽出によう得られる、中間貯蔵のた
めに場合により水溶液、ペースト状物として又は噴霧乾
燥されて存在する抽出物を、攪拌下に水中に溶かし、こ
の水溶液を場合により混濁物質の濾別後に、フェノール
で抽出し；相分ｍ（水相は廃棄する）後に、フェノール
相にエタノールを混ぜ、この際低分子蛋白質及び／又は
オリゴペプチドよりなる画分（以後常にペプチド画分と
して表示する）が沈殿するからこれを濾別し、沈殿濾液
から黄色画分をカラムクロマトグラフィーにより単離す
ることができる。この際得られる画分から、臓器特異性
のオリゴペプチドと会合しているリボフラビンを含有す
る黄色画分（以後常に黄色画分又は黄色物質として表示
する）を分離し、かつ合一し；残シＯ画分は廃棄する。

こうして得られる黄色画分を更にクロマトグラフィー（
閉鎖クロマトグラフィー）により、例えば、□□＋、７
アアツ／　、、、（５ｅｐｂ工。工■）１ヨー２０−カ
ラムで、溶離剤として水（トリフルオルエタノール１チ
）を用いて分離することができ；この場合には殊にこの
第２のクロマトグラフィー分離で得られる主画分、及び
特に黄色成分（リボフラぎン／オリゴペゾチｙ）′ｔ−
含有する画分を本発明による医薬組成物の黄色画分（黄
色物質）として使用する。

個々の方法工程は自体公知の方法で実施することができ
る。クロマトグラフィー分離は閉鎖クロマトグラフィー
（分子篩−効果）に常用の条件下で、かつ適当な常用の
填料（例えば珪酸［Ｆ］ ゲル、セファデックス（Ｓθｐｈａａｅｘ　　）　）及
び溶離剤（例えば水／トリフルオルエタノール１チ）を
用いて実施することができる。フェノール−沈殿濾液の
第１カラムクロマトグラフイーは殊に酸化アルミニウム
カラムで、かつ溶離剤として水を用いて実施する。

油出物の溶解用及び溶離用の水としては、殊に菌の少な
い濾過した水、無菌水又は蒸留水を使用する。個々の方
法工程は有利に不活性気体雰囲気下、例えば窒素ガス下
で実施され、ぴ過は殊に滅菌濾過の条件下で実施される
。

真空中のペプチド画分の乾燥及び真空中の回転蒸発器で
の黄色画分の注意深い蒸発濃縮により、又は凍結乾燥に
より、結晶化した乾燥生成物が得られる；この際乾燥は
両方の場合とも≦６０°Ｃの温度で実施されねばならな
い。

しかしペプチド画分及び黄色画分は水溶液として又は濃
縮物として、場合によりその他の医榮助剤及び／又は賦
形剤及び／又は作用物質の添加後に、直接使用すること
もできる；製造に依シ溶液はなお少量のフェノールを含
有する仏これは障害にはならない。特に濃縮物の製造の
際には、しかし溶液においても、安定剤、例えば更に、
水性′ａｍ物又は溶液に対して約０．３〜１．０重量係
、特に０．５重量幅の濃度までのフェノールを添加する
ことが同様に有利であり得る。

しかし溶液から、例えば中間貯蔵後に、乾燥物質を、例
えば凍結乾燥により単離することもでき、次いでこれを
そのものとして、又はその他の作用物質及び／又は医礒
助剤及び賦形剤と共に適用することができる。

一般に低分子蛋白及び／又はオリイペゾチｒよりなる画
分（ペプチｒ画分）の黄色画分に対する量比は、この２
つの成分が臓器抽出及びそれに続く抽出物からの分離の
際に得られる割合に相当する：しかし若干の場合、例え
ば特殊な適用には、一方の成分又は他の成分を過剰で又
は抽出から直接イυらハる量比とは別の割合で通用する
ことも；自利であり得る。

医梁助剤及び賦形剤としては全てのこのような適用目的
に適当な助剤及び賦形剤と使用することができ、この際
その選択は、特に所定の固体又は液状の適用形態（錠剤
、糖衣錠、カプセル剤、シロップ、溶液、注射用溶液等
）によう適応させる。１種又は数才澹のその他の、適応
症の範囲で適当な作用物質との本発明による抽出物混合
物を使用することもできる。

本発明で、有利な実施態様に関連する次の実施例につき
詳説するが、本発明はこれに限定されるものではない。

他の記載のない限り、前記及び後記のパーセントの記載
は重量係に、温度の記載は０Ｃに依る。

実施例 例　　１ ａ）フェノールとして、ＤＡＢ７の純度基単に相応する
化学的に純粋なフェノールを使用する：エタノールとし
ては無水の、かつメチルエチルケトンで変性されたエタ
ノールを使用する。

砕壊した子ウシ胸腺から得られる抽出物を攪拌下に水（
濾過して菌を少なくした）中に約２０重１１チの濃度で
（乾燥残渣に対して）溶かす。この水溶液をフェノール
（１重量％）と共に保存する。１〜１０日間の中間貯蔵
の後に、水溶液を濾過によって澄明にし、濾別された懸
濁物質は廃棄する。

澄明濾液にフェノールを混ぜ、約５分間攪拌する；相分
離の後（約２〜５時間）、上層の水相（フェノール約７
ｍ１ｌｌ）を溜去し、かつフェノール相を、濾過して細
菌を少なくした水で５回（そのつと５分間攪拌する）洗
浄し、次いで鉱物質を除去した水で１回洗浄する。この
際洗浄水中に溶解するフェノール量は絶えず補給する。

洗浄されたフェノール相を攪拌下にエタノール中に装入
し、この際ペゾチドが沈殿する。

濾過後に検板上に得られる残渣（ペデチｒ画分）をエタ
ノールで、洗浄アルコール中のフェノール含量が約１重
量係になるまで、洗浄する。濾過残渣を濾過器上で前乾
燥（真空、濾過した菌を少なくした空気）後に最高６０
°０で真空中乾燥する。

ｂ）例１　ａ）により得られるペプチＰ画分（以後１０
１／８３と表示する）の物理的−化学的炭素、水素及び
窒素の元素を酸素流中での燃焼及び引続いて一酸化窒素
の還元により二酸化炭素、窒素及び水としてガスクロマ
トグラフィーにより測定した。偕黄測定は硫酸塩として
過塩素酸バリウムでの滴定により行なった。

１０１　／　８３　：　ｃ　４６．５２　ａ４　　Ｈ６
，９２％Ｎ　１４．３％　Ｓ　Ｏ，８３％ ８６をスタイｙ　（５ｔｅ１ｎ　）及びモア（Ｍｏｏｒ
ｓ　）の方法により、自動アミノ酸−分析器（バイオト
ロニック社製（Ｆｉｒｍａ　Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ　）　
）を用いて、各前処理なしに、定量的に遊離アミノ酸含
量について検査した。秤量した試料を分析器の一定量の
出発緩衝液中に溶解し、一定部分を装置中に注入した。

ペプチド画分（１０１／８３）１■は、次の遊離アミン
ｉ（ｎモル）ニジスティンスルホン酸５６゜０、アスパ
ラギン酸２１．＜Ｓ、セリン５．４、グルタミン酸６．
０、プロリン１１゜６、ヒスチジ；／１７．８、アルギ
ニン約２０を、明確に同定できないアミノ酸１８７及び
１７．８　ｎモルと共に含有する。

１０１／８３を封管中で濃塩酸／水（１：１）中で１２
０°Ｃで２４時間完全に加水分解し、真空中で蒸発濃縮
し、残渣を分析器の一定量の出発緩衝液（ｐｉ−１１，
８）中に溶かし、一定部分を装置に注入した。

物質１０１／８３（胸腺からのベプチｒ画分）１０４μ
ｙは、総合して次のものより成る（ｎモル）ニジスティ
ンスルホン酸１３．５５（２，２９μｇ）、アスパラギ
ン酸６０゜９５（８，１１μｇ）、スレオニン１８．１
　（２，１６μｇ）、セリン２２．６　（２，３８μｇ
）、グルタミン酸６１．１（８，９９μｇ）、ゾロリン
９０．６（１０，４μｇ）、グリシン１４３．１（１１
，１２μｇ）、アラニン４９゜１５（４，３８μｇ）、
バリンろ７゜０（４，３６μｇ）、イソロイシン２５．
８　（３，３８μｇ）、ロイシン３６．９５　（４，８
５μｇ）、チロシン４．４（０，７９７μｇ）、フェニ
ルアラニン１７．５５（２，９μｇ）、リジン３６．１
　（５，２７μｇ）、ヒスチジン１２゜６５（１゜９６
μｇ）、アルギニン５４．４８　（６，ｔ１μｇ）。

従って胸腺からのベプチｒ画分は、加水分解可能なアミ
ノ酸（ペプチド性物質；　ＨＰＬＣによりヌクレオチー
を定性的に立証した）約７６憾に相当する。結果を第１
図に示す。

２．１　　ポリアクリルアミター１＠気泳動：３００Ｘ
１　ｓｏｘ　１ｍの大きさの分１ｌｆＩ！ゲルを注型し
た。架橋度１０−１１５−及び２０チのゲルを使用した
。分離はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）の存在で
行なった。

このゲルの特別製造のために次の基準溶液を使用した： 下部トリス−緩衝液ニ トリス３６．３４、濃ＨＣｊ５−及び１０俤の５ＤＢ−
溶液８−′ｆ：■】２０で２００１に充す（ｐＨ＝８．
８）。

上部トリス−緩衝液ニ トリス６．０６　ｇ、濃ＦＩ　Ｃ１４ｒＩＬｔ及び１０
チの５ＤＳ−溶液ｔ−Ｈ２Ｏで１００ＷＬｔに充す。

電気泳動−緩衝液： 槽−緩衝液２５０１ｒＬｔ及び１０係の：３Ｄ８−溶液
１０ｍｔｆ：１０００−に充す。

槽−緩衝液： トリス１２゜０及びグリ７ン５７．６ｇをＨ２Ｏで１０
００ＷＬｔに充す。

アクリルアミｒ−溶液： アクリルアミド５０９及びＮ　、　Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミ−０，８９をＨ２Ｏで１００−に充す
。

過硫酸アンモニウム： 水中の１０チ新製溶液。

ナ性−緩衝液 グリセリン２０％、５ＤＳ５％、メルカプトエタノール
３チを有する電気泳動−緩衛液＋デロムフェノールデル
ー。

固定浴：　１２．Ｓ係のＴＣＡ 染　浴：　ＭｅＯＨ５００ｍｌ、Ｈ２Ｏ５００ＷＬｔ及
びＡｃＯＨ１４Ｑ＋＋＋ｊ中のクーーｒ’／−ブルー２
．７５　、！７ 脱色浴：　ＭｅＯＥ（１００ｍｌ及びＡｃＯＨ１５０ｍ
ｌ’ｒＨ２０で２０００−に充す。

分離ゲル　　　出発ゲル （１０チ） Ｈ２Ｏ８，３３ｒＩＬｔ３．２５　ｄ 上部トリス−緩衝液　　５．００ 下部トリス−緩衝液　　　　　　　１．２５アクリルア
ミげ一溶液：　　　６．６７　　　０．５５テトラメチ
ルエチレンジアミン　０．［］２　　　０．０１（ＴＥ
ＭＥＤ　） 硫酸アンモニウム　　　　　０．０１　　　０．０２実
　　施 塗布される試料の濃度： １　０１／８’５　　：　　７．５１！／６（：ｌ　　
）ｔｌ試料を変性−緩衝液５０μ！及びプロムフェノー
ルゾルーー溶液１０μｌ各々中に装入した。

各２０μｌを塗布した。

電気泳動分離のために先ず４５分間１３ｍＡ（最高４０
０Ｖ）で試料を収集ゲル領域（出発帯域）中で濃縮し、
かつ６時間一定の５３　ｍＡ（８°Ｃ冷却）で′徨気泳
勧にかけた。

展開のためにゲルを引続きサンＰイツチー室に装入し、
４５分間２２℃で染浴中で処理した。

過剰の染料を脱色浴中で浴液を砿回取シ替えながら８時
間で除去した。

結果：ペデチｒ製剤について予想されるように、１０１
／８３は１０％架橋化のポリアクリルアミｒ−ｓＤｓ−
ｒルにおいては電気泳動的には個々の成分に分離するこ
とはできない：このことは低分子ペプチげの含量を示す
。

２．２　濾紙電気泳動 物質１０１／８３を濾紙電気泳動法により検査する実験
においては、この物質は高圧電場におけるこの条件下で
は分離不可能であり、ニンヒドリンで呈色可能な、混合
ペプチドに特有に広巾ににじんだ帯域を形成することが
立証された。

緩衝液：ｐ）１１．９；組成（１）：氷酢酢１５／蟻酸
５／水８０（容積部）。

＆ 濾紙：　Ｍａｃｈｅｒｙ　ＸＮａｇｅｌ　）７７　ｖＣ
ｏ、、駅−クロマトグラフィー紙、Ａ２１４　（２３ｘ
５８ｃｒＩＬ）。

物質試料は水／　１４　トリフルオルエタノール中に溶
解されて、出発地点に塗布された。

分離は１０００’／２時間（０°Ｃ）で行なめれた。

展開二１！気泳動濾紙を１００℃で乾燥し、かつニンヒ
げリン−溶液を噴霧した後に、分離結果’ｅ１００°Ｏ
／１０分間に加熱することによって可視化した。

３、末端基測定： ２−次元の、クロマトグラフィーによる分離における前
記の微量法で、アミノ酸、ペプチｒ及び蛋白賞のＮ−末
端をピコ−モル範囲（１０−１２Ｍ　’）で立証するこ
とができる塩化ダンシルを用いる末端基標識化法を適用
した。

ダンシル化：試験すべき物質の最少量を０．０５モルの
ＮａＨＣＯ３−緩衝液中で、１化ダンシルと反応させ、
引続き酸性加水分解した。

加水分解物を超薄−ポリアミド板上で２−次元クロマト
グラフィーによ、り倹査する：１次元、蟻酸４８％ ２次元、氷酢酸／トリオール（１：　４、”ｉｖ　）。

Ｎ−末端の標識されたアミノ酸はポリアミド板上でツー
光におけるその螢光により確認され、写真に取られる。

確認はダンシル化されたアミノ酸の略図式（Ｋａｒｔｉ
ｅｒｕｎｇｅ　ｓｃｈＱｍａ　）により行なった。

（ラッチ：ｘ、　（Ｈ，Ｌａａｔ！ｉｃｈ　）、Ｊ、（
：ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ７１７３巻（１９７８年）
第５９８〜４０２頁）。

結　　果： 主標識化：　Ａｓｐ　％二、±１−１Σ上１−三四−１
（Ｈａｕｐｔｍａ　−五５　旦１８　％　　ＮＨ４％　
　Ｃ７５Ｏ３Ｂ　Ｘ５ｉｒ　。

ｒｋｅｔｒｕｎｇ　） 裏標識化：　Ｍａｌ　、Ｉｃｅ　、Ｌｓｕ　、　Ｔｙｒ
　、　Ｐｈｅ、　Ｌｙｓ　０（Ｈｌｎｔａｒｇｒｅｎｄ
ｍａｒｋｉｅｒｕｎｇ　）４、ゲルクロマトグラフィー
： 胸腺からのベプチｖ画分（試料出発番号１０１／８３）
１．４５５Ｉｎ９を、溶離剤として水（トリフルオルエ
タノール１％）を用いてクロマトグラフィーカラム（６
×２６００ｒＩＬ）、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅ
ｃ　）　ＬＨ２Ｑ上で分離した。

分別　　：２ＱｘＡ／ガラス管２５分管流５　　：０．
８ｄ／分間 ２−経路一検出：１．　ＵＶ　（２８０ｎｍ　）、２．
屈折計法（Ｅｍｐｆ、　３２　） 結　　果　　： １０主画分：（９−１４）、（２Ｄ　）　、（２３）、
（２６）、（２８）、（３０−３１）、（５０−５５）
、（６０−６４）、（６７−７０）、（１３４−１４８
）； ８副１面分：　（１５−１９）、（２１−２２）、（２
４−２５）、（２７）、（２９）、（３２−４９）、（
５６−５９）、（６５−６６）。

ガラス管７０及び１３４の間では、クロマトグラムは基
線にそって流れる：このガラス管は廃棄した。

付加的に挙げた薄層−クロマトグラフィーで、ゲルクロ
マトグラフィーの際に得られた主画分の試料を塗布した
。

薄層クロマトグラフィー（ｒ＋ｃ）−プレート：珪酸デ
ルＦ２，４（２０Ｘ２０ＣＩＦｌ；メルク（Ｍθｒｃｋ
　）　）　、層厚０．２５０ｍｍ。

展開剤：酢酸エステル１５／ピリミジン２０／酢酸６／
水１１（容積部）。

第２図はゲルクロマトグラフィーによる分離を示す。

Ｈ検査結果の評価 前文：検査物質の酸性全加水分解の前後におけるアミノ
酸分析の定量的データの総括の際に、最低ざ−ク及び分
析器°に、［、る白妙評価の際に関係付は得なかつ／と
ピークは考慮しなかった。

遊離アミノ酸が、ペプチド製剤について予想される様に
、最低の随伴物へとしてつみ立証されることは注目され
る。遊離アミノ酸の確認は疑いがなくは無い、それとい
うのも分離経過で個々のピークは、ペゾチ−の分離モデ
ルへの付着体（Ａｕｆｓｅｔｚｅｒ　）としてのみ立証
されるからである。しかしながら、特により高い試料濃
度（１ｒｎ９１５（）０μｌ）において再現可能なピー
ク−モデルが得られ、にれは製剤１０１／８３そのもの
の確認ばかりでなく、その標鵡化も例えば２３．７３　
（アスパラギン酸）及び８３゜８１（ヒスチジン）にお
けるピーク、並びに９．５６．５７．１５及び７１．１
５における特異的ピーク（この場合特異的ペプチＶ分離
が重要である）により容易に可能である。

２．１ｒｌ？リアクリルアミド−電気泳動ケ９ル電気泳
動における反応に依シ、１０１／８６はもっばら最高１
５アミノ酸／配列の査定ゆ長を有する低分子ペプチｒか
ら成ることが推論できる。酵素的部分加水分解なしの胸
腺組織からの１抽出生成物のみがこの電気泳動法におい
て僅かに分離できる。

しかしながら、１０１／８ろが胸腺からの黄色画分より
もペプチドに富んでいることがこの技術において認めら
れるという簡単な所貝が重要である（例２）。

２．２　　濾紙電気泳ｄ： 胸腺からの黄色画分の分離そデルとペデチｒ画分１０１
／８３のそれとの比較は、後者の場合においては、その
多官能のイオン性のために、電気的高圧電場におけるク
ロマトグラフィーによる萌分離なしでは細分化されず、
かつ不連続のベゾチー帝として描かれる複合ペプチド混
合物が存在することを明らかに示している。

６、末端基測定： 適用技術においては、…１０．５でプロトン化さねてい
ない全ての窒素官能が、把捉され；すなわちペゾチドー
及び蛋白質−末端基ばがりでなく１．場合によりｙｌｌ
ｉして存在するアミノ酸もこの技術において標識される
。

グリシン及びアラニンは、遊離アミノ酸として製剤中に
含有されていないので、この２種は１０１／８３におけ
るペゾチｒの主なる末端基であることは明らかと々る。

遊離アミノ酸の分析でのアスパラギン酸及びシスティン
スルホン酸、並びにアルギニン及ヒヒスチジンの高含量
は、末端基測定の場合にもそれが認められ、従ってこれ
らのアミノ酸はＮ−未然にブチｒ結合に由来し得ない。

グルタミン酸、ゾロリン及びセリンは、末端基測定では
者しく一μ在し、従ってこれらのアミノ酸はペプチド末
端基として見なすこともできる。そねというのもこれら
はアミノ酸分析によれば極めて少」ｊでのみ製剤１０１
／８３中に遊離して存在するからである。

４．デルクロマトグラフィー挙動 、（掬ｔ８からのペプチド画分１０１／８３はセファデ
ックス（５ｅｐｈａａｅｘ　）　ＬＨ２０での分離の際
に直色画分６９／８３とは者しく異なる（例２参照）。

主画分２〜乙の２８０　ｎｍにおける紫外想（ＵＶ　）
　ｅ、収はオリゴメクレオチド含量にのみ起因され得る
。それというのも幽剤１０１／８乙はそのアミノ酸組瓜
によればａｙ−吸収性アミノＩｉ（Ｔｙｒ　、　Ｐｈｅ
　、Ｈｌｓ　）を合計して６重量係含肩するにすぎない
からである。

これはセルロース薄層上の電気泳動所見及びＨＰＬＣに
依る定性検査により確認される。水中におけるセファデ
ックスＬＨ２０のカラムクロマトグラフィー分離により
、製剤のオリイヌクレオチド含量はペプチド成分（画分
６）から分離され得ることは重要である。画分７〜１０
中に総括さね、主内容物からすつかシ分離される製剤１
０１／８３の成分は、遊離アミノ酸及びモノヌクレオシ
ドの分子容量の物質のみを含有し得ることが、傅離図（
第２図）から最終的に推察さオ］る。このことは付加的
な電気泳動検査並びに薄層クロマトグラフィー検査に工
り確認される。

１０１／８３よりなるゲルクロマトグラフィー−分６は
製剤のペプチド誘導画分とみなされる。

本発明による医桑組成物にはペプチド画分とじてゲルク
ロマトグラフィー（例１ｂｓＬ’４）の際に得られる主
画分又はペプチド誘導画分（１Ｉｉｊ分６）のみを使用
することが有利であり得る。

例　　２ ＆）黄色画分の取得 例１　ａ）に工Ｃ得られるペプチド画分の濾液を真空中
（傾Ｐｒ管高速回伝蒸発器）でその容量の約５０％まで
蒸発さ−ｔ（ａ浄アルコール濾液は容量の約２０％に）
、この際温度は６０°Ｃ′に越えてはならない。

そうして得られる濃縮混合物を醸化アルミニウムカラム
上に施こす（ＡｌｕｍｉｎｉｕｍｏｘｉＷＱａｌｍ　Ａ
　５ｕｐｅｒ　工、Ｗ２Ｏ０Ｗ、ヴエルム社製（Ｆａ、
　Ｗｏｓｌｍ　）、工７ユヴエーデ（Ｅｓａｈｗｅｇｅ
）；カラムの充填は、カラムに先ずエタノールヲ充たし
、次いでｙ化アルミニウムを添加するようにして行なう
；１２時間の固定時間後にカラムは開用潴備完了である
）。濃縮混合物をクロマトグラフィーカラムに装入した
後に＝タノールで後洗浄する：溶離は蒸留水で圧力下に
行なわれる（濾過して細菌を少なくした圧縮空気）。

溶離液を溶離終了後に真空中で容量の約２０チ１で濃縮
しくｇ４斜管蒸発器）、こうして得られるｉ細物から次
いで回転蒸発器中での蒸発濃縮により結晶化さ九た乾燥
生成物（黄色画分）を得る。

ｂ）例２　＆）により褐らおる画分（以降６９／８６と
して表示される）の物理的−化学的特徴１．１　　閉鎖
クロマトグラフィーによるフラビンの分取分離 ゲル床寸法３−５　ｘ　２４０ｃｍ０調製用セフアデツ
クス（５ｅｐｈａｄｅｘ■）　ＬＨ２０−カラムで、溶
離剤としての水（１憾トリプルオルエタノール）５．０
０７９中で、黄色画分（黄色物質）１６ｇを分子篩効果
の利用下に閉鎖クロマトグラフィーにより分離した。こ
のために各２Ｘ５．９及び１ｘ６ｇの少量を、そのつと
蒸留水（１ｃｓトリフルオルエタノール）５−中に完全
に溶かし、ゲル床上に施こした。画分１９−／ガラス管
／２５分間を採取し、ゲルクロマトグラフィー分離経過
を連続的に、１）２８０ｎｍにおけるＵＶ−吸収測定（
ＬＫＢ社製流動光度計［ｖｉｃｏｎｃＬ　ＴＪ　）及び
２）クロマトグラフィー溶離液の密度変化の測定による
流動屈折計法（ウォータースーリフラクトメーター（Ｗ
ａｔｅｒｓ　−Ｒｅｆｒａｋｔｏｍｅｔａｒ）、Ｒ４；
　ＤａｅｍＴ）ｆｕｎｇ　６４　）に工す記録した。

代表的な分取分離経過は第６図（溶離略図）から判る。

分離経過中に強く黄色に呈色した成分がはっきりした境
界をつけた帯域として分離カラムを通って移動し、ガラ
ス管／１６８０〜１００の範囲で採取し、凍結乾燥させ
、かつ秤量した。

結　　果： ６９／８３（１６ｇ）から合計して黄色成分２２４叩（
１，４重量に憾）が得られ、これを次に分析的かつ天然
物化学的に検査する。

元素分析 Ｃ俤　　　Ｈ係　　Ｎチ 黄色成分　　５２，４１　　６．２７　　１４．８７リ
ポフラビン　　　５２．５９　　　５．７９　　　１５
．３４１．２６９／８３のゲルクロマトグラフィー分６
９／８３（５，００７ｇ）の分取分離後に、分離した成
分の濃度及び―′−吸収に基づき、１８画分を一緒にし
た。

このために相応するガラス管の内容物を前もって秤量し
た丸底フラスコ中にあけ、ガラス管を蒸留水で６回後洗
浄し、合一したガラス管に相応して画分を標識した。

水性画分を回転下で真空中−７８℃で凍結させ、引続き
凍結乾燥させた（凍結乾燥機、ヘレウスーレイポルド（
Ｈａｅｒｅｕａ　−Ｌｅｙｂｏｌｄ）、Ｇ２）。

凍結乾燥した画分をそのつど丸底フラスコ中で秤量し、
空気−及び湿気を通さないよう閉鎖しくパラフィルム）
、かつ冷Ｒｖｔ中＋４°Ｃでその他の実験のために貯蔵
した。

結　　果： ６９／８３（５，００７ｇ）から次の画分が得られた： 画分　　　重量（ＩＱ）　　　　画　分　　　重量−）
（８２−９８）”　　　９４”　　　（１９９−２０８
）　　　　１４脣　黄色成分 凍結乾燥画分の総量は５．００２９　（９９，９係）で
あった。

両　分　　重量憾肴　　Ｃ憾　Ｈ％　　Ｎ係　　Ｓチ２
０−３１　　　　０８　　　３４．９０　　５．１６　
　３９．８４　　０．０３２−５９　　　７７．６　　
４７．８１　　７．４３　　１５．７３　　０．９５６
０−６５　　　　６．３　　５３，１６　　７．３８　
　１２，１７　　０．７０６６−８１　　　　４．７　
　　５２，４２　　７．３０　　１５．７０　　０．５
１８２−９８　””　　　１゜９　　５２．４１　　６
．２７　　１４．８７　０．０９９−１０２　　　０．
８　　　４６，９５　　４．６Ｂ　　　２６，５８　　
０．０１０３−１１０　　　１．０　　５０．８０　　
５．０６　　１６．９６　　０．０１１１−１１７　　
　０．４ １１８−１２１　　　０．２　　４５，５３　　４．０
１　　１９．３３　　０．０１２２−１４２　　　６．
１ １４３−１４＜Ｓ　　　　Ｏ，１４２，８９５，０９１
６，５５０，０１４７−１６５０，３ １６６−１９８２，３ １９９−２０８０，３３６，１９７，００２６，６６０
・０２０９−２２２　　　０．３ ２２３−２４０　　　０゜１　　　２８，２２　　３．
９８　　１０．２［］　　　　−２４１−２５１０，４
２５，８５３，１４７゜６４−２５２−２６５＜０．１
　　　　　−　　　　−　　　　　　　　　　−井原゛
詰乾燥１＋ｊｉ分のａ葉（５，００２ｇ）に対して 斧簀黄色成分 遊離アミノ酸の含量測定のために４０μ９〜２η全杵看
し、各前処理なしに出発緩衝液（−１，８）中に入れ、
かつ自動分析′ｒｉヲ用いて、いかなる末端基標識化（
１，３Ｇ参照）が画分中の一緒に移行したベデチｒ会合
の遊’Ｒ１アミノ酸含１４ｋに帰されるべきか、及びい
かなる画分成分がペプチド性であるかを知り得るために
実験した。

結　　果： Ｉ−分（２０〜３１）１．４１１ダは遊１？ｊアミノｉ
Ｔｈ＆について、システィンスルホンｍ　５２．７　（
ｎモル）、アスパラＶンＭ１５．４、スレオニン５．９
、セリン７．７、グリシン５．１、リジン１゜８及びＮ
Ｈ４”　１１．６を含有する。調査したデータから、画
分の約１重量憾が遊離アミノ酸であることが判る。

画分（６２〜５９）１９５μｇは遊離アミノ酸について
、システィンスルホン酸５２゜１（ｎモル）、アスパラ
ギン酸６．６、イソロイシン２０．７、ロイシン２５．
１及びフェニルアラニン４９．９を含有する。含量測定
から、画分の約８重−ｆｔ幅が遊離アミノ酸であること
が判る。

画分（６０〜６５）２０４■は遊離アミノ酸について、
ロイシン２．５　（ｎモル）、フェニルアラニン１０８
．２、ヒスチジン５４．４及びアルギニン２７．３　ｋ
含有する。末端基測定に依れば（１，３００照）、保留
時間７３．６におけるぎ−りはリジンに関係しなかった
；ヒスチジン及びアルギニルの含有も不確かである。そ
ｔというのもピークの形態はこれらのアミノ酸について
特徴的ではないからである。これらの制限下で、画分の
約１６重量％は遊離アミノ酸であることが判る。

画分（６６〜８１）２００μｙは遊離アミノ酸ニついて
、チロシン４．０　（ｎモル）、フェニルアラニン９１
．９、ＮＩ（、”　１７、ヒスチジン４．２及びアルギ
ニン３．１　ｆｔ含有する。これから画分の約１．９重
量％は遊離アミノ酸であることが判る。

画分（８２〜９８）４０μｇは遊離アミノ酸についてシ
スティンスルホン酸４．９　（ｎモル）及びヒスチジン
１．５を含有する。これから画分の約２．８重量％は遊
離アミノ酸であることが判る。

画分（９９〜１０２）１．９９５Ｉｎ９は遊離アミノ酸
について、ロイシン８．６　（ｎモル）、チロシン１．
７及びヒスチジン１０．４に含有する。これから画分の
約０．２重量％は遊離アミノ酸であることが判る。

画分（１０６〜１１０）２．３１９ｒｎ９は遊離アミノ
酸について、７ステインスルホン酸１．６（ｎモル）、
システィン１．９、ロイシン４．５、フェニルアラニン
２．１及びヒスチジン５，９ｆｉｌ有する。このことか
ら０．１重１係よりも少ない画分が遊離アミノ酸である
ことが判る。

アミノ酸の総合値、ゲルクロマトグラフィーに工り得ら
れた画分のペデチｒ成分の測定：主画分（２０〜３１）
〜（１０３〜１１０）から各約４０μＩの秤量分を溶封
アンプル中で２４時間１２０°Ｃで６ＮＨｃｉ中で完全
加水分解し、真空中蒸発乾固し、出発緩衝液（ｐ）１１
．８）中に入れ、自動分析器を用いてアミノ酸の含量に
ついて定量的に実験した。調査したアミノ酸の総含量か
ら画分含量の引算によりベデチｒ含量の遊離アミノ酸を
算出した。

その結果を次の表■にまとめる： 、／、−１・゛ 副画分（１１８〜１２１）〜（２５２〜２６５）の定性
アミノ酸分析 前記の方法論で、試料的４０μｇを完全加水分解後に定
性的にアミノ酸の含量について、末端基測定（１，３Ｑ
診照）との関係を確立し得るために、実験した。

結　　果： ６９／８３のゲルクロマトグラフィー分離の、童成分か
らは重要ではない後者の画分は、ペプチｒ及びアミノ酸
を約１０〜２０重量係含有するにすぎず、後者の画分は
ど減少する傾向がある。付随する元素分析（１，３＆参
照）に工れば、ヌクレオチＶ−断片の含量は除外すべき
ではない。

１．６Ｃ主画分の末端基測定 ピコ−モル範囲（１０−１２Ｍ　）のアミノ酸、ペプチ
ド及び蛋白質のＮ−末端を前記の微量法における２−次
元の、クロマトグラフィー分離で立証する塩化ダンシル
を用いる末端基標識化の方法を適用した。

ダンシル化：試験すべき物質的５μｇを０．０５モルの
ＮａＨＣＯ３−緩衝液中で塩化ダンシルと反応させ、引
続き溶封した毛細管中で４時間６ＮＨＣ７！中で１２０
℃で完全加水分解した。加水分解物を真空中乾燥し、水
中に入れ、２−次元クロマトグラフィーにより微細−ボ
リアミド板上で実験した： １゜次元、４８係蟻酸： ２゜次元、米酢＃Ｉ／トリオール（１：　４　；ｖ、ｖ
）。

Ｎ−末端に標識したアミンｒｊＩｌヲその螢光によ１石
−光中でボリアミド板上で確認し、写真に堰った。等位
化はダンシル化アミノ酸の略図式にニジ行なった（例１
ｔ）％１％３参照）。

結　　果： 画分（２０〜３１）、主標識化：　Ｈｌｓ　；裏標識化
（痕跡で）　：　Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇ１７゜画分（６２
〜５９）、主標識化：　Ｇａｙ　ｓ　Ｈｌｓ、Ｈｌｓ　
、Ａｒｇ、　Ｌｅｕ； 裏標識化：　Ａｓｐ　Ｘ５ｅｒ　、　Ａｈａ　Ｘ’Ｖａ
ｎ　、Ｐｒｏ　、　ＩＣｅ　。

Ｐｈｅ　ＸＴｙｒ　、　Ｌｙｅ　。

画分（６０〜６５）、主標識化：　ＰｈｅＸＡｓｐ　。

Ｔｙｒ　、　Ｉｌｅ　、　Ｌｅｕ　、ＮＨ４”、Ｇａｙ
　、　Ｈｌｅ　、　Ａｒｇ　（左下四分円の縁の広汎性
の 斑点は等位化すべきで ない）； 裏標識化：　ＣｙＳＯ３Ｈ、Ａｈａ　、　Ｖａｎ　、Ｌ
ｙｇ　（痕跡）。

画分（６６〜８１）、主標識化：　Ｐｈｅｈ　−、Ｔｙ
ｒ　ＮＮＨ４＋、ＧｌｙＸＡｓｐ； 裏標識化：　Ｈｌｓ　、Ｓａｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｈ
ａ　、　Ｍａｌ　、ＩＩｓ、Ｌｅｕ　０ 画分（８２〜９８）、主標識化：　Ｔｙｒ　；裏標識化
：　Ｐｈｅ　、　ＩＩｓ　、　Ｌｅｕ　、　Ｖｍｌ　、
Ａｌａ　、　ＮＨ４”、Ｃ）ｌｙ　０ 画分（９９〜１０２）、主標識化：Ｈ１日、Ｈ１ｅ′ｋ
ＸＴｙｒ　； 裏標識化：　Ｃ）ｌｕ　、　Ｌｅｕ　、　Ｐｈｅ。

画分（１０６〜１１０）、主標識化：　（）ｌｙ　；裏
標識化：Ａｓｐ０ ２、フラビン成分の精匁のための、１．１で得られた黄
色成分の分析用かつ分取用ＨＰＬＣ後記のＨＰＬＣ−実
験のために、水溶液中で強く螢光を呈する６　９／８３
からの黄色成分合計計して２２４１１１９に使用する。

この富化されたフラビン成分の元素分析により、リボフ
ラビンへの凝いが強くなったので（１挙照）、ＦＩＰＬ
Ｃ−分析の比較目的のために市販の”生化学目的のため
のりがフラビン′″（メルク（Ｍｅｒｃｋ　）　）　を
関連させた。

±Ｊｕ口り乞： 分析用Ｃよ８−逆相珪酸デルカラム（４×２５０ｍｇｇ
；粒度：５μ）： ｌ羞Ｊユ 水中メタノール２５％、１０分間；更に２５分間メタノ
ール５０％までの上昇性勾配、引続き純メタノールでの
１２．５分間の洗浄相を行なう。次いでカラム金初条件
で平衡させる。

分析的ＨＰＬＣ： １により富化されたＣＱ＝９．２５μｇ／μｌ）黄色成
分４６．２５μｇ／メタノール：水（１：１）５μｌｔ
分離カラム内に噴霧し、流速１厘ｔ／分間で前記の勾配
系で溶離させた。記録計の紙送りは１ｍ／分間であった
。検出はＵＶ−範囲（２１０ｎｍ　）及び螢光範囲（励
起２６５ｎｍ。

発光５３０　ｎｒｎ）で行なった。結果を第４図に示す
。

技術的に同じ経過で、同様の分析用ＨＰＬＣ−カラムに
、メタノール：水（１：１）５μｌ中に溶かした６９／
８３（元来の物質）　１．２０５ηを噴霧した。結果ｔ
−第５図に示す。

もう１つの、技術的に同様の実験経過で、同様の分析用
分離カラム上に水中に溶かした（Ｃ＝７１４μｇ／−）
リボフラビン（メルク＞６ａｌを装入した。

分析的比較の結果： セファデックスＬＨ２Ｄで、富化された黄色成分中、並
びに元来物質と９／８３中には、螢光性物質が含有され
ており、これは分析用ＨＰＬＣ−カラムから正確に２１
分間の純粋なりポフラビン（メルク）と同じ滞留時間で
出て来る。

純粋なリボフラビンのそれに関連して螢光曲線に依る濃
度算出は、セファデックスＶ２０で富化された成分につ
いてはりがフラビン約０．６　％の含量を明らかにした
。

分取ＨＰＬＣ： 寸法２８Ｘ２５０冨１％　　Ｃ１８−逆相珪酸ゲル、粒
度：５μの分取カラムで、１によυ富化された、水（５
Ｎ　ＮＨ４０Ｆ１５滴）４．２−中に溶解した黄色成分
１２９．７〜を、メタノール／水（１８：８２）ｚりな
るインクラチック混合物で分離した。流速は１３０バー
ルで２６−７分間であシ、石−検出は２５４　ｎｍであ
シ、記録計の紙送りは３０ｃｍ／時間であった。

分離結果を第６図に記載する。４つの画分て２つの−一
りがとらえられた：画分１は最初の無色のぎ−クを含有
し、画分２．３及び４におけ２第２ぎ−クは黄色螢光を
呈する。

これらの総括された画分は、凍結乾燥後に精製フラビン
成分３．３１１Ｊ９ｆｃ生成しな。

純度対照： 分取ＨＰＬＣにより得られたフラビン成分の３つの一分
を、前記のカラムでの分析用ＨＰＬＣに依シ実験し、こ
の際次の、時間的１／（延長された勾配を使用した＝１
０分間水中メタノール２５チで、次いで６５分間で水中
メタノール６０’ｆｆｉまで上昇させ、引続き１０分間
メタノール１００係で後洗浄。その他の全てのパラメー
ターは前記したものと同一であった。

ｊＬＪＬ： 全６種の分離経過は曹−及び螢光−曲線下で純粋なりポ
フラピンと同じｔ−り面の相関を示す。螢光−曲線の下
降肩部に２つの小さい螢光−２−りが認められ、これは
同様に純粋なりがフラビン（メルク）にも認められた。

調製用ＨＰＬＣ−分離の無色の画分１について完全加水
分解後に定量的アミノ酸分析が行なわれた。

フラビン成分と会合したペプチド５５μｇは次のアミノ
酸（ｎモル）を含有する：グルタミン酸２．８、プロリ
ン４８．９、グリシン３．１、アラニン１．６、バリン
２．１、イソロイシン１４．４、チロシン８．０、フェ
ニルアラニン１．２　　リシン１．５、Ｎ）！、”　１
４．９及びアルギニ／３．８゜この結果は１７図から判
鳴ｒる。

３．６９／８．５から単１：Ｊされたフラビン成分の天
然物−分析実験 ６９／８３から単離さｔｉ７’ｃフラビン成分の分取Ｈ
ＰＬＣ精製の画分６ｔ−天然物−分析的構造立証のため
に使用した。

核共鳴−スベクトル： ６９／８３からのフラビン成分の分取ＨＰＬＣ分離から
の画分６の３６　Ｑ　ＭＨ２ＩＨ−ＮＭＲ−、ｘ。

ベクトルｔ−Ｄ２０中で記録した。

結　　果： 核共鳴−スペクトルはフざフラビンに特有の全ての構造
元素を示す：インアロキサジンー環のメチルプロトンの
シグナルは２．４６　ｐｐｍ及び２．６８　ｐｐｍであ
り、リビット一部分については３．７５　ｐｐｍ、６．
８５〜４．０５　ｐｐｍ及び４．３５〜４．４６　ｐｐ
ｍであり、並ひに芳香族プロトンについ−Ｃは７．８３
〜７．９２　ｐｐｍ　テある。

リボフラビンについてはＤ２０中で１４個の非交換性の
プロトンが予想された。１４個の非交換性のプロトンが
実測さねた。

質　スペクトル分析的同定： ６９／８３からセファデックスＬＨ−２０での閉鎖クロ
マトグラフィーにより富化されたフラビン成分の分取Ｈ
ＰＬＣ−精製の画分３はリボフラビン（メルク）に比較
して次の結果をもたらした： 純粋なりボフラぎン（溶剤水）は、最高シグナルとして
３７６ｎ／Ｚでの分子イオン及び３９９７７１／Ｚでの
（Ｍ＋Ｎａ）”−イオｙ’ｌ有する明確な電場−放出−
質量スペクトルを明らかにした。６９／８３からのフラ
ぎン成分の付属する電場−放出−質量スペクトルも同様
に（Ｍ＋Ｈ）”−イオンについて３７７で強いシグナル
を示し、かつ更に強いシグナルを（Ｍ＋Ｎａ　）＋−イ
オン関して３９９で示す（溶剤水）。

従って真正のリボフラビン（メルク）と比較して、分取
ＨＰＬＣにより単離されたリボフラビンは高められた量
のアルカリ塙ヲ含有する。

分取ＨＰＬＣ’により６９／８３から凰掘されたりポフ
ラ♂ンとりボフラピン（メルク）との直接的比較のＴＡ
Ｂ−質量スペクトル（高速原子衝撃（ｆａｓｔ　ａｔｏ
ｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　）　）は両方の化合物の
同一性を示すが、胸腺から得られるリボフラビンにおい
ては付加的なシグナルを３６７ｒｒＬ／２で、かつその
グリシン−付加ピーク”ｋ４５９ｍ／２で示す。このこ
とから、６９／８３から分取Ｉ−ＩＰＬＣに工り単離さ
ねたりボフラピンは分子量６６６を有する混合物を含有
することが判る。

２４〜２７５　ｍＡのより高い熱電力で６６７の未知物
質の分子ぎ−クが同様に電場−放出−質量スペクトルで
立証される。

■、実験結果の評価 Ｉ、１．３ｔｌから、分離可能なフラビン成分はベプチ
ρｔ−１７重Ｍ４含有することが判る。このことからこ
の成分のベデチＰ含量が化学的にそれと結合して存在す
るのか、又は親油性相互作用の理由から螢光体と会合し
て現われるのかという問題が生じる。

逆相−珪酸ゲル（ＣＡＢ　：　５μ）での分析用ＨＰＬ
Ｃにより疑なく立証され得るように、螢光物質は真正リ
ボフラビン（メルク）２同様に滞留時間２１分間で溶離
する；この特性は、螢光性物質が元来の製剤６９／８３
中で直接分析用ＨＰＬＣにより立証されたか、又はセフ
ァデックスＬＨ−２０で富化されたフラビン成分からか
、には無関係であると証明した。このことから、ペプチ
ド−混合物はフラビン成分と化学的に結合され得いない
という結論が導びかれる。それというのもさもな（ばフ
ラビン成分は真正リボフラビンとは異なって）３　ＰＬ
Ｃ−系で現わｉｌなければならないからである。更に、
フラビン成分と会合したベプチｒはフラビン成分と極め
て安定した会合で存在するにちがいないことも認められ
る。それというのも分析用８ＰＬＣで螢光−ピークのす
ぐ隣りに、この遅−吸収成分の前後で痙離代打ス萌λ瓜
〒凱入（と−れについでけ憚鰺の第４図参照）。

フラビン成分中のベデチ一部分は、セファデックスＬＨ
−２０富化後に存在したように、分取ＨＰＬＣに依シフ
ラビンから基線−分離で驚異的に効果的に分離された。

分離されたベプチ２のアミノ酸分析は、プロリン、イソ
ロイシン、チロシン及びフェニルアラニンの含量により
、明らかに高い親油性を示し、従ってフラピンとの狭い
相互作用が明らかである。

１１１Ｌｔ当りの組成： 臓器抽出画分　　　　　　　　　　　１０゜ＯＯη（例
１及び２より得られる２種の画分 の混合物） フｚ　／　−ｈ　（ＤＡＢ７）　　　　　　　　　　４
．５５　ｍ９ＮａＣｊ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５．００ｍ９注射用水　　　　　　　　　　
全量１．００．ｄ使用ｆｉ：２．２１（各２ｒｒＬｔず
つ１０００アンプルに十分） 内容物を水１．５１中に溶かし、次いで１チのＮａＯＨ
でｐ’　値５−８０に調整し、水で２．２　ｌ−！で充
填する。得らする溶液を滅菌しく０．２μｍ膜濾過器）
、次いで２ｒｒＬｔ−アンプル中に窒素ガス下で充填す
る。

／′ ”ｌ’ｊ ７、′−７ ／″ 列　　４ 免疫刺激もしくは免疫調整時性の立証の之めに、得られ
る本発明による組成・吻（列１ａにより得られるペノテ
ド画分及び列２ａにより得られる黄色画分の混合物）を
滅直膚過及び凍結乾譲後に、ヒトの健康な提供者のヘパ
リン処理されｔ完全血液中の’ｌ’　＋　１７７８球及
びＴ−細胞亜渠団のその免疫生物学的活性について実験
し之。

比咬吻質としては滅菌４過し、かつ凍結乾燥された胸腺
−画分１６５を用Ａた。

ａ）健康な提供者からの血液試料の噴得：この血液製剤
の之めに１１人の４．責な試料提供者が必要であった。

機影カニユーレ（Ｓｃｈｍｅ−ｔｔｅｒＬｉｎｇｋａｎ
ｉｉｌｅ　）を用いて、椀静脈から血液各１０Ｍを採暇
し、この際、その量は、吸引せずにシリコンホースを通
ってカニユーレからヘパリン処Ｊ」試験管中に導入した
。この処理は、機砿的貞荀の際に特異的レセプターの１
部分を失なわせることのできるＴ−リンパ球の畏酊−マ
ーカーの昧護作用をする。

ｂ）培養パッチ： 各提供者のヘパリン処理完全血液１０ｄを各々２．５４
に四分し、培養フラスコ中でＲＰＭ１１６４〇−媒体を
充填して各々１０ゴにした（このＲＰＭＴ−媒体は、等
張ＮａＨＣＯ３−溶ｆＫで−７，２に緩衝されて＾る）
。この培養フラスコを弛ろく閉じ、その池の添加物を加
えずに（牛胎児血清なし、Ｍｌ悦ナトリウムアルデミン
なし）、無菌条件下に００２−恒温装置中６７℃で２４
時間恒温医押した。

Ｃ）血球計算去月の完全血液培養バッチの準備二完全血
液中の’Ｊ’　＋　１７７８球及び−亜泉団の螢光性の
、マーカー特異性抗体（０ＫＴ−血清、オルト診断糸：
　０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ　
）での直接漂識付け。各々の完全血液培養パッチから○
ＫＴ−血清での５標識付けの念めに各々１００μｔを取
り出し、５個のオルトムン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ■）Ｏ
ＫＴ−血清各１０ムｔと共に６０分間恒は保持した。引
続き浴解試粟（Ｌｙｓｅｒｅａｇｅｎｚ　）　（Ｏｒｔ
ｈ。

診断系）で２ｒｎｌ　／試料まで充填し、赤血球の破壊
の念めに５〜１０分間恒畠保持しく不透明な濁り）１直
接サイトフルオログラフ（ＣｙｔｏｆＬｕ−ＯｒＯｇｒ
ａｐｈ　）　（０ｒｔｈｏ　）で測定した。

螢光性のマーカー特異性抗体（０ＫＴ−血清）での直接
４鷹付けの之めのＴ　−１／　７パ球及び−亜集団の単
離： 完全血液培養パッチを遠心分離し、血漿を捨てる。沈殿
をフィコルーグラディエンド（ＦｉｃｏＬｌ−ｇｒａｄ
ｉｅｎｔｅｎ　）中、２０℃で４０分間遠心し、分離さ
れたリンパ法号を単離する。おそらく付層する残留−赤
血球を溶解試薬に工？）除去し）リンパ球を数回のＰＢ
Ｓ中への再懸濁及び遠心分離により洗浄する。

ＰＢＳ中へのｆｒ之な再合濁の後に、リンパ球を１１ａ
胞１０７個／　ｒｒｔｌ　Ｋ調節し、これからの試料１
００μｔにオルトムン［Ｆ］ＯＫＴ　−血清各１０μｔ
を加え、水浴中に３０分保持し、この際、各々１０分後
に振出する。

欠の螢光性のモノクロナールｆｒ、本を筐用し之：ＯＫ
Ｔ　−３、末Ｊ１４　Ｔ　−’Ｊンパ球に対し特異性；
０ＫＴ−３、Ｔ−へルファー亜渠団に対し特異性； ＯＫＴ　−６、胸腺励胞（未成、熟Ｔ−細砲）に対し特
異性； ＯＫＴ　−８、サプレッサー（細胞心性）Ｔ−岨集団に
対し特異性； ０ＫＴ−１１、末梢ニー細胞上のＥ−レセプターに対し
特異性。

各試料提供者の対照−及びテスト４養物を各々、吟異注
の０ＫＴ−血清での標識付けに相応して５　＋！ｉｆの
測定パッチに細分した。

モノクロナール抗体での標識付けのための５０分の恒温
保持時間の経過の後に、非特異性の螢光とさけるために
、遠心分離及びＰＢＳでの２回洗浄により過剰の０ＫＴ
−血清を除く。残留沈設吻をＰＢＳ　１〜２！Ｌｌ中に
再懸濁させると、全ｒｆｃｐに、細胞的Ｉ　Ｑ６閾が残
ｄする。

ｄ）サイトフルオログラフ（オルト診断系）を用＾る真
流７萌胞計−１］（Ｄｕｒｃｈｆｌｕｓｓｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｉｅ）；測定試料と同じ非標識対照試料の１つで測
定し念挟角拡散光を用いて、サイトフルオログラフでの
測定窓をヒストグラムのリンパ球に対して特異的な部分
に適合させ、この際自己宛光分をｄ気的ｖＣ除去する。

各測定試料から、細胞２５〜３０口００個／３０秒を緑
色螢光（それぞれ標識されたＴ−７２曲胞詳に対して特
異的）及び挟角拡故光（すべてのリンパ球に対して特異
的）を用＾て評価する。測定直を１気的に蓄積し、全一
リンパ球数のＣ分率として示す。

ｅ）　　ｌｌｌ果： 次の第２表〜第４表に、本発明による組成吻で得られた
結果をまとめ、第５表〜第７表には、テモシン−７ラク
ション／１６５を用＾で得られた結果をまとめ几。第８
表は、比蚊定ｌｉｔ評価を示して贋る。

これら測定結果は、表に記載の１這々の浸度での完全血
液Ｊ＠御物から得られた。測定データは翫それぞれ、作
用物質適用されてＡないそれぞれの当該対照培養物と関
係付けられている。第２表及び第５表の記載は、所定の
作用物質適用の影響下における末梢ヒ）Ｔ−ａ砲（ＯＫ
Ｔ−３１遍性）並びにそのヘルファー及びサプレッサー
Ｔ〜Ｉ商ノ泡の唾遵団（ＯＫＴ　−４及びＯＫＴ　−８
１場性）、未成熟胸腺細胞（ＯＫＴ　−６１場性）及び
Ｔ−リンパ球上のＥ−レセプター（ＯＫＴ　−１１１Ｖ
ｌ注）の割合（％）を！味する。

すべての表中に、完全血液中のリンパ球（０）又は完全
血液培養物から単離されたリンパ球（ｉ）の測定データ
が、螢光注抗本での直接標識付けにより得られたか否か
が記載されて＾る。

測定データの評画は、第２表もしくは第５表に関連して
＾る第３表及び！！６表に示されて＾る。

ａ）作用物質の添加なしで、同じＴ　−、、ｌ胞対照群
と比べた作用物質適用の影響下におけるそれぞれのＴ−
細胞群の差（差＝％−変化）及び ｂ）対ハく直（これと１０口％とする）Ｋ対する測定直
の％−削合（Ｖ） 分計算した。

測定データの統計は、第４表及び第７表に示されてｈる
。完全血ｉ　（０）中で直接又はリンパ球の単離（ｉ）
の麦の０ＫＴ−血清でのＴ−細胞−＃Ｉ＃付けの方式く
より解２抗して、個々の測定（財）の数（ｒｌ）を用い
て、その−Ｐ均１直（汀）からの個々の測定の標準偏差
（Ｓ）を次式により計算した：史に、各提供者に関して
、異なる日の供血と関連して測定データの生物学的及び
方法的な分赦幅を示すｆ動係数（ＣＶ）を、確認し之：
０　ｏ　ｏ　ｏ　　　　ｏ　ｏ　　Ｏ００００￥Ｎ寸’
Ｏｙ囚℃　×へ寸っ ００００　　　　００００　　　　　　ｏｏ　　　　　
　ｏＱ咎　ＣＳＪ　　寸　℃　　　　♀　　〜　寸　”
０　　　　７　　Ｃ’４　　　　７　　　ＮＯＯＯ″　
　　−−一一一一一 ２′：′Ｊゞ　２へ　−Ｎ　２へ　ｆき、−８−−−−
−−−−− ／へ　７　（Ｎ　　Ｗ　＋Ｎ　　閏へ寸　閏へＯ−れ　
　　−・　　　−・　・　　　ｍ　・盲　醗　○　亨　
憚　− 口　！　智　＠　　＋　　［−１ ）Ｎ　　　’＜、ＩＮ　　　−層重　・　−１１＼　Ｉ
Ｉ　　Ｉ　　１−１　１　１　１ψ　間　−０４＋Ｉｌ
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　閏へ　２Ｎ　閏Ｎ寸 −＃＃− 山　　　　ロ　　　う　５０８ ′″　　　−〇−由　　　山　　　山　　１０　でロ　
　　　　Ｉｒ４　　　　　　の ｆ）評価 完全血液（０）中での直播のＴ−リンパ球の標識付けは
、変動係数（ＣＶ）で表現される測定データの拡欣幅に
あまり影會しな＾。

しかしながら、ＯＫＴ　−６での標識付け（未成熟胸腺
細胞に対して特異性）に基づく測定データの高い分散鴫
が目立つ。ここで、Ｃｖは４０〜１００％の・鴫で存在
する。ＯＫ’ｌ’−血清での標識付けの品質をその部間
測定された分欣幅で評価する際には、一連の増ｍ注のＣ
ＶがＯＫＴ　−１ｌ（Ｔ−細）成上のＥ−レセプターに
対して特異性）　（ＯＫＴ　−３（全Ｔ−ａ胞に対して
特異性）＜　ＯＫＴ　−４（Ｔ−ヘルファ細胞に対して
寺異性）＜　ＯＫＴ　−８（Ｔ−サゾレッサー；−施に
対して特異性）に関して得られる。自然の細胞ＣＲ照培
養物）における分散扁は７〜２０％の範囲内にあジ、作
用物質添加物を有する培ｉ！吻からの細胞では、時折ジ
、２培も高い。

同じ試料提供者は、同じ細胞標識付は法及び特異性０Ｋ
Ｔ−面（ｆＩの同じバッチで使用の際には異なる日の採
血におＡて、著るしい測定偏差を示す。しかしながら、
この人に関連する偏差は、各々のＴ−）ｌｆｉｌｌ胞型
が全試料提供者にわたる全測定系列内で平均して示す分
散幅内に存在する。

統計的評価に関する信順できる直は、対ｆｌｌ直（１０
０％）に対する測定直の平均された割合Ｍｖ　（％）、
当該標準偏差（Ｓ）及びこれから酵導分 される鉱欣幅（ＣＡ％）に基つき得られる。

本発明による組成物で、ｏｘ’ｒ−６１場性細胞の増加
の明確な作用は、珠にＴ−、ｄ胞の単離の後の直接ｇａ
付けの際（百Ｖ；対照直の１５１．８％）で、既に２／
ｒ１９／１０Ｍ（培養物バッチ）の１度で明白である。

Ｔ−サルッサー細胞（細胞毒性亜湘団）を増加する方向
の本発明の製剤のこの優れた作用は、すべての試料提供
者（ｎ二２１）にゎたり、かっＴ−細胞標識付けの２つ
の方法（完全血液中で直接又は、＄瑞の後）を平均する
際にも統計的ｔａが存在する（Ｍｖ＝１２０％）。死康
な提供者の血液試料で、各々は、正常の場合は１．５の
大きさであり、これからのｔＩ差は、免疫平衡の移動を
明白に信号化する。

本発明の、組成物ば、チモシンーフラクション、％　５
　ノＯＫＴ　−８關ａ　Ｔ　−ｆ　ｆ　Ｖ　ツ？　　ａ
　Ｊｔｉｉｌｌ　（ｉａ胞４注亜東団）の増加（７７１
２７％）に関して、完全血液培養物中でのその作用で憂
れて匹ることが判明した。本発明による製剤の１部成分
としてのベノテド画分は、製剤に関連するＴ−細胞並楽
団への作用プロフィルを示し、この製剤の他の成分即ち
黄色画分は、完全血液培養物に対する測定可能な影響を
有するが、これはＴ−、拙ノ泡型に関連しては顕著に現
Ｖれな＾。従って、この成分の存在に１９、この製剤を
他の胸腺装削列えはチモシンー７ラクション、４６５と
比べてその試験管内作用を明らかに増強する相米作用添
加偕が車装になる〇 前記の評誦から、対照培養物中のＯＫＴ　−４１０ＫＴ
　−８−割合が異常（≠１．５）と認められた試料提供
者を排除すると、１７測定（ｎ）を基礎とする本発明の
及剤の終極的な評１面にとって、対照培養物に対する１
５０％のＯＫＴ　−ｉ場性細胞の平均割合が、値かに１
６％の分散唱で得られる。このことは、分；牧咄が、１
壇：漬な提供者血液の対照培養物で全測定パラメータに
わたり一完全血液中での直接標識付けでも単離されたＴ
−＋ｆａ胞での直接ｉ　ａ付けでも平均して見出すこと
のできる正常限界［［内に存在するので、極めて厘要な
所見である。

試験著内系（完全血液培養物）中で、Ｔ−リンパ球の亜
渠団にとって典型的であり、モノクロナール杭木を用−
る真流２紬胞計測で演出され九表面特性の出現（Ａｕｓ
ｐｒｉｉｇｕｇ　）に対する明白な作用効果が明らかに
なった。殊に、サプレッサー幽胞もしくは細胞毒性Ｔ−
細胞に詩徴的である（　ＯＫＴ　−８−１場注）洲／Ｍ
）この特徴の１加が明らかであった。この作用効果はｈ
くつかの個体（レスボンダー：　Ｒｅ５ｐｏｎｄｅｒと
称される）でも、統計的に、参照物質テモシンーフラク
ション／Ｉ６５におけるより大きかった。

すべての（４康な）試料提供者は、全’１’　−＋）ン
パ球状１１４（場合による低下は、Ｂ−ＩＪンパ球を増
加する気付かな＾（ａ伏）感染にエフＢ−リンパ球が増
加している）の、並びに殊にヘルファ／インデュサー（
ＯＫＴ　−４−陽性）及びサプレッサー／細胞毒性（Ｏ
ＫＴ　−８−１１！性）Ｔ−細胞の正常と称すべきプロ
フィルを有する。　　　ｌ得られた結果から、本発明の
製剤は、亜集団殊にサプレッサー／細胞毒性（ＯＫＴ　
８−１場性）７咄胞で異常状帳を有する患者において臨
床使用することができることが明らかである。このよう
な所見は、特に、自己免疫病として記載されている、殆
んど例外な（ＯＫＴ　−８−陽性並集団の減少が起こっ
ているＡくつかの結合組織疾病（リウマチ性関節炎、紅
ｉ注狼癒、強皮症、ジオグレン症侯詳寺）に公知である
。これらの場合には、試；倹♂内系でも、０ＫＴ８−關
性綱胞の数のＬ茜加に関する浸れた作用効果を期イ毒す
べきであり、この際、作用吻買用量も鴎かに深持される
べきである。前記のリウマチ注同梨団の患者へのこの製
剤の適用の際には、使用の前又はその間に、末梢リンパ
球での細胞免疫本質を０ＫＴ−血清で検査すべきである
。

本発明による組成物の適用の方式及び肴は殊に疾病の４
類及び重症度及び一般的所見及び患者の敏感性に依り決
まる。

【図面の簡単な説明】

第１図は胸腺からのベノチド画分（１０１／８５）の定
量的遊離アミノ酸含青を示す図でらり、第２図は胸腺か
らのベプチ団画分（１０１／８３　）のデルクロマトグ
ラフィーによる醍：碓を示すクロマトグラムであり、第
６図は黄色画分のデルクロマトグラフィーによる分喉分
離を示す図であり、第４図は６９／８５からの黄色成分
の分析用ＨＰＬＣによる演出を示す図であり１第５図は
６９／８３元来・吻質の分析用ＨＰＬＣによる検出を示
す図であり、第６図は黄色成分の分＄　Ｅ（ＰＬＣＫよ
る分離を示す図であり、第７図は分収ＨＰＬＣＫエフ得
られたフラビン成分の３櫃の画分と分析用ＨＰＬＣＫ　
、１：る分１催を示す図である。 手続補正書（自！り７・ 昭和６１年１２月１９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、胸腺抽出物の分別によつて得られる低分子蛋白質及
   び／又はオリゴペプチドよりなる画分及び臓器特異性の
   オリゴペプチドと会合しているリボフラビンを含有する
   黄色画分を含有する医薬組成物。 ２、低分子蛋白質及びオリゴペプチドの分子量は＜２０
   ００ダルトンである、特許請求の範囲第１項記載の医薬
   組成物。 ３、低分子蛋白質及び／又はオリゴペプチドより成る画
   分は遊離又は結合形のアミノ酸、システインスルホン酸
   、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸
   、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシ
   ン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、
   ヒスチジン及びアルギニン及び加水分解可能なアミノ酸
   少なくとも７５重量％を含有する、特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の医薬組成物。 ４、低分子蛋白質及び／又はオリゴペプチドより成る画
   分は胸腺抽出物の水溶液のフェノール抽出及びフェノー
   ル相からエタノールによる沈殿により得られ、かつ黄色
   画分は沈殿濾液からクロマトグラフイーにより得られる
   、特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項
   に記載の医薬組成物。 ５、クロマトグラフイーは酸化アルミニウムを介して溶
   離剤として水を用いて行なう、特許請求の範囲第４項記
   載の医薬組成物。