SU559653A3 - Способ получени полипептидов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ виде их хлортдов при концентрации (мол рной). При ишользоваики фер1ч5ен1а Миксобактер AL- протеазой II услови  реакции подти такие же, которые используют с AM-протеазой. Соотношение э «нм-субстрат- ) при рН 4-10 и температуре 25-75° С. Предпочтательными услови ми  вл ютс  следующие: концентраци  инсулина, близка  к его растворимости в инкубаторной среде, рН 6-9, температура 30-50° С и низкое соотношение энзимсубстрат , напртмер 1:1000 или менее. В инкубационную сред}- включают металлические ионы, например, кальци  или магни . Реакцию осуществл ют при использовании знзима , св занного ковалентно с подложкой. Одним. нз способов гфисоединени  AM-протеазы к подложке  вл етс  активирование шариков агарозногр гел  цианогенбромидом с пространственными группами (или без них), происход щими, например, иэ пексиламина или гексановой кислоты. Затем активированную агарозу подвергают взаимодействию с АМ-протеазой. Если реакщ ю с энзимом осуществл ют при помощи энзима, растворенного в водной среде, необходимый дес-Лиз -Ала -свиной (или бычий ) инсулин можно отдел ть от друшх компонентов инкубационной смеси при помонди любого обшеприп того технологаческого приема разделени  полипептидов, например техники молекул рных сит. Водную среду, оставш тос  после того как весь исходный инсулин деградрфовал, фильтруют через колонку из поперечно-св занного декстранового гел  или пслиак риламидного гел , подход идах дл  фракционировани  соединений с мол.в. 5000-10000 при любом удобном значет1И рН, предпочтительно удаленных от полипептидов и предпочштельно с тжзкой изоэлектрической точкой. Колонку элюируют буферной смесью, состо щей из компонентов, которые  вл ютс  летучими при сушке вымораживанием под высоким вакуумом, например водной уксусной кислоты, карбоната аммони  или ацетата аммони , дава  требуемый продукт , которЬ1Й отдел ют при сушке вымораживанием злюата. Если реакцию с энзимом осуществл ют с помощью энзима, присоединенного к подложке, то отделение требуемого полипептида от энзима осуществл ют фильтровавшем, если подложка  вл етс  нераст зоримой, или используют фильтр дл  DbiciuHX полимеров, сопи подложка  вл етс  растворимой в водной среде. Лаже в кристаллизованном свином или бычьем инсулине содержатс  {фугие полипептиды в качестве примесей. Эти примеси обычно присутствуют о количестве 3-5 вес.% от всего инсулина и состо т из таких BesnecTB, как про-инсулин, фрагменты про инсулина и глюкатон, которые трудно отделимы 01 инсулина. Под действием специфической амимо.иьишептнлазы лизина примеси разрушаютс  до более мелких полипептидов. Инкубацией свиного йтш бычьего инсулина со специфической аминоэвдопептидазой и отделением продукта, полученного из энзима, лизил-аланина и полипептидаз с меньщим молекул рным весом, чем инсулин, т.е. олигопептидов, получают продукт, содержащий меньцше количества примесей, чем было в исходном препарате. Примеси, присутствующие в инсулиновом препарате, способствуют его антигенности. Продукты и полипептвды, полученные по предлагаемому способу, имеют активность, подобную инсулину, а также вызывают малое количество антител, которые св зывают вещества, подобные инсулину при последующем введении в организм, чем исходные вещества. Полученные полипептиды не обладают какимлибо токсическим действием. Их используют дл  лечени  диабета, также как при, использовании свиного или бычьего инсулина. Назначают их парзнтерально, обычно подкожно или в виде раствора, или в виде препаратов, предназначенных дл  хранени . Препараты оказывают продолжительное действие, например до 24 час. Дозы выбирают в зависимости от требуемого лечени  диабета, они могут быть высокими, например 200 ед. ежедневно. Пример 1. Свиной кнсулин, который предварительно был перекристаллизован 10 раз, раствор ют в 0,1 М бикарбоната аммони  (1,0 мл). Раствор инкубируют с АМ-протеазой (50 мкг) в течение 16 час при 37° С. Одну дозу (Шрлкг) инкубационной смеси затем анализируют на N - концевые амино-кислоты с помощью приема дансилировзни  при использовании 1 - диметиламинафталин - 5 - сульфонилхлорида . Вторую дозу провер ют с помощью бумажного электрофореза в смеси уксусной и муравьиной кислот при рН 2,1 (20мл муравьиной кислоты, 80 мл уксусной кислоты, разбавленных до I л водой ) и показьшают присутствие Н-.Пиз-Ала-ОН и епю одного компонента. Элюировапие второго компонента и анализ N - концевых аминокислот обнаруживает глицин и фенилалаиии.. Общий анализ аминокислот дает общее соотношение аминокислот аспарагиновой кислоты 3, сери (а 3, TpeofttiHa 2, глютаминовой кислоты 7, пролина 1, глицина 4, аланина 1, валина 4, изолейцика 2, лейцина 6, фенилаланина 3, тирозина 4, гистидина 2 и аргинина 1 вместе с цистенном количество которое точно не определено. Соединение отличаетс  от свиного инсулина отсутствием в нем лизина и только одного остатка алаиина. Третью дозу помешают в верхнюю часть колонки из смолы амино-кислотного анализатора Локарта . Колонку из смолы элюируют при 55°С следующим образом; доладн (рН 3,28); 55 мин (рН 4,25), 2 час 5 мин (рН 6,65), на которой инсулин по вл етс  3 час 54 мин, Лиз-Ала через 4 час 5 мин и дес-Лиэ -Ала свиной инсулин через

3 час 43 мин. Обнаружены только два пика, соответствующие дес-Лиз - Ала °-свиному инсули(су

Лиз-Ала.

Остаток инкубационной смеси помещают на колонку из пористого поперечно-св занного декстранового гел , уравновешенного 0,1 мол  карбонатааммони . Колонку про вл ют 0,1 М карбонатом аммони  при скорости потока 3 мл/час и собирают фракции 30 капель (1 мл). Фракцию анализируют fia пептидный материал измерением УФ-поглошени  при 280 нм и фракции 25-35, содержащие основной пик, сочетают и лиофилизируют, дава  дасЛиз - Ала - свиной инсулин.

П р и м е р 2. Свиной инсулин, перекристаллизовьтанный 10 раз, раствор ют в 0,1 М бикарбоната аммони , содержащем хлористый кальций, дава  раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальщ1Й в 3x1 б мол рной концентрации. Порции зтого раствора затем инкубируют при рН 8,2 при температуре 37° С в течение 40 час с количеством AM-протеазы, дающим следующие соотношени  энзим-субстрат: ;б25, 1:1250, .1:2500 и 1:5000. Анализ инкубационных смесей с некоторыми интервалами с помощью приемов, описанных в примере 1, показывает полное расщепление в каждом случае, за исключением 1:5000 реакции, в которой в конце :)ксперимента получают 88%-ное расщепление.

П р и м е р 3. Свиной инсулин, перекристаллизованный 10 раз, раствор ют в буферных смес х, приготовленных из аммиака и уксусной кислоты с рН 4,0; 6,0; 8,0 и 10, содержащих хлористый кальций, дава  2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх Мол рной концентрации. Растворы инкубируют с AM-протеазой при соотнощении энзим-субстрат 1:100 при температуре ЗТС в течение 6 час. Анализ показывает, что в каждом случае имеет место расщепление.

П р и м е р 4. Свиной инсулин, предварительно перекристаллизованный Шраз, раствор ют в 0,1 М буферном растворе бикарбоната аммони  при рН 8,2, содержащем хлористый кальций, дава  раствор, содержащий 2 мг/мл илсулина и хлористый кальций в ЗхШ мол рной концентрации. Порции раствора инкубируют с AM-протеазой при соотнощении знзим-субстрат 1:1000 в течение 3 час при температуре 23,37,45 и 55°С. Алализ, аиалогичный примеру 2, показывает полное расщепление при 37 и 45°С, прибшпительно 50%-ное расщепление при 55С и в небольшой степени расщепление при 23°С.

П р и м е р 5. Раствор свиного инсулина (120 мг- кристаллизованный один раз свиной инсулин, очищеиньш с помощью гелевой фильтрации в 0,1 М карбоната аммони ) в воде (14мл), доведенный до рН 8,0 и содержаш}1Й хлористьш кальций в 3x10 мол рной конценгращди, инкубируют при 37°С с АМ-протеазой (120 мкг) в течение 5 час. Во врем  инкубации рП подаерживают 8,0 с помощью добавлени  0,005М раствора гидртокиси натри . Полученный раствор помещают на кoлoF кy из ггористого

поперечно-св занного декстрапоного )ел  и колонку про вл ют 0,1М карбонатом аммони  при скорости потока 13 мл/час при температуре 4°С. Фракцию по 150 капель (5 мл) собирают и анализируют на пептидный материал измерением их УФ-поглощени  при 280 нм. Фракции (22-30), содержащие главный пик, собирают и лиофилизируют, дава  де(;-Лиз -Ала - свиной инсулин (100мг). После электрофореза с помощью потшакриламидного гел  при рН 8,9 материал представл ет собой единственный компонент при окрашивании амидочерным . Он имеет подвижность по направлению к аноду 1,2 относительно подвижности свиного инсушна . Он также дает некоторые интегральные амино-кислотные соотношени  (найденные в примере 1).

П р и м е р 6. Раствор свиного инсулина (1 мг) в 0,1 М буферной смеси бикарбоната аммони  с рН 8,2 (1 мл) помещают на верхнюю часть колонки,

содержащей 3 мл 4%-ного агарозного гел , к которому ковалентно присоедин ют5 мг АМ-протеазы и уравновешивают в том же самом буферном растворе бикар&)ната аммони  при 22° С-Колонку элюируют буферным раствором бикарбоната аммони 

при скорости потока 7 мл/час в течение 1 час и фракцию анализируют на пептидньш материал путем измерени  УФ-поглощени  при 280 нм. Ф15ак1ЩИ , содержащие пептидный материал, собирают и

лиофилизируют, дава  дес-Лиз -Ала - свиной

инсулин, имеющий те же физические свойства, что и продукт примера 5.

П р и м е р 7. Растворы свиного инсулина (кристаллизованные 10 раз), содержащие 1 мг инсулина на 1 мг растворител , инкубируют при рН

8,0 и температуре 40° С в течение 2 час с АМ-протеаэой при соотношении знзим-субстрат 1:1000 в присутствии, хлористого магни  при концентраци х 10, 1(Т, и iff мол рных соответственно. Анализ, как в примере 2, показывает 90%-ное

расщепление с К мол рной концентрацией Мо, 75%-иое расщепление с lO и 10 мол рным Мо и 65%-ное расщепление с id мол рным Мо. При отсутствии магни  имеет место 68%-ное расщепление .

П р и м е р 8. Раствор кристаллического

бычьего инсулина (150мг) в воде (20мл), доведенной до рН 8,3 и содержащий хлористый кальций, инкубируют с AM-протеазой (240 мкг) в течение 3 час при 37°С.

Во врем  инкубировани  рН поддерживают при

8,3 путем добавлени  0,02М раствора гидроокиси натри . Дозу раствора (10 мкг) провер ют при использовании амино-кислотного анализатора, как описано в примере 1, 1 лшн (рН 3,28); i мин

Claims (1)

1. (рН 4,25), 60 мин (рН 6,65), затем цикл регенерации на колонке. Пик инсулина (элюирование в течение 90 мин) отсутствует, тогда как дес-Лиз -Ала - бычий инсулин (врем  элюировани  80 мин) и Ала-Ала (элюирование в течение 1 20 мин) присутствуют . Инкуби1) раствор затем лиофили:)ируют и твердое вещество раствсф ют в М уксусной кислоте (2ш). Этот раствар подвергают гепевой фильтрации л{ж 4° С с М уксусной кислотой в качестве растворител . Фракции, включан цие главный пик, измеренный с noMouiibto адсорбции УФ при 280 нм, объедин ют и модифицируют, дава  дес-Лиз -Ала -бычий инсулин (113 мг). После полнакрилаАвщ-гелевого электрофореза (рН 8) мате1шал выгл дит как единственный компонент, когда окраишваетс  амидо-черным. Он имеет подвижность 1-2-кратную подвижности бычьего инсулина по направлению к аноду. Общий алтно-ютслотный анализ дает те же самые интегральные соотноившш аминокислот, что и бычий инсулин, за исключошем того, что отсут ствует лизин и только два остатка алаиина. Глидан и феюшаланин обнаруживаютс  как N концевые аминокислоты при приеме .дансилировани  описшном в примере 1. П р и м е р 9. Один раз фисталлизованный свиной инсулин (150мг) раствор ют в воде при добавлешш N гидроокиси аъоюви  и раствор разбавл ют до 3,0 мл 0,1 М бикарбонатом аммони . Добавл ют раствор АМ-протеазы (150мкг, 0,5 мл) и раствор вьщерживают при телшературе в течение И час. Анализ дозы перевара с помощью приема, описанного в примере 8, показывает , что переваривание завершилось. Раствор разбавл ют 40 об %/об водной уксусной кислоты (3 мл) и полученньш раствор помещают на колонку Сефадекс G-50. Колонку элюируют 20об %/об водной уксуснсж кислотой и элюат провер ют при измерении абсорбции2Ф при 280 нм. Собирают фракцию из 8(Ю капель со скоростью потока 15 мл/час. Инсулииовый пик по вл етс  между фракци ми 45-56, зти фракции объедин ют и сушат , получают дес-Лиз -Ала -свиной инсулин (135 лет). При этих услови х АМ-протеаза, мечена  1-125, по вл етс  между фракци ми 36-43. Формула изобретени  Способ Получени  погмпептидов из инсулина путем его обработки пептидазой с последующим выделением целевого продукта, отличающийс   тем, что, с целью пежьпиени  качества препарата , обработку осуществл ют ферментами АМ-прОтеазой из грибка Armillaria Meltea или Миксобактер 2-1 протеазой 11 из штамма MyxobactetA2-1 . Источники информащш, прин тые во внимание при зкспертизе: 1. Патент США № 3.364.116, кл. 424-178,1968.